Das Chemokin CXCL12 (stromal cell derived-factor, SDF-1) bindet an die Rezeptoren CXCR4 und CXCR7 und kontrolliert damit unter anderem das Wachstum sowie die Metastasierung von Tumoren in unterschiedlichen Organen. Interessanterweise werden diese protumorogenen Einflüsse abhängig vom Zelltyp und der jeweiligen zellulären Antwort entweder von CXCR4, CXCR7 oder der Kombination beider Rezeptoren vermittelt. CXCR4 ist ein klassischer G-Protein-gekoppelter Rezeptor, der nach Ligandenbindung zur Aktivierung von Gi, Gq sowie G12/G13 führt. Demgegenüber steht der CXCR7, welcher primär als Scavenger Rezeptor betrachtet wird und über Bildung eines extrazellulären CXCL12-Gradienten vor allem die CXCR4-abhängige Zellmigration kontrolliert. Neuere Arbeiten belegen allerdings, dass auch CXCR7 zu einem eigenständigen Signalverhalten in der Lage ist und ähnlich wie CXCR4 die Migration, Proliferation sowie Invasion von (Tumor)zellen beeinflusst. Die Aktivierung der beteiligten Signalwege erfolgt dabei im Regelfall über Arrestine. Ausnahmen bilden bislang Astrozyten und bestimmte Gliomzellen, in denen CXCR7 als klassischer G-Protein-gekoppelter Rezeptor wirkt. Eine weitere, bislang vor allem für CXCR4 gezeigte Möglichkeit, zelluläre Signalwege zu aktivieren, ist über die Transaktivierung des EGFRs (engl.: epidermal growth factor receptor). Diese Arbeit zeigt, dass die Src-Kinase-vermittelte und G-Protein-abghängige Transaktivierung des EGFRs einen generellen Mechanismus darstellt, über den CXCL12 die Migration in den Tumorzelllinien steuert und damit zur Tumormetastasierung führen kann. Untersucht wurden dabei die Tumorzelllinien A549 (nichtkleinzelliges Lungenkarzinom), C33A (Zervixkarzinom), DLD‑1 (kolorektales Karzinom), MDA‑MB‑231 (Mammakarzinom) und PC‑3 (Prostatakarzinom), in denen die CXCL12-induzierte Zellmigration entweder über CXCR4, CXCR7 oder beide Rezeptoren vermittelt wird. Tatsächlich unterblieb die CXCL12-abhängige Migration aller Tumorzellen in Anwesenheit sowohl des Src-Kinase-Inhibitors Src-I1 als auch des EGFR-Inhibitors AG1478, nicht aber nach Hemmung der Arrestin-Expression mittels RNA-Interferenz. Das zelluläre Migrationsverhalten wurde mittels der Boyden-Kammer analysiert. Die Expression des EGFRs sowie β-Arrestin 1/2 wurde im Western Blot nachgewiesen. Die bereits früher gezeigte unterschiedliche Verwendung von CXCR4 und/oder CXCR7 für die Vermittlung des CXCL12-Signals in den verschiedenen Tumorzellen wurde unter Zuhilfenahme spezifischer Rezeptor-Antagonisten (AMD3100, CCX771) bestätigt. Die erhaltenen Befunde identifizieren den EGFR als einen möglichen therapeutischen Ansatzpunktpunkt zur Unterbindung der von CXCL12 induzierten Metastasierung von Tumoren. Im Vergleich zu CXCR4- oder CXCR7-Rezeptorantagonisten hat dieser Ansatz den Vorteil, dass keine Kenntnis darüber notwendig ist, über welchen CXCL12-Rezeptor das Metastasierungsverhalten des jeweiligen Tumors gesteuert wird.

Les lésions hépatiques observées au cours de l'obésité (NAFLD, stéatopathie non alcoolique) s'étendent de la stéatose isolée à la stéatohépatite (NASH, stéatohépatitie non alcoolique), la fibrose, la cirrhose et au carcinome hépatocellulaire. L'identification des mécanismes de recrutement des cellules immunitaires par le foie stéatosique est une étape clé dans la compréhension du déclenchement de l'inflammation hépatique et la recherche de nouvelles cibles thérapeutiques. Au cours de l’obésité, la stéatose sensibilise le foie au lipopolysaccharide (LPS), qui active la voie pro-inflammatoire NFκB. Nous avons récemment montré que: 1) la stéatose induisait une augmentation du recrutement lymphocytaire (TCD4+, TCD8+ et B) vers le foie mais également une augmentation de la réponse des lymphocytes TCD4+ à la chimiokine CXCL12 (SDF-1α), dont le récepteur est CXCR4 ; 2) GILZ (Glucocorticoid-Induced Leucine Zipper), une protéine induite par les glucocorticoïdes (GCs), inhibait la voie NFkB et jouait un rôle clé dans l’inflammation hépatique au cours de la consommation excessive d’alcool.Le but de ce travail était d’étudier les mécanismes de l’inflammation hépatique liée à l’obésité. Au cours de mon travail, nous avons montré que le chimiotactisme des lymphocytes TCD4+ à la chimiokine CXCL12 était augmenté non seulement chez les souris obèses mais également chez des patients ayant une NASH. L’augmentation de l’effet chimiotactique de CXCL12 était due à une augmentation de l’affinité de CXCL12 à son récepteur CXCR4. La migration anormale des lymphocytes T CD4+ vers le foie stéatosique était réversible pharmacologiquement en inhibant la liaison de CXCL12 à CXCR4 par AMD3100 (antagoniste deCXCR4). Le déficit d’expression et l’altération de l’induction du facteur anti-inflammatoire GILZ dans les cellules des Kupffer des souris obèses étaient responsables de la sensibilisation de ces cellules au LPS. Cette altération était liée à la diminution de l’expression du récepteur aux glucocorticoïdes (GR) dans les cellules de Kupffer des souris obèses. La surexpression de GILZ dans l’obésité en utilisant des souris trangéniques restaurait la tolérance hépatique au LPS. Ces anomalies des lymphocytes TCD4+ et de l’expression de GILZ dans les cellules de Kupffer participent au déclenchement d’une inflammation hépatique sur un foie stéatosique et pourraient représenter de nouvelles cibles thérapeutiques / Non alcoholic fatty liver disease (NAFLD) includes a spectrum ranging from simple steatosis to nonalcoholic steatohepatitis (NASH), fibrosis, cirrhosis, and hepatocellular carcinoma. The identification of the mechanisms involved in the recruitment of immunity cells by the fatty liver is a key in the comprehension of the onset of liver and the finding of new therapeutic targets. In obesity, steatosis sensitizes the liver to the lipopolysaccharide (LPS) from the gastrointestinal tract and the NFkB pro-inflammatory pathway is activated. We recently showed that: 1) the steatosis led to an increase recruitment of lymphocytes (TCD4+, TCD8+ and B) by the liver but also an hyperresponsive of CD4+T cells to CXCL12 (SDF-1"), the ligand of CXCR4; 2) GILZ(Glucocorticoid-Induced Leucine Zipper), a protein induced by glucocorticoids (GCs), inhibits the nuclear factor kB pathway and plays a key role in alcoholic hepatitis.This aim of my work was to study the mechanisms involved in obesity-related liver inflammation.I demonstrated that the chemotaxis of CD4+T cells to CXCL12 was increased not only in obese mice but also in patients with NASH. This increased chemotactisme of CXCL12 was due to an increase of the affinity ofCXCL12 to its receptor. The abnormal migration of CD4+T lymphocytes to the fatty liver was reversible by pharmacologically inhibiting the binding of CXCL12 to CXCR4 using AMD3100.The decreased expression and the impairment of the induction of the anti-inflammatory factor GILZ in Kupffer cells from obese mice was responsible for a sensitization of these cells to LPS. This impairment was due to a decrease of the glucocorticoid receptor (GR) expression in Kupffer cells from obese mice. The overexpression of GILZ level in obese transgenic mice restored the liver tolerance to LPS. These abnormalities of CD4+T lymphocytes and the GILZ expression in Kupffer cells contribute to the onset of liver inflammation in obesity and may represent new therapeutic targets.

La NAFLD (non alcoholic fatty liver disease) ou stéatopathie dysmétabolique est la manifestation hépatique du syndrome métabolique. Elle regroupe l’ensemble des lésions hépatiques liées à l’obésité en dehors de toute consommation d’alcool : la stéatose, la NASH (non alcoholic steatohepatitis), la fibrose, la cirrhose et le carcinome hépatocellulaire. Les systèmes immunitaires inné et adaptatif participent activement à la pathologie. J’ai étudié deux axes : l’axe du récepteur des glucocorticoïdes-GILZ dans les cellules de Kupffer et CXCR4-CXCL12 dans les lymphocytes T CD4+.Les cellules de Kupffer (CK) jouent un rôle clé dans la pathologie de la NASH. GILZ (glucocorticoid induced leucine zipper) est exprimé par les monocytes/macrophages et est sous le contrôle du récepteur aux glucocorticoïdes (GR). De plus, GILZ intervient dans l’inhibition des processus inflammatoires. J’ai montré que l’obésité entraîne une diminution de l’expression du GR et de GILZ dans les CK. En utilisant du RU486, un antagoniste spécifique du GR, j’ai prouvé que la diminution de l’expression du GR entraîne la diminution de l’expression de GILZ et sensibilise les CK au LPS. Ce mécanisme joue un rôle déterminant dans le développement de l’inflammation hépatique au cours de l’obésité, en modulant la réponse inflammatoire des CK. Le recrutement de cellules inflammatoires dans le foie est un élément clé de la progression de la NASH. Les lymphocytes T CD4+ issus de souris obèses ont des propriétés chimiotactiques accrues dépendantes de CXCR4. J’ai montré que la NASH augmente les propriétés migratoires dépendantes de CXCR4 des lymphocytes T CD4+ chez l’homme et la souris dans trois modèles murins de NASH. Le traitement de souris obèses par de l’AMD3100, un antagoniste de CXCR4, permet de diminuer le recrutement hépatique de lymphocytes. L’augmentation du chimiotactisme des lymphocytes T CD4+ n’était pas dû, ni à une augmentation de l’expression de CXCR4 et CXCR7, ni même de CXCL12 au niveau du foie. J’ai montré que ce mécanisme dépendait de l’augmentation de l’affinité de CXCR4 pour CXCL12.Ainsi, j’ai mis en évidence deux axes participant à l’inflammation hépatique au cours de l’obésité. Ces axes représentent de nouvelles cibles thérapeutiques potentielles. / NAFLD (non alcoholic fatty liver disease) is the hepatic manifestation of metabolic syndrome. It encompasses the entire spectrum of obesity-related liver lesions : steatosis, NASH (non alcoholic steatohepatitis), fibrosis, cirrhosis and hepatocellular carcinoma. Innate and adaptative immune systems participate actively to the pathophysiology.I studied two axis : the glucocorticoid receptor-GILZ axis in Kupffer cells and CXCR4-CXCL12 in CD4+ T lymphocytes.Kupffer cells (KC) play a key role in pathophysiology of NASH. GILZ (glucocorticoid induced leucine zipper) is expressed by monocytes/macrophages and is under the control of glucocorticoid receptor (GR). Moreover, GILZ takes part in inhibition of inflammatory processes. I showed that obesity induces a decreased expression of GR and GILZ in KC. Using RU486, a GR antagonist, I proved that decreased expression of GR induces the decreased expression of GILZ and sensitize KC to LPS. This mechanism plays a decisive role in initiation of liver inflammation in obesity, modulating inflammatory response of KC. In obese mice, recruitment of inflammatory cells into the liver is a key element in the progression of NASH. CD4+ T lymphocytes from obese mice have enhanced CXCR4-dependent chemotactic properties. I showed that NASH enhances CXCR4-dependent chemotactic properties of CD4+ T lymphocytes in patients and in three mouse models of NASH. Obese mice treatment with AMD3100, a CXCR4 antagonist, decreases lymphocytes recruitement into the liver. Enhanced chemotactic properties of CD4+ T lymphocytes were not due to increased expressions of nor CXCR4 and CXCR7, neither CXCL12 in the liver. I showed that this mechanism was dependent of an increased affinity of CXCR4 to CXCL12.Therefore, I highlighted two axis participating to obesity-related liver inflammation. These axis represent new potential therapeutic targets.

Chez l’adulte les premières étapes du développement hématopoïétique se déroulent dans la moelle osseuse (MO). La contribution de cellules d’origine mésenchymateuse, appelées niches stromales, a été démontrée dans le cas de la maintenance des cellules souches hématopoïétiques (CSH) et du développement des lymphocytes B (LB). Ainsi la maintenance des CSH dépend de niches périvasculaires sécrétant CXCL12 et SCF. Par ailleurs les LB les plus précoces (preproB) sont en contact de cellules stromales CXCL12+, puis migrent vers des cellules stromales exprimant l’interleukine-7 lors de leur différentiation en cellules proB. L’expression du préBCR, marque ensuite l’entrée dans le stade préB. À ce stade, les cellules sont au contact de cellules stromales galectine-1+.Malgré les progrès obtenus dans la compréhension du rôle des niches stromales, leur hétérogénéité et les mécanismes contrôlant la migration et l’adhésion des cellules hématopoïétiques en différenciation restent à mieux définir. Dans cet objectif, nous avons caractérisé phénotypiquement les cellules stromales de la MO mais aussi démontré l’existence d’une niche multi-spécifique, associée aux sinusoïdes et capable de soutenir les CSH et les LB.La contribution des niches dans le développement et la résistance aux traitements des Leucémies Aigues Lymphoblastiques de type B (LAL-B), équivalents pathologiques des LB en développement, a aussi été démontrée. Au cours de mon travail de thèse nous avons révélé l'influence d'un facteur exprimé par des cellules stromales de la MO sur la prolifération des LAL-B. À terme, ces travaux permettront de développer des traitements ciblant les fonctions protectrices des niches tumorales. / In adults, the early stages of hematopoietic development take place in the bone marrow (BM). The contribution of specialized cells of mesenchymal origin, called stromal niches, has been demonstrated in the case of hematopoietic stem cell (HSC) maintenance and B lymphocyte development. Indeed, the maintenance of HSC depends on perivascular niches secreting CXCL12 and SCF. Furthermore progenitor B cells (preproB) are in contact with CXCL12+ stromal cells and migrate towards interleukin 7 expressing stromal cells during their differentiation into proB cells. PreBCR expression then marks the entrance into the preB cell stage. At this point, the cells are in contact with galectin-1+ stromal cells.Although progress have been made in understanding the role of stromal cell niches, their heterogeneity and the mechanisms controlling migration and adhesion of differentiating hematopoietic cells are controversial and remain to be defined. With this objective, we characterized phenotypically BM stromal cells but also demonstrated the existence of a multi-specific niche, associated to sinusoids and able to support both HSC and early B cells.The contribution of BM niches in the development and resistance to treatment of B cell Acute Lymphoblastic Leukemia (B-ALL), pathological equivalent of developing B cells has also been demonstrated. During my PhD, our work revealed the influence of a factor expressed by BM stromal cells on the proliferation of B-ALL. Ultimately, this work will allow the development of treatments targeting the protective functions of tumor niches.

Ischämische Herzerkrankungen stellen die weltweit häufigste Todesursache dar. Das Chemokin SDF-1 zählt zu den vielversprechendsten neuen Therapietargets. Allerdings werden die dem SDF-1 Effekt zugrunde liegenden Mechanismen kontrovers diskutiert. Um den Einfluss von SDF-1 auf die Herzregeneration aufzuklären, wurden transgene Ratten generiert, welche SDF-1 in Kardiomyozyten überexprimieren. Die basale Herzfunktion war in diesen Ratten nicht verändert, jedoch zeigte sich nach Herzinfarkt eine Verschlechterung der kardialen Funktion. Des Weiteren ließen sich eine verstärkte Fibrosebildung, ein Anstieg neutrophiler Granulozyten im Blut sowie eine erhöhte Einwanderung von Makrophagen in die Herzen transgener Ratten feststellen. Dagegen waren die Anlockung von Stammzellen und die Blutgefäßneubildung nicht verändert. Diese Daten bestätigen, dass kardiales SDF-1 eine nachteilige Wirkung ausüben kann, indem es entzündliche Prozesse im geschädigten Gewebe beeinflusst. Ferner wurde ein Microarray-basiertes Screening in kardialem Gewebe nach Herzinfarkt durchgeführt. Ziel der Studie war die Identifizierung neuer Moleküle, deren Rolle bei Herzerkrankungen bislang unbekannt ist. Das Screening brachte das Glykoprotein GPNMB hervor, welches an fibrotischen Prozessen nach Gewebeschädigung beteiligt ist. Wir untersuchten das Protein mit Hilfe des DBA/2J Mausstammes, in dem kein funktionelles GPNMB vorhanden ist. Die Untersuchung dieser Mäuse ergab keine Veränderungen der basalen Herzfunktion, nach Herzinfarkt zeigte sich jedoch eine verbesserte kardiale Funktion sowie erhöhte Hämoglobinkonzentrationen im Blut. Außerdem war die Funktion von Makrophagen verändert. Darüber hinaus fanden wir erhöhte Konzentrationen von GPNMB in Plasmaproben von Patienten nach akutem Herzinfarkt. Zusammenfassend weisen die Ergebnisse darauf hin, dass GPNMB nicht nur ein vielversprechendes Therapietarget, sondern auch einen potenziellen Biomarker für ischämische Herzerkrankungen darstellt. / Ischemic heart diseases are a major cause of death worldwide due to the postmitotic state of the heart. The chemokine SDF-1 is one of the most promising novel therapeutic targets due to its ability to attract leukocytes and stem cells. However, the role of different cardiac cell types in this process remains elusive and underlying mechanisms have been controversially discussed. To clarify the role of SDF-1 and its receptor CXCR4 in myocardial regeneration, we generated transgenic rats overexpressing SDF-1 in cardiomyocytes. The function of the heart at baseline was not altered in these rats, whereas the induction of myocardial infarction resulted in impaired cardiac function and remodeling. This finding was accompanied by increased fibrosis, neutrophil blood counts and macrophage infiltration into the heart. On the other hand, stem cell recruitment and neovascularization were not altered in SDF-1 transgenic rats. In conclusion, our findings confirm that the SDF-1/CXCR4 axis can have adverse effects by affecting the inflammatory state of the healing heart. In addition, a microarray-based screening was conducted in rat hearts after myocardial infarction with the aim to discover yet unknown molecules involved in cardiac repair. This screening yielded GPNMB, a glycoprotein known to be involved in inflammatory and fibrotic processes after tissue injury. We studied the protein further using DBA/2J mice that lack functional levels of GPNMB. While the cardiac function was normal in these mice at baseline, induction of myocardial infarction revealed a preservation of cardiac function, less dilatation as well as higher red blood cell and hemoglobin levels. Moreover, the absence of GPNMB resulted in an altered activity and distribution of macrophages. We also found increased levels of GPNMB in plasma of patients after myocardial infarction. In conclusion, our findings suggest that GPNMB might constitute a novel therapeutic target and biomarker of acute ischemic heart diseases.

Le cancer épithélial de l'ovaire (CEO) est une cause majeure de mortalité parcancer gynécologique. Il est associé à un mauvais pronostic car il est souventdécouvert à un stade tardif. Mieux comprendre les causes et les mécanismesmoléculaires et cellulaires associés à la progression de ce cancer représente unenjeu majeur.Les deux chimiokines CXCL12/SDF-1 et fractalkine (FKN)/CX3CL1 ont étéimpliquées dans diverses tumeurs. La chimiokine SDF-1, a un effetimmunosuppresseur dans le CEO. Elle est aussi impliquée dans l'angiogenèsetumorale. L'effet de SDF-1 médié par CXCR4 est également impliqué dans larégulation de la prolifération, la survie, la migration et l'invasion des cellulescancéreuses. La FKN, a largement été mise en évidence dans les tissusépithéliaux et dans divers cancers où elle peut avoir soit un rôle anti-tumoral soitun rôle pro-tumoral. Jusqu'à présent la FKN n'a pas été étudié dans le CEO.Dans notre étude, nous avons démontré l'expression de SDF-1 et de la FKNdans l'épithélium de surface de l'ovaire sain et dans les tumeurs bénignes etmalignes. Ces résultats montrent que l'expression de SDF-1 et de la FKNpréexiste à la tumorigenèse. Nous avons démontré une expression hétérogènedes deux chimiokines dans les cellules du CEO. Les niveaux d'expression deSDF-1 dans les cellules tumorales sur une cohorte de 183 patientes n'ont aucunevaleur pronostique sur la survie globale et sur la survie sans progressiontumorale des patientes atteintes par le CEO. L'étude de la corrélation del'expression de la FKN avec les deux marqueurs de prolifération, Ki-67 etGILZ, sur une autre cohorte de 54 patientes, complétée par des expériences invitro, a montré que GILZ augmente l'expression de la FKN et d'autre part que laFKN elle-même augmente la prolifération. Cette étude contribue à élucider lerôle de SDF-1 et de la FKN dans le CEO.

The development of a bioartificial pancreas (BAP) has the potential to substantially improve the treatment of insulin-dependent diabetes. Composed of insulin-secreting cells encapsulated in a hydrogel material, a BAP may provide superior glycemic regulation compared with conventional exogenous insulin-delivery therapies. Towards this goal, β- cells or islets encapsulated in alginate microcapsules remain a promising approach. Due to the limited supply of human islets, alternative cell sources are under investigation for incorporation into a BAP, including porcine islets and β- cell lines. Several challenges remain to clinical implementation, including loss of islet or β- cell function and viability following transplantation and host response to the transplanted microcapsules. The objective of this work was to evaluate strategies to improve a BAP by supporting the function and survival of encapsulated islets and β -cells. Towards this goal, two areas were explored: 1) the provision of pro-survival and insulinotropic factors, namely, CXCL12 and GLP-1 (or a GLP-1 analog, Exendin-4), to encapsulated islets and β-cells and 2) modification of the alginate microcapsule to confer long-term resistance to host cell adhesion. To achieve the first objective, methods to deliver both pro-survival and insulinotropic factors to a BAP were developed and their effects on encapsulated β-cells and porcine islets were studied, both in vitro and in vivo. Results demonstrate that delivery of pro-survival and insulinotropic factors is a promising strategy to prolong the survival and function of a BAP. To reduce host cell adhesion to the microcapsule, we employed covalent conjugation of PEG to the surface of alginate-PLL capsules to replace the un-crosslinked layer of alginate used in traditional alginate-PLL-alginate (APA) microcapsules. Results demonstrate that while PEGylation of alginate-PLL microcapsules initially reduced host cell adhesion over 2 weeks in vivo compared with APA capsules, the PEG coating did not provide long-term protection over 3 months. Taken together, these studies represent a multipronged approach towards improving the duration of BAP function, with the ultimate goal of advancing this technology to the clinic.