A criptococose clinica foi observada por volta do primeiro dia da inoculação e a sobrevida dos animais 15 dias após-inoculação (PI). Isolamos C. neoformans no cérebro a partir do 5º dia (PI) e no pulmão a partir 11º dia (PI). No 1º dia (PI) observamos por meio do tecido cerebral que já havia um quadro inicial de infecção, presença de edema, que evoluiu durante todo o período. C. neoformans foi visualizado primeiramente nos vasos capilares, o que nos leva a sugerir que seja esta rota importante para a entrada da levedura no órgão. A meningite aguda aconteceu por volta do 7º dia quando visualizamos o microrganismo na meninge e com um discreto infiltrado inflamatório. A partir do 13º dia a doença evoluiu para crônica permanecendo até o óbito dos animais. A monoterapia com anfotericina B (AMB) reduziu a sobrevida dos animais, enquanto que, o tratamento isolado com fluconazol (FLC) prolongou a mesma. A associação AMB-FLC foi eficaz, quando iniciamos o tratamento 24 horas (PI), enquanto que, o mesmo tratamento iniciado a partir do 7º dia quando já tínhamos um quadro compatível de meningite aguda não foi satisfatório. É importante ressaltar que os resultados descritos foram referentes à inoculação com isolado sensível in vitro ao fluconazol, enquanto que, o tratamento não resultou em êxito quando empregamos isolado resistente in vitro ao fluconazol. / Clinical cryptococcosis was observed on day 1 postinoculation (PI), and the animals survived until day 15 PI. C. neoformans was isolated from brain tissue starting on day 5 PI, and from lung tissue starting on day 11 PI. On day 1 PI, signs of infection were already observed in brain tissue, with presence of edema, which evolved throughout the period. C. neoformans was first seen in the capillaries, suggesting that this is an important route for the entrance of the yeast into this organ. Acute meningitis occurred around day 7 PI, when the microorganism was observed in the meninges, along with a discrete inflammatory infiltrate. From day 13 PI onward the disease became chronic, persisting until the death of the animals. Treatment with amphotericin B (AMB) alone shortened the animals\' survival, while treatment with fluconazole (FLC) alone lengthened it. Treatment with the two drugs in association was effective when treatment was begun at 24 hours PI, however, when treatment was begun at day 7 PI, already with signs of acute meningitis, the effectiveness was unsatisfactory. It is important to emphasize that these results relate to inoculation with an isolate susceptible in vitro to fluconazole, while the treatment was not effective for an isolate resistant in vitro to fluconazole.

Cryptococcus neoformans var. grubii est responsable de la majeure partie des infections au Cryptococcus chez les individus infectés au VIH-1. Cryptococcus gattii infecte généralement les personnes immunocompétentes. Afin de comprendre les mécanismes responsables de la susceptibilité différentielle de ces espèces lors de l’infection au VIH-1, nous avons établi et caractérisé un modèle novateur de la cryptococcose chez des souris transgéniques (Tg) CD4C/HIVMutA exprimant des gènes du VIH-1, et qui développent une maladie similaire au SIDA. Les objectifs sont de démontrer une différence significative au niveau de la survie, de la réponse inflammatoire et du recrutement cellulaire pulmonaire en fonction de la présence du transgène et de l’espèce de Cryptococcus inoculée. Des analyses de survie, d’histopathologie et de cytométrie en flux sur les populations cellulaires pulmonaires ont été effectuées. Les souris Tg infectées avec C. neoformans H99 ou C23 ont démontré une survie réduite et une augmentation de la dissémination comparativement aux souris non-Tg, contrairement aux souris Tg infectées au C. gattii R265 ou R272. L’examen histopathologique des poumons de souris Tg infectées au H99 a montré une faible réponse inflammatoire, contrairement aux souris non-Tg. Pour la souche R265, il y avait une très faible réponse inflammatoire chez les deux types de souris. Enfin, l’étude des populations cellulaires du poumon a révélé chez les souris Tg une augmentation des pourcentages de macrophages interstitiels et de cellules polymorphonucléaires, ainsi qu’une diminution des lymphocytes T CD4+ et CD8+, indépendamment de l’infection au Cryptococcus. Ce modèle novateur représente donc un outil très pertinent pour l’étude de l’immunopathogenèse de la cryptococcose dans le contexte du VIH. / Cryptococcus neoformans var. grubii is the most frequent cause of AIDS-associated cyptococcosis worldwide, in sharp contrast to Cryptococcus gattii which usually infects immunocompetent individuals. To understand the mechanisms which cause differential susceptibility to these cryptococcal species in HIV infection, we established and characterized a novel model of cryptococcosis in CD4C/HIVMutA transgenic (Tg) mice expressing HIV-1 gene products and developing an AIDS-like disease. The objectives are to demonstrate significant differences in survival, inflammatory response and lung cell recruitment in Tg mice compared to non-Tg mice when inoculated with different species of Cryptococcus. Tg mice infected with C. neoformans strains H99 or C23 consistently displayed reduced survival and an increase of systemic dissemination compared to non-Tg mice, in contrast with Tg mice infected with C. gattii strains R265 or R272. Histopathologic examination of lungs of Tg mice infected with H99 showed a minimal inflammatory cell response, in contrast with the non-Tg mice infected with H99. In the case of R265, both types of mice failed to induce a strong inflammatory response. Finally, expression of the HIV-1 transgene increased the percentage of pulmonary interstitial macrophages and polymorphonuclear cells, while reducing CD4+ and CD8+ T-lymphocytes, independently of cryptococcal infection. This model therefore provides a powerful new tool to further investigate the immunopathogenesis of cryptococcosis in the specific context of HIV-infection.

No período de 1981-2010, foram estudados, retrospectivamente, 54 casos de criptococose em pacientes com transplante de órgão sólido, identificados no Laboratório de Micologia da Santa Casa Complexo Hospitalar, Porto Alegre, RS. A criptococose ocorreu em 31 transplantados de rim, 13 de fígado, 7 de pulmão, 2 de pâncreas e rim, e 1 de coração. A idade média foi de 47,91 ± 13,98 (12-76 anos). Um total de 38 pacientes do sexo masculino (70,4%). As manifestações clínicas mais frequentes (54 pacientes) foram febre, cefaléia, vômito, tosse e estado mental alterado. Os achados radiográficos mais comuns no tórax, em 27 pacientes, foram nódulo, consolidação, cavitação e derrame pleural, sendo 10 com comprometimento pulmonar comprovado. Trinta e quatro apresentavam acometimento do sistema nervoso central, 7 tinham envolvimento cutâneo, e 4 em outros locais. O liquor, sangue e urina, respectivamente, contribuíram para o diagnóstico microbiológico com maior frequência. A maioria das infecções, nesta série de pacientes com criptococose, foi causada por Cryptococcus neoformans (92,7%). Pela primeira vez na literatura, documentamos C. gattii em pacientes com transplante de pulmão. Finalmente, quanto ao regime imunossupressor primário utilizado, houve maior mortalidade entre os pacientes que usaram o regime terapêutico baseado em ciclosporina e menor naqueles que usaram tacrolimus. / In the period of 1981 to 2010, 54 cases of cryptococcosis in patients with solid organ transplantation indetified at Mycology Laboratory in Santa Casa Hospital Complex, Porto Alegre, RS, were retrospectively studied. Cryptococcois occured in 31 kidney, 13 liver, 7 lung, 2 kidney-pancreas, and 1 heart transplant. The mean age was 47.3 years old (range, 12-76; SD 13.98). A total of 38 patients were male (70.4%). The most frequent clinical manifestation (54 patients) was fever, headache, vomiting, cough and altered mental status. The most common chest radiographic fidings, in 27 patients, were nodules, masses, consolidation, cavitation, and pleural effusion, 10 with proved pulmonary involvement. Thirty four patients had central nervous system involvement, 7 with cutaneous involvement, and 4 at other sites. The cerebospinal fluid, blood, and urine had the highest yield for the microbiologic diagnosis, respectivelly. Nearly all infections in this series of patients with cryptococcosis involved Cryptococcus neoformans (92.7%). By the first time in the literature, we documented C. gattii in lung transplant patients. Finally, considering the type of primary immunosupressive agent used, there was a higher mortality rate on patients with cyclosporine based therapy, and lowest in those with tacrolimus.

No período de 1981-2010, foram estudados, retrospectivamente, 54 casos de criptococose em pacientes com transplante de órgão sólido, identificados no Laboratório de Micologia da Santa Casa Complexo Hospitalar, Porto Alegre, RS. A criptococose ocorreu em 31 transplantados de rim, 13 de fígado, 7 de pulmão, 2 de pâncreas e rim, e 1 de coração. A idade média foi de 47,91 ± 13,98 (12-76 anos). Um total de 38 pacientes do sexo masculino (70,4%). As manifestações clínicas mais frequentes (54 pacientes) foram febre, cefaléia, vômito, tosse e estado mental alterado. Os achados radiográficos mais comuns no tórax, em 27 pacientes, foram nódulo, consolidação, cavitação e derrame pleural, sendo 10 com comprometimento pulmonar comprovado. Trinta e quatro apresentavam acometimento do sistema nervoso central, 7 tinham envolvimento cutâneo, e 4 em outros locais. O liquor, sangue e urina, respectivamente, contribuíram para o diagnóstico microbiológico com maior frequência. A maioria das infecções, nesta série de pacientes com criptococose, foi causada por Cryptococcus neoformans (92,7%). Pela primeira vez na literatura, documentamos C. gattii em pacientes com transplante de pulmão. Finalmente, quanto ao regime imunossupressor primário utilizado, houve maior mortalidade entre os pacientes que usaram o regime terapêutico baseado em ciclosporina e menor naqueles que usaram tacrolimus. / In the period of 1981 to 2010, 54 cases of cryptococcosis in patients with solid organ transplantation indetified at Mycology Laboratory in Santa Casa Hospital Complex, Porto Alegre, RS, were retrospectively studied. Cryptococcois occured in 31 kidney, 13 liver, 7 lung, 2 kidney-pancreas, and 1 heart transplant. The mean age was 47.3 years old (range, 12-76; SD 13.98). A total of 38 patients were male (70.4%). The most frequent clinical manifestation (54 patients) was fever, headache, vomiting, cough and altered mental status. The most common chest radiographic fidings, in 27 patients, were nodules, masses, consolidation, cavitation, and pleural effusion, 10 with proved pulmonary involvement. Thirty four patients had central nervous system involvement, 7 with cutaneous involvement, and 4 at other sites. The cerebospinal fluid, blood, and urine had the highest yield for the microbiologic diagnosis, respectivelly. Nearly all infections in this series of patients with cryptococcosis involved Cryptococcus neoformans (92.7%). By the first time in the literature, we documented C. gattii in lung transplant patients. Finally, considering the type of primary immunosupressive agent used, there was a higher mortality rate on patients with cyclosporine based therapy, and lowest in those with tacrolimus.

A criptococose clinica foi observada por volta do primeiro dia da inoculação e a sobrevida dos animais 15 dias após-inoculação (PI). Isolamos C. neoformans no cérebro a partir do 5º dia (PI) e no pulmão a partir 11º dia (PI). No 1º dia (PI) observamos por meio do tecido cerebral que já havia um quadro inicial de infecção, presença de edema, que evoluiu durante todo o período. C. neoformans foi visualizado primeiramente nos vasos capilares, o que nos leva a sugerir que seja esta rota importante para a entrada da levedura no órgão. A meningite aguda aconteceu por volta do 7º dia quando visualizamos o microrganismo na meninge e com um discreto infiltrado inflamatório. A partir do 13º dia a doença evoluiu para crônica permanecendo até o óbito dos animais. A monoterapia com anfotericina B (AMB) reduziu a sobrevida dos animais, enquanto que, o tratamento isolado com fluconazol (FLC) prolongou a mesma. A associação AMB-FLC foi eficaz, quando iniciamos o tratamento 24 horas (PI), enquanto que, o mesmo tratamento iniciado a partir do 7º dia quando já tínhamos um quadro compatível de meningite aguda não foi satisfatório. É importante ressaltar que os resultados descritos foram referentes à inoculação com isolado sensível in vitro ao fluconazol, enquanto que, o tratamento não resultou em êxito quando empregamos isolado resistente in vitro ao fluconazol. / Clinical cryptococcosis was observed on day 1 postinoculation (PI), and the animals survived until day 15 PI. C. neoformans was isolated from brain tissue starting on day 5 PI, and from lung tissue starting on day 11 PI. On day 1 PI, signs of infection were already observed in brain tissue, with presence of edema, which evolved throughout the period. C. neoformans was first seen in the capillaries, suggesting that this is an important route for the entrance of the yeast into this organ. Acute meningitis occurred around day 7 PI, when the microorganism was observed in the meninges, along with a discrete inflammatory infiltrate. From day 13 PI onward the disease became chronic, persisting until the death of the animals. Treatment with amphotericin B (AMB) alone shortened the animals\' survival, while treatment with fluconazole (FLC) alone lengthened it. Treatment with the two drugs in association was effective when treatment was begun at 24 hours PI, however, when treatment was begun at day 7 PI, already with signs of acute meningitis, the effectiveness was unsatisfactory. It is important to emphasize that these results relate to inoculation with an isolate susceptible in vitro to fluconazole, while the treatment was not effective for an isolate resistant in vitro to fluconazole.

La cryptococcose chez les patients atteints du VIH-1 est principalement causée par Cryptococcus neoformans var. grubii tandis que Cryptococcus gattii infecte surtout les personnes immunocompétentes. Afin d’élucider les mécanismes causant la susceptibilité différentielle à l’égard de ces deux espèces de Cryptococcus dans le contexte de l’infection au VIH-1, nous avons utilisé un modèle novateur de la cryptococcose chez la souris transgénique CD4C/HIVMutA, qui exprime les gènes nef, env et rev du VIH-1. L’expression du transgène VIH-1 a augmenté le recrutement pulmonaire des macrophages alvéolaires mais a diminué celui des lymphocytes T CD4+ et CD8+ en réponse à l’infection par le C. neoformans ou le C. gattii. La production pulmonaire des chimiokines MCP-1 (CCL2) et RANTES (CCL5) était également réduite chez les souris transgéniques infectées par l’une ou l’autre de ces espèces de Cryptococcus. La production pulmonaire de MIP-1α, MIP-1β, TNF-α, TGF-β, IL-2, IL-4 et IL-13 était augmentée chez la souris infectée au C. neoformans comparativement à C. gattii. In vitro, les macrophages alvéolaires prélevés chez la souris Tg et stimulés par des agonistes ont produit davantage de MIP-1β, alors que les chimiokines MCP-1 et RANTES n’ont pas été détectées. / The most common cause of cryptococcosis in HIV-1-infected patients is Cryptococcus neoformans var. grubii, while Cryptococcus gattii usually infects immunocompetent people. We used a novel inhalation model of cryptococcosis in CD4C/HIVMutA transgenic mice expressing nef, env, and rev of HIV-1 to examine the mechanisms that cause differential susceptibility to these species of Cryptococcus in the context of HIV-1 infection. HIV-1 transgene expression increased alveolar macrophage but decreased pulmonary CD4+ and CD8+ T lymphocyte recruitment. Pulmonary production of the CC chemokines MCP-1 (CCL2) and RANTES (CCL5) was reduced in transgenic mice infected with C. neoformans or C. gattii, and concentrations were lower after infection with C. gattii compared to C. neoformans. Production of MIP-1α, MIP-1β, TNF-α, TGF-β, IL-2, IL-4 and IL-13 was increased in mice infected with C. neoformans compared to C. gattii. Production of MIP-1β by alveolar macrophages harvested from Tg mice was enhanced after agonist exposure in vitro, but production of the chemokines MCP-1 and RANTES was undetectable.

Introdução: A meningite criptocócica causa elevada mortalidade, sobretudo em pacientes acometidos de alguma condição imunossupressora. O objetivo deste estudo foi identificar fenômenos de baixa suscetibilidade a antifúngicos e outros preditores clínicos que possam explicar falha terapêutica e recidiva da neurocriptococose Metodologia: Foram avaliados 96 casos com coleta de dados clínicos epidemiológicos e laboratoriais. Os isolados foram identificados quanto a genótipo molecular, suscetibilidade de anfotericina B (AMB) e fluconazol (FCZ) pela determinação da concentração inibitória mínima (Minimal Inhibitory Concentration, MIC), nível de heteroresistência ao FCZ (NHF) e determinação do tempo de morte frente AMB (Time-Kill, TK). Foram selecionados isolados heterorresistentes para análise quantitativa de DNA por PCR em tempo Real, expressão de bombas de efluxo por citometria de fluxo e isolados tolerantes a AMB para estudo de resistência ao estresse oxidativo. Foi realizada análise univariável e múltipla usando regressão logística para identificar preditores de óbito hospitalar e de um desfecho composto definido pelo óbito, encaminhamento para unidade de terapia intensiva ou recidiva 6 meses após alta hospitalar. Resultados: A maioria dos pacientes eram imunodeprimidos, com CD4 de 2 a 722 cel./mm3 e 96,7% eram portadores do HIV. Foram identificados 93 isolados de C. neoformans, sendo 76 do genótipo VNI e 17 VNII e 3 C. gattii, todos VGII. MIC de AMB variou de 0,012 a 0,94 mg/L e MIC de FCZ estiverem entre 0,12 e 64 mg/L. Resistência a FCZ (MIC>16mg/L) foi maior em VNI do que em VNII (p=0,03). Dentre os isolados VNI, 64,5% sofreu atividade fungicida até as 24h (TK24) de exposição à AMB e 6 cepas VNI não sofreram ação fungicida (TK>72). A maioria dos isolados VNII (64,7%) apresentou TK24. Os 3 isolados VGII sofreram atividade fungicida a partir de TK24. A maioria dos isolados VNI, VNII e todos os isolados VGII apresentaram alto NHF (>32mg/L). Diferença no NHF de acordo com os genótipos foi observada (p=0,005). No modelo múltiplo, as variáveis associadas significativamente ao óbito foram: idade em anos (OR=1,08;IC95%=1,02-1,15), contagem de leveduras no líquido cefalorraquidiano em logaritmo (LCR) (OR=1,66;IC95%=1,21-2,28) e uma variável composta por hipertensão arterial sistêmica ou diagnóstico de edema cerebral ou dilatação ventricular por tomografia (OR=35,68;IC95%=4,97-256,31). Para o desfecho composto, as variáveis associadas foram: contagem de leveduras do 1D em logaritmo (OR=1,50; IC95%=;1,20-1,86; p=<0,001), cultura de sangue positiva para Cryptococcus spp. (OR=3,30; IC95%=0,86-12,59; p=0,08) e descrição de neurotoxoplasmose (OR=18,62; IC95%=1,85-187,5; p=0,01). As associações foram consistentes em modelos de sobrevida. Conclusão: Foi possível descrever genótipos mais frequentes e identificar fatores genéticos, como aumento da expressão de genes e bombas de efluxo, relacionados à resistência aos fármacos. Nenhum dos testes de suscetibilidade esteve associado com os desfechos. Variáveis obtidas nos primeiros dias de internação mostraram utilidade para predizer o prognóstico em pacientes com meningite criptocóccica. Estes preditores podem ajudar a identificar os casos com maior potencial de óbito e que necessitam da otimização dos recursos terapêuticos. / Background: Cryptococcal meningitis causes high mortality in immunocompromised patients. The objective of this study was to identify the phenomena of low susceptibility to antifungal and other clinical predictors that may explain therapeutic failure and relapse of neurocryptococcosis Methodology: It was analyzed 96 cases with clinical and epidemiological data. The respective isolates were identified for genotype, susceptibility profile by Minimal Inhibitory Concentration (MIC), FCZ heteroresistance level (NHF), and time to death determination against 1 mg / L BMA (Time-Kill, TK). We isolated heteroresistant DNA expression analysis by real-time PCR, expression of efflux pumps by flow cytometry and, some isolates tolerant to AMB were selected to study resistance to oxidative stress. Univariable and multiple analyses using logistic regression were performed to identify predictors of in-hospital mortality and a composed outcome defined by death, referral to the intensive care unit and relapse 6 months after hospital discharge. Results: Most of the patients were immunocompromised, with CD4 range from 2 to 722 cells/mm3 and 96.7% patients HIV-positive. It was analyzed 93 strains of Cryptococcus neoformans of which 76 were genotype VNI and 17 were VNII and 3 were C. gattii, all were VGII. AMB MIC ranged from 0.012 to 0.94 mg/L and FCZ MIC were between 0.12 and 64 mg/L. Resistance to FCZ (MIC>16mg/L) was higher to VNI than VNII (p=0.03). Among the VNI strains, 64.5% had fungicidal activity up to 24h (TK24) of exposure to AMB and 6 VNI did not present this activity until 72h (TK> 72). Most VNII strains (64.7%) had TK24. The 3 VGII strains presented fungicidal activity from TK24. According to the MIC, all strains were susceptible to AMB. The majority of VNI strains (93.4%) and VNII (76.5%) and 3 VGII strains showed high NHF (>32mg/L) and it was observed statistical difference according to the genotypes VNI and VNII (p=0.005). At the multiple analysis, the variables significantly associated with the death were the age in years (OR=1.08,95%CI=1.02-1.15), the cerebrospinal fluid (CSF) yeasts count-log (OR=1.66,95%CI=1.21-2.28), and a variable composed of systemic arterial hypertension or diagnosis of cerebral edema or ventricular dilatation by tomography (OR=35.68,95%CI=4.97-256.31). At the composed outcome, the variables associated were: CSF yeasts count-log (OR=1,50; IC95%=;1,20-1,86; p=<0,001), positive blood culture for Cryptococcus spp. (OR=3,30; IC95%=0,86-12,59; p=0,08) and neurotoxoplasmosis (OR=18,62; IC95%=1,85-187,5; p=0,01). The associations were consistent at survival models. Conclusion: It was possible to describe more frequent genotypes and to identify genetic factors, such as increased gene expression and efflux pumps, related to drug resistance. The antifungal susceptibilities were not associated with the outcomes. were not associated with outcomes. Variables available in the first days of hospitalization showed utility to predict the prognosis in patients with cryptococcal meningitis. These predictors can help to identify the cases with higher potential of death and that require the optimization of the therapeutic resources.

O complexo C. neoformans (no qual as espécies C. neoformans e C. gattii estão inseridas) é constituído por leveduras encapsuladas que causam infecção em humanos e animais, com distribuição mundial. Diante do reconhecimento da importância dessas leveduras, seja no meio ambiente ou na área médica, há um crescente interesse no desenvolvimento de pesquisas que possam levar a uma melhor compreensão de sua epidemiologia e estrutura. Cepas clínicas e ambientais pertencentes ao acervo de amostras do Departamento de Microbiologia do HCFMUSP e ao Laboratório de Leveduras Patogênicas do ICB-USP foram reidentificadas, estudadas quanto aos fatores relacionados à virulência (por pesquisa de exoenzimas), quanto ao perfil de suscetibilidade in vitro frente aos antifúngicos: anfotericina B, fluconazol e voriconazol pela utilização da técnica E-test®, e quanto aos aspectos epidemiológicos (estudo de prontuários dos pacientes). As cepas de origem clínica (60) e ambiental (42) foram reidentificadas e condiziam com o estabelecido pela literatura. Nota-se que quanto às cepas clínicas, 90% delas pertenciam à espécie C. neoformans e 10% à espécie C. gattii e das cepas ambientais, 95,2% eram C. neoformans e 4,8% eram C. gattii. Com relação à produção de exoenzimas, cepas de origem clínica (45%) apresentaram índice 2 (positiva) e cepas de origem ambiental (45,2%) apresentaram índice 3 (fortemente positiva) quanto à proteinase; quanto à fosfolipase, 71,7% das cepas de origem clínica apresentaram índice 2 e, 52,4% das cepas ambientais apresentaram índice 3. Todas as cepas foram sensíveis aos antifúngicos testados (com exceção de uma que era sensível de forma dose dependente ao fluconazol). Em estudo epidemiológico, a maioria dos pacientes acometidos de criptococose foi do sexo masculino (70%), com média de acometimento aos 47 anos; 25 pacientes (41,7%) foram ao óbito; a criptococose mais frequente (50%) foi a neurocriptococose; 50% dos pacientes tinham sorologia positiva para o HIV e 26,7% dos pacientes utilizaram anfotericina B associada ao fluconazol como tratamento. Ao final do trabalho chegamos a importantes conclusões: o meio CGB não se apresentou como método capaz de identificar eficazmente cepas C. gattii, sendo útil apenas como uma primeira triagem, devendo ser acoplado à técnica de PCR-RFLP; ensaios de produção da atividade fosfolipásica são extremamente relevantes, podendo-se afirmar que a fosfolipase pode ser a mais importante enzima na patogênese da criptococose (servindo como indicador das espécies do gênero Cryptococcus spp.); homens são mais acometidos de criptococose do que mulheres, sendo estas acometidas mais cedo. A leucemia de células linfoides granulares grandes (LGL), com expressão anômala de CD16+CD56+CD19+, encontrada em 1 paciente HIV negativo, infectado por C. gattii pode sugerir que a substituição de células imunocompetentes por células aberrantes com ineficiência funcional poderia ser a responsável pela imunossupressão do paciente. Esse fato sugere a importância de uma investigação detalhada em pacientes com meningite causada por Cryptococcus spp. com um sistema imune aparentemente competente / C. neoformans complex (the species C. neoformans and C. gattii are inserted) consists of encapsulated yeasts that cause infection in humans and animals, with worldwide distribution. With the recognition of the importance of these yeasts, either in the environment or in the medical field, there is a growing interest in developing research that may lead to a better understanding of its epidemiology and structure. Clinical and environmental strains of the collection of samples from the Department of Microbiology, HC-USP and the Laboratory of Pathogenic Yeasts of ICB- USP were reidentified, studied concerning the factors related to virulence (by exoenzymes research), as the susceptibility profile in vitro front of antifungal: amphotericin B, fluconazole and voriconazole by use of the E-test® technique, and as to the epidemiological (study of medical handbooks of patients). The strains of clinical (60) and environmental origin (42) were reidentified and established in the literature. We notice that as the clinical strains, 90% of them belonged to the species C. neoformans and (10%) to the species C. gattii and of theenvironmental strains, 95,2% were C. neoformans and 4,8 % were C. gattii. With respect to exoenzyme production, strains of clinical origin (4 %) had an index 2 and strains of environmental origin (45,2%) had an index 3, as the phospholipase, 71,7 % of the strains of clinical origin showed index 2 (positive) and 52,4 % of the environmental strains exhibited index 3 (strongly positive). All strains were susceptible to antifungal agents tested (except one that was sensitive dose dependente to fluconazole). In an epidemiological study, the majority of patients with cryptococcosis were male (70%), with age of 47 years, 25 patients (41,7%) died; the cryptococcosis more frequent (50%) was the neurocryptococcosis, 50 % of patients were seropositive for HIV and 26,7 % of patients received amphotericin B associated to fluconazole treatment. At the end of the study we got some important conclusions: the middle CGB is not presented as a method that effectively identify C. gattii strains , being useful only as a first triage, and should be coupled with PCR-RFLP; tests that measuring phospholipase activity are extremely relevant, we can affirm that the phospholipase may be the most important enzyme in the pathogenesis of cryptococcosis (serving as an indicator species of the genus Cryptococcus spp.), men are more affected of cryptococcosis than women, which are affected earlier as men with the age. The NK-cell leukemia found in 1 patient, HIV negative, infected by C. gattii and with a special expression of both their NK cells (CD19+CD16+CD56+ aberrant cells) gave origin to a lymphoid population anomalous CD56+CD19+, and this lymphoid tumor cells lineage may suggest that the substitution of immunocompetent cells by aberrant cells with a functional inefficiency could be responsible for the immunosuppression of the patient, and this suggests the importance of a detailed investigation in patients with meningitis caused by Cryptococcus spp., with an apparently competent immune system

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Contudo, falhas no tratamento associadas à toxicidade e ao aparecimento de resistência aos fármacos têm sido relatadas, o que torna essencial a descoberta de novas alternativas terapêuticas, como a ciclopirox olamina (CPO). Neste contexto, o objetivo deste estudo foi caracterizar e avaliar a ação in vitro e in vivo da CPO livre e encapsulada em lipossomas frente a amostras de Cryptococcus neoformans para futura aplicação no tratamento da criptococose sistêmica. Foram obtidas 30 amostras de Cryptococcus neoformans provenientes de pacientes imunocomprometidos. A preparação dos lipossomas convencionais e furtivos de CPO foi realizada pelo método da hidratação do filme lipídico e a caracterização foi realizada avaliando os seguintes parâmetros: tamanho de partícula, Índice de Polidispersão (PDI) e taxa de encapsulação (EE%). Para otimização dos constituintes lipídicos, foi realizado um planejamento fatorial fracionado a 24-1 a partir da melhor formulação obtida nos estudos de pré-formulação. A cinética de liberação in vitro foi conduzida para avaliar e comparar estatisticamente o perfil de liberação dos sistemas convencional e furtivo. Adicionalmente, testes de susceptibilidade antifúngica foram realizados de acordo com Clinical and Laboratotry Standards Institute (CLSI). Para caracterização molecular dos isolados, PCR fingerprinting foi conduzida utilizando os primers M13 e URA5. O estudo in vivo foi conduzido com camundongos imunossuprimidos, infectados com Cryptococcus neoformans (106 cels/mL) e tratados com CPO lipossomal (Lipo-CPO) (0.5 mg/Kg). As concentrações de CPO utilizadas na forma livre e encapsuladas em lipossomas convencionais e furtivos variaram de 0,30 a 625 µg/mL. Os resultados do planejamento fatorial mostraram que o ponto central apresentou características proeminentes com redução do tamanho de partícula em 17,1%; melhora do PDI em 15,34% e da quantidade de fármaco encapsulado (25%). A cinética do lipossoma furtivo apresentou uma velocidade de liberação mais controlada quando comparada ao lipossoma convencional. Com relação ao teste de susceptibilidade, todos os inóculos foram susceptíveis a CPO livre, com atividade fungistática entre 0,30 e 0,61 g/mL e fungicida entre 1,22 e 4,88 g/mL. Não houve diferença relacionada à atividade antifúngica entre as formulações lipossomais convencionais e furtivas. A atividade fungistática dos lipossomas foi observada em concentrações variando de 1,22 e 2,44 g/mL. A faixa das concentrações fungicidas foi de 1,22 a 9,76 g/mL. O padrão de bandas do URA5 revelou que todos os isolados apresentam genótipo VNI, característico de C. neoformans. Lipo-CPO apresentou eficácia antifúngica comparada à anfotericina B após 14 dias de infecção, reduzindo a carga fúngica em aproximadamente 8% no baço, 41% no fígado, 63% no pulmão e 89% no cérebro. O exame histológico evidenciou infiltrado celular no fígado dos grupos tratados com Lipo-CPO e anfotericina B, porém com menor intensidade quando comparado ao grupo controle. O estudo sugere que a CPO encapsulada em lipossomas apresenta significativa ação antimicótica frente às amostras sistêmicas de C. neoformans, reforçando seu potencial na terapêutica da criptococose. / Cryptococcosis is an opportunistic fungal infection whose the main ethiological agents are Cryptococcus neoformans and C. gattii. The treatment of choice for this mycosis is amphotericin B combined or not with 5-fluorocytosine, followed by maintenance therapy with fluconazole. However treatment failures associated with toxicity and drug resistance has been reported, which makes it essential to the discovery of new therapies, such as ciclopirox olamine (CPO). The purpose of this study was to characterize and evaluate the in vitro and in vivo antifungal activity of ciclopirox olamine in its free form and encapsulated in liposomes against thirty Cryptococcus neoformans isolates obtained from immunocompromised patients for future application in systemic cryptococcosis treatment. Preparation of conventional and stealth liposomes was performed to define particle size, polydispersity index (PDI), CPO amount of encapsulated and efficiency of encapsulation (EE%). For optimization of liposomal lipid constituents, a 24-1 fractional factorial design was carried out from the prominent formulation obtained in pre-characterization studies. In vitro release kinetics was conducted to evaluate and compare statistically the release profile of conventional and stealth liposomes. Antifungal susceptibility testing was conducted in accordance with the reference method. Regarding molecular characterization, PCR fingerprinting was carried out by using MT3 and URA5 primers. Concentrations of CPO used in free form and encapsulated into stealth and conventional liposomes ranged from 625 to 0.3 g.mL-1. Despite of the central point of the factorial design have increased the total lipids amount in 35.52%, it showed prominent characteristics when compared with the L4 formulation with improvement of the mean size in 17.1%, PDI in 15.34% and CPO amount in 25%. The minimum concentrations of stearylamine to obtain the stable formulation for one month was 5.88 mM. . Kinetics of stealth liposomes showed a release profile more controlled as compared to conventional liposomes. All inoculations were susceptible to CPO in its free form, presenting fungistatic activity between 0.3 and 0.61 g.mL-1 and fungicidal activity between 1.22 and 4.88 g.mL-1. There was no difference with respect to antimycotic activity between conventional and stealth liposomal formulations. Fungistatic activity of liposomes was observed at concentrations ranging from 1.22 and 2.44 g.mL-1. Fungicidal concentration range was 1.22-9.76 g.mL-1. The URA5 profile analized demonstrated all isolates are VNI genotype (C. neoformans). The treatment with Lipo-CPO showed a reduction of 8% of the C. neoformans population in spleen, 40.8% in liver, 63% in lungs and 89% in brain after 14 days of infection. Histological examination revealed cell infiltrate either Lipo-CPO or Amphotericin B treated groups, but less intense when compared to control group. The results suggest that Ciclopirox olamine loaded-liposomes have significant antimycotic activity against Cryptoccocus spp, reinforcing its potential for in vivo studies and its application in cryptococcosis treatment.

O complexo C. neoformans (no qual as espécies C. neoformans e C. gattii estão inseridas) é constituído por leveduras encapsuladas que causam infecção em humanos e animais, com distribuição mundial. Diante do reconhecimento da importância dessas leveduras, seja no meio ambiente ou na área médica, há um crescente interesse no desenvolvimento de pesquisas que possam levar a uma melhor compreensão de sua epidemiologia e estrutura. Cepas clínicas e ambientais pertencentes ao acervo de amostras do Departamento de Microbiologia do HCFMUSP e ao Laboratório de Leveduras Patogênicas do ICB-USP foram reidentificadas, estudadas quanto aos fatores relacionados à virulência (por pesquisa de exoenzimas), quanto ao perfil de suscetibilidade in vitro frente aos antifúngicos: anfotericina B, fluconazol e voriconazol pela utilização da técnica E-test®, e quanto aos aspectos epidemiológicos (estudo de prontuários dos pacientes). As cepas de origem clínica (60) e ambiental (42) foram reidentificadas e condiziam com o estabelecido pela literatura. Nota-se que quanto às cepas clínicas, 90% delas pertenciam à espécie C. neoformans e 10% à espécie C. gattii e das cepas ambientais, 95,2% eram C. neoformans e 4,8% eram C. gattii. Com relação à produção de exoenzimas, cepas de origem clínica (45%) apresentaram índice 2 (positiva) e cepas de origem ambiental (45,2%) apresentaram índice 3 (fortemente positiva) quanto à proteinase; quanto à fosfolipase, 71,7% das cepas de origem clínica apresentaram índice 2 e, 52,4% das cepas ambientais apresentaram índice 3. Todas as cepas foram sensíveis aos antifúngicos testados (com exceção de uma que era sensível de forma dose dependente ao fluconazol). Em estudo epidemiológico, a maioria dos pacientes acometidos de criptococose foi do sexo masculino (70%), com média de acometimento aos 47 anos; 25 pacientes (41,7%) foram ao óbito; a criptococose mais frequente (50%) foi a neurocriptococose; 50% dos pacientes tinham sorologia positiva para o HIV e 26,7% dos pacientes utilizaram anfotericina B associada ao fluconazol como tratamento. Ao final do trabalho chegamos a importantes conclusões: o meio CGB não se apresentou como método capaz de identificar eficazmente cepas C. gattii, sendo útil apenas como uma primeira triagem, devendo ser acoplado à técnica de PCR-RFLP; ensaios de produção da atividade fosfolipásica são extremamente relevantes, podendo-se afirmar que a fosfolipase pode ser a mais importante enzima na patogênese da criptococose (servindo como indicador das espécies do gênero Cryptococcus spp.); homens são mais acometidos de criptococose do que mulheres, sendo estas acometidas mais cedo. A leucemia de células linfoides granulares grandes (LGL), com expressão anômala de CD16+CD56+CD19+, encontrada em 1 paciente HIV negativo, infectado por C. gattii pode sugerir que a substituição de células imunocompetentes por células aberrantes com ineficiência funcional poderia ser a responsável pela imunossupressão do paciente. Esse fato sugere a importância de uma investigação detalhada em pacientes com meningite causada por Cryptococcus spp. com um sistema imune aparentemente competente / C. neoformans complex (the species C. neoformans and C. gattii are inserted) consists of encapsulated yeasts that cause infection in humans and animals, with worldwide distribution. With the recognition of the importance of these yeasts, either in the environment or in the medical field, there is a growing interest in developing research that may lead to a better understanding of its epidemiology and structure. Clinical and environmental strains of the collection of samples from the Department of Microbiology, HC-USP and the Laboratory of Pathogenic Yeasts of ICB- USP were reidentified, studied concerning the factors related to virulence (by exoenzymes research), as the susceptibility profile in vitro front of antifungal: amphotericin B, fluconazole and voriconazole by use of the E-test® technique, and as to the epidemiological (study of medical handbooks of patients). The strains of clinical (60) and environmental origin (42) were reidentified and established in the literature. We notice that as the clinical strains, 90% of them belonged to the species C. neoformans and (10%) to the species C. gattii and of theenvironmental strains, 95,2% were C. neoformans and 4,8 % were C. gattii. With respect to exoenzyme production, strains of clinical origin (4 %) had an index 2 and strains of environmental origin (45,2%) had an index 3, as the phospholipase, 71,7 % of the strains of clinical origin showed index 2 (positive) and 52,4 % of the environmental strains exhibited index 3 (strongly positive). All strains were susceptible to antifungal agents tested (except one that was sensitive dose dependente to fluconazole). In an epidemiological study, the majority of patients with cryptococcosis were male (70%), with age of 47 years, 25 patients (41,7%) died; the cryptococcosis more frequent (50%) was the neurocryptococcosis, 50 % of patients were seropositive for HIV and 26,7 % of patients received amphotericin B associated to fluconazole treatment. At the end of the study we got some important conclusions: the middle CGB is not presented as a method that effectively identify C. gattii strains , being useful only as a first triage, and should be coupled with PCR-RFLP; tests that measuring phospholipase activity are extremely relevant, we can affirm that the phospholipase may be the most important enzyme in the pathogenesis of cryptococcosis (serving as an indicator species of the genus Cryptococcus spp.), men are more affected of cryptococcosis than women, which are affected earlier as men with the age. The NK-cell leukemia found in 1 patient, HIV negative, infected by C. gattii and with a special expression of both their NK cells (CD19+CD16+CD56+ aberrant cells) gave origin to a lymphoid population anomalous CD56+CD19+, and this lymphoid tumor cells lineage may suggest that the substitution of immunocompetent cells by aberrant cells with a functional inefficiency could be responsible for the immunosuppression of the patient, and this suggests the importance of a detailed investigation in patients with meningitis caused by Cryptococcus spp., with an apparently competent immune system