O vírus da hepatite E (HEV) é um patógeno emergente de distribuição global, causador de hepatite aguda e crônica em humanos e infecções assintomáticas em animais. No Brasil a prevalência de infecção por HEV em humanos e animais ainda é pouco compreendida, assim como as características de virulência, patogenicidade e de infecção inter-espécies de isolados do genótipo 3, zoonótico, circulantes no país também são desconhecidas. O estudo foi dividido em duas etapas, com os objetivos de 1) contribuir no diagnóstico laboratorial molecular do HEV a partir do desenvolvimento de um protocolo de RT-PCR em tempo real (RT-qPCR) para pesquisa do HEV em amostras biológicas, e 2) contribuir com a compreensão das características moleculares, sorológicas, clínico-laboratoriais, ultrassonográficas e histopatológicas associadas à infecção experimental em macacos-da-noite (Aotus azarai infulatus) por um isolado do genótipo 3 suíno do HEV previamente detectado na Amazônia oriental brasileira. O protocolo de RT-qPCR foi desenvolvido com a caracterização da curva de detecção e aplicado em concomitância com testes sorológicos para avaliação diagnóstica restrospectiva de 318 (n = 318) amostras de soros humanos suspeitos de hepatite E. O HEV-RNA não foi detectado em nenhuma das amostras humanas testadas, mas foi determinada soroprevalência de 3,4% e 5,9% de anti-HEV IgM e IgG, respectivamente, o que indicou baixa prevalência de infecção por HEV, mesmo entre pacientes com suspeita clínica e/ou laboratorial de hepatite E na Amazônia brasileira. O estudo experimental em macacos-da-noite foi desenvolvido durante 12 semanas e os animais infectados, por via intravenosa (n=3) e oral (n=3) (e dois controles), foram avaliados semanalmente para determinação dos parâmetros clínicos, bioquímicos, hematológicos, sorológicos (pesquisa de anti-HEV IgM e IgG por enzimaimunoensaio) e moleculares (HEV-RNA soro e fezes por RT-qPCR). Adicionalmente, os animais também foram submetidos a avaliação hepática mensal por ultrassonografia, histopatologia e pesquisa hepática de antígenos do HEV por imunohistoquímica. Os seis macacos-da-noite infectados apresentaram o HEV-RNA em amostras de soro e/ou fezes, e alguns apresentaram evidências de soroconversão, detecção hepática do antígeno viral por imunohistoquímica associada a alterações clínicas e laboratoriais de hepatite aguda oligossintomática. Assim, o protocolo RT-qPCR demonstrou ser aplicável na pesquisa molecular do HEV em amostras de humanos e animais, representando uma importante ferramenta de diagnóstico laboratorial. O estudo experimental permitiu a primeira validação de um primata neotropical como modelo experimental para estudos de infecção com o genótipo 3 do HEV. / Hepatitis E virus (HEV) is an emerging pathogen with global distribution that causes acute and chronic hepatitis in humans and asymptomatic infections in animals. In Brazil, the prevalence of HEV infection in humans and animals is still poorly understood, and the characteristics of virulence, pathogenicity and inter-species infection of the genotype 3 isolates circulating in the country are unknown. The study was divided in two stages that aimed to 1) contribute to the molecular diagnosis of HEV infection by the development of a real-time RT-PCR protocol (RT-qPCR) for HEV-RNA research in biological samples, and 2) to contribute to understanding of molecular, serological, clinical-laboratory, ultrasonographic and histopathological features of HEV genotype 3 in owl monkeys (Aotus azari infulatus) experimental infected with isolate of swine HEV genotype 3 previously detected in the Eastern Brazilian Amazon. The RT-qPCR protocol was developed with characterization of a quantification standard curve and later applied concurrently with serological tests in the retrospective evaluation of 318 (n = 318) human serum samples of hepatitis E suspected cases. HEV-RNA was not detected in any of human tested samples, but seroprevalence of 3.4% and 5.9% was determined for anti-HEV IgM and IgG, respectively, that indicated a low prevalence of HEV infection, even among patients with clinical and/or laboratory suspicion of hepatitis E in the Brazilian Amazon. The experimental study in owl monkeys was developed during12 weeks and the animals were infected by intravenous (n = 3) and oral (n = 3) routes (and two negative controls) were evaluated for determination of clinical, biochemical, hematological, serological (anti-HEV IgM and IgG by enzyme immunoassay) and molecular (HEV-RNA serum and stool by RT-qPCR) parameters weekly. Additionally, the animals were also evaluated by hepatic ultrasonography, histopathology and immunohistochemistry research of HEV antigens in liver monthly. The six infected owl monkeys presentend HEV-RNA in serum and/or stool, and some monkeys presented with evidence of seroconversion, liver detection of HEV antigens by immunohistochemistry associated with clinical and/or laboratory findings of oligosymptomatic acute hepatitis. Thus, the RT-qPCR protocol demonstrated to be applicable in the molecular investigation of HEV infection in human and animal samples, and it also represented an important laboratory diagnostic tool. The experimental study allowed the validation of the first neotropical primate model for HEV genotype 3 infection studies.

A audição representa a principal fonte para o aprendizado da fala e linguagem durante a infância e a surdez e a privação de estímulos auditivos pode implicar em dificuldades emocionais e sociais àqueles indivíduos afetados. Aproximadamente 360 milhões de pessoas sofrem de perda auditiva no mundo, o que corresponde a 5,3% da população mundial. A surdez pode se desenvolver em decorrência de causas genéticas (hereditárias), não-genéticas e ambientais. As infecções pré-natais e a exposição a ruídos constituem as causas ambientais mais comuns. Já a surdez hereditária, constitui o transtorno neurossensorial mais comum em humanos, com uma prevalência de 1:1000 nascidos vivos. Mais de 70% dos casos de surdez hereditária constituem casos não-sindrômicos, destes cerca de 70% cursam com surdez congênita ou pré-lingual. Na maioria dos casos, a perda auditiva hereditária é neurossensorial, heterogênea, com diferentes padrões de herança e com uma grande quantidade de genes envolvidos. Estudos têm demonstrado o importante papel dos genes GJB2, GJB6 e SLC26A4 na fisiologia do ouvido interno e alterações nestes genes têm sido relatadas como causa da surdez hereditária. Desta forma, o objetivo deste estudo foi investigar a base genética e o papel do gene SLC26A4 na perda auditiva neurossensorial (PANS) nãosindrômica pré-lingual em pacientes atendidos pelo serviço de Genética Médica do Hospital das Clínicas de Ribeirão Preto. Para isso, uma série de 88 casos foi investigada quanto a características clínicas e moleculares. A amostra abrangeu indivíduos de ambos os sexos, com idade de 2 a 63 anos, provenientes de 88 famílias diferentes, assistidos durante o período de 2003 a 2013. As amostras foram triadas pela técnica de High Resolution Melting (HRM) e em seguida levadas para o seqüenciamento para caracterização das alterações. Na série de casos estudada, 23,9% (21/88) dos pacientes portadores de surdez neurossensorial não-sindrômica pré-lingual evidenciaram alterações nos genes GJB2, GJB6 e SLC26A4 sugeridas como patogênicas. A prevalência de alterações no gene SLC26A4 foi de 28,4% (25/88), não relacionada à Síndrome do Aqueduto Vestibular Alargado (SAVA). Dentre as 11 alterações encontradas neste gene, três constituem mutações não descritas: p.Gly139Arg, p.Ile254Val, p.Asn382Lys. Os genótipos mais freqüentes neste estudo foram a c.35delG/c.35delG no gene GJB2 (5/88), a dupla heterozigose com o gene GJB6 c.35delG/del(GJB6-D13S1854) (3,4%) e chr7:g.107301238C>G/wt no gene SLC26A4 (10,2%). Entretanto, apenas 19,3% dos indivíduos apresentaram genótipos sugeridos como responsáveis pelo fenótipo estudado. Alterações particulares no gene SLC26A4 podem sugerir a explicação para a surdez genética para aproximadamente 9,1% destes casos. Destes, cinco casos de heterozigose preditas como patogênicas (p.Ile300Leu; p.Asn324Tyr e p.Asn382Lys), dois casos de heterozigose composta (chr7:g.107301201T>C/chr7:g.107301238C>G e chr7:g.107301238C>G/p.Gly139Arg) e um caso de dupla heterozigose com GJB2 (chr7:g.107301238C>G/c.35delG). Isto ressalta a importância do gene SLC26A4 para o diagnóstico molecular de surdez hereditária e reforça a sua potencial contribuição para o processo de aconselhamento genético. Entretanto, nossos dados sugerem a necessidade de testes funcionais a fim de elucidar o papel destas alterações para o estabelecimento do fenótipo, como também, a presença de outros genes ou regiões envolvidas naqueles casos em que mutações monoalélicas não foram suficientes para justificar o fenótipo. / The hearing is the main source for learning speech and language during childhood and deafness and deprivation of auditory stimuli can result in emotional and social difficulties to those affected individuals. Approximately 360 million people suffer from hearing loss worldwide which corresponds to 5.3% of the world population. Deafness may develop due to genetic (hereditary), non-genetic and environmental causes. Prenatal infections and exposure to noise are the most common environmental causes. Hereditary deafness is the most common sensorineural disorder in humans, with a prevalence of 1:1000 live births. More than 70% of hereditary deafness cases are nonsyndromic, about 70% of these occur with congenital or prelingual deafness. In most cases, inherited sensorineural hearing loss is heterogeneous, with different patterns of inheritance and with a large number of genes involved. Studies have shown the important role of genes GJB2, GJB6 and SLC26A4 in the physiology of the inner ear and changes in these genes have been reported as cause of hereditary hearing loss. Thus, the aim of this study was to investigate the genetic basis and the role of SLC26A4 gene in non-syndromic prelingual sensorineural hearing loss (SNHL) in patients enrolled in the Medical Genetics Service of Hospital das Clínicas de Ribeirão Preto. For this, a series of 88 cases were submitted to a clinical and molecular investigation. The sample consisted of individuals of both sexes, aged 2-63 years from 88 different families, assisted during the period 2003-2013. The samples were screened by the technique of High Resolution Melting (HRM) and then taken for sequencing to characterize the mutations. In the series of cases studied, 23.9% (21/88) of patients with non-syndromic prelingual sensorineural deafness showed variants in genes GJB2, GJB6 and SLC26A4 suggested as pathogenic. The prevalence of mutations in the SLC26A4 gene was 28.4% (25/88), not related to non-syndromic EVA. Among the 11 mutations found in this gene, three are reported as novel mutations: p.Gly139Arg, p.Ile254Val, p.Asn382Lys. The most frequent genotypes found in this study were the c.35delG/c.35delG in GJB2 gene (5/88), the double heterozygosity with GJB6 gene c.35delG/del(GJB6-D13S1854) (3,4%) and chr7:g.107301238C>G/wt in the SLC26A4 gene (10,2%). However, only 19.3% of subjects presented genotypes suggested as responsible for the studied phenotype. Particular mutations in the SLC26A4 gene may suggest the explanation for the genetic deafness to approximately 9.1% of these cases. Of these, five cases of heterozygosity predicted as pathogenic (p.Ile300Leu; p.Asn324Tyr and p.Asn382Lys), two cases of compound heterozygosity (chr7:g.107301201T>C/chr7:g.107301238C>G and chr7:g.107301238C>G/p.Gly139Arg) and one case of double heterozygosity with GJB2 gene (chr7:g.107301238C>G/c.35delG). Those data highlights the importance of the SLC26A4 gene for molecular diagnosis of hereditary hearing loss and give strength to its potential contribution to the genetic counseling process. However, our data suggest the need for functional tests in order to elucidate the role of these changes to the phenotype, as well as the presence of other genes or regions involved in those cases that monoallelic mutations were not sufficient to justify the phenotype.

Orientador: Helio Jose Montassier / Resumo: As infecções do trato respiratório de aves têm-se constituído em problemas crescentes e com marcantes consequências negativas sobre a produção avícola em várias partes do mundo, notadamente onde a avicultura é mais desenvolvida como no Brasil. Dentre essas enfermidades, destacam-se as micoplasmoses aviárias e a pneumovirose aviária, que, apesar de suas relevâncias em sanidade avícola, não têm sido investigadas de forma sistematizada no Brasil, em especial no que concerne à interação entre esses agentes ou a ocorrência de co-infecção em frangos de corte. O presente estudo investigou a ocorrência de infecção por Mycoplasma gallisepticum (MG) e pelos subtipos A ou B de Metapneumovírus aviário (AMPV) em frangos de corte de plantéis avícolas comerciais mantidos em granjas mais tecnificadas localizadas nas regiões Sudeste e Centro-Oeste do Brasil. Para tanto, as técnicas de PCR e de RT-Nested-PCR foram usadas na detecção e/ou identificação, respectivamente de MG e AMPV em amostras de suabes nasais e traqueais colhidos de 87 lotes de frangos de corte com problemas respiratórios e oriundos de 15 granjas de produção comercial de frangos de corte. Dos lotes amostrados, dois deles em um total de 87 (2,3%) e de uma única granja da região Sudeste, mostraram-se positivos para MG, enquanto que nenhum dos lotes investigados revelou-se positivo para AMPV. A baixa ou nenhuma incidência desses agentes pode ser explicada pela utilização de medidas cada vez mais efetivas para o controle sanitário... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Respiratory infections of poultry may be an increasing and negative problem with poultry production in several parts of the world, especially when poultry farming is more widely used than in Brazil. These diseases include avian mycoplasmosis and avian pneumovirosis, which, despite their relevance in poultry health, have not been systematically investigated in Brazil, especially with regard to the interaction between these agents or the occurrence of co-infection in broilers. The present study investigated the occurrence of infection by Mycoplasma gallisepticum (MG) and A or B subtypes of avian Metapneumovirus (AMPV) in broiler commercial poultry farms located in the Southeast and Center-West regions of Brazil. For this, PCR and RT-Nested-PCR techniques were used in the detection and / or identification, respectively of MG and AMPV in nasal and tracheal swab samples collected from 87 lots of broilers with respiratory problems and from 15 commercial production of broilers. Of the sampled lots, two of them in 87 (2.3%) were positive for MG, whereas none of the lots were positive for AMPV. The low or no incidence of these agents can be explained by the use of increasingly effective measures for the sanitary control of these agents in the commercial farms of sampled broilers. Our findings also suggest, however, that other bacterial and viral infectious agents not investigated in this study may be involved in the etiology of the respiratory problems of these birds, since those that... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Made available in DSpace on 2014-08-13T14:50:38Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013-11-27Bitstream added on 2014-08-13T18:01:34Z : No. of bitstreams: 1 000744257.pdf: 1345587 bytes, checksum: 884d34a74775bc0bdd270eedb4458762 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Cryptosporidium serpentis infection is common in reptiles, especially snakes, and is characterized by chronic infection with severe hypertrophic gastritis, which can be lethal. This research aimed to use the real- time polymerase chain reaction (PCR) targeting the heat shock protein gene (Hsp70) for detection of C. serpentis in fecal samples of 503 snakes, and to determine its analytical and epidemiological specificity and sensitivity using, as a gold standard, the nested PCR targeting the 18S rRNA (18S rRNA) gene followed by sequencing of the amplified fragments (nPCR/S). The real-time PCR was positive for C. serpentis in 17 samples (3.37%), and nPCR/S resulted in positive results for C. serpentis in 15 samples (2.98%). It was also observed that the nPCR/S was positive for Cryptosporidium spp. in 60 samples (11.98%). Sequencing of the fragments amplified by nPCR was possible in 38 samples, and resulted in the identification of Cryptosporidium tyzzeri, Cryptosporidium muris, Cryptosporidium varanii and C. serpentis in several species of snakes. The sensitivity and specificity of real-time PCR were, respectively, 93.8% and 99.5%. Although three samples were positive for C. serpentis only by real-time PCR, and were considered as false positive results in the estimation of the epidemiological specificity and sensitivity, the melting curve analysis indicated that these samples had the same melting temperature of the C. serpentis samples. Thus, we conclude that real-time PCR targeting the gene Hsp70 is a sensitive and specific method for the detection of C. serpentis in fecal samples from snakes / FAPESP: 07/54312-2

Orientador: Marcia Aparecida Silva Graminha / Banca: Paulo Inácio da Costa / Banca; Rosangela Zacarias Machado / Resumo: Leishmania spp. são protozoários pertencentes à família Trypanosomatidae e agentes etiológicos das leishmanioses. Estima-se que estão em risco de contrair leishmanioses 350 milhões de pessoas em 98 países em diferentes continentes. Dentre as manifestações clínicas existentes, leishmaniose cutânea, mucocutânea e visceral, esta última é a mais severa e apresenta o maior número de óbitos. A Leishmania infantum é o agente causador da leishmaniose visceral nas Américas, na China e na bacia do Mediterrâneo, apresentando o cão como reservatório de importância epidemiológica. A Leishmania é um modelo experimental biológico que vem sendo explorado por vários pesquisadores ao redor do mundo, e isso tem proporcionado estudos por meio de tecnologias genômicas, proteômicas e metabolômicas. Muitas das sequências estudadas dentro desse grupo de parasitos são conservadas e são gênero ou, até mesmo, espécie específicas e têm sido utilizadas para diagnósticos moleculares. Para esse último são requeridos testes de alta sensibilidade e especificidade. De modo a proporcionar maior sensibilidade aos testes, novas ferramentas baseadas em métodos moleculares estão sendo desenvolvidas. Dentro desse contexto, este estudo visa avaliar a aplicação de um gene específico para L. infantum, denominado TGMACK na utilização em diagnóstico molecular de leishmaniose visceral canina, por meio de técnicas de PCR (Reação em Cadeia da Polimerase) convencional e em tempo real. Este trabalho revelou que o gene em est... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Leishmania spp. are protozoa belonging to the family Trypanosomatidae and etiological agents of leishmaniasis. It is estimated that 350 million people are at risk of contracting leishmaniasis in 98 countries on different continents. Among the existing clinical manifestations, cutaneous, mucocutaneous and visceral leishmaniasis, the latter is the most severe and presents the highest number of deaths. Leishmania infantum is the causative agent of visceral leishmaniasis in the Americas, China and the Mediterranean Basin, presents the dog as a reservoir of epidemiological importance. Leishmania is an experimental biological model that has been explored by several researchers around the world, and this is an example for the genome, proteomics and metabolomics technologies. Many of the sequences studied within the parasite group are conserved and are genus or even specific species and have been difficult for molecular diagnostics. For the latter, tests of high sensitivity and specificity are required. In order to provide more information on testing, new tools based on molecular methods are being developed. In the context, this study aims to evaluate an application of a specific gene for L. infantum, denominated TGMACK in the use in molecular diagnosis of canine / human visceral leishmaniasis, by means of PCR (Polymerase Chain Reaction) techniques. This work revealed that the gene under study is specific especies for the L. infantum, and there is no cross-reaction with other parasit... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Orientador: Rosangela Zacarias Machado / Banca: Cristiane Divan Baldani / Banca: Carlos Termignoni / Banca: Marcos Rogério André / Banca: Cristina Harumi Adania / Resumo: Agentes das Ordens Rickettsiales, Haemosporida e Rhizobiales são causadores de enfermidades que acometem várias espécies animais, podendo representar um risco à saúde dos mesmos, inclusive de seres humanos. Aves carnívoras podem infestar-se e infectar-se com muitas espécies de parasitas, incluindose carrapatos e hemoparasitas, sendo os hábitos de predação fatores de favorecimento à transmissão e translocação de diversos agentes etiológicos. O objetivo deste estudo foi pesquisar, por meio de métodos indiretos (Reação de Imunofluorescência Indireta - RIFI) e diretos (esfregaços sanguíneos, PCR em Tempo Real e PCR Convencional) os agentes das Famílias Anaplasmataceae (Ehrlichia, Anaplasma, Neorickettsia), Bartonellaceae (Bartonella spp.) e Ordem Haemosporida (Plasmodium, Haemoproteus e Leucocytozoon) em ectoparasitas e amostras de sangue de aves carnívoras, realizando-se um estudo filogenético dos agentes encontrados. Para tanto, procedeu-se à colheita de 121 amostras de sangue total e 88 amostras de soro de aves pertencentes às Ordens Accipitriformes, Falconiformes, Strigiformes e Cathartiformes, capturadas nos estados de São Paulo e Rio de Janeiro. Em relação aos ectoparasitas, foram recolhidas três larvas e uma ninfa ingurgitada de carrapatos do gênero Amblyomma de um gavião carijó (Rupornis magnirostris) no Estado de São Paulo. Na RIFI para E. chaffeensis e A. phagocytophilum, 03 (3,41%) e 05 (5,68%) amostras apresentaram sororreatividade, respectivamente. Todas as amostras testadas na RIFI para E. canis mostraram-se negativas. Na avaliação de esfregaços sanguíneos corados pelo Giemsa, não foram encontradas estruturas compatíveis com hemoparasitas. Em relação a PCR em Tempo Real (qPCR), não foram encontrados animais PCR positivos para Ehrlichia chaffeensis (gene vlpt) e Anaplasma phagocytophilum (gene msp-2). Na qPCR Multiplex para Ehrlichia spp., Anaplasma spp. (gene groE) e... / Abstract: Rickettsiales, Haemosporida and Rhizobiales agents cause diseases that affect various animal species, including humans. Carnivorous birds become infested and infected with many species of parasites, including ticks and hemoparasites, and the predation habits favoring transmission and translocation of various etiological agents. The aim of this study was to investigate, using indirect methods (Immunofluorescence - IFAT) and direct methods (blood smears, Real-Time PCR and Conventional PCR) agents of Families Anaplasmataceae (Ehrlichia, Anaplasma, Neorickettsia), Bartonellaceae (Bartonella spp.) and Haemosporida Order (Plasmodium, Haemoproteus and Leucocytozoon) in ectoparasites and blood samples carnivorous birds, performing a phylogenetic study of these agents. Therefore, we collected 121 blood samples and 88 serum samples from birds belonging to the Accipitriformes, Falconiformes, Strigiformes and Cathartiformes Orders, captured in the states of São Paulo and Rio de Janeiro. Regarding the ectoparasites, we collected three larvae and one engorged nymphal Amblyomma ticks of a Rupornis magnirostris in São Paulo. At IFAT for E. chaffeensis and A. phagocytophilum, 03 (3.41%) and 05 (5.68%) samples showed seroreactivity, respectively. Blood smears stained by Giemsa were analyzed and hemoparasites were not found. Regarding the Real-Time PCR (qPCR), in multiplex qPCR for Ehrlichia spp., Anaplasma spp. (groE gene) and Bartonella spp. (nuoG gene) observed 12 samples positive for Anaplasma spp. (9.91%). In conventional PCR-based 16SrRNA gene for Anaplasmataceae and cytochrome B gene for hemosporidia, eight birds were PCR positive for Ehrlichia spp (6.61%, five in PCR for E. chaffeensis and three in PCR for E. canis), three for Haemoproteus spp (2.48%) and Plasmodium spp (0.83%). In phylogenetic analysis, four samples of Ehrlichia spp. positioned on the same branch Ehrlichia identified in wild animals in Brazil and the US human isolate. The ... / Doutor

Resumo:A infecção por Cryptosporidium serpentis é comum em répteis, em particular em serpentes, e é caracterizada por infecção crônica com presença de gastrite hipertrófica grave, que pode ser letal. Esta pesquisa teve como objetivo utilizar a reação em cadeia da polimerase (PCR) em tempo real, tendo como alvo o gene da proteína do choque térmico (Hsp70), para detecção de C. serpentis em amostras fecais de serpentes, e determinar a sua especificidade e sensibilidade analíticas e epidemiológicas utilizando, como padrão ouro, a nested PCR para amplificação de fragmento parcial do gene da subunidade 18S do rRNA (18S rRNA) seguida de sequenciamento dos fragmentos amplificados (nPCR/S). A PCR em tempo real foi positiva para C. serpentis em 17 amostras (3,37%), enquanto a nPCR/S resultou em positividade para C. serpentis em 15 amostras (2,98%). A nPCR/S resultou em positividade para Cryptosporidium spp. em 60 amostras (11,98%). O seqüenciamento dos fragmentos amplificados pela nPCR foi possível em 38 amostras e resultou na identificação de Cryptosporidium tyzzeri, Cryptosporidium muris, Cryptosporidium varanii e C. serpentis, em diversas espécies de serpentes. Os valores de sensibilidade e especificidade epidemiológicas da PCR em tempo real foram, respectivamente, 93,8% e 99,5%. Embora três amostras tenham apresentado positividade para C. serpentis apenas pela PCR em tempo real, e foram consideradas como resultado falso positivo na estimativa da especificidade e sensibilidade epidemiológicas, a análise da curva de dissociação indicou que essas amostras apresentaram a mesma temperatura de dissociação que as amostras de C. serpentis. Assim, concluiu-se que a PCR em tempo real, visando ao gene Hsp70 é um método sensível e específico para detecção de C. serpentis em amostras fecais de serpentes / Abstract:Cryptosporidium serpentis infection is common in reptiles, especially snakes, and is characterized by chronic infection with severe hypertrophic gastritis, which can be lethal. This research aimed to use the real- time polymerase chain reaction (PCR) targeting the heat shock protein gene (Hsp70) for detection of C. serpentis in fecal samples of 503 snakes, and to determine its analytical and epidemiological specificity and sensitivity using, as a gold standard, the nested PCR targeting the 18S rRNA (18S rRNA) gene followed by sequencing of the amplified fragments (nPCR/S). The real-time PCR was positive for C. serpentis in 17 samples (3.37%), and nPCR/S resulted in positive results for C. serpentis in 15 samples (2.98%). It was also observed that the nPCR/S was positive for Cryptosporidium spp. in 60 samples (11.98%). Sequencing of the fragments amplified by nPCR was possible in 38 samples, and resulted in the identification of Cryptosporidium tyzzeri, Cryptosporidium muris, Cryptosporidium varanii and C. serpentis in several species of snakes. The sensitivity and specificity of real-time PCR were, respectively, 93.8% and 99.5%. Although three samples were positive for C. serpentis only by real-time PCR, and were considered as false positive results in the estimation of the epidemiological specificity and sensitivity, the melting curve analysis indicated that these samples had the same melting temperature of the C. serpentis samples. Thus, we conclude that real-time PCR targeting the gene Hsp70 is a sensitive and specific method for the detection of C. serpentis in fecal samples from snakes / Orientador:Marcelo Vanconcelos Meireles / Banca:Alex Akira Nakamura / Banca:Valéria de Sá Jayme / Banca: Carlos Noriyuki Kaneto / Banca:Roberta Lemos Freire / Doutor

Submitted by Diogo Misoguti (diogo.misoguti@gmail.com) on 2018-04-18T13:18:24Z No. of bitstreams: 1 Tese-15860.pdf: 879437 bytes, checksum: c869f5350ca0a0b0f13be8ba348f8fa5 (MD5) / Approved for entry into archive by Mariusa Loução (mariusa.loucao@unifesp.br) on 2018-04-18T13:20:15Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Tese-15860.pdf: 879437 bytes, checksum: c869f5350ca0a0b0f13be8ba348f8fa5 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-04-18T13:20:15Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese-15860.pdf: 879437 bytes, checksum: c869f5350ca0a0b0f13be8ba348f8fa5 (MD5) Previous issue date: 2016 / O uso da biologia molecular como ferramenta de diagnóstico microbiológico vem se expandindo no setor da medicina laboratorial. Novas plataformas aparecem com a prerrogativa de facilitar e acelerar o processo de análise. O uso de sistemas automatizados, que realizam extração, amplificação e detecção de ácidos nucleicos dentro da mesma plataforma, permite maior precisão e facilidade ao desenvolvimento de um novo teste por apresentarem todos os processos acoplados e reagentes disponíveis para o processo. Dentre as plataformas automatizadas, uma das que se destacam é o BD Max™ (Becton Dickinson Diagnostics). O sistema BD Max é uma plataforma automatizada aberta, que combina a extração de ácidos nucleicos, PCR (Reação de Polimerização em Cadeia) em tempo real e detecção dentro do mesmo instrumento, oferecendo a opção de usar os testes aprovados pelo Food and Drug Administration (FDA) e também, testes desenvolvidos pelo usuário. Com o objetivo de testar os recursos que a modalidade aberta da plataforma BD Max oferece, foram desenvolvidos três estudos distintos para o diagnóstico molecular de agentes infecciosos direto de amostras clínicas. Estudo 1: O objetivo deste estudo foi validar um teste multiplex usando a tecnologia PCR em tempo real no sistema aberto BD MAX™, para detectar o complexo Mycobacterium tuberculosis (CMT), complexo Mycobacterium avium (CMA) e Mycobacterium spp. (PAN) diretamente de amostras clínicas. Quando os resultados do novo teste foram comparados com os resultados da cultura, a reação de PCR apresentou especificidade de 97,1%, 100% e 100% para CMT, CMA e PAN, respectivamente. Estudo 2: O objetivo deste estudo foi validar um teste multiplex usando a tecnologia PCR em tempo real no sistema aberto BD MAX™ para detectar o grupo Mycobacterium abscessus (GMA), complexo Mycobacterium fortuitum (CMF) e Mycobacterium chelonae (MC), diretamente de amostras clínicas. Quando os resultados do novo teste foram comparados com os resultados da cultura, uma concordância de 97%, 100% e 99% para GMA, CMF e MC, respectivamente foi observada. Estudo 3: O objetivo deste estudo foi validar um teste multiplex usando a tecnologia PCR em tempo real no sistema aberto BD MAX™ para detectar e identificar Achromobacter xylosoxidans (AX), Burkholderia cepacia (BC), Pseudomonas aeruginosa (PSA) e Stenotrophomonas maltophilia (SM) diretamente de amostras respiratórias de pacientes portadores de Fibrose Cística (FC). Quando os resultados do novo teste foram comparados com os resultados da cultura, uma alta concordância foi observada entre as duas metodologias. Conclusão: Os 3 testes desenvolvidos provaram ser específicos e sensíveis para detectar por PCR em tempo real microrganismos causadores de infeção direto da amostra clínica. A plataforma automatizada BD Max provou ser uma excelente ferramenta para a realização de testes moleculares automatizados. / The use of molecular biology as a tool for microbiology diagnostic has been expanding in the laboratory routine. Despite of the strong growth of the area, companies can not afford the demand about epidemiological changes around the world and for this reason laboratories opt to develop their own methods. New platforms appear with the prerogative to facilitate and accelerate the analysis process. The use of automated sample-in results-out platforms allows higher precision and facilitates the development of a new test by presenting all attached processes and reagents available for the test. Among platforms that best fits this profile, the BD Max™ (BD Diagnostics) is one of the most used ones. The BD Max system is an automated open platform that combines extraction and real time PCR in the same instrument, offering the option of using tests approved by the FDA or the open platform mode for userdeveloped test. In order to explore the BD Max open mode platform, three differents studies were developed to detect the microorganisms that causes infection directly from clinical samples. Study 1: A multiplex real time PCR was validated on the BD MAX™ open mode system to detect Mycobacterium tuberculosis complex (MTC), Mycobacterium avium complex (MAC) and Mycobacterium spp. (PAN) directly from clinical specimens. When compared to culture results, the new BD MAX PCR test presented specificities of 97.1%, 100% and 100% for MTC, MAC and PAN, respectively. Study 2: A multiplex real time PCR was validated on the BD MAX™ open mode system to detect Mycobacterium abscesses Group (MAG), Mycobacterium fortuitum complex (MFC) and Mycobacterium chelonae (MC) directly from clinical specimens. When compared to culture results, the new BD Max PCR test presented an overall agreement of 97%, 99% and 100% for the detection of MAG, MFC and MC, respectively. Study 3: A multiplex real time PCR was validated on the BD MAX™ open mode system to detect Achromobacter xylosoxidans (AX), Burkholderia cepacia (BC), Pseudomonas aeruginosa (PSA) and Stenotrophomonas maltophilia (SM) directly from clinical specimens collected from Cystic Fibrosis patients. When culture results were compared to the new BD Max PCR test results, a high overall agreement were observed between both methodologies. Conclusion: All 3 tests proved to be specific and sensitive to detect different microorganisms associated with infections, directly from clinical samples. The BD Max proved to be an excellent tool for automated molecular tests.

Made available in DSpace on 2012-05-07T14:44:01Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) 000068.pdf: 816656 bytes, checksum: c8740fc970374a5b1d5b8e0e1ab000ba (MD5) Previous issue date: 2007 / A cólera é uma doença bacteriana historicamente conhecida por seu potencial de provocar epidemias, tendo levado milhares de indivíduos à morte. É causada pelo bacilo Gramnegativo Vibrio cholerae O1 toxigênico. No Brasil, apesar de grandes avanços no que se refere a prevenção, a infecção ainda persiste e, embora não seja causa de alta mortalidade, sua presença é motivo de preocupação para a rede de Saúde Pública local. A infecção colérica é endêmica no nordeste brasileiro e está relacionada, principalmente, a condições sanitárias precárias. O diagnóstico clássico da infecção é a cultura bacteriana, complementada pela detecção da toxina colérica, o que retarda o resultado do exame. O objetivo principal deste trabalho foi avaliar a técnica de nested PCR em tubo único com dois genes alvos (MSTNPCR) na detecção de V. cholerae O1 diretamente do meio de cultura. Utilizando DNA, a técnica foi capaz de amplificar até 1 pg de V. cholerae O1, além de ter possibilitado a detecção do vibrião diretamente do meio de cultura líquido, sem prévia extração de DNA, apresentando limite de detecção de três Unidades Formadoras de Colônia. Além disso, a MSTNPCR mostrou-se específica para V. cholerae O1 quando testada com vários microrganismos diferentes. Um kit diagnóstico foi montado e estocado a -20 ºC, permanecendo estável durante os quatro meses em que foi testado. A MSTNPCR descrita neste trabalho pode ser útil no diagnóstico da infecção colérica e em investigações epidemiológicas, complementando os resultados obtidos com a cultura bacteriana

Made available in DSpace on 2015-10-21T12:25:06Z (GMT). No. of bitstreams: 2 moyra_portilho_ioc_mest_2013.pdf: 2657721 bytes, checksum: ac38c443da941a1c7b8e800b3c858856 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2015-04-14 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A detecção e quantificação do DNA do vírus da hepatite B (HBV) são importantes para o diagnóstico da infecção, definição e monitoramento do tratamento antiviral. Entretanto o diagnóstico molecular é difícil em áreas remotas ou com poucos recursos devido ao custo dos métodos comerciais e pouca infra-estrutura para coleta, armazenamento e transporte de amostras de sangue. O objetivo deste estudo foi desenvolver um método para quantificação do DNA do HBV em amostras de soro e fluido oral, e avaliar um método qualitativo \201Cin house\201D para detecção do DNA do HBV em comparação com métodos comerciais disponíveis no mercado. Amostras pareadas de soro e fluido oral foram obtidas de 116 indivíduos, onde 66 eram reagentes para HBsAg no soro e 50 não apresentavam nenhum marcador sorológico no soro. As amostras de soro foram submetidas a testes imunoenzimáticos para detecção de marcadores sorológicos do HBV (HBsAg, anti-HBc, anti-HBs, anti-HBcIgM, anti-HBe e HBeAg) e ao PCR em tempo real para quantificação do DNA do HBV (COBAS TaqMan HBV, Roche). O DNA do HBV foi extraído utilizando o conjunto de reagentes \201CHigh Pure Viral Nucleic Acid kit\201D (Roche Diagnostics, EUA) em amostras de soro e \201CRTP® DNA/RNA Virus Mini kit\201D (Invitek, Alemanha) para amostras de fluido oral Para a detecção qualitativa do HBV foi realizada uma PCR com iniciadores para o gene do core, e para detecção quantitativa do HBV foi utilizada a metodologia de PCR em tempo real com sondas TaqMan® na plataforma Line-Gene 9600 (Bioer Serves Life, Canada). Para obtenção da curva de quantificação foi construído um plasmídeo recombinante obtido a partir de amostras padrão do painel de quantificação do HBV (Optiquant HBV, Acrometrix, Life Technologis, EUA). As seguintes condições da PCR em tempo real foram avaliadas: concentração de DNA (5 e 7,5\03BCL), temperatura de hibridização (60°C e 62°C), e números de ciclos (40 e 45 ciclos). A sensibilidade analítica da PCR em tempo real foi estimada em 10 cópias de HBV DNA/mL e a faixa de quantificação abrangeu cerca de 8 logs de 10. Para quantificação do DNA do HBV em soro e fluido oral foi necessário o aumento da temperatura de hibridização, e para o fluido oral também foi necessário o aumento da concentração de DNA (7,5 \03BCL) e do número de ciclos (45). Entre as amostras de soro HBsAg reagentes, 64 foram quantificadas pela PCR em tempo real comercial e 28 pelo teste quantitativo \201Cin house\201D com carga viral média igual a 3,993 ± 1,922 e 3,761± 1,829 log cópias de HBV DNA/mL (r=0,7643; p<0,0001), respectivamente, e concordância de 37,87% Por outro lado, 8 amostras de fluido oral amplificaram pelo método quantitativo \201Cin house\201D, com carga viral média igual a 4,459 ± 1,127 log cópias de HBV DNA/mL (r=- 0,2994; p= 0,9453). A PCR qualitativa \201Cin house\201D foi capaz de detectar o DNA do HBV em 50 amostras de soro HBsAg reagentes apresentando 75% de concordância com o teste comercial quantitativo (p=1,000), porém somente uma amostra de fluido oral foi detectada por este método. Concluímos que as metodologias qualitativa e quantitativa para detecção do DNA do HBV analisadas neste estudo apresentaram boa eficiência em amostras de soro, porém não foram eficientes em amostras de fluido oral. Estas metodologias podem ser bastante úteis para detecção molecular do HBV em áreas com recursos limitados / The detection and quantification of the DNA of Hepa titis B virus (HBV) are important to diagnose the infection, determine and monitore the antiviral treatment. However, the molecular diagnosis is difficult in remote areas or presenting low resources, because of the cost of commercial methods and few infrastructu re for collection, storage and transport of blood samples. The objective of this s tudy was to develop a method for quantification of HBV DNA in serum and oral fluid s amples, and to evaluate an in house qualitative method for HBV DNA detection compared t o commercial methods available in the market. Paired serum and oral fluid were obtain ed from 116 individuals, where 66 were HBsAg reactive in their sera and 50 did not pr esent any HBV serological marker in sera. Serum samples were submitted to enzyme immuno assays for detection of HBV serological markers (HBsAg, anti-HBc, anti-HBs, ant i-HBcIgM, HBeAg and anti-HBe) and quantified by commercial real time PCR (COBAS® TaqM an HBV Test, Roche Diagnostics, EUA). HBV DNA was extracted using the commercial kit "High Pure Viral Nucleic Acid Kit" (Roche Diagnostics, USA) in serum samples and "RTP ® DNA / RNA Virus Mini Kit" (Invitek, Germany) for oral fluid s amples. For HBV qualitative detection it was employed a PCR using primers for Core gene, and for quantitative detection of HBV it was employed a real time PCR methodology with Ta qMan ® probes in the Line-Gene 9600 (Bioer Serves Life, Canada) platform. To obtai n the quantification curve, a recombinant plasmid was constructed using standard quantification panel of HBV (Optiquant HBV, Acrometrix, Life Technologis, USA). The following PCR conditions were evaluated in real time PCR: DNA concentration (7.5 and 5 μL), annealing temperature (60° C and 62° C), number of cycles (cycles 40 and 45). The analytical sensitivity of real- time PCR was estimated at 10 HBV DNA copies/mL and the quantitation range comprised about 8 logs of 10. For quantification of HBV DNA in serum and oral fluid, it was necessary to increase the annealing temperature , and for oral fluid, it was also necessary to increase the concentration of DNA (7.5 μL) and the number of cycles (45). Among HBsAg reactive serum samples, 64 were quantif ied by commercial real time PCR and 28 by “in house” quantitative test, with mean v iral load equal to 3,993 ± 1,922 e 3,761± 1,829 log copies of HBV DNA/mL (r=0,7643; p< 0,0001), respectively, and concordance of 66.6%. Moreover, eight oral fluid sa mples were amplified by quantitative "in house" method, with average viral load equal to 4,459 ± 1,127 log copies of HBV DNA/mL (r=-0.2994, p=0,9453). The qualitative "in h ouse" PCR was able to detect HBV DNA in 50 HBsAg reactive serum samples, showing 75% of agreement with the commercial test (p=1.000), but only 1 oral fluid sa mple has been detected by this method. We concluded that the qualitative and quant itative methods for the detection of HBV DNA analyzed in this study presented good effic iency in serum samples, but they were not effective among oral fluid samples. These methodologies can be useful for molecular detection of HBV in areas with limited re sources