Orientador: Heloisa Amelia de Lima Castro / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba / Made available in DSpace on 2018-07-27T21:01:20Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Oliveira_RogerioNogueirade_D.pdf: 3569902 bytes, checksum: 17185a17d4b8451b3874e92c0c333634 (MD5) Previous issue date: 2001 / Resumo: A identificação humana pode ser realizada por meio dos mais variados procedimentos técnicos, principalmente pela análise comparativa dos documentos do prontuário odontológico. Atualmente, as técnicas de biologia molecular têm se apresentado como o recurso comparativo mais eficaz, contudo parcela significativa desses métodos requer, além do estabelecimento prévio de parâmetros de coleta de material biológico, a verificação da freqüência alélica da população na qual será aplicada. Assim, o presente estudo procurou evidenciar a freqüência dos alelos em 3 lócus de STR do cromossomo Y (DYS390, DYS391 e DYS393) numa população de indivíduos brasileiros leucodérmicos. Para tanto, foram padronizados protocolos de coleta e armazenamento de diferentes materiais biológicos, e estabelecidas rotinas de extração e amplificação do DNA. Os resultados apresentaram o lócus DYS390 com freqüência nos alei os 21, 22, 23, 24, 25 e 26, sendo o alelo 24 o que apresentou maior freqüência desse lócus, com 46%; o STR DYS391 com presença nos alelos 8,9, 10, 11 12 e 13, tendo o alelo 11 incidência de 37% desse STR; e o STR DYS393 nos alelos 11, 12, 13 14 e 15, tendo o alelo 13 apresentado freqüência de 45% desse lócus. Esses dados, comparados àqueles de outras populações, demonstraram haver individualidade no perfil alélico da população estudada, comprovando que, mais do que aplicar as metodologias disponíveis, é prudente que se verifiquem os padrões dos alelos na população alvo, pois a utilização de padrões alélicos de populações diversas da nossa pode levar a imprecisões nos diagnósticos de identificação humana / Abstract: Human identification can be accomplished by several technical procedures, especially by the comparative analysis of dental documents. Nowadays, molecular biology introduced more effective resources for the human identification. However, these methods demand the previous definition of parameters to the collection of biological material, and the verification of the allele frequency of the population in which they will be applied. Aiming to subsidize these methods, we observed the frequency of the alleles in three loci of STRs of the Y chromosome (DYS390, DYS391 and DYS393) in a group of Brazilian white subjects. We also standardized protocols for the collection and storage of different biological materiais, besides defining routines for the extraction and amplification of the DNA. Results presented alleles 21, 22, 23, 24, 25 and 26 in the locus DYS390, being the allele 24 the most frequent with 46%. STR DYS391 presented alleles 8, 9, 10, 11 12 and 13, and the allele 11, with 37%, was the most frequent. STR DYS393 presented alleles 11, 12, 1314 and 15, and the allele 13, with 45%, was the mostfrequent. The comparative analysis of these data, with information related to other populations, stresses the singularity of the allele profile of the studied population. Therefore, prior to the introduction of recent methods of molecular biology to the human identification, we should carefully verify allele patterns of the population, because the use of allele standards of other populations could produce imprecision in human identification processes / Doutorado / Doutor em Odontologia Legal e Deontologia

Este trabalho tem como objetivo a determinação da freqüência alélica de 12 microssatélites do cromossomo Y na população de Araraquara e da Grande São Paulo, tendo em vista a necessidade de ampliação dos dados referentes a estes marcadores devido a sua crescente aplicação em diferentes áreas, entre elas a forense na qual a utilização destes microssatélites torna-se muitas vezes a única ferramenta disponível para resolução de casos. Para isto foram tipados 200 indivíduos, que não apresentavam relação de parentesco, divididos em quatro grupos de acordo com autoclassificação de cor (branco, preto, pardo ou oriental). Foram coletadas destes indivíduos amostras de sangue ou saliva a partir das quais foi feita extração do DNA utilizando diferentes protocolos de acordo com o tipo de amostra, seguida da amplificação dos 12 locos do cromossomo Y através do PowerPlex® Y System (Promega) de acordo com instruções do fabricante. Os produtos da amplificação foram submetidos a eletroforese em gel de poliacrilamida desnaturante a 6%, no seqüenciador ABI377 (Applied Biosystems) para obtenção dos perfis de cada loco. Os quais foram analisados com a utilização do software GeneScan ver. 2.1 (Applied Biosystems). Foi realizado o cálculo das freqüências alélicas e diversidade gênica de cada loco, assim como da diversidade haplotípica e capacidade de discriminação para cada grupo e para a amostra total. A comparação entre os resultados obtidos demonstrou que a variação dentro de cada grupo é maior que a variação entre os grupos. Os resultados obtidos foram enviados ao banco de dados mundial do cromossomo Y (Y-STR Haplotype Reference Database). / The aim of this study is to determine the allelic frequency of 12 microsatellites of the Y chromosome in Grande São Paulo and Araraquara population, in face of the amplification necessity of these markers data due to the increasing application of these markers on different fields, including the forensic on which the use of them is sometimes the only way to solve crime cases. For this purpose it was typed 200 unrelated individuals divided according to self report in four groups based on color skin (white, black, mulatto or yellow). Blood or buccal swab samples were collected and submitted to DNA extraction with different protocols according to the kind of sample. Subsequent amplification of 12 Y-STR was proceeded using the PowerPlex® Y System (Promega) following the manufacture’s protocol. The amplification products were submitted to electrophoresis in 6% polyacrilamid gel on ABI377 sequencer (Applied Biosystems) to obtain the profile of each locus. The results were analyzed with GeneScan ver. 2.1 software (Applied Biosystems). The allelic frequency and gene diversity of each locus as well as the haplotypic diversity and discrimination capacity was calculated for each group and for total sample. The comparison among the results showed that the variation inside the groups is higher than between groups. The haplotypes observed on this sample were sent to Y-STR Haplotype Reference Database.

Orientadores: Andréa Trevas Maciel Guerra, Maricilda Palandi de Mello / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-23T00:38:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Santos_AnaPaulados_M.pdf: 2717833 bytes, checksum: 8a3a2ff5cccd42ca60c0bc51ba3b0067 (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: As disgenesias gonadais parcial (DGP) e mista (DGM) caracterizam-se por ambiguidade genital e presença de gônada disgenética associada a testículo disgenético ou dois testículos disgenéticos. Na DGP o cariótipo é 46,XY; na DGM, há mosaico 45,X/46,XY ou suas variantes (mais de duas linhagens e (ou) anomalias estruturais do cromossomo Y). Esses mosaicos podem determinar, ainda, fenótipo feminino com síndrome de Turner (ST), distúrbio da diferenciação do sexo ovotesticular (DDS OT) e esterilidade em homens com genitais normais. Independentemente do fenótipo gonadal e genital, esses indivíduos apresentam outros sinais clínicos decorrentes da linhagem 45,X, como baixa estatura, dismorfismos, anomalias cardíacas e renais e diversas afecções adquiridas. Nos últimos anos surgiram evidências de ligação entre microdeleções do Y e o mosaicismo com linhagem 45,X. Há, ainda, indicações de que a instabilidade cromossômica trazida por essas deleções possa ser mais pronunciada nas gônadas. O objetivo deste trabalho foi investigar a presença de microdeleções do Y em indivíduos com DGP e naqueles com mosaico 45,X/46,XY ou suas variantes e diferentes fenótipos. A casuística constou de 15 indivíduos com DGP e 15 com mosaicismo, dos quais a maioria apresentava DGM (11 casos). Foram analisados 38 sequence tagged sites (STS) cobrindo a região específica masculina (MSY, male specific region) em Yp, centrômero e Yq por meio da técnica de reação em cadeia da polimerase (PCR) multiplex e individual. Todos os STS investigados nos indivíduos com DGP tiveram amplificação positiva, porém havia STS de Yq ausentes em seis indivíduos com mosaicismo e DGM, dos quais dois sem alterações estruturais de Y evidentes ao cariótipo. Essas deleções se localizavam em regiões contendo genes relacionados à espermatogênese (AZFb e AZFc - azoospermia factor). A ausência de deleções nos indivíduos com DGP não confirma a hipótese de que a instabilidade desse cromossomo nas gônadas seja uma das causas dessa afecção. Por outro lado, as deleções encontradas no segundo grupo indicam, em alguns casos, associação entre alterações estruturais do Y detectáveis somente a nível molecular e o surgimento de mosaicismo. Caso sejam criados no sexo masculino e busquem procedimentos de fertilização in vitro, há risco de que esses indivíduos transmitam cromossomos Y instáveis na divisão celular / Abstract: Partial and mixed gonadal dysgenesis (PGD and MGD) are characterized by genital ambiguity and the finding of either a streak gonad and a dysgenetic testis or two dysgenetic testes. In PGD there is a 46,XY karyotype, whereas in MGD there is a 45,X/46,XY mosaic or its variants (more than two lineages and/or structural abnormalities of the Y chromosome). These mosaics are also compatible with a female phenotype and Turner syndrome, ovotesticular disorder of sex development, and infertility in men with normal external genitalia. Regardless of the gonadal and genital phenotypes, these individuals present other clinical features associated with the 45,X cell line, including short stature, dysmorphisms, cardiovascular and renal anomalies and various acquired diseases. During the last few years, evidences of a link between Y microdeletions and 45,X mosaicism have been reported. There are also indications that the instability caused by such deletions might be more significant in germ cells. The aim of this work was to investigate the presence of Y chromosome microdeletions in individuals with PGD and in those with 45,X/46,XY mosaicism or its variants and variable phenotypes. Our sample comprised 15 individuals with PGD and 15 with mosaicism, most of them with a MGD phenotype (n=11). Thirty-eight sequence tagged sites (STS) spanning the male specific region (MSY) on the Y chromosome (Yp, centromere and Yq) where analyzed by multiplex PCR and some individual reactions. All STS showed positive amplifications in the PGD group. Conversely, in the group with mosaicism, six individuals with MGD had been identified with Yq microdeletions, two of them did not have structural abnormalities of the Y chromosome recognized by routine cytogenetic analysis. The deleted STSs were located within AZFb and AZFc (Azoospermia Factor) regions, which harbor several genes responsible for spermatogenesis. Absence of deletions in individuals with PGD does not confirm the hypothesis that instability of the Y chromosome in the gonads could be one of the causes of such condition. However, deletions identified in the second group indicate that mosaicism may be associated with Y chromosome abnormalities detectable only at the molecular level. If patients with mosaicism and Y microdeletions reared as males decide to undergo in vitro fertilization, Y chromosomes which tend to be unstable during cell division may be transmitted to offspring / Mestrado / Ciencias Biomedicas / Mestra em Ciências Médicas

Made available in DSpace on 2014-06-12T18:05:00Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo6210_1.pdf: 2287524 bytes, checksum: dfca247db39ee408bfaa63d470e22ddd (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2007 / Neste trabalho foi feita a análise dos polimorfismos de 15 microssatélites do cromossomo Y (haplótipo mínimo mais locos DYS447, DYS458, DYS464) em uma amostra da população de Pernambuco, constituída por 247 indivíduos não aparentados e um banco de dados construídos apartir de haplótipos das diversas populações que historicamente participaram na composição étnica da população deste Estado. A abordagem estatística foi feita com base nas freqüências haplotípicas assumindo o modelo de mutação passo a passo (Stepwise Mutation Model - SMM). Foi possível estabelecer um modelo que se mostrou útil na determinação da contribuição genética das três principais etnias formadoras da população de Pernambuco, e também inferir o haplogrupo ao qual cada haplótipo pertence. Foi desenvolvido um método de trabalho para estabelecer relações entre as freqüências alélicas dos haplótipos e os haplogrupos com o propósito de verificar a provável origem étnica de cada indivíduo. Também possibilitou quantificar e inferir os haplogrupos a partir de haplótipos modais de referência, levando em conta as taxas de mutação por loco como fator de ponderação do prognóstico. Para isto, foi gerado um banco de dados que incorporou as informações e foram desenvolvidos algoritmos para os cálculos e interfaces de manipulação dos dados. Foram observados 247 indivíduos diferentes e identificados 183 haplótipos mínimos distintos (153 únicos). Foram estimados uma diversidade haplotípica igual a 0,9951 e um poderde diferenciação igual a 0,7409. O haplótipo mínimo mais comum ocorreu 15 vezes. Este haplótipo apresentou em Pernambuco uma freqüência superior àquelas encontradas na Europa, Portugal e das outras regiões do Brasil. O haplótipo da população africana apresentou em Pernambuco, uma freqüência maior do que o haplótipo ameríndio. O método de prognóstico se mostrou eficiente e compatível com os existentes na literatura. Como conseqüência, foi possível quantificar a contribuição de cada etnia masculina para a composição populacional de Pernambuco. A construção filogenética de árvores utilizando o algoritmo Median-Joining, ponderadas pelas taxas de mutação das pequenas repetições em tandem (STR), se mostrou bastante similar àquelas feitas utilizando as variâncias das frequencias alélicas dos locos e apresentou coerência na distribuição dos haplótipos, de acordo com os haplogrupos prognosticados

Resumo O Vale do Ribeira é uma área que ocupa cerca de 10% da região sul do estado de São Paulo e abriga pelo menos 25 comunidades remanescentes de quilombos. Dessas, 13 já foram oficialmente reconhecidas ou estão em fase de reconhecimento. Com o objetivo de contribuir para o conhecimento da estrutura populacional e da história da formação desses remanescentes de quilombos, estudamos os indivíduos do sexo masculino de seis comunidades: Abobral Margem Esquerda (48), Galvão (22), São Pedro (22), Pedro Cubas (60), Pilões (15) e Maria Rosa (9), além de uma amostra de 81 homens da cidade de São Paulo, em relação a quatro locos polimórficos do cromossomo Y: dois microssatélites (DYS19 e DYS390), um SNP (DYS199) e uma inserção de Alu (DYS287). Os genótipos foram identificados por meio da amplificação do DNA pela reação em cadeia da polimerase (PCR), seguida de eletroforese em gel de poliacrilamida. Um quinto marcador foi estudado, um SNP (M168), apenas em alguns indivíduos selecionados. Nesse caso os genótipos foram identificados por seqüenciamento direto do DNA. As freqüências alélicas no DYS19 e DYS390 indicaram que nas populações por nós estudadas há uma importante contribuição patrilinear portuguesa. O SNP DYS199, por possuir um alelo-específico de ameríndios, o alelo T, indicou uma baixa contribuição patrilinear ameríndia entre as comunidades de quilombo. Essa contribuição foi detectada somente na população de Pedro Cubas. A inserção de Alu YAP (DYS287), por ser muito freqüente entre africanos, é um bom indicador de contribuição paterna africana. No entanto, nem todos os africanos a possuem. Por essa razão o marcador M168 veio completar a informação em relação à origem africana do cromossomo Y. Esses marcadores moleculares indicaram uma contribuição masculina provavelmente africana nos quilombos, em freqüências que variaram de 11 a 55%. Somente em Pedro Cubas, a freqüência de cromossomos Y de origem africana superou a freqüência de cromossomos Y de origem européia. Em Abobral, a freqüência de cromossomo Y provavelmente africano chegou a aproximadamente 40%, revelando serem essas duas populações as mais africanas do ponto de vista do cromossomo Y. O total das populações de quilombo apresentou índice de diversidade genética haplotípica equivalente ao da amostra de São Paulo, provavelmente devido à diversidade das populações africanas que as constituíram ou à mistura com populações de outros grupos étnicos. Entre as comunidades de quilombo, Galvão foi a que apresentou menor índice de diversidade, indicando que nessa comunidade o efeito do fundador foi o mais notável. O haplótipo mais freqüentemente observado em Galvão tem provável origem européia. Quando observamos o dendrograma que reúne as populações quilombolas, a população de São Paulo e outras populações da literatura, os quilombos de Galvão, São Pedro e Abobral mostraram-se mais próximos das populações africanas do que das demais populações da literatura. Dentre os remanescentes de quilombos, Pedro Cubas é a única com afinidade com os ameríndios. Pilões e Maria Rosa ficaram mais próximas de São Paulo, bem como de brasileiros brancos e portugueses, indicando maior contribuição européia. / Abstract At least 25 quilombos remnants are supposed to exist in the Vale do Ribeira region, located in the southern part of São Paulo State. Thirteen of those quilombo remnants have already been identified and officially recognized. In order to understand the structure and history of the foundation of these quilombo remnants, we studied male individuals belonging to six populations: Abobral Left Margin (48 individuals), Galvão (22), São Pedro (22), Pedro Cubas (60), Pilões (15) and Maria Rosa (9), in addition to 81 individuals sampled from the city of São Paulo, for four Y chromosome polymorphic loci: two microsatellite loci (DYS19 and DYS390), one SNP (DYS199) and one Alu insertion (YAP). The genotypes were identified by DNA amplification by polymerase chain reaction (PCR) followed by acrylamide gel electrophoresis. A fifth locus was also analysed, by a different SNP (M168), but only in a few individuals. In this analysis DNA direct sequencing was employed. The allelic frequencies in the locus DYS19 indicated significant male Portuguese contribution in the quilombos. The Amerindian specific allele (T) of the DYS199 locus indicated little or no contribution from Amerindian males, except the population of Pedro Cubas. The Alu insertion (YAP or DYS287), frequent in Africans, is a good indicator of African ancestry, although not all Africans show it. Thus, the analysis of the M168 locus helped to determine the origin of Y chromosomes. These markers indicated a range from 11 to 55% of probable African contribution in the quilombos. Only in Pedro Cubas the frequency of African Y chromosomes was higher than the one European Y chromosomes. In Abobral, the frequency of African Y chromosomes was approximately 40%, being the most African of the quilombo populations, when Y chromosomes are considered. The total haplotype diversity in the quilombos was similar to the one observed for the sample from São Paulo, probably due to the diversity of African populatons that originated the quilombos, or the admixture with other ethnic groups. Galvão showed the lowest diversity, indicating that this population was the most influenced by founder effects. In the neighbor-joining tree built with allelic frequencies obtained in the quilombos, São Paulo and other populations previously reported, the quilombos of Galvão, São Pedro and Abobral were closer to the African populations and Pedro Cubas is the only one close to Amerindians. Pilões and Maria Rosa were closer to São Paulo, white Brazilians and Portuguese populations, indicating European contribution.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Marcadores genéticos presentes no cromossomo Y, como os microssatélites (Y-STRs) e polimorfismos de único nucleotídeo (Y-SNPs) são utilizados na caracterização de linhagens masculinas, visto que são transmitidos às gerações seguintes sem alterações, a menos que ocorram mutações (Singh et al., 2011; Mitchell & Hammer, 1996; Butler, 2009). Por isso, esses marcadores são amplamente empregados em diversas situações, destacando-se o uso constante dos Y-STRs na genética forense por apresentarem alta capacidade de discriminar linhagens. Recentemente, foram descritos 13 marcadores com taxas de mutação substancialmente superiores àquelas verificadas para loci STR do cromossomo Y, denominados Rapidly Mutating (RM) Y-STRs (Ballantyne et al., 2010; Kayser et al., 2012). Devido às taxas de mutação elevadas, os RM-YSTRs apresentam maior eficiência na discriminação entre indivíduos proximamente relacionados, pertencentes à mesma linhagem patrilínea. O presente trabalho buscou aprofundar o conhecimento acerca das características populacionais e mutacionais dos loci RM-YSTRs em amostra do Rio de Janeiro, contribuindo com estudos desta natureza na população brasileira. Realizou-se a análise de 13 loci do cromossomo Y em 258 indivíduos do sexo masculino, compondo 129 pares de pais e filhos, nascidos no estado do Rio de Janeiro. O DNA das amostras foi extraído, conforme os protocolos vigentes na rotina do LDD-UERJ. As sequências genéticas de interesse foram amplificadas pela técnica de reação em cadeira da polimerase (PCR) através da realização de três PCR multiplex, cujos produtos de amplificação foram separados por eletroforese em sequenciador automático ABI-3500 (Applied Biosystems). Para os pares pai/filho que apresentaram haplótipos mutados, empregou-se a técnica de sequenciamento para confirmação das mutações. Os loci RM-YSTR geraram um poder de discriminação de 1,0 na amostra analisada, o que significa que todos os 129 indivíduos da amostra populacional apresentaram haplótipos diferentes para tais marcadores, com frequências de 0,0077 e diversidade haplotípica igual a 1. Além disso, foram obtidos valores elevados de diversidade gênica para os 13 marcadores. A análise de distância genética e os resultados de AMOVA baseados nos valores de Fst demonstraram que os RM-YSTR não indicam subdivisão populacional e traços ancestrais comuns. Tais valores estão associados às elevadas taxas de mutação encontradas, cuja média foi de 2,11 x 10-2. Foi possível observar que os loci RM-YSTR são muito discriminativos na amostra miscigenada analisada, além de terem maior capacidade de diferenciar indivíduos do que outros conjuntos de marcadores normalmente usados em estudos populacionais e análises forenses. Sendo assim, é possível concluir que os marcadores RM-YSTR são promissores para discriminar indivíduos da mesma linhagem patrilínea, visto que devido às suas elevadas taxas mutacionais e poder de discriminação, são capazes de diferenciar indivíduos de maneira mais eficiente do que os outros conjuntos de STR. Porém, é necessário maior número de estudos para melhor caracterização destes loci em diferentes populações. / Genetic markers on Y chromosome, as microsatellites (Y-STRs) and single nucleotide polymorphisms (Y-SNPs) are used for the characterization of male lineages, since they are fully transmitted to next generations unless mutations occurs (Singh et al., 2011; Mitchell & Hammer, 1996; Butler, 2009). Therefore, these markers are widely applied in several situations, highlighting the constant use of Y-STRs in the field of forensic genetics because of their high capacity of discriminate lineages. Recently, 13 rapidly mutating markers were described due to their highly mutation rates in comparison to other common Y-chromosome STRs, being called as Rapidly Mutating Y-STR (RM-YSTR) (Ballantyne et al., 2010; Kayser et al., 2012). As a result of their high mutation rates, RM-YSTRs display high efficiency in discriminating paternally related males. The present work aimed to deepen the knowledge about population and mutational RM-YSTR loci characteristics in Rio de Janeiro sample, and then, contribute to other studies with this purpose in Brazilian population. Y chromosome 13 STRs analysis was realized in 258 males born in Rio de Janeiro state, grouped in 129 fathers/sons pairs. The extraction of DNA from biological samples was performed according to routine protocols from LDD-UERJ. Target sequences were amplified by three polimerase chain reactions (PCR) and the amplicons were separated through electrophoresis on automated sequencer ABI-3500 (Applied Biosystems). When mutations were detected, they were confirmed by sequencing. Among the investigated sample, RM-YSTR loci showed a discrimination capacity of 1,0 which means that all 129 analyzed individuals have different haplotypes for these markers, displaying frequencies of 0,0077 and haplotype diversity of 1,0. Moreover, high values of genetic diversities were obtained for the 13 markers. Distance genetic analysis and AMOVA values based on Fst results did not show population substructure and common ancestral traits. These results are associated with high mutation rates found, with an average rate about 2,11 x 10-2. RM-YSTR showed to be very discriminative at this mixed sample, besides proving to be more discriminative than other markers commonly used in population studies and forensic analysis. Thus, it is possible to conclude that RM-YSTR markers are promising to discriminate individuals of the same male strain and due to their high mutation rates and discrimination capacity, they are able to differentiate individuals better than other common markers. Nevertheless, for a better characterization of these loci in different populations more studies are needed.

Submitted by admin tede (tede@pucgoias.edu.br) on 2017-11-10T16:06:34Z No. of bitstreams: 1 KELLER GABRIEL MARTINS.pdf: 1151760 bytes, checksum: 3a640f73b5ee5ea85d89f69f6ccd9aa9 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-11-10T16:06:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 KELLER GABRIEL MARTINS.pdf: 1151760 bytes, checksum: 3a640f73b5ee5ea85d89f69f6ccd9aa9 (MD5) Previous issue date: 2017-08-04 / The determination of fetal sex using maternal plasma is a noninvasive prenatal diagnostic test (NIPDT), offered to pregnant women, especially those with an increased risk of having children with conditions X-linked inheritance. Because it is a non-invasive technique, it presents a greater advantage over other methods of invasive prenatal diagnosis such as amniocentesis, cordocentesis and biopsy of chorionic villi. The use of cell free fetal DNA (cffDNA) in maternal plasma has become a promising alternative for the diagnosis of noninvasive and early sex determination. The porpuse this study is to conduct a qualitative test in pregnant women with gestational age ranging from 6 to 20 weeks using the noninvasive prenatal test for the early sex determination of fetal by the real time PCR technique. Twenty-one healthy pregnant women, over 18 years of age, single gestation and attended at the Gynecology and Obstetrics Clinic of the Unigen Laboratory belonging to the Private Health Care Network of the City of Goiânia-GO were selected. After venous blood collection, plasma was separated and frozen (-20 ° C). The material to be analyzed followed the laboratory of the company Qiagen® located in São Paulo, SP, where DNA extraction and purification were performed using fully automated equipment (QIAcube®, with the QIAamp® DNA Micro kit, using the protocol "Purification of viral nucleic acids from large body-fluid samples", according to the manufacturer's specifications), and then the quantitative PCR technique (Rotor-Gene® Qiagen) was run for specific Y-sequence amplification. Of the 21 pregnant women selected, two participants aborted and were excluded from the study. The results showed that, in the 19 cases analyzed, comparing the results of qPCR with fetal sex determined by ultrasonography (USG), 7/19 (36.8%) pregnancies with positive results for the Y chromosome (determining the male sex) and 11/19 (57.9%) pregnancies with a negative result for the Y chromosome (determining the female sex) and only one gestation (5.3%) presented false-negative results for males. The analysis of the concordance index, between the results of the qPCR and the USG, found a concordance of 0.89. These results confirmed a good sensitivity and specificity of the method for the gestation period studied (mean of 12 weeks), indicating that this procedure should be used in the medical routine as an auxiliary tool in cases where fetal sexing becomes necessary for health fetal and/or decreased parents anxiety. / A determinação do sexo fetal utilizando o plasma materno é um teste de diagnóstico pré-natal não invasivo (DPIN), oferecido as gestantes, principalmente para aquelas com risco aumentado de terem crianças com doenças ligadas ao sexo. Por se tratar de uma técnica não invasiva, apresenta-se com maior vantagem sobre outros métodos de diagnóstico pré-natal invasivos como a amniocentese, cordocentese e a biópsia de vilosidades coriônicas. O diagnóstico pré-natal (DPN) tem sido importante no acompanhamento de gestações com anormalidades fetais, além de permitir um planejamento mais adequado para o parto e de cuidados neonatais específicos. Dessa forma, o DPN tem sido estabelecido na prática obstétrica moderna e integra um conjunto de procedimentos para identificar uma anormalidade no feto durante a gravidez. Diversas pesquisas têm buscado a utilização de novas tecnologias para o diagnóstico pré-natal não invasivo (DPNI). O uso de DNA fetal livre (cffDNA) no plasma materno passou a ser uma alternativa promissora para diagnóstico do sexo não invasivo e precoce. O objetivo do presente trabalho é realizar um estudo qualitativo em pacientes gestantes, com idade gestacional variando de 6 a 20 semanas utilizando o teste pré-natal não invasivo para a determinação precoce do sexo fetal pela técnica de qPCR. Foram selecionadas 21 gestantes saudáveis, maiores de 18 anos e gestação única e atendidas em clínica de ginecologia e obstetrícia do Centro de Diagnóstico Clínico UNIGEN pertencente à Rede Privada de Atendimento à Saúde da Cidade de Goiânia-GO. Após a coleta de sangue venoso, houve a separação e o congelamento do plasma (-20°C). O material a ser analisado seguiu para o laboratório da empresa Qiagen® localizado em São Paulo-SP, onde foram realizadas a extração e purificação do DNA utilizando equipamento automatizado (QIAcube®, com o kit QIAamp® DNA Micro, empregando-se o protocolo “Purification of viral nucleic acids from large body-fluid samples”, conforme especificações do fabricante), e em seguida foi ralizada a técnica de PCR quantitativa (Rotor-Gene® Qiagen) para amplificação de sequência Y específica. Das 21 gestantes selecionadas, duas participantes abortaram, sendo dessa forma excluídas do estudo. Os resultados revelaram que dos 19 casos analisados, ao comparar os resultados da qPCR com o sexo fetal determinado pela ultrassonografia (USG), 7/19 (36,8%) gestações com resultados positivos para o cromossomo Y (determinando o sexo Masculino) e 11/19 (57,9%) gestações com resultado negativo para o cromossomo Y (determinando o sexo Feminino) e apenas uma gestação (5,3%) apresentou resultado falso-negativo para o sexo masculino. A análise do índice de concordância, entre os resultados da qPCR com a USG foi de 0,89. Esses resultados confirmaram uma boa sensibilidade e especificidade do método para o período de gestação estudado (média de 12 semanas), indicando que este procedimento deve ser utilizado na rotina médica como ferramenta auxiliar nos casos onde a sexagem fetal torna-se necessária para tratamento fetal e/ou diminuição da ansiedade dos pais.

A infertilidade é um problema de saúde pública com um significativo impacto social, econômico e psicológico. Em todo o mundo, a incidência da infertilidade entre a população geral é estimada em 10-15%. Cerca de 50% da infertilidade dos casais são de origem masculina. Em mais da metade dos homens inférteis, a causa da infertilidade é desconhecida (idiopática). Etiologicamente, a infertilidade masculina apresenta causas genéticas e não genéticas. Dentre as causas genéticas mais conhecidas temos mutação do receptor de andrógenos, mutação do gene regulador da condutibilidade transmembrana da fibrose cística (CFTR), anomalias cromossômicas clássicas, anomalias meióticas, microdeleções do cromossomo Y, etc. As anomalias cromossômicas são encontradas com muito mais frequência em homens inférteis, com uma incidência de 4-16% em relação à incidência de 0,4% na população fértil. Estudos mostram que as CNVs também podem estar relacionadas com a infertilidade masculina, especificamente com a falha na espermatogênese. CNVs encontradas tanto no cromossomo Y quanto nos cromossomos autossômicos também foram associadas a possíveis falhas na espermatogênese. Um outro fator que também pode estar envolvido com a infertilidade masculina é a expressão desregulada dos miRNAs. O presente trabalho teve como objetivo promover a análise em larga escala da distribuição de CNVs e do perfil transcricional dos miRNAs em amostras de biopsias testiculares de paciente com azoospermia. Para o estudo das CNVs nós utilizamos a metodologia do CytoScan HDTM da Affymetrix. O perfil transcricional de miRNAs nos indivíduos estudados foi avaliado por meio da tecnologia de microarranjos também da plataforma Affymetrix. Para estas analises montamos dois grupos de estudo (Parada de Maturação (MA) de Células Germinativas e Síndrome de Células Sertoli Only (SCOS)) e um grupo controle (azoospermia obstrutiva e espermatogênese normal). Através das análises das CNVs nós encontramos 94 CNVs nos cromossomos autossômicos e sexuais, 35 (37%) CNVs foram classificadas como benignas, 24 (23%) como potencialmente benignas, sete CNVs (7,4%) como patogênicas e sete foram classificadas como potencialmente patogênica. Todas as CNVs classificadas como patogênica estão presentes no cromossomo Y, cinco CNVs são do tipo duplicação e duas do tipo deleção. A CNV do tipo duplicação foi encontrada no paciente MA e a CNV do tipo deleção foi encontrada no paciente SCOS. As CNVs se sobrepõem e quando analisadas em conjunto (formando uma única CNV de cada condição) elas apresentam um tamanho parecido. Estas CNVs apresentam genes envolvidos na espermatogênese. As CNVs classificadas como potencialmente patogênicas estavam presentes nos cromossomos autossômicos e cromossomo X. Nestas CNVs estavam presentes genes que foram associados com a falha na espermatogênese. A análise da expressão dos miRNAs revelou um perfil transicional muito mais alterado nos pacientes com SCOS. As duas condições apresentaram miRNAs exclusivos, mas também compartilharam: 30 miRNAs. Nós identificamos duas famílias de miRNAs (miR449 e miR34) diferencialmente expressos nas duas condições e que apresentam expressão preferencial no testículo. Nossos resultados mostram que alterações no número de copias (CNVs) no cromossomo Y levam a infertilidade masculina e CNVs nos cromossomos autossômicos e X podem levar a infertilidade masculina. As alterações do tipo deleção podem levar a uma falha na espermatogênese maior que as alterações do tipo duplicação. A expressão diferencial dos miRNAs em tecido testicular de pacientes com diferenças histopatológicas (SCOS e MA) apresentam um padrão de expressão de miRNAs diferentes devido ao tipo de células germinativas que eles apresentam no tecido epitelial do testículo. / Infertility is a public health problem with significant social, economic and psychological impact. Worldwide, the incidence of infertility in the general population is estimated at 10- 15%. Approximately 50% of infertility of couples is of male origin. In more than half of infertile men, the cause of infertility is unknown (idiopathic). Etiologically, male infertility has genetic and non-genetic causes. Among the best known genetic causes we found the mutation of the androgen receptor, the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR), classic chromosomal abnormalities, meiotic abnormalities and microdeletions of the Y chromosome. Chromosomal abnormalities are found much more frequently in infertile men, with an incidence of 4-16% in the incidence of 0.4% in the fertile population. Studies show that CNVs can also be related to male infertility, specifically in the failure of spermatogenesis. CNVs found in both the Y and autosomes chromosomes were also associated with possible failures in spermatogenesis. Another factor that may also be involved in male infertility is the deregulated expression of miRNAs. This work aimed to promote the analysis of large-scale distribution of CNVs and the transcriptional profile of miRNAs in testicular biopsy samples from patients with azoospermia. For the study of CNV we used the CytoScan HDTM Affymetrix methodology and the transcriptional profile of miRNAs in the samples was assessed by means of microarray technology from Affymetrix platform. For these analyzes we set up two study groups (Stop Maturation (MA) of Germ Cells and Sertoli Cell Only Syndrome (SCOS)) and compared them to a control group (obstructive azoospermia, normal spermatogenesis). Through analysis of CNVs, we found 94 CNVs in sexual and autosomes chromosomes, 35 (37%) were classified as benign CNVs, 24 (23%) as a potentially benign seven CNVs (7.4%) as pathogenic and 7 were classified as potentially pathogenic. All CNVs classified as pathogenic are present on the Y chromosome, five CNVs are of duplication type and two are deletion type. The duplication type CNV was found in MA patients and deletion type CNV was found in SCOS patient. We identified that CNVs overlap and when analyzed jointed - as a single CNV of each condition - they have a similar size. These CNVs have genes involved in spermatogenesis. CNVs classified as potentially pathogenic were present in autosomes and in the X chromosome. In these CNVs were present genes that were associated with failure in spermatogenesis. The analysis of the expression of miRNAs revealed a transitional profile much more altered in patients with SCOS. The two conditions presented exclusive miRNAs, but shared 30 miRNAs differentially expressed when compared to the control group. We identify two families of miRNAs (miR449 and miR34) which exhibit preferential expression in testis as differentially expressed in both conditions. Our results show that changes in the number of copies (CNVs) on the Y chromosome lead to male infertility and CNVs in autosomes and X chromosomes may lead to male infertility. The deletion type changes can lead to a failure of spermatogenesis greater than the duplication type changes. The differential expression of miRNAs in patients with testicular tissue histopathologic differences (SCOS and MA) has a different pattern of miRNA expression due to the type of germ cells they present in epithelial tissue of the testis.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Marcadores genéticos presentes no cromossomo Y, como os microssatélites (Y-STRs) e polimorfismos de único nucleotídeo (Y-SNPs) são utilizados na caracterização de linhagens masculinas, visto que são transmitidos às gerações seguintes sem alterações, a menos que ocorram mutações (Singh et al., 2011; Mitchell & Hammer, 1996; Butler, 2009). Por isso, esses marcadores são amplamente empregados em diversas situações, destacando-se o uso constante dos Y-STRs na genética forense por apresentarem alta capacidade de discriminar linhagens. Recentemente, foram descritos 13 marcadores com taxas de mutação substancialmente superiores àquelas verificadas para loci STR do cromossomo Y, denominados Rapidly Mutating (RM) Y-STRs (Ballantyne et al., 2010; Kayser et al., 2012). Devido às taxas de mutação elevadas, os RM-YSTRs apresentam maior eficiência na discriminação entre indivíduos proximamente relacionados, pertencentes à mesma linhagem patrilínea. O presente trabalho buscou aprofundar o conhecimento acerca das características populacionais e mutacionais dos loci RM-YSTRs em amostra do Rio de Janeiro, contribuindo com estudos desta natureza na população brasileira. Realizou-se a análise de 13 loci do cromossomo Y em 258 indivíduos do sexo masculino, compondo 129 pares de pais e filhos, nascidos no estado do Rio de Janeiro. O DNA das amostras foi extraído, conforme os protocolos vigentes na rotina do LDD-UERJ. As sequências genéticas de interesse foram amplificadas pela técnica de reação em cadeira da polimerase (PCR) através da realização de três PCR multiplex, cujos produtos de amplificação foram separados por eletroforese em sequenciador automático ABI-3500 (Applied Biosystems). Para os pares pai/filho que apresentaram haplótipos mutados, empregou-se a técnica de sequenciamento para confirmação das mutações. Os loci RM-YSTR geraram um poder de discriminação de 1,0 na amostra analisada, o que significa que todos os 129 indivíduos da amostra populacional apresentaram haplótipos diferentes para tais marcadores, com frequências de 0,0077 e diversidade haplotípica igual a 1. Além disso, foram obtidos valores elevados de diversidade gênica para os 13 marcadores. A análise de distância genética e os resultados de AMOVA baseados nos valores de Fst demonstraram que os RM-YSTR não indicam subdivisão populacional e traços ancestrais comuns. Tais valores estão associados às elevadas taxas de mutação encontradas, cuja média foi de 2,11 x 10-2. Foi possível observar que os loci RM-YSTR são muito discriminativos na amostra miscigenada analisada, além de terem maior capacidade de diferenciar indivíduos do que outros conjuntos de marcadores normalmente usados em estudos populacionais e análises forenses. Sendo assim, é possível concluir que os marcadores RM-YSTR são promissores para discriminar indivíduos da mesma linhagem patrilínea, visto que devido às suas elevadas taxas mutacionais e poder de discriminação, são capazes de diferenciar indivíduos de maneira mais eficiente do que os outros conjuntos de STR. Porém, é necessário maior número de estudos para melhor caracterização destes loci em diferentes populações. / Genetic markers on Y chromosome, as microsatellites (Y-STRs) and single nucleotide polymorphisms (Y-SNPs) are used for the characterization of male lineages, since they are fully transmitted to next generations unless mutations occurs (Singh et al., 2011; Mitchell & Hammer, 1996; Butler, 2009). Therefore, these markers are widely applied in several situations, highlighting the constant use of Y-STRs in the field of forensic genetics because of their high capacity of discriminate lineages. Recently, 13 rapidly mutating markers were described due to their highly mutation rates in comparison to other common Y-chromosome STRs, being called as Rapidly Mutating Y-STR (RM-YSTR) (Ballantyne et al., 2010; Kayser et al., 2012). As a result of their high mutation rates, RM-YSTRs display high efficiency in discriminating paternally related males. The present work aimed to deepen the knowledge about population and mutational RM-YSTR loci characteristics in Rio de Janeiro sample, and then, contribute to other studies with this purpose in Brazilian population. Y chromosome 13 STRs analysis was realized in 258 males born in Rio de Janeiro state, grouped in 129 fathers/sons pairs. The extraction of DNA from biological samples was performed according to routine protocols from LDD-UERJ. Target sequences were amplified by three polimerase chain reactions (PCR) and the amplicons were separated through electrophoresis on automated sequencer ABI-3500 (Applied Biosystems). When mutations were detected, they were confirmed by sequencing. Among the investigated sample, RM-YSTR loci showed a discrimination capacity of 1,0 which means that all 129 analyzed individuals have different haplotypes for these markers, displaying frequencies of 0,0077 and haplotype diversity of 1,0. Moreover, high values of genetic diversities were obtained for the 13 markers. Distance genetic analysis and AMOVA values based on Fst results did not show population substructure and common ancestral traits. These results are associated with high mutation rates found, with an average rate about 2,11 x 10-2. RM-YSTR showed to be very discriminative at this mixed sample, besides proving to be more discriminative than other markers commonly used in population studies and forensic analysis. Thus, it is possible to conclude that RM-YSTR markers are promising to discriminate individuals of the same male strain and due to their high mutation rates and discrimination capacity, they are able to differentiate individuals better than other common markers. Nevertheless, for a better characterization of these loci in different populations more studies are needed.

A infertilidade é um problema de saúde pública com um significativo impacto social, econômico e psicológico. Em todo o mundo, a incidência da infertilidade entre a população geral é estimada em 10-15%. Cerca de 50% da infertilidade dos casais são de origem masculina. Em mais da metade dos homens inférteis, a causa da infertilidade é desconhecida (idiopática). Etiologicamente, a infertilidade masculina apresenta causas genéticas e não genéticas. Dentre as causas genéticas mais conhecidas temos mutação do receptor de andrógenos, mutação do gene regulador da condutibilidade transmembrana da fibrose cística (CFTR), anomalias cromossômicas clássicas, anomalias meióticas, microdeleções do cromossomo Y, etc. As anomalias cromossômicas são encontradas com muito mais frequência em homens inférteis, com uma incidência de 4-16% em relação à incidência de 0,4% na população fértil. Estudos mostram que as CNVs também podem estar relacionadas com a infertilidade masculina, especificamente com a falha na espermatogênese. CNVs encontradas tanto no cromossomo Y quanto nos cromossomos autossômicos também foram associadas a possíveis falhas na espermatogênese. Um outro fator que também pode estar envolvido com a infertilidade masculina é a expressão desregulada dos miRNAs. O presente trabalho teve como objetivo promover a análise em larga escala da distribuição de CNVs e do perfil transcricional dos miRNAs em amostras de biopsias testiculares de paciente com azoospermia. Para o estudo das CNVs nós utilizamos a metodologia do CytoScan HDTM da Affymetrix. O perfil transcricional de miRNAs nos indivíduos estudados foi avaliado por meio da tecnologia de microarranjos também da plataforma Affymetrix. Para estas analises montamos dois grupos de estudo (Parada de Maturação (MA) de Células Germinativas e Síndrome de Células Sertoli Only (SCOS)) e um grupo controle (azoospermia obstrutiva e espermatogênese normal). Através das análises das CNVs nós encontramos 94 CNVs nos cromossomos autossômicos e sexuais, 35 (37%) CNVs foram classificadas como benignas, 24 (23%) como potencialmente benignas, sete CNVs (7,4%) como patogênicas e sete foram classificadas como potencialmente patogênica. Todas as CNVs classificadas como patogênica estão presentes no cromossomo Y, cinco CNVs são do tipo duplicação e duas do tipo deleção. A CNV do tipo duplicação foi encontrada no paciente MA e a CNV do tipo deleção foi encontrada no paciente SCOS. As CNVs se sobrepõem e quando analisadas em conjunto (formando uma única CNV de cada condição) elas apresentam um tamanho parecido. Estas CNVs apresentam genes envolvidos na espermatogênese. As CNVs classificadas como potencialmente patogênicas estavam presentes nos cromossomos autossômicos e cromossomo X. Nestas CNVs estavam presentes genes que foram associados com a falha na espermatogênese. A análise da expressão dos miRNAs revelou um perfil transicional muito mais alterado nos pacientes com SCOS. As duas condições apresentaram miRNAs exclusivos, mas também compartilharam: 30 miRNAs. Nós identificamos duas famílias de miRNAs (miR449 e miR34) diferencialmente expressos nas duas condições e que apresentam expressão preferencial no testículo. Nossos resultados mostram que alterações no número de copias (CNVs) no cromossomo Y levam a infertilidade masculina e CNVs nos cromossomos autossômicos e X podem levar a infertilidade masculina. As alterações do tipo deleção podem levar a uma falha na espermatogênese maior que as alterações do tipo duplicação. A expressão diferencial dos miRNAs em tecido testicular de pacientes com diferenças histopatológicas (SCOS e MA) apresentam um padrão de expressão de miRNAs diferentes devido ao tipo de células germinativas que eles apresentam no tecido epitelial do testículo. / Infertility is a public health problem with significant social, economic and psychological impact. Worldwide, the incidence of infertility in the general population is estimated at 10- 15%. Approximately 50% of infertility of couples is of male origin. In more than half of infertile men, the cause of infertility is unknown (idiopathic). Etiologically, male infertility has genetic and non-genetic causes. Among the best known genetic causes we found the mutation of the androgen receptor, the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR), classic chromosomal abnormalities, meiotic abnormalities and microdeletions of the Y chromosome. Chromosomal abnormalities are found much more frequently in infertile men, with an incidence of 4-16% in the incidence of 0.4% in the fertile population. Studies show that CNVs can also be related to male infertility, specifically in the failure of spermatogenesis. CNVs found in both the Y and autosomes chromosomes were also associated with possible failures in spermatogenesis. Another factor that may also be involved in male infertility is the deregulated expression of miRNAs. This work aimed to promote the analysis of large-scale distribution of CNVs and the transcriptional profile of miRNAs in testicular biopsy samples from patients with azoospermia. For the study of CNV we used the CytoScan HDTM Affymetrix methodology and the transcriptional profile of miRNAs in the samples was assessed by means of microarray technology from Affymetrix platform. For these analyzes we set up two study groups (Stop Maturation (MA) of Germ Cells and Sertoli Cell Only Syndrome (SCOS)) and compared them to a control group (obstructive azoospermia, normal spermatogenesis). Through analysis of CNVs, we found 94 CNVs in sexual and autosomes chromosomes, 35 (37%) were classified as benign CNVs, 24 (23%) as a potentially benign seven CNVs (7.4%) as pathogenic and 7 were classified as potentially pathogenic. All CNVs classified as pathogenic are present on the Y chromosome, five CNVs are of duplication type and two are deletion type. The duplication type CNV was found in MA patients and deletion type CNV was found in SCOS patient. We identified that CNVs overlap and when analyzed jointed - as a single CNV of each condition - they have a similar size. These CNVs have genes involved in spermatogenesis. CNVs classified as potentially pathogenic were present in autosomes and in the X chromosome. In these CNVs were present genes that were associated with failure in spermatogenesis. The analysis of the expression of miRNAs revealed a transitional profile much more altered in patients with SCOS. The two conditions presented exclusive miRNAs, but shared 30 miRNAs differentially expressed when compared to the control group. We identify two families of miRNAs (miR449 and miR34) which exhibit preferential expression in testis as differentially expressed in both conditions. Our results show that changes in the number of copies (CNVs) on the Y chromosome lead to male infertility and CNVs in autosomes and X chromosomes may lead to male infertility. The deletion type changes can lead to a failure of spermatogenesis greater than the duplication type changes. The differential expression of miRNAs in patients with testicular tissue histopathologic differences (SCOS and MA) has a different pattern of miRNA expression due to the type of germ cells they present in epithelial tissue of the testis.