O vírus da hepatite E (HEV) é um patógeno emergente de distribuição global, causador de hepatite aguda e crônica em humanos e infecções assintomáticas em animais. No Brasil a prevalência de infecção por HEV em humanos e animais ainda é pouco compreendida, assim como as características de virulência, patogenicidade e de infecção inter-espécies de isolados do genótipo 3, zoonótico, circulantes no país também são desconhecidas. O estudo foi dividido em duas etapas, com os objetivos de 1) contribuir no diagnóstico laboratorial molecular do HEV a partir do desenvolvimento de um protocolo de RT-PCR em tempo real (RT-qPCR) para pesquisa do HEV em amostras biológicas, e 2) contribuir com a compreensão das características moleculares, sorológicas, clínico-laboratoriais, ultrassonográficas e histopatológicas associadas à infecção experimental em macacos-da-noite (Aotus azarai infulatus) por um isolado do genótipo 3 suíno do HEV previamente detectado na Amazônia oriental brasileira. O protocolo de RT-qPCR foi desenvolvido com a caracterização da curva de detecção e aplicado em concomitância com testes sorológicos para avaliação diagnóstica restrospectiva de 318 (n = 318) amostras de soros humanos suspeitos de hepatite E. O HEV-RNA não foi detectado em nenhuma das amostras humanas testadas, mas foi determinada soroprevalência de 3,4% e 5,9% de anti-HEV IgM e IgG, respectivamente, o que indicou baixa prevalência de infecção por HEV, mesmo entre pacientes com suspeita clínica e/ou laboratorial de hepatite E na Amazônia brasileira. O estudo experimental em macacos-da-noite foi desenvolvido durante 12 semanas e os animais infectados, por via intravenosa (n=3) e oral (n=3) (e dois controles), foram avaliados semanalmente para determinação dos parâmetros clínicos, bioquímicos, hematológicos, sorológicos (pesquisa de anti-HEV IgM e IgG por enzimaimunoensaio) e moleculares (HEV-RNA soro e fezes por RT-qPCR). Adicionalmente, os animais também foram submetidos a avaliação hepática mensal por ultrassonografia, histopatologia e pesquisa hepática de antígenos do HEV por imunohistoquímica. Os seis macacos-da-noite infectados apresentaram o HEV-RNA em amostras de soro e/ou fezes, e alguns apresentaram evidências de soroconversão, detecção hepática do antígeno viral por imunohistoquímica associada a alterações clínicas e laboratoriais de hepatite aguda oligossintomática. Assim, o protocolo RT-qPCR demonstrou ser aplicável na pesquisa molecular do HEV em amostras de humanos e animais, representando uma importante ferramenta de diagnóstico laboratorial. O estudo experimental permitiu a primeira validação de um primata neotropical como modelo experimental para estudos de infecção com o genótipo 3 do HEV. / Hepatitis E virus (HEV) is an emerging pathogen with global distribution that causes acute and chronic hepatitis in humans and asymptomatic infections in animals. In Brazil, the prevalence of HEV infection in humans and animals is still poorly understood, and the characteristics of virulence, pathogenicity and inter-species infection of the genotype 3 isolates circulating in the country are unknown. The study was divided in two stages that aimed to 1) contribute to the molecular diagnosis of HEV infection by the development of a real-time RT-PCR protocol (RT-qPCR) for HEV-RNA research in biological samples, and 2) to contribute to understanding of molecular, serological, clinical-laboratory, ultrasonographic and histopathological features of HEV genotype 3 in owl monkeys (Aotus azari infulatus) experimental infected with isolate of swine HEV genotype 3 previously detected in the Eastern Brazilian Amazon. The RT-qPCR protocol was developed with characterization of a quantification standard curve and later applied concurrently with serological tests in the retrospective evaluation of 318 (n = 318) human serum samples of hepatitis E suspected cases. HEV-RNA was not detected in any of human tested samples, but seroprevalence of 3.4% and 5.9% was determined for anti-HEV IgM and IgG, respectively, that indicated a low prevalence of HEV infection, even among patients with clinical and/or laboratory suspicion of hepatitis E in the Brazilian Amazon. The experimental study in owl monkeys was developed during12 weeks and the animals were infected by intravenous (n = 3) and oral (n = 3) routes (and two negative controls) were evaluated for determination of clinical, biochemical, hematological, serological (anti-HEV IgM and IgG by enzyme immunoassay) and molecular (HEV-RNA serum and stool by RT-qPCR) parameters weekly. Additionally, the animals were also evaluated by hepatic ultrasonography, histopathology and immunohistochemistry research of HEV antigens in liver monthly. The six infected owl monkeys presentend HEV-RNA in serum and/or stool, and some monkeys presented with evidence of seroconversion, liver detection of HEV antigens by immunohistochemistry associated with clinical and/or laboratory findings of oligosymptomatic acute hepatitis. Thus, the RT-qPCR protocol demonstrated to be applicable in the molecular investigation of HEV infection in human and animal samples, and it also represented an important laboratory diagnostic tool. The experimental study allowed the validation of the first neotropical primate model for HEV genotype 3 infection studies.

Este estudo descreve a análise molecular de pacientes da doença de Gaucher (DG) e Tay-Sachs (DTS) no Brasil. Foram estudados nove casos de formas clássicas da DTS que mostraram uma prevalência da mutação IVS7+1g>c, já descrita em pacientes Portugueses e dez casos das variantes de início juvenil e tardio da DTS, mostrando heterogeneidade genética. Nos casos da variante B1, percebeu-se uma maior incidência da mutação R178H, também descrita previamente em pacientes Portugueses. A presença das mesmas mutações nos casos Brasileiros e Portugueses se deve provavelmente à ancestralidade comum. Uma família com quatro pacientes da variante de início tardio da DTS mostrou uma extensa variabilidade clínica intrafamilial e identificou relevantes aspectos do diagnóstico e das implicações dos programas de triagem populacional. A análise por RFLP de nove mutações causadoras da DG, em 262 pacientes permitiu detectar 76% das alterações e mostrou uma prevalência das mutações N370S e L444P, similar à descrita em diversas outras populações. Os pacientes com variantes neuronopáticas da doença apresentaram uma alta freqüência da mutação G377S, que também é encontrada em pacientes Portugueses. Os pacientes apresentando a G377S indicaram a existência de um provável mecanismo de efeito de dose alélica para essa mutação. Foi observada uma alta freqüência de alelos resultantes da recombinação do gene GBA com seu pseudogene. Diversas outras relações genótipo-fenótipo puderam ser verificadas, mostrando uma baixa penetrância do genótipo N370S/N370S e corroborando a importância do diagnóstico molecular da DG, devido a seu valor preditivo. A análise de mutações raras no gene GBA usando as técnicas de RFLP, dHPLC e seqüenciamento de DNA possibilitou detectar mutações em 84% dos alelos de 54 pacientes. Foram identificadas 14 novas mutações causadoras da DG. Diversas relações genótipo-fenótipo puderam ser verificadas, conferindo valor preditivo para a detecção dessas mutações. Por fim, a análise da associação da DG e da DP permitiu encontrar uma freqüência significativamente maior de portadores das principais mutações no gene GBA em pacientes parkinsonianos (2/65=3%), com aparecimento precoce da doença, comparados a um grupo controle de 267 indivíduos. Esse trabalho fornece nova evidência de que mutações no gene GBA são um raro, mas consistente fator de risco para a DP. / This study describes the molecular diagnosis of Gaucher (GD) and Tay-Sachs disease (TSD) patients in Brazil. Nine cases of the classic infantile form of TSD were analyzed disclosing a prevalence of the IVS7+1g>c mutation, described previously in Portuguese patients. Ten cases of juvenile and late-onset TSD forms were diagnosed showing genetic heterogeneity. Among the B1 variant cases, there was a predomenance of mutation R178H that was also associated to Portuguese ancestry. The presence of the same mutations in Brazilian and Portuguese cases are probably due to common ancestry. A family with 4 affected patients of late onset TSD showed and extensive intrafamilial clinical variability, highlighting relevant characteristics of diagnosis and implications of heterozygote screening programs. Among 263 GD patients, the detection of nine mutations by RFLP revealed 76% of the mutant alleles and a preponderance of N370S and L444P, similar to other populations. The type 3 neuronopathic patients presented a high frequency of mutation G377S, that is also described among Portuguese cases. The patients with G377S indicated the possibility of an allele dose effect for this mutation. Recombinant alleles, presenting pseudogene mutations were detected at a high frequency. Several genotype-phenotype correlations could be verified, highlighting a low penetrance of genotype N370S/N370S and corroborating the importance of molecular diagnosis in GD cases, due to its predictive value. The search for rare mutations at the GBA gene, using dHPLC and DNA sequencing after RFLP analysis, allowed the detection of 84% of the alleles among 54 patients. Fourteen new GD causing mutations were described. Several genotype-phenotype correlations could be established, confering prective value to the identification of these mutations. Finally, the study of the association of GD and Parkinson disease (PD) lead to the detection of a significant increase in the frequency of GBA mutations carriers, among 65 PD patients (2/65=3%) with earlier disease onset compared to a control group (n=267 individuals). This work confers further evidence for the fact that GBA mutations are a rare but consistent risk factor for PD.

Os parasitas pertencentes ao gênero Leishmania têm distribuição ubíqua. Este táxon inclui Leishmania infantum chagasi, agente etiológico da leishmaniose visceral nas Américas, uma zoonose negligenciada cujas metodologias diagnósticas acumulam uma série de limitações, requerendo a validação e padronização de metodologias diagnósticas satisfatórias. Vários fatores estão relacionados à patogênese causada por este protozoário, entre eles a catepsina L-like, uma cisteíno protease envolvida em processos regulatórios metabólicos e infecciosos. Portanto, este trabalho teve como objetivo avaliar a eficácia do gene de catepsina L-like isoforma CPA como alvo de diagnóstico molecular e como marcador filogenético que permita a compreensão das variações intraespecíficas e elucidem a história evolutiva de L. infantum chagasi no Brasil. Foram utilizados 44 isolados de L. infantum chagasi de diferentes estados brasileiros. Os fragmentos do gene de catepsina L-like foram amplificados, purificados, sequenciados, alinhados manualmente e analisados por métodos filogenéticos de máxima parcimônia e inferência bayesiana. As sequências geradas foram usadas para pesquisar e sintetizar iniciadores a serem usados em reações específicas para o parasita alvo. O gene de catepsina L-like não mostrou variabilidade intraespecífica entre os isolados analisados, sugerindo um evento recente de introdução do mesmo nas Américas. O par de iniciadores propostos amplificou o DNA alvo de isolados de L. infantum chagasi, sendo efetivo na amplificação de DNA em concentrações de até 10-11g / µl. O marcador proposto não apresentou reações cruzadas com outros hemoparasitas de importância clínica. Quando utilizado para o diagnóstico em um painel de amostras clínicas de cães, obteve-se uma frequência de positividade de 49,03% (102/208), contrastando com o valor de 14,42% (30/208) obtido com o marcador para o gene do espaçador ribossomal interno ITS. Quando testado em amostras de flebotomíneos se obteve um valor de 6,25% e em amostras de pacientes humanos o valor foi de 14,28%. Os marcadores também foram eficazes em amplificar DNA extraído de amostras de urina, de sangue fixado em papel filtro e mesmo em amostras de swab de lesões conjuntivas. Este conjunto de parâmetros permite inferir que o CatLeish- PCR é sensível e específico para o diagnóstico de L. infantum chagasi podendo ser aplicado tanto em pesquisas clínicas quanto em inquéritos epidemiológicos de vigilância. / The parasites belonging to the Leishmania genus have a wide distribution. This taxon includes Leishmania infantum chagasi, the etiologic agent of Visceral Leishmaniasis in the Americas, a neglected zoonosis that requires the validation and standardization of satisfactory diagnostic methodologies. Several factors are related to the pathogenesis caused by this protozoan, as Catepsin L-like, a cysteine protease involved in regulatory and infectious processes. Given this information this work aimed to evaluate the effectiveness of Cathepsin L-like isoform CPA as a target for molecular diagnosis and as a phylogenetic marker that allows understanding the intraspecific variations and the evolutionary history of L. infantum chagasi in Brazil. We used 44 isolates of L. infantum chagasi from different Brazilian states. The cathepsin L-like gene fragments were amplified, purified, sequenced, manually aligned and analyzed by maximum parsimony and Bayesian inference methods. The sequences generated were researched to construction of oligonucleotide primers to be used in reactions specific to the target parasite. The Cathepsin L-like gene did not show intraspecific variability among the isolates analyzed, suggesting a recent event of introduction of the same in the Americas. The pair of proposed primers amplified the target DNA of L. infantum chagasi isolates, being effective in DNA amplification at concentrations of up to 10-11g/µl. The proposed marker did not present cross-reactions with other hemoparasites of clinical importance. When used for the diagnosis in a panel of clinical samples of dogs obtained a positive frequency of 49.03% (102/208), against the 14.42% (30/208) to ribosomal ITS marker. Samples of sandflies obtained a value of 6.25% and in humans the value was 14.28%. The markers were also effective in blood samples fixed on filter paper and even in samples from conjunctival lesion swabs. This set of parameters allows to infer that CatLeish-PCR is a sensitive and specific marker for the diagnosis of L. infantum chagasi in clinical and epidemiological surveys.

No Brasil, casos de doença exantemática em bovinos e humanos têm sido relatados em diversas regiões, cujo agente causal é o virus vaccinia pertencente ao gênero Orthopoxirus da família Poxviridae. Classicamente, a varíola bovina é causada pelo Cowpoxvirus, entretanto, outros Poxvirus, como o vírus vaccinia podem desenvolver sintomatologia clínica semelhante. Além de comprometer a cadeia produtiva de leite, uma vez que dificulta a ordenha, predispõe a mastite e descarte do produto, é uma zoonose e atualmente está incluída no diagnóstico de doença vesicular. A origem desses casos bem como a epidemiologia da doença ainda é pouco conhecida. Assim, objetivou-se no presente estudo 1) Avaliar a soroprevalência de Orthopoxirus em rebanhos bovinos do circuito sete do Estado de São Paulo que compreendem as regiões do Vale do Paraíba e Mogi das Cruzes e associar os possíveis fatores de risco envolvidos na transmissão da doença; 2) Detectar e caracterizar a presença de Orthopoxirus em amostras suspeitas de doença vesicular, no período de 2007 a 2009, provenientes de diversas regiões do Brasil utilizando técnicas convencionais e moleculares: microscopia eletrônica, isolamento viral, PCR e RFLP; 3) Sequenciamento e análise filogenética das amostras positivas para o vírus vaccinia. Para o inquérito soroepidemiológico foram analisadas 76 propriedades pertencentes ao circuito 7 que compreendem as regiões do Vale do Paraíba e Mogi das Cruzes, estado de São Paulo, selecionadas aleatoriamente, totalizando 619 animais, estratificados em fêmeas acima de dois anos. A soroprevalência de Orthopoxirus no Vale do Paraíba foi de 32,3% (200/619) pela virusneutralização. Associação positiva foi encontrada para presença de animais silvestres. No diagnóstico virológico foram analisadas 227 amostras de epitélio, negativas para outras doenças vesiculares. Encontrou-se frequencia de 63,4% (144/227) positivas para o Orthopoxirus em praticamente todas as regiões do país. A análise por RFLP revelou perfil de padrão para o vírus vaccinia. O sequenciamento dos isolados confirmou que o vírus vaccinia é a estirpe circulante e está agrupado no grupo I de isolados de vaccinia brasileiros. / In Brazil, cases of rash illness in cattle and humans have been reported in several regions whose causal agent is the vaccinia virus belonging to the genus Orthopoxirus (OPV) family Poxviridae. Classically, cowpox is caused by Cowpoxvirus, however, other poxviruses such as vaccinia virus may develop same clinical signs. In addition to compromising the production chain of milk, as it hampers milking, predisposes to mastitis and discard the product, also it is a zoonosis and is currently included in the differential diagnosis of vesicular disease. The origin of these cases as well as the epidemiology of the disease is still unknown. Thus, the aim of the present study 1) assess the serum prevalence of OPV in cattle herds circuit seven Vale do Paraíba and associate the possible risk factors involved in disease transmission, 2) identify and characterize the presence of OPV in samples suspected vesicular disease in the period 2007-2009, from various regions of Brazil using conventional techniques and molecular electron microscopy, virus isolation, PCR and RFLP; 3) Sequencing and phylogenetic analysis of the samples positive for OPV. For epidemiological survey were analyzed 76 properties in the region of Vale do Paraíba, São Paulo, randomly selected, totaling 619 animals, stratified in females more than two years. The serum prevalence of OPV in the Paraíba Valley was 32.3% (200/619) by virus neutralization. Positive association was found for presence of wild animals. The virological diagnosis were analyzed 227 samples of epithelium, negative for other vesicular diseases. Met frequency of 63.4% (144/227) positive for OPV in practically all regions of the country. RFLP analysis revealed default profile for the vaccinia virus. The sequencing of the isolates confirmed that vaccinia virus strain is circulating and is clustered in group I isolates of Brazilians vaccinia.

Padronizou-se a PCR-Multiplex para a detecção do DNA de Neisseria meningitidis. Para tanto os primers escolhidos foram: RW01, DG74 e COR28 baseados na subunidade menor do ribossomo (16S rRNA) que apresenta regiões de seqüências conservadas encontradas em todas as bactérias conhecidas. Os primers RW01 e DG74 amplificaram o fragmento universal bacteriano de 370 bp e, os primers RW01 e COR28, o fragmento específico de N. meningitidis de 279 bp em uma única etapa. Os resultados obtidos nas amostras de LCR de 168 pacientes pelos métodos de cultura e PCR-Multiplex quando comparados à bacterioscopia mostraram que tal técnica apresentou alta sensibilidade (91,3%) no estudo de amostras de LCR de bacterioscopia positiva, enquanto que a cultura apresentou resultados menores (19,7%). Nas amostras de LCR com bacterioscopia negativa a sensibilidade da PCR-Multiplex (57,8%) também foi mais elevada do que da cultura (10%). Estes dados sugerem que a técnica aqui padronizada é altamente promissora para ser utilizada como método diagnóstico da meningite meningocócica, especialmente nos casos de pacientes submetidos à terapia antibiótica prévia. / The PCR-multiplex technique was standardized to detect N.meningitidis DNA. It was used universal primer for all bacteria showing sequence of minor subunit of 16S ribossome regions (RW01, DG74) by amplification of 370bp fragment and another (COR28) for specific sequence of N. meningitidis, amplifying 279bp fragment in one step. The results obtained in CSF samples of 168 patients by culture and PCR-Multiplex technique when compared with microscopy showed high sensitivity (91,3%) in samples with positive microscopy (81) to Gram negative diplococcus, however the culture presented only 19, 7% of positivity in the same samples. In other hand the CSF samples with negative bacterioscopy (67) the PCR-Multiplex sensitivity (57,8%) was higher to culture (10,0%) too. These data indicate a high sensitivity and specificity of PCR as a tool for a rapid diagnosis of meningococcal meningitis, mainly in that patient submitted to previous antibiotic therapy as in case of this work (90% of patients) besides the possibility of a rational practice of specific treatment.

Submitted by Fabíola Silva (fabiola.silva@famerp.br) on 2016-06-20T21:04:05Z No. of bitstreams: 1 fabiananakashima_tese.pdf: 1263029 bytes, checksum: ea1d05d8998fac5ccacd5e04039e5c2a (MD5) / Made available in DSpace on 2016-06-20T21:04:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 fabiananakashima_tese.pdf: 1263029 bytes, checksum: ea1d05d8998fac5ccacd5e04039e5c2a (MD5) Previous issue date: 2015-12-14 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo - FAPESP / Introduction: Toxoplasma gondii, which causes toxoplasmosis, is an intracellular protozoan that has several transmission routes, among them the transfusion. Objective: To investigate by serological and molecular methods the T. gondii infection in blood donors to assess the risk of transmission via transfusion. Methods: We selected 750 individuals able to donate blood. These individuals were submitted to an interview about their lifestyle habits and a collection of peripheral blood. The immunosorbent assay (ELISA) was used to investigate the presence of anti-T. gondii IgM and IgG classes, and the Nested PCR and qQPCR, the parasitaemia. Positive samples in the molecular methods were submitted for genotyping by the Multilocus Nested PCR RFLP method. Donors with positive molecular result and no positive serology were recalled to investigate seroconversion by ELISA and Indirect Immunofluorescence (IIF). In addition, recipients of blood components with molecular suspected parasitemia were screened. Of these, aliquots were separated from peripheral blood prior to transfusion and after transfusion (± 20 days), which were also analyzed by serological methods (ELISA and IIF) and molecular (PCR, qPCR Mulitplex nested PCR and RFLP). Results: Three hundred and fifty-seven (47.6%) donors had positive result and 393 (52.4%) showed no positive result for the presence of anti-T. gondii IgG class. Twenty-seven (3,6%) showed positive result for IgM and 723 (96.4%) non-reactive. The variables associated with infection by T. gondii were: advanced age (P < 0.0001), consumption of raw milk (P = 0.001), consumption of raw and underare beef and pork meat (P = 0.003), to reside in the countryside (P = 0.004), frequent presence of mechanical vectors in the residence (cockroach, mouse and fly P = 0.02; mice, P = 0.03), lower education (1st grade incomplete, P <0.0001 and 1st grade complete, P = 0.002) and low family income (P = 0.002). No sample was positive by qPCR, but 40 (11%) were positive by Nested PCR and positive serology. However, these samples did not show amplification when undergoing to genotyping. The four cases screened did not show positive results to molecular analysis and no recalled donor presented seroconversion. Conclusion: We concluded that the studied population of blood donors is exposed to various risk factors associated with infection by T. gondii, and it is likely that the high frequency of anti-T. gondii IgG class found in this study is related to this exposure. The results show that there is no molecular evidence of parasitaemia in the studied donors, thus the risk of transmission of this infection via blood transfusion is low or zero in this region. In addition, the failure of genotyping and the non-occurrence of seroconversion of reanalyzed donors suggest that the positivity found in some samples analyzed by Nested PCR, were related to false-positive results. / Introdução: Toxoplasma gondii, causador da toxoplasmose, é um protozoário intracelular que apresenta várias vias de transmissão, dentre elas a transfusional. Objetivo: Investigar por métodos sorológicos e moleculares, a infecção por T. gondii em doadores de sangue para avaliar o risco de transmissão via transfusional. Casuística e métodos: Foram selecionados 750 indivíduos aptos à doação de sangue. Estes indivíduos foram submetidos a uma entrevista sobre seus hábitos de vida e a uma coleta de sangue periférico. Com o ensaio imunoenzimático (ELISA) foi investigada a presença de anticorpos anti-T. gondii das classes IgM e IgG, e por Nested PCR e qPCR a parasitemia. As amostras positivas nos métodos moleculares foram submetidas à genotipagem pelo método Multilocus Nested PCR RFLP. Os doadores com resultados moleculares positivos e sorologias não reagentes foram reconvocados para investigar a soroconversão por ELISA e imunofluorescência indireta (IFI). Além destes, os receptores dos hemocomponentes com suspeita molecular de parasitemia foram rastreados. Destes, foram separadas alíquotas de sangue periférico, antes da transfusão e após a transfusão (±20 dias), as quais também foram analisadas pelos métodos sorológicos (ELISA e IFI) e moleculares (Nested PCR, qPCR e Mulitplex Nested PCR RFLP). Resultados: Trezentos e cinquenta e sete (47,6%) doadores apresentaram resultado reagente e 393 (52,4%) apresentaram resultado não reagente para a pesquisa de anticorpos anti-T. gondii da classe IgG. Vinte e sete (3,6%) apresentaram resultado reagente para IgM e 723 (96,4%) não reagente. As variáveis associadas a infecção por T. gondii foram: média de idade avançada (P < 0,0001), consumo de leite cru (P = 0,001), consumo de carne crua e mal passada de bovino e suíno (P = 0,003), residir na zona rural (P = 0,004), presença frequente de vetores mecânicos na residência (barata, rato e mosca P = 0,02; ratos, P = 0,03), menor grau de escolaridade (1º grau incompleto, P < 0,0001 e 1º grau completo, P = 0,002) e a baixa renda familiar (P = 0,002). Nenhuma amostra foi positiva pela qPCR, mas 40 (11%) apresentaram resultado positivo pela Nested PCR e sorologia reagente. Entretanto, estas amostras ao serem submetidas a genotipagem, não apresentaram amplificações. Os quatro casos rastreados também não apresentaram resultados positivos nas análises moleculares e nenhum doador reconvocado apresentou soroconversão. Conclusão: Concluímos que a população de doadores de sangue estudada está exposta a vários fatores de riscos associados a infecção por T. gondii e, é provável que a elevada frequência de anticorpos anti-T. gondii da classe IgG encontrada neste trabalho esteja relacionada a esta exposição. Os resultados demonstram que não há evidências moleculares de parasitemia nos doadores estudados, portanto o risco de transmissão desta infecção via transfusional é baixo ou nulo para esta região. Além disto, o insucesso da genotipagem e a não ocorrência de soroconversão dos doadores reanalisados sugerem que a positividade, encontrada em algumas amostras analisadas por Nested PCR, tratavam-se de resultados falso-positivos.

Orientadora: Márcia Aparecida Sperança / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do ABC, Programa de Pós-Graduação em Biossistemas, 2013

Orientador: Márcia Aparecida Sperança / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do ABC. Programa de Pós-Graduação em Biossistemas, 2014

Submitted by Cássia Santos (cassia.bcufg@gmail.com) on 2017-01-13T10:53:51Z No. of bitstreams: 2 Tese - Marc Alexandre Duarte Gigonzac - 2016.pdf: 12763622 bytes, checksum: 3479eadda35402525c2387337a3a0d69 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2017-01-16T10:58:58Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Tese - Marc Alexandre Duarte Gigonzac - 2016.pdf: 12763622 bytes, checksum: 3479eadda35402525c2387337a3a0d69 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2017-01-16T10:58:58Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Tese - Marc Alexandre Duarte Gigonzac - 2016.pdf: 12763622 bytes, checksum: 3479eadda35402525c2387337a3a0d69 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2016-02-02 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Goiás - FAPEG / X-Fragile Syndrome (FXS) is the leading cause of inherited intellectual disability in the world and the second of genetic etiology, with an estimated prevalence of 1/4000 men and 1/8000 women. The most common molecular mechanism in SXF is due to changes in the expression of the FMR1 gene, located in Xq27.3, due to CGG trinucleotide expansions in the promoter region and subsequent methylation of the gene. In spite of presenting consistent clinical findings, they are not exclusive, and the existence of carriers of alteration in the FMR1 gene without apparent clinical manifestations makes it impossible to diagnose SXF based only on the evaluation. In the present study, a methodological proposal for the molecular diagnosis of X-Fragile Syndrome was developed from the methylation-specific triple amplification of the promoter region of the FMR1 gene combined with capillary electrophoresis. Thirty-four patients with clinical indication of SXF were referred to a laboratory of the public health network. After extraction and quantification of the DNA, the samples were amplified in an optimized protocol and the products submitted to 36cm capillary electrophoresis to verify the amount of CGG repeats and the degree of DNA methylation of each sample. Pre-mutation (3%) and six complete mutations (18%) were detected, all of which revealed a high degree of methylation. Considering the clinical signs commonly presented, the patients were also analyzed for the occurrence of Autism Spectrum Disorder (ASD), which shadowing and overlapping the SXF, verifying that 100% of the individuals with complete mutation presented the phenotype. Thus, it was possible to observe small behavioral differences in the patients analyzed, indicating a lighter clinical picture regarding aspects of social interaction and stereotypies. Thus, the new methodological proposal allows to effectively determine the CGG trinucleotide expansions in FMR1 allowing an assertive diagnosis of SXF for the families of patients attended in the public health network in Goiás. / A Síndrome do X-Frágil (SXF) é a principal causa de deficiência intelectual herdável no mundo e a segunda de etiologia genética, com uma prevalência estimada de 1/4000 homens e 1/8000 mulheres. O mecanismo molecular mais comum na SXF é decorrente de alterações na expressão do gene FMR1, localizado em Xq27.3, devido a expansões trinucleotídicas CGG na região promotora e subsequente metilação do gene. Apesar de apresentar achados clínicos consistentes, os mesmos não são exclusivos, e a existência de portadores de alteração no gene FMR1 sem manifestações clínicas aparentes impossibilitam o diagnóstico da SXF baseado apenas no exame físico. No presente estudo foi desenvolvido uma proposta metodológica para o diagnóstico molecular da Síndrome do X-Frágil a partir da amplificação tripla metilação-específica da região promotora do gene FMR1 combinada a eletroforese em capilar. Foram utilizados 34 pacientes com indicação clínica de SXF encaminhados para um laboratório da rede pública de saúde. Após extração e quantificação do DNA, as amostras foram amplificadas em protocolo otimizado e os produtos submetidos a eletroforese em capilar de 36cm para verificar a quantidade de repetições CGG e o grau de metilação do DNA de cada amostra. Foram detectadas uma pré-mutação (3%) e seis mutações completas (18%), sendo que todas estas últimas revelaram um alto grau de metilação. Considerando os sinais clínicos comumente apresentados, os pacientes foram também analisados para a ocorrência do Transtorno do Espectro do Autismo (TEA), que sombreia e se sobrepõe à SXF, verificando que 100% dos indivíduos com mutação completa apresentaram o fenótipo. Foi possível observar pequenas diferenças comportamentais nos pacientes analisados, indicando um quadro clínico mais leve quanto aos aspectos da interação social e das estereotipias. Sendo assim, a nova proposta metodológica permite determinar de forma eficaz as expansões trinucleotídicas CGG no FMR1 permitindo um diagnóstico assertivo da SXF para as famílias de pacientes atendidos na rede pública de saúde em Goiás.

Este estudo descreve a análise molecular de pacientes da doença de Gaucher (DG) e Tay-Sachs (DTS) no Brasil. Foram estudados nove casos de formas clássicas da DTS que mostraram uma prevalência da mutação IVS7+1g>c, já descrita em pacientes Portugueses e dez casos das variantes de início juvenil e tardio da DTS, mostrando heterogeneidade genética. Nos casos da variante B1, percebeu-se uma maior incidência da mutação R178H, também descrita previamente em pacientes Portugueses. A presença das mesmas mutações nos casos Brasileiros e Portugueses se deve provavelmente à ancestralidade comum. Uma família com quatro pacientes da variante de início tardio da DTS mostrou uma extensa variabilidade clínica intrafamilial e identificou relevantes aspectos do diagnóstico e das implicações dos programas de triagem populacional. A análise por RFLP de nove mutações causadoras da DG, em 262 pacientes permitiu detectar 76% das alterações e mostrou uma prevalência das mutações N370S e L444P, similar à descrita em diversas outras populações. Os pacientes com variantes neuronopáticas da doença apresentaram uma alta freqüência da mutação G377S, que também é encontrada em pacientes Portugueses. Os pacientes apresentando a G377S indicaram a existência de um provável mecanismo de efeito de dose alélica para essa mutação. Foi observada uma alta freqüência de alelos resultantes da recombinação do gene GBA com seu pseudogene. Diversas outras relações genótipo-fenótipo puderam ser verificadas, mostrando uma baixa penetrância do genótipo N370S/N370S e corroborando a importância do diagnóstico molecular da DG, devido a seu valor preditivo. A análise de mutações raras no gene GBA usando as técnicas de RFLP, dHPLC e seqüenciamento de DNA possibilitou detectar mutações em 84% dos alelos de 54 pacientes. Foram identificadas 14 novas mutações causadoras da DG. Diversas relações genótipo-fenótipo puderam ser verificadas, conferindo valor preditivo para a detecção dessas mutações. Por fim, a análise da associação da DG e da DP permitiu encontrar uma freqüência significativamente maior de portadores das principais mutações no gene GBA em pacientes parkinsonianos (2/65=3%), com aparecimento precoce da doença, comparados a um grupo controle de 267 indivíduos. Esse trabalho fornece nova evidência de que mutações no gene GBA são um raro, mas consistente fator de risco para a DP. / This study describes the molecular diagnosis of Gaucher (GD) and Tay-Sachs disease (TSD) patients in Brazil. Nine cases of the classic infantile form of TSD were analyzed disclosing a prevalence of the IVS7+1g>c mutation, described previously in Portuguese patients. Ten cases of juvenile and late-onset TSD forms were diagnosed showing genetic heterogeneity. Among the B1 variant cases, there was a predomenance of mutation R178H that was also associated to Portuguese ancestry. The presence of the same mutations in Brazilian and Portuguese cases are probably due to common ancestry. A family with 4 affected patients of late onset TSD showed and extensive intrafamilial clinical variability, highlighting relevant characteristics of diagnosis and implications of heterozygote screening programs. Among 263 GD patients, the detection of nine mutations by RFLP revealed 76% of the mutant alleles and a preponderance of N370S and L444P, similar to other populations. The type 3 neuronopathic patients presented a high frequency of mutation G377S, that is also described among Portuguese cases. The patients with G377S indicated the possibility of an allele dose effect for this mutation. Recombinant alleles, presenting pseudogene mutations were detected at a high frequency. Several genotype-phenotype correlations could be verified, highlighting a low penetrance of genotype N370S/N370S and corroborating the importance of molecular diagnosis in GD cases, due to its predictive value. The search for rare mutations at the GBA gene, using dHPLC and DNA sequencing after RFLP analysis, allowed the detection of 84% of the alleles among 54 patients. Fourteen new GD causing mutations were described. Several genotype-phenotype correlations could be established, confering prective value to the identification of these mutations. Finally, the study of the association of GD and Parkinson disease (PD) lead to the detection of a significant increase in the frequency of GBA mutations carriers, among 65 PD patients (2/65=3%) with earlier disease onset compared to a control group (n=267 individuals). This work confers further evidence for the fact that GBA mutations are a rare but consistent risk factor for PD.