Made available in DSpace on 2014-06-11T19:35:10Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013-07-01Bitstream added on 2014-06-13T20:26:11Z : No. of bitstreams: 1 ferreira_ar_dr_botfmvz.pdf: 1429391 bytes, checksum: 8f14684d6c31152b88742021cd3eb683 (MD5) / Os objetivos deste estudo foram: 1) Avaliar a expressão alelo-específica do gene monoamina oxidase de tipo A (MAOA), presente no cromossomo X e sujeito a inativação, em embriões produzidos in vivo e por transferência nuclear (TN). Para análise foram utilizadas biópsias da massa celular interna (MCI) e do trofoblasto (TF) dos embriões; 2) Avaliar se a carência de S e Co (Grupo -S-Co) na dieta, ou a suplementação com Metionina e Colina encapsuladas (Grupo +Met+Col) afetaria os níveis bioquímicos sanguíneos de componentes do ciclo da metionina e do metabolismo de glicose, expressão de genes ligados ao ciclo de um carbono em células do cumulus, qualidade ovocitária e taxa de embriões. Foram oferecidas três dietas com níveis diferentes de Co e S para novilhas da raça Nelore, alocadas em 10 animais/grupo. Após 3 meses de dieta os folículos ovarianos das novilhas foram aspirados semanalmente durante 7 semanas. Para a ICX, nos embriões in vivo detectou-se a presença dos dois alelos, tanto na MCI quanto no TF. Da mesma forma, encontrou-se a expressão dos dois alelos do gene MAO-A em embriões TN, mas com uma prevalência da detecção do alelo A comparado ao G na MCI e no TF. Nenhuma diferença foi encontrada entre +Met+Col e o grupo controle. O grupo -S-Co teve diferença do grupo controle para homocisteína (13,7 vs. 10,6; p<0,001), ácido fólico (29,6 vs. 26,0; p=0,011), B12 (143,8 vs. 165,6; p<0,001), IGF-I (375,3 vs. 410,2; p=0,034), e glicose (82,2 vs. 76,2; p=0,003). Os genes MAT2B e DNMT1 foram menos expressos no grupo - S-Co comparado ao controle quando normalizados pelos genes endógenos GAPDH (MAT2B p=0,05; DNMT1 p=0,03) e β-Actina (MAT2B p=0,06; DNMT1 p=0,01). As novilhas do grupo -S-Co produziram menor número de ovócitos por animal comparado ao grupo controle (13,81 vs 17,79; p=0,0438), sem diferença para a produção embrionária / The objectives of this study were: 1) to assess allele-specific expression of the monoamine oxidase type A (MAO-A) gene, which is located on the X chromosome, in inner cell mass (ICM) and trophoblast (TF) of embryos produced in vivo and by somatic cell nuclear transfer (SCNT); 2) to evaluate the influence of different levels of dietary sulfur (S), cobalt (Co), methionine and choline on the blood plasma levels of homocysteine, folic acid, B12, IGF-I, glucose and insulin; oocyte and in vitro embryo production; and the expression of genes codifying key enzymes of the one-carbon cycle and DNA methylation in cumulus cells. Three diets with different levels of Co, S, methionine and choline were given for Nellore heifers (n=10 per group). Regards to the MAO-A expression, both alleles were detected in in vivo and by SCNT produced embryos both in ICM and TF. However, a higher frequency of the mono-allelic expression of a specific allele was observed in SCNT embryos. No differences were found between the +Meth+Chol and control groups. The -S-Co group differed from the control in homocysteine levels (13.7 vs. 10.6; p<0.001), folic acid levels (29.6 vs. 26.0; p=0.011), B12 levels (143.8 vs. 165.6; p<0.001), IGF-I levels (375.3 vs. 410.2; p=0.034), and glucose levels (82.2 vs. 76.2; p=0.003). The MAT2B and DNMT1 genes were expressed less in the -S-Co group compared to the control when normalized by the GAPDH (MAT2B p=0.05; DNMT1 p=0.03) and β-Actin (MAT2B p=0.06; DNMT1 p=0.01) endogenous genes. Heifers from the -S-Co group produced lower numbers of oocytes per animal compared to the control group (13.81 vs. 17.79; p=0.0438), but no differences were observed in embryo production

Orientador: Roberto Sartori Filho / Coorientador: Mauricio Machaim Franco / Banca: Milo Charles Wiltbank / Banca: Margot Alves Nunes Dode / Banca: José Buranti Junior / Banca: João Carlos Pinheiro ferreira / Resumo: Os objetivos deste estudo foram: 1) Avaliar a expressão alelo-específica do gene monoamina oxidase de tipo A (MAOA), presente no cromossomo X e sujeito a inativação, em embriões produzidos in vivo e por transferência nuclear (TN). Para análise foram utilizadas biópsias da massa celular interna (MCI) e do trofoblasto (TF) dos embriões; 2) Avaliar se a carência de S e Co (Grupo -S-Co) na dieta, ou a suplementação com Metionina e Colina encapsuladas (Grupo +Met+Col) afetaria os níveis bioquímicos sanguíneos de componentes do ciclo da metionina e do metabolismo de glicose, expressão de genes ligados ao ciclo de um carbono em células do cumulus, qualidade ovocitária e taxa de embriões. Foram oferecidas três dietas com níveis diferentes de Co e S para novilhas da raça Nelore, alocadas em 10 animais/grupo. Após 3 meses de dieta os folículos ovarianos das novilhas foram aspirados semanalmente durante 7 semanas. Para a ICX, nos embriões in vivo detectou-se a presença dos dois alelos, tanto na MCI quanto no TF. Da mesma forma, encontrou-se a expressão dos dois alelos do gene MAO-A em embriões TN, mas com uma prevalência da detecção do alelo A comparado ao G na MCI e no TF. Nenhuma diferença foi encontrada entre +Met+Col e o grupo controle. O grupo -S-Co teve diferença do grupo controle para homocisteína (13,7 vs. 10,6; p<0,001), ácido fólico (29,6 vs. 26,0; p=0,011), B12 (143,8 vs. 165,6; p<0,001), IGF-I (375,3 vs. 410,2; p=0,034), e glicose (82,2 vs. 76,2; p=0,003). Os genes MAT2B e DNMT1 foram menos expressos no grupo - S-Co comparado ao controle quando normalizados pelos genes endógenos GAPDH (MAT2B p=0,05; DNMT1 p=0,03) e β-Actina (MAT2B p=0,06; DNMT1 p=0,01). As novilhas do grupo -S-Co produziram menor número de ovócitos por animal comparado ao grupo controle (13,81 vs 17,79; p=0,0438), sem diferença para a produção embrionária / Abstract: The objectives of this study were: 1) to assess allele-specific expression of the monoamine oxidase type A (MAO-A) gene, which is located on the X chromosome, in inner cell mass (ICM) and trophoblast (TF) of embryos produced in vivo and by somatic cell nuclear transfer (SCNT); 2) to evaluate the influence of different levels of dietary sulfur (S), cobalt (Co), methionine and choline on the blood plasma levels of homocysteine, folic acid, B12, IGF-I, glucose and insulin; oocyte and in vitro embryo production; and the expression of genes codifying key enzymes of the one-carbon cycle and DNA methylation in cumulus cells. Three diets with different levels of Co, S, methionine and choline were given for Nellore heifers (n=10 per group). Regards to the MAO-A expression, both alleles were detected in in vivo and by SCNT produced embryos both in ICM and TF. However, a higher frequency of the mono-allelic expression of a specific allele was observed in SCNT embryos. No differences were found between the +Meth+Chol and control groups. The -S-Co group differed from the control in homocysteine levels (13.7 vs. 10.6; p<0.001), folic acid levels (29.6 vs. 26.0; p=0.011), B12 levels (143.8 vs. 165.6; p<0.001), IGF-I levels (375.3 vs. 410.2; p=0.034), and glucose levels (82.2 vs. 76.2; p=0.003). The MAT2B and DNMT1 genes were expressed less in the -S-Co group compared to the control when normalized by the GAPDH (MAT2B p=0.05; DNMT1 p=0.03) and β-Actin (MAT2B p=0.06; DNMT1 p=0.01) endogenous genes. Heifers from the -S-Co group produced lower numbers of oocytes per animal compared to the control group (13.81 vs. 17.79; p=0.0438), but no differences were observed in embryo production / Doutor

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, 2007. / Submitted by Rebeca Araujo Mendes (bekinhamendes@gmail.com) on 2009-12-21T23:59:54Z No. of bitstreams: 1 2007_LilianBarrosQueiroz.PDF: 2239571 bytes, checksum: 5e97a61f8c82fcfb2f6016ad05934e71 (MD5) / Approved for entry into archive by Carolina Campos(carolinacamposmaia@gmail.com) on 2010-01-11T16:04:48Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2007_LilianBarrosQueiroz.PDF: 2239571 bytes, checksum: 5e97a61f8c82fcfb2f6016ad05934e71 (MD5) / Made available in DSpace on 2010-01-11T16:04:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2007_LilianBarrosQueiroz.PDF: 2239571 bytes, checksum: 5e97a61f8c82fcfb2f6016ad05934e71 (MD5) Previous issue date: 2007 / A síndrome do X frágil (SXF), causa comum de retardo mental (RM) hereditário ocorre por mutação no gene FMR1 pela expansão não traduzida de CGG na extremidade 5’. Na população, a expansão varia de 5 a 52 repetições. Portadores de 52 a 200 cópias (pré-mutação) produzem a proteína FMRP, porém podem transmitir a mutação à geração seguinte. Indivíduos SXF possuem mais de 200 cópias (mutação completa) e resulta em metilação e inativação do gene impedindo a expressão da FMRP. Ausência de FMRP é responsável pelo RM. Mulheres portadoras da mutação completa apresentam variação no grau de RM devido inativação aleatória do X. A SXF é identificada pelo sítio frágil (FRAXA), na região Xq27.3. A imuno-histoquímica permite observar a expressão da FMRP no bulbo de cabelo. Indivíduos afetados mostram níveis inferiores aos controles. A reação em cadeia da polimerase (PCR) representa o melhor método para triagem da SXF. Objetivos: 1) avaliar a eficácia da técnica de imuno-histoquímica em pacientes suspeitos de SXF; 2) comparar três técnicas de diagnóstico para SXF: imuno-histoquímica, citogenética e PCR. Métodos: foram selecionados 121 pacientes com suspeita SXF sendo 59 (48,8%) homens e 62 (51,2%) mulheres. Noventa indivíduos sadios, com 75-100% de expressão da FMRP foram selecionados como controles negativos da imuno-histoquímica. Resultados: de 113 pacientes que realizaram a imuno-histoquímica, 54 eram homens, com 17 positivos, 28 negativos e nove inconclusivos e 59 mulheres, com sete positivas, 27 negativas e 25 inconclusivas. Entre os 119 que realizaram a PCR, 57 homens, com 20 positivos e 37 negativos e 62 mulheres, com três negativas e 59 inconclusivas. Dos 104 pacientes analisados para citogenética, 57 homens, com 34 positivos e 23 negativos e 47 mulheres, com 27 positivas e 20 negativas. A menor expressão do FRAXA foi 3% nos homens e 5,4% nas mulheres e a maior 36% e 37,1%, respectivamente. Comparando as técnicas imuno-histoquímica e PCR (considerado o padrão-ouro) nos homens observaram-se sensibilidade 84,2%; especificidade 100%; acurácia 94,2%. Comparando citogenética com PCR nos homens, encontraram-se sensibilidade 100%; especificidade 61,1%; acurácia 74,5%. A citogenética exige profissional qualificado, cultura prolongada, tendo boa sensibilidade em homens. As vantagens da imuno-histoquímica são: rapidez, baixo custo e facilidade de obtenção das amostras de bulbo de cabelo. A PCR é técnica versátil, rápida, com alta sensibilidade e especificidade com desvantagem em relação às mulheres de não diferenciar as homozigotas normais das heterozigotas afetadas. Conclusões: Houve correlação positiva e significativa entre homens com a SXF pela imuno-histoquímica comparada à PCR e citogenética. A PCR mostrou-se eficiente como triagem da SXF nos homens quando comparada com citogenética e imuno-histoquímica devido à ausência de falso-positivos. Fragilidade cromossômica em não afetados pode ser devido à presença de outros sítios frágeis. Todas as técnicas imuno-histoquímica, citogenética e PCR, isoladamente, não detectam portadores da pré-mutação e mulheres com mutação completa. ___________________________________________________________________________________ ABSTRACT / The fragile X syndrome (FXS), common cause of hereditary mental retardation (MR) is caused by a mutation in the gene FMR1 characterized by a not translated CGG expansion in extremity 5'. In the population, this expansion varies from five to 52 repetitions. Carriers of 52 to 200 copies (premutation) show a normal production of the FMRP protein, but they can transmit an expanded mutation to the following generation. Individuals FXS have more than 200 copies (full mutation) which result in gene methylation and inactivation hindering the expression of the FMRP. Absence of FMRP is responsible for the MR. Female carrying the full mutation presents various degrees of MR due to random inactivation of the X chromosome. The FXS is identified by the presence of a fragile site (FRAXA) located in the Xq27.3 region. The immunohystochemical method allows the detection of the FMRP expression in the hair bulb. Affected individuals disclose decreased levels of FMRP than controls. The polimerase chain reaction (PCR) represents the best screening method to identify FXS affected individuals. Objectives: 1) to evaluate the effectiveness of the immunohystochemical technique in the identification of suspected FXS patients; 2) to compare three techniques used in the diagnosis of FXS: immunohystochemical, cytogenetic and PCR. Methods: Were selected 121 patients with signs and symptoms consistent with a probable diagnosis of FXS. Fifty-nine (48.8%) men and 62 (51.2%) were women. As negative controls were used 90 healthy individuals with 75 to 100% of FMRP expression. Results: Among the 113 patients that underwent immunohystochemical testing, 54 were men (17 being positive, 28 negative and nine with dubious results) and 59 were women with seven positive, 27 negative and 25 with dubious results. Among the 119 individuals that underwent PCR, 57 were men (with 20 positive and 37 negative results) and 62 women (with three negative and 59 showing dubious results). Of the 104 patients analyzed by cytogenetic testing were men (with 34 positives and 23 negatives results) and 47 were women (with 27 positive and 20 negatives results). The FRAXA lower expression was detected in 3% of men and 5.4% of women xx and the greater expression was 36% and 37.1%, respectively. Comparing the immunohystochemical technique and PCR (considered the gold-standard method) in men was observed a sensitivity of 84.2%; and a specificity of 100%; the accuracy was 94.2%. Comparing cytogenetic analysis and PCR in men, the sensitivity of the analysis was 100% and its specificity of 61.1%; accuracy was 74.5%. The cytogenetic analysis requires a qualified professional, a prolonged cell culture time its sensitivity being satisfying mainly in men. The advantages of the immunohystochemical are its shorter execution time, low cost, and facility to obtain the hair bulb samples. The PCR is a fastest technique, versatile, with high sensitivity and specificity. The disadvantage of this test being its incapacity to differentiate the normal homozigous from the affected heterozygous women. Conclusion: A positive correlation was found between FXS affected men when comparing the immunohystochemical technique to PCR and to cytogenetic analysis. The PCR was considered an efficient method in detecting the FXS in men when compared to cytogenetic analysis and immunohystochemical technique mainly due to the absence of false positive results. The presence of chromosome fragility in non affected individuals can be due to the presence of other fragile sites. Considering all the three techniques, immunohystochemical, cytogenetic and PCR, can be concluded that, itself, all are ineffective in the identification of premutation carriers and in women with full mutation.

Dissertação (mestrado)-Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, 2011. / Submitted by Clarissa Pêgas e Souza (clarissapegas@hotmail.com) on 2011-09-06T14:22:08Z No. of bitstreams: 1 2011_PatriciaMariaFritsch.pdf: 1197677 bytes, checksum: 9e0634e2c62a092daa8b3c6afeff7c82 (MD5) / Approved for entry into archive by Jaqueline Ferreira de Souza(jaquefs.braz@gmail.com) on 2011-09-28T11:51:11Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2011_PatriciaMariaFritsch.pdf: 1197677 bytes, checksum: 9e0634e2c62a092daa8b3c6afeff7c82 (MD5) / Made available in DSpace on 2011-09-28T11:51:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2011_PatriciaMariaFritsch.pdf: 1197677 bytes, checksum: 9e0634e2c62a092daa8b3c6afeff7c82 (MD5) / A síndrome do X frágil (SXF) é a causa hereditária mais comum de Deficiência Mental familiar. É causada pela expansão da repetição CGG na região 5’ não traduzida do gene FMR1. Indivíduos normais apresentam entre 20 e 50 repetições CGG enquanto que indivíduos com pré-mutação apresentam de 55 a 200 repetições e pacientes X frágil apresentam mais de 200 repetições (mutação completa) que levam à hipermetilação e inativação do gene FMR1. O presente trabalho teve como objetivo implantar uma metodologia de triagem molecular para a SXF em portadores de deficiência mental DM atendidos pelo Serviço de Genética Clínica do HUB/UnB. Foram investigados 128 indivíduos com DM e 29 familiares de afetados pela SXF. A metodologia utilizada, baseada na PCR, associou duas técnicas para visualização do produto amplificado, Eletroforese em gel de agarose (PCR CGG-EA) e Eletroforese Capilar (PCR CGG-EC). Foi possível distinguir pré-mutações maiores que 112 repetições CGG. Dos 128 pacientes com DM testados 8 apresentaram resultado positivo para a presença de mutação completa. Em 25 das 30 mulheres testadas, foi possível determinar heterozigose. A associação das técnicas PCR CGG-EA e PCR CGG-EC se mostrou eficaz na identificação de mulheres heterozigotas, indivíduos com mutação completa, pré-mutação e alelos normais, reduzindo em 83% a necessidade de triar por Southern Blotting. _______________________________________________________________________________ ABSTRACT / The Fragile X syndrome (SXF) is one of the most commom inheritable causes of mental retardation (MR). It is caused by expansion of the CGG repeat in the 5’ untrusnlated region of the FMR1 gene. Normal individuals have between 20 and 50 CGG repeat, while individuals with premutation have from 55 to 200 repeat and fragile X patients shown more than 200 repeat (full mutation) that lead to hypermethylation and inactivation of the FMR1 gene. The objective of this study is to implement a molecular selection methodology for SXF in bearers of MR assisted by the Clinical Genetics Service of HUB/UnB. One hundred and twenty eight mentally retarded individuals and 29 family members affected by SXF were investigated. Based on PCR, the methodology utilized associated two techniques for visualization of the amplified product: electrophoresis in agarose gel (PCR CGG-EA) and Capillary Electrophoresis (PCR CGG-EC). It was possible to distinguish premutations greater than 112 CGG repeats. Of the 128 patients with MR tested, 8 showed positive results for the presence of the full mutation. In 25 of the 30 women tested, it was possible to define heterozygous. Association of the PCR CGG-EA and PCR CGG-EC techniques was shown to be efficacious in identifying individual heterozygotic women with complete mutation, premutation and normal alleles, thus reducing the need for sample to be tested by to Southern blotting of 83%.

Orientadores: Antonia Paula Marques-de-Faria, Iscia Lopes Cendes / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-03T21:46:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Camargo_MariaEugeniaRibeirode_M.pdf: 5663240 bytes, checksum: da16953f8e521ccd08401398ff5c4a82 (MD5) Previous issue date: 2004 / Resumo: Entre as etiologias genéticas da deficiência mental (DM), um grupo vem sendo objeto de atenção especial, o do retardo mental ligado ao X (RMLX), no qual entre 25 a 40% correspondem a casos da síndrome do X Frágil (SXF). Tal denominação se relaciona à presença de um sítio frágil na região Xq27.3, representado genotipicamente por FRAXA, causado pela variação do número de cópias de uma repetição instável de trinucleotídeos CGG na extremidade 5' não traduzida do gene FMR-l. Ainda na região Xq27-28 estão localizados os sítios frágeis FRAXE e FRAXF. O objetivo principal deste projeto foi implantar a técnica e realizar a análise molecular, utilizando o método da PCR, para triagem da mutação por expansão de trinuc1eotídeos, e o de Southem blot para análise da mutação completa e pré-mutação relacionadas a SXF, em indivíduos do sexo masculino com DM de etiologia não esclarecida, apresentando ou não quadro clínico sugestivo da SXF, nos quais a análise citogenética para tal alteração se mostrou negativa. A análise molecular da repetição CGG, em um total de 54 indivíduos, revelou apenas um (1,9%) com o alelo expandido de aproximadamente 7,OKb; 51 (94,4%) apresentaram apenas alelos de tamanhos normais, variando entre 5 e 54 repetições CGG e, em dois indivíduos (3,7%), os resultados se mostraram inconclusivos. A análise do tamanho normal da repetição trinucleotídica polimórfica (CGG)n, em 49 mulheres do grupo controle, mostrou que 65,3% destas são heterozigotas, apresentam dois alelos CGG normais de tamanhos diferentes. Como protocolo de investigação diagnóstica em indivíduos com DM idiopática, a associação do exame de cariótipo rotineiro à triagem por PCR da SXF possibilitou uma cobertura satisfatória das principais causas de RM. A implementação das técnicas da PCR e de Southem blot para a SXF representou um passo fundamental para que o laboratório de Genética Molecular do Departamento de Genética Médica da UNICAMP possa oferecer mais este serviço à população, tendo em vista a importância dessa condição como etiologia da DM / Abstract: mong the mental deficiencies of genetic origin the group of X-linked mental retardation (XLMR) has got special attention. lnside this group 25 to 40% corresponds to cases of ftagile X syndrome (FXS). This designation is related to the presence of a ftagile site in the Xq27.3 region, genotypically represented by FRAXA, that is caused by thevariation in the number of copies of an instable repetition of CGG trinucleotides at the 5' untranslated region ofthe FMR-l gene. The FRAXE and FRAXF sites are both located inside the region Xq27-28. The main aim of this project is to setup a reliable method to perform the molecular analysis using the PCR technique in order to screen the trinucleotides expansion mutation, and the Southem blot analysis to identify the pre- and complete mutation related to FXS in males with mental deficiency of unknown origino This group of males was chosen because there was no clinical pattem indicative of FXS and the cytogenetic analysis for such alteration was negative. The molecular analysis of the CGG repetition for a total of 54 subjects showed only one (1.9 %) individual with an expanded allele of around 7.0 kb; 51 (94.4 %) showed normal size alleles,varying between 5 and 54 CGG repetitions, and for two individuals (3.7 %) the results were inconclusive. The analysis of the normal size of the polymorphic trinucleotides repetition (CGG)n in 49 women ftom the control group showed that 65.3 % of them as eterozygotes for the normal allele,with two normal CGG alleles of different sizes. As a protocol for the diagnosis of individuais with idiopathic MO, the association of the routine cariotype examination together with PCR screening for FXS became a satisfactory tool to identifythe principal causes for MR. The implementation of the PCR and Southem blot techniques for the diagnosis of FXS represented an important step for the Molecular Genetic laboratory of the Medical Genetic Department at UNICAMP to offer one more service to the general population, keeping in mind the importance of identifying the FXS condition as a possible origin for the MO / Mestrado / Ciencias Biomedicas / Mestre em Ciências Médicas

Este trabalho teve o objetivo de estimar a frequência de deficiência mental causada por mutações no cromossomo X entre pacientes do sexo masculino, que constituem casos isolados de deficiência mental. A estratégia adotada foi a determinação do padrão de inativação do cromossomo X nas mães dos afetados, com base (a) nas indicações de que desvios extremos do padrão casual de inativação do cromossomo X têm alta probabilidade de estar relacionados à presença de mutações do cromossomo X e (b) na observação de que a frequência desses desvios está significantemente aumentada em mulheres certamente portadoras de mutações que causam deficiência mental de herança ligada ao X. A vantagem seletiva das células que possuem o alelo não mutado no cromossomo X ativo é uma explicação para tais desvios extremos da inativação do cromossomo X, raramente encontrados na população geral. Selecionamos 115 meninos portadores de deficiência mental moderada a grave associada a outros sinais clínicos, não característicos de síndrome conhecida e que tinham cariótipos normais e teste negativo para a síndrome do cromossomo X frágil; suas genitoras concordaram com a participação no estudo. Esses pacientes foram encaminhados ao Serviço de Aconselhamento Genético do Laboratório de Genética Humana, Departamento de Genética e Biologia Evolutiva, por diferentes serviços médicos, para diagnóstico e orientação quanto a riscos de recorrência na família. O padrão de inativação do cromossomo X nas mães dos afetados foi investigado, com base na metilação diferencial dos alelos do gene AR (Androgen Receptor gene) , no cromossomo X ativo e inativo. As mães de 100 desses meninos se revelaram heterozigóticas quanto à repetição polimórfica CAG do gene AR, requisito do teste para determinar o padrão de inativação do cromossomo X. Onze mulheres (11%) apresentaram desvios extremos do padrão de inativação do X (&ge; 98:2), frequência significativamente maior (P = 0.0001; teste exato de Fisher) do que aquela que a literatura registra, em estudo utilizando o mesmo ensaio, entre mulheres adultas da população geral (0,017; IC 95% = 0,007 0,034). A raridade de desvios tão extremos na população geral permite admitir que as mães dos afetados que apresentam tais desvios sejam portadoras de mutação no cromossomo X, que causa a deficiência mental em seus filhos. Sendo assim, estimamos em 11% a frequência de deficiência mental em nossa amostra de 100 meninos casos isolados de deficiência mental (IC 95% = 0,056 0,188), sem incluir a síndrome do X frágil, responsável por 2,5% a 3% da deficiência mental no sexo masculino. Essa nossa estimativa para a proporção de deficiência mental moderada grave ligada ao X entre indivíduos do sexo masculino com DM é da mesma ordem de grandeza daquelas relatadas na literatura, baseadas (a) na frequência da síndrome do X frágil em coortes de homens com deficiência mental e entre famílias com deficiência mental de herança ligada ao X ou (b) nas inferências da prevalência de deficiência mental e de deficiência mental causada por mutações no cromossomo X na população geral masculina. Entretanto, a frequência por nós determinada deve ser uma subestimativa, considerando que os desvios extremos do padrão de inativação ocorrem em apenas um terço das portadoras obrigatórias de mutações que causam deficiência mental com herança ligada ao X. Com base nos resultados deste estudo, consideramos indicada a avaliação do padrão de inativação do cromossomo X em mães de indivíduos do sexo masculino, casos isolados de deficiência mental. A detecção de desvio extremo da inativação deve ser considerada indicativa de deficiência mental de herança ligada ao X, constituindo subsídio para o aconselhamento genético da família e podendo levar á identificação da mutação causadora da deficiência mental. / Nearly a third of obligate carriers of mutations causative of X-linked mental retardation (XLMR) have been reported to have extreme X-inactivation skewing in peripheral blood cells, compared to their non-carrier relatives. Selective advantage of cells with the non-mutated allele on the active X chromosome would explain this skewing. Based on these findings, we used the pattern of X-inactivation in mothers of mentally retarded boys, as a parameter to evaluate the frequency of XLMR among non-familial cases. To determine the X-inactivation pattern in these women, we investigated the methylation status of the AR (Androgen Receptor) alleles in blood cells. We selected 115 boys with moderate to severe mental retardation of unknown cause, who had normal karyotypes and tested negative for fragile X syndrome; the mothers of 100 of these boys were found to be heterozygous for the polymorphic CAG repeat of the AR gene, a requisite of the X-inactivation assay. Eleven women (11%) had extremely skewed X-inactivation (&ge; 98:2), a frequency significantly higher (P = 0.0001; Fisher exact test) than the frequency reported for adult women from the general population (1.7%; 95% CI = 0.007 0,034). Assuming that every mother with extremely skewed X-inactivation is a carrier of an X-chromosome mutation that causes mental retardation in her son, the frequency of XLMR in our sample of 100 boys is 11% (95% CI = 0,056 0,188), the fragile X syndrome being excluded. Although these figures are quite in agreement with previous estimations of the frequency of XLMR among mentally retarded men, they might be an underestimation, when it is taken into account that only about a third of obligate carriers of XLMR mutations have highly skewed X inactivation.

Este trabalho teve o objetivo de estimar a frequência de deficiência mental causada por mutações no cromossomo X entre pacientes do sexo masculino, que constituem casos isolados de deficiência mental. A estratégia adotada foi a determinação do padrão de inativação do cromossomo X nas mães dos afetados, com base (a) nas indicações de que desvios extremos do padrão casual de inativação do cromossomo X têm alta probabilidade de estar relacionados à presença de mutações do cromossomo X e (b) na observação de que a frequência desses desvios está significantemente aumentada em mulheres certamente portadoras de mutações que causam deficiência mental de herança ligada ao X. A vantagem seletiva das células que possuem o alelo não mutado no cromossomo X ativo é uma explicação para tais desvios extremos da inativação do cromossomo X, raramente encontrados na população geral. Selecionamos 115 meninos portadores de deficiência mental moderada a grave associada a outros sinais clínicos, não característicos de síndrome conhecida e que tinham cariótipos normais e teste negativo para a síndrome do cromossomo X frágil; suas genitoras concordaram com a participação no estudo. Esses pacientes foram encaminhados ao Serviço de Aconselhamento Genético do Laboratório de Genética Humana, Departamento de Genética e Biologia Evolutiva, por diferentes serviços médicos, para diagnóstico e orientação quanto a riscos de recorrência na família. O padrão de inativação do cromossomo X nas mães dos afetados foi investigado, com base na metilação diferencial dos alelos do gene AR (Androgen Receptor gene) , no cromossomo X ativo e inativo. As mães de 100 desses meninos se revelaram heterozigóticas quanto à repetição polimórfica CAG do gene AR, requisito do teste para determinar o padrão de inativação do cromossomo X. Onze mulheres (11%) apresentaram desvios extremos do padrão de inativação do X (&ge; 98:2), frequência significativamente maior (P = 0.0001; teste exato de Fisher) do que aquela que a literatura registra, em estudo utilizando o mesmo ensaio, entre mulheres adultas da população geral (0,017; IC 95% = 0,007 0,034). A raridade de desvios tão extremos na população geral permite admitir que as mães dos afetados que apresentam tais desvios sejam portadoras de mutação no cromossomo X, que causa a deficiência mental em seus filhos. Sendo assim, estimamos em 11% a frequência de deficiência mental em nossa amostra de 100 meninos casos isolados de deficiência mental (IC 95% = 0,056 0,188), sem incluir a síndrome do X frágil, responsável por 2,5% a 3% da deficiência mental no sexo masculino. Essa nossa estimativa para a proporção de deficiência mental moderada grave ligada ao X entre indivíduos do sexo masculino com DM é da mesma ordem de grandeza daquelas relatadas na literatura, baseadas (a) na frequência da síndrome do X frágil em coortes de homens com deficiência mental e entre famílias com deficiência mental de herança ligada ao X ou (b) nas inferências da prevalência de deficiência mental e de deficiência mental causada por mutações no cromossomo X na população geral masculina. Entretanto, a frequência por nós determinada deve ser uma subestimativa, considerando que os desvios extremos do padrão de inativação ocorrem em apenas um terço das portadoras obrigatórias de mutações que causam deficiência mental com herança ligada ao X. Com base nos resultados deste estudo, consideramos indicada a avaliação do padrão de inativação do cromossomo X em mães de indivíduos do sexo masculino, casos isolados de deficiência mental. A detecção de desvio extremo da inativação deve ser considerada indicativa de deficiência mental de herança ligada ao X, constituindo subsídio para o aconselhamento genético da família e podendo levar á identificação da mutação causadora da deficiência mental. / Nearly a third of obligate carriers of mutations causative of X-linked mental retardation (XLMR) have been reported to have extreme X-inactivation skewing in peripheral blood cells, compared to their non-carrier relatives. Selective advantage of cells with the non-mutated allele on the active X chromosome would explain this skewing. Based on these findings, we used the pattern of X-inactivation in mothers of mentally retarded boys, as a parameter to evaluate the frequency of XLMR among non-familial cases. To determine the X-inactivation pattern in these women, we investigated the methylation status of the AR (Androgen Receptor) alleles in blood cells. We selected 115 boys with moderate to severe mental retardation of unknown cause, who had normal karyotypes and tested negative for fragile X syndrome; the mothers of 100 of these boys were found to be heterozygous for the polymorphic CAG repeat of the AR gene, a requisite of the X-inactivation assay. Eleven women (11%) had extremely skewed X-inactivation (&ge; 98:2), a frequency significantly higher (P = 0.0001; Fisher exact test) than the frequency reported for adult women from the general population (1.7%; 95% CI = 0.007 0,034). Assuming that every mother with extremely skewed X-inactivation is a carrier of an X-chromosome mutation that causes mental retardation in her son, the frequency of XLMR in our sample of 100 boys is 11% (95% CI = 0,056 0,188), the fragile X syndrome being excluded. Although these figures are quite in agreement with previous estimations of the frequency of XLMR among mentally retarded men, they might be an underestimation, when it is taken into account that only about a third of obligate carriers of XLMR mutations have highly skewed X inactivation.

A inativação do cromossomo X (ICX) em fêmeas é um exemplo de regulação epigenética. O silenciamento de um dos cromossomos X leva à formação estável da heterocromatina facultativa através da aquisição de múltiplas modificações na cromatina que são mantidas nas subsequentes divisões celulares. Atualmente, algumas características epigenéticas associadas à manutenção da ICX têm sido descritas, contudo os mecanismos de ação e a identidade dos diferentes fatores envolvidos na manutenção da ICX ainda são desconhecidos ou pouco compreendidos. Nosso laboratório realizou uma triagem funcional genômica por bibliotecas de shRNAs (short harpin RNAs) para encontrar genes envolvidos na manutenção da ICX em humanos. A partir deste estudo foram identificados 20 novos genes candidatos a estarem envolvidos na manutenção da ICX. Assim, o objetivo deste trabalho foi validar o grau de envolvimento de dois destes genes candidatos (H3F3B e ASF1A) no processo de controle epigenético do cromossomo X. Para isto, foi realizado o silenciamento dos genes candidatos através da utilização de partículas lentivirais portando shRNAs específicos em fibroblastos primários femininos heterozigotos para uma mutação no gene HPRT e com desvio total de ICX, onde o único alelo normal do gene HPRT está no Xi. A reativação do Xi nestas células foi avaliada por cultivo das mesmas em meio HAT, que seleciona células HPRT+. Só sobreviveram os fibroblastos que foram silenciados para o gene H3F3B. Nestes, as células transduzidas com o shH3F3B.2 expressam o alelo selvagem do gene, presente no Xi, além do gene mutante. Ensaios de RNA-FISH e trimetilação de histonas foram feitos nessas células para avaliar a perda das marcas de cromatina inativa. Foi observada uma perda da nuvem de XIST nas células transduzidas com o shH3F3B.2 e selecionadas em HAT em passagens altas. Por último, análises de expressão alelo-específica de genes ligados ao X comprovaram que dois genes que são submetidos à ICX apresentaram expressão do alelo inativado (FLNA e FHL1). Porém, também foi observada uma mudança no padrão de expressão alelo-específica em genes autossômicos. Finalmente, as análises de expressão geral do cromossomo X mostraram que as células transduzidas com o shH3F3B.2 e selecionada em HAT tinham uma expressão gênica aumentada em relação ao controle. Em conclusão, nossos resultados sugerem uma descondensação da cromatina no cromossomo Xi e portanto um provável envolvimento do gene H3F3B na manutenção da ICX. / The X chromosome Inactivation (XCI) in females is an example of epigenetic regulation. Silencing of one of the X chromosomes leads to the stable formation of the facultative heterochromatin through the acquisition of multiple modifications in the chromatin that are maintained in the subsequent cell divisions. Currently, some epigenetic features associated with the maintenance of XCI have been described. Nonetheless, the mechanisms of action and the identity of the different factors involved in the maintenance of XCI are still unknown or poorly understood. Our laboratory performed a genomic functional screening by shRNA (short harpin RNAs) libraries to find genes involved in the maintenance of XCI in humans. From this study, we identified 20 new candidate genes to be involved in the maintenance of XCI. Thus, the objective of this work was to validate the degree of involvement of two of these candidate genes (H3F3B and ASF1A) in the epigenetic process control of the X chromosome. For this, the silencing of the candidate genes was performed in female heterozygous primary fibroblasts for a mutation of the HPRT gene and with a total XCI shift through the use of lentiviral particles carrying specific shRNAs, where the only normal allele of the HPRT gene is in the Xi (inactivated X). Xi reactivation was evaluated in these cells by culturing them in HAT medium, which selects HPRT + cells. Only the fibroblasts that were silenced for the H3F3B gene survived. Furthermore, the cells transduced with shH3F3B.2 express the HPRT wild gene allele, present in Xi, in addition to the mutant gene. RNA-FISH and histone trimethylation assays were performed on these cells to evaluate the loss of inactive chromatin marks. A loss of the XIST cloud was observed in cells transduced with shH3F3B.2 and selected in HAT at high passages. Finally, allele-specific expression analyzes of X-linked genes showed that two genes that undergo XCI showed expression of the inactivated allele (FLNA and FHL1). However, a change in allele-specific expression pattern was also observed in autosomal genes. Finally, the X chromosome general expression analyses showed that cells transduced with shH3F3B.2 and selected on HAT had increased gene expression relative to the control. In conclusion, our results suggest a decondensation of the chromatin in the Xi chromosome and therefore a probable involvement of the H3F3B gene in the maintenance of ICX.

Introdução: A maioria das doenças lisossômicas são herdadas como traços recessivos, mas a mucopolissacaridose tipo II (MPS II) é de herança ligada ao cromossomo X. As doenças ligadas ao cromossomo X possuem um importante impacto para as famílias devido ao risco que as heterozigotas apresentam em ter um filho afetado. A maioria das heterozigotas para as doenças ligadas ao cromossomo X são clinicamente assintomáticas. Em relação à MPS II somente dez mulheres afetadas foram relatadas na literatura. Entretanto, nenhum estudo foi realizado para a avaliação da presença de sinais sutis da doença nessas heterozigotas. Objetivo: o objetivo principal desse estudo foi a identificação de sinais clínicos sutis e bioquímicos relacionados à MPS II nas heterozigotas para essa doença e adicionalmente estabelecer a associação desses achados com o padrão de inativação do cromossomo X. Métodos: esse foi um estudo observacional e transversal. Essas mulheres foram classificadas como heterozigotas e não heterozigotas baseadas na análise molecular do gene da iduronato sulfatase (IDS). Ambos grupos foram comparados com relação às seguintes variáveis: dados clínicos, achados do exame físico, cariótipo, padrão de inativação do cromossomo X (ensaio HUMARA), atividades da IDS em leucócitos e plasma, níveis de glicosaminoglicanos na urina, tomografia computadorizada de abdomen e coluna e ressonância magnetica de crânio. Resultados: Quarenta mulheres pertencentes a 24 famílias foram avaliadas. De acordo com a análise do DNA 22 foram classificadas em heterozigotas e 18 em não heterozigotas. Não foi encontrada nenhuma anormalidade no exame físico (n=40), cariótipo (n=31/40) ou na TC de coluna (n=31/40). A incidência de abortamento também não apresentou diferenças entre essas mulheres. Entretanto, a atividade da IDS em plasma (p<0,001) e em leucócitos (p<0,001) apresentaram níveis inferiores nas heterozigotas. A correção de Bonferroni foi aplicada e não foi encontrada nenhuma diferença entre os grupos dentre as variáveis analisadas. Também em relação ao padrão de inativação do cromossomo X não foi observada diferença esntre as heterozigotas e não heterozigotas. Conclusões: Esse é o primeiro estudo sistemático realizado em heterozigotas para MPS II. Não foi encontrada nenhuma evidência de manifestações clínicas sutis ou sinais radiológicos da doença MPS II nessas mulheres. Nossos achados sugerem que não existe relação entre a ausência dos sinais clínicos nessas mulheres e a ocorrência de um padrão favorável de desvio da inativação do cromossomo X. Esses dados sugerem que a MPS II apresenta uma baixa penetrância nas heterozigotas. / Introduction: Most lysosomal diseases are inherited as recessive traits, but muchopolysaccharidosis type II (MPS II) presents X-linked inheritance. The X-linked disorders have an important impact for families because the risk heterozygous present of having an affected child. Most heterozygotes for X-linked disorders are clinically asymptomatic. Regarding MPS II only ten affected females have been reported in the literature. However, none study has been taken in order to evaluate subtle signs of the disease in heterozygotes. Objective: The main objective of this study was to identify subtle clinical and biochemical signs of MPS II in heterozygotes for this disease, and to correlate the findings with the pattern of X chromosome inactivation presented by these women. Methods: This was an observational, transversal and controlled study. The women were classified as heterozygote or non-heterozygote based on molecular analysis of the iduronate sulfatase (IDS) gene. Both groups were compared between regarding clinical data, physical exam findings, karyotype, pattern of X inactivation (HUMARA assay), IDS activity in leukocytes and plasma, glycosaminoglicans levels in urine, computadorized tomography scans of abdomen and spine, and brain magnetic resonance imaging. Results: Forty women from 24 families were evaluated. According to DNA analysis, 22 women were classified as heterozygote and 18 as non-heterozygotes. We did not found any abnormality in physical examination (n=40), karyotype (n=31/40) or spine CT scans (n=31/40). The incidence of miscarriage also did not differ between these females. However, IDS activities in plasma (p<0.001) and in leukocyte (p<0.001) were lower in heterozygotes. Applying the Bonferroni’s correction, we did not find any difference between the groups regarding the variables analyzed. Also the pattern of X chromosome inactivation was not different between heterozygotes and non-heterozygotes. Conclusion: This is the first systematic study performed in heterozygotes for MPS II. We did not find any evidence of subtle clinical manifestations or radiological signs of MPS II disease in these females. Our findings suggest that there is no relation between the absence of clinical signs in these women and the occurrence of a favorable skewing pattern of X chromosome inactivation. This data suggests that MPS II is a disease which shows low penetrance in heterozygotes.

Introdução: A maioria das doenças lisossômicas são herdadas como traços recessivos, mas a mucopolissacaridose tipo II (MPS II) é de herança ligada ao cromossomo X. As doenças ligadas ao cromossomo X possuem um importante impacto para as famílias devido ao risco que as heterozigotas apresentam em ter um filho afetado. A maioria das heterozigotas para as doenças ligadas ao cromossomo X são clinicamente assintomáticas. Em relação à MPS II somente dez mulheres afetadas foram relatadas na literatura. Entretanto, nenhum estudo foi realizado para a avaliação da presença de sinais sutis da doença nessas heterozigotas. Objetivo: o objetivo principal desse estudo foi a identificação de sinais clínicos sutis e bioquímicos relacionados à MPS II nas heterozigotas para essa doença e adicionalmente estabelecer a associação desses achados com o padrão de inativação do cromossomo X. Métodos: esse foi um estudo observacional e transversal. Essas mulheres foram classificadas como heterozigotas e não heterozigotas baseadas na análise molecular do gene da iduronato sulfatase (IDS). Ambos grupos foram comparados com relação às seguintes variáveis: dados clínicos, achados do exame físico, cariótipo, padrão de inativação do cromossomo X (ensaio HUMARA), atividades da IDS em leucócitos e plasma, níveis de glicosaminoglicanos na urina, tomografia computadorizada de abdomen e coluna e ressonância magnetica de crânio. Resultados: Quarenta mulheres pertencentes a 24 famílias foram avaliadas. De acordo com a análise do DNA 22 foram classificadas em heterozigotas e 18 em não heterozigotas. Não foi encontrada nenhuma anormalidade no exame físico (n=40), cariótipo (n=31/40) ou na TC de coluna (n=31/40). A incidência de abortamento também não apresentou diferenças entre essas mulheres. Entretanto, a atividade da IDS em plasma (p<0,001) e em leucócitos (p<0,001) apresentaram níveis inferiores nas heterozigotas. A correção de Bonferroni foi aplicada e não foi encontrada nenhuma diferença entre os grupos dentre as variáveis analisadas. Também em relação ao padrão de inativação do cromossomo X não foi observada diferença esntre as heterozigotas e não heterozigotas. Conclusões: Esse é o primeiro estudo sistemático realizado em heterozigotas para MPS II. Não foi encontrada nenhuma evidência de manifestações clínicas sutis ou sinais radiológicos da doença MPS II nessas mulheres. Nossos achados sugerem que não existe relação entre a ausência dos sinais clínicos nessas mulheres e a ocorrência de um padrão favorável de desvio da inativação do cromossomo X. Esses dados sugerem que a MPS II apresenta uma baixa penetrância nas heterozigotas. / Introduction: Most lysosomal diseases are inherited as recessive traits, but muchopolysaccharidosis type II (MPS II) presents X-linked inheritance. The X-linked disorders have an important impact for families because the risk heterozygous present of having an affected child. Most heterozygotes for X-linked disorders are clinically asymptomatic. Regarding MPS II only ten affected females have been reported in the literature. However, none study has been taken in order to evaluate subtle signs of the disease in heterozygotes. Objective: The main objective of this study was to identify subtle clinical and biochemical signs of MPS II in heterozygotes for this disease, and to correlate the findings with the pattern of X chromosome inactivation presented by these women. Methods: This was an observational, transversal and controlled study. The women were classified as heterozygote or non-heterozygote based on molecular analysis of the iduronate sulfatase (IDS) gene. Both groups were compared between regarding clinical data, physical exam findings, karyotype, pattern of X inactivation (HUMARA assay), IDS activity in leukocytes and plasma, glycosaminoglicans levels in urine, computadorized tomography scans of abdomen and spine, and brain magnetic resonance imaging. Results: Forty women from 24 families were evaluated. According to DNA analysis, 22 women were classified as heterozygote and 18 as non-heterozygotes. We did not found any abnormality in physical examination (n=40), karyotype (n=31/40) or spine CT scans (n=31/40). The incidence of miscarriage also did not differ between these females. However, IDS activities in plasma (p<0.001) and in leukocyte (p<0.001) were lower in heterozygotes. Applying the Bonferroni’s correction, we did not find any difference between the groups regarding the variables analyzed. Also the pattern of X chromosome inactivation was not different between heterozygotes and non-heterozygotes. Conclusion: This is the first systematic study performed in heterozygotes for MPS II. We did not find any evidence of subtle clinical manifestations or radiological signs of MPS II disease in these females. Our findings suggest that there is no relation between the absence of clinical signs in these women and the occurrence of a favorable skewing pattern of X chromosome inactivation. This data suggests that MPS II is a disease which shows low penetrance in heterozygotes.