Made available in DSpace on 2015-10-21T12:25:06Z (GMT). No. of bitstreams: 2 moyra_portilho_ioc_mest_2013.pdf: 2657721 bytes, checksum: ac38c443da941a1c7b8e800b3c858856 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2015-04-14 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A detecção e quantificação do DNA do vírus da hepatite B (HBV) são importantes para o diagnóstico da infecção, definição e monitoramento do tratamento antiviral. Entretanto o diagnóstico molecular é difícil em áreas remotas ou com poucos recursos devido ao custo dos métodos comerciais e pouca infra-estrutura para coleta, armazenamento e transporte de amostras de sangue. O objetivo deste estudo foi desenvolver um método para quantificação do DNA do HBV em amostras de soro e fluido oral, e avaliar um método qualitativo \201Cin house\201D para detecção do DNA do HBV em comparação com métodos comerciais disponíveis no mercado. Amostras pareadas de soro e fluido oral foram obtidas de 116 indivíduos, onde 66 eram reagentes para HBsAg no soro e 50 não apresentavam nenhum marcador sorológico no soro. As amostras de soro foram submetidas a testes imunoenzimáticos para detecção de marcadores sorológicos do HBV (HBsAg, anti-HBc, anti-HBs, anti-HBcIgM, anti-HBe e HBeAg) e ao PCR em tempo real para quantificação do DNA do HBV (COBAS TaqMan HBV, Roche). O DNA do HBV foi extraído utilizando o conjunto de reagentes \201CHigh Pure Viral Nucleic Acid kit\201D (Roche Diagnostics, EUA) em amostras de soro e \201CRTP® DNA/RNA Virus Mini kit\201D (Invitek, Alemanha) para amostras de fluido oral Para a detecção qualitativa do HBV foi realizada uma PCR com iniciadores para o gene do core, e para detecção quantitativa do HBV foi utilizada a metodologia de PCR em tempo real com sondas TaqMan® na plataforma Line-Gene 9600 (Bioer Serves Life, Canada). Para obtenção da curva de quantificação foi construído um plasmídeo recombinante obtido a partir de amostras padrão do painel de quantificação do HBV (Optiquant HBV, Acrometrix, Life Technologis, EUA). As seguintes condições da PCR em tempo real foram avaliadas: concentração de DNA (5 e 7,5\03BCL), temperatura de hibridização (60°C e 62°C), e números de ciclos (40 e 45 ciclos). A sensibilidade analítica da PCR em tempo real foi estimada em 10 cópias de HBV DNA/mL e a faixa de quantificação abrangeu cerca de 8 logs de 10. Para quantificação do DNA do HBV em soro e fluido oral foi necessário o aumento da temperatura de hibridização, e para o fluido oral também foi necessário o aumento da concentração de DNA (7,5 \03BCL) e do número de ciclos (45). Entre as amostras de soro HBsAg reagentes, 64 foram quantificadas pela PCR em tempo real comercial e 28 pelo teste quantitativo \201Cin house\201D com carga viral média igual a 3,993 ± 1,922 e 3,761± 1,829 log cópias de HBV DNA/mL (r=0,7643; p<0,0001), respectivamente, e concordância de 37,87% Por outro lado, 8 amostras de fluido oral amplificaram pelo método quantitativo \201Cin house\201D, com carga viral média igual a 4,459 ± 1,127 log cópias de HBV DNA/mL (r=- 0,2994; p= 0,9453). A PCR qualitativa \201Cin house\201D foi capaz de detectar o DNA do HBV em 50 amostras de soro HBsAg reagentes apresentando 75% de concordância com o teste comercial quantitativo (p=1,000), porém somente uma amostra de fluido oral foi detectada por este método. Concluímos que as metodologias qualitativa e quantitativa para detecção do DNA do HBV analisadas neste estudo apresentaram boa eficiência em amostras de soro, porém não foram eficientes em amostras de fluido oral. Estas metodologias podem ser bastante úteis para detecção molecular do HBV em áreas com recursos limitados / The detection and quantification of the DNA of Hepa titis B virus (HBV) are important to diagnose the infection, determine and monitore the antiviral treatment. However, the molecular diagnosis is difficult in remote areas or presenting low resources, because of the cost of commercial methods and few infrastructu re for collection, storage and transport of blood samples. The objective of this s tudy was to develop a method for quantification of HBV DNA in serum and oral fluid s amples, and to evaluate an in house qualitative method for HBV DNA detection compared t o commercial methods available in the market. Paired serum and oral fluid were obtain ed from 116 individuals, where 66 were HBsAg reactive in their sera and 50 did not pr esent any HBV serological marker in sera. Serum samples were submitted to enzyme immuno assays for detection of HBV serological markers (HBsAg, anti-HBc, anti-HBs, ant i-HBcIgM, HBeAg and anti-HBe) and quantified by commercial real time PCR (COBAS® TaqM an HBV Test, Roche Diagnostics, EUA). HBV DNA was extracted using the commercial kit "High Pure Viral Nucleic Acid Kit" (Roche Diagnostics, USA) in serum samples and "RTP ® DNA / RNA Virus Mini Kit" (Invitek, Germany) for oral fluid s amples. For HBV qualitative detection it was employed a PCR using primers for Core gene, and for quantitative detection of HBV it was employed a real time PCR methodology with Ta qMan ® probes in the Line-Gene 9600 (Bioer Serves Life, Canada) platform. To obtai n the quantification curve, a recombinant plasmid was constructed using standard quantification panel of HBV (Optiquant HBV, Acrometrix, Life Technologis, USA). The following PCR conditions were evaluated in real time PCR: DNA concentration (7.5 and 5 μL), annealing temperature (60° C and 62° C), number of cycles (cycles 40 and 45). The analytical sensitivity of real- time PCR was estimated at 10 HBV DNA copies/mL and the quantitation range comprised about 8 logs of 10. For quantification of HBV DNA in serum and oral fluid, it was necessary to increase the annealing temperature , and for oral fluid, it was also necessary to increase the concentration of DNA (7.5 μL) and the number of cycles (45). Among HBsAg reactive serum samples, 64 were quantif ied by commercial real time PCR and 28 by “in house” quantitative test, with mean v iral load equal to 3,993 ± 1,922 e 3,761± 1,829 log copies of HBV DNA/mL (r=0,7643; p< 0,0001), respectively, and concordance of 66.6%. Moreover, eight oral fluid sa mples were amplified by quantitative "in house" method, with average viral load equal to 4,459 ± 1,127 log copies of HBV DNA/mL (r=-0.2994, p=0,9453). The qualitative "in h ouse" PCR was able to detect HBV DNA in 50 HBsAg reactive serum samples, showing 75% of agreement with the commercial test (p=1.000), but only 1 oral fluid sa mple has been detected by this method. We concluded that the qualitative and quant itative methods for the detection of HBV DNA analyzed in this study presented good effic iency in serum samples, but they were not effective among oral fluid samples. These methodologies can be useful for molecular detection of HBV in areas with limited re sources

Orientador: Helio José Montassier / Banca: Cintia Hiromi Okino / Banca: Manoel Victor Franco Lemos / Resumo: Em plantéis avícolas, é frequente a ocorrência de doenças infecciosas respiratórias e dentre estas, destaca-se a Bronquite Infecciosa (BI), uma doença aguda e altamente contagiosa de aves. A BI é causada pelo vírus da bronquite infecciosa (VBI), cujo processo infeccioso geralmente provoca perdas econômicas significativas para as criações avícolas. A extensa variação genética, especialmente nas regiões hipervariáveis (HVRs) do gene S1, é uma das principais características da evolução do VBI, e resulta no surgimento de diversas variantes, que requerem um diagnóstico molecular que inclua a detecção dessas novas estirpes, como o genótipo brasileiro (BR-VBI), pois a detecção e identificação do agente etiológico são essenciais para o controle dessa enfermidade. Para tanto, é necessário que os métodos de diagnóstico empregados sejam sensíveis, específicos e de baixo custo. Foi então desenvolvida e avaliada neste estudo uma técnica de Nested-RT-PCR (BR-Nested-RT-PCR) utilizando um conjunto de oligonucleotídeos iniciadores desenvolvido dentro da região HVR3 do gene S1 de estirpes variantes brasileiras do VBI para a detecção e identificação de linhagens do genótipo brasileiro do VBI presentes em amostras biológicas de aves e comparada com a Nested-RT-PCR universal, utilizando oligonucleotídeos iniciadores universais para a mesma região do gene S1. Os resultados demonstraram que a técnica BR-Nested-RT-PCR apresentou uma elevada sensibilidade na detecção de estirpes do genótipo BR-I do V... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Infectious bronchitis (IB) is an acute and highly contagious disease of birds. IB is caused by infectious bronchitis virus (IBV), which usually results in significant economic losses for poultry farms. The extensive genetic variation, especially in the hypervariable regions (HVRs) of the S1 gene, is one of the main characteristics of the evolution of IBV, and results in the appearance of several variants that require a molecular diagnosis which includes the detection of these new strains, such as Brazilian I genotype (BR-I), since the detection and identification of the causative agent are essential for the control of the disease. Therefore, the diagnostic methods used must be sensitive, specific and inexpensive. A Nested-RT-PCR (BR-Nested-RT-PCR) technique was developed and evaluated in this study using a set of primers designed for the HVR3 region of the S1 gene for the detection and identification of Brazilian genotype strains of IBV present in biological samples from birds and compared with universal Nested-RT-PCR using universal primers for the same region of the S1 gene. The results demonstrated that the BR-Nested-RT-PCR technique had a high sensitivity to detect IBV strains from BR-I genotype and did not generate amplified products from heterologous virus samples tested (Newcastle disease virus, avian metapneumovirus, Reovirus and Gumboro disease virus), neither from IBV strains of other genotypes. In addition, the comparison between BR-Nested-RT-PCR techniques with th... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Made available in DSpace on 2015-10-06T13:03:26Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2015-06-15. Added 1 bitstream(s) on 2015-10-06T13:18:31Z : No. of bitstreams: 1 000848350.pdf: 2552487 bytes, checksum: 834f8a43bf7d63a12d8041a4a5022654 (MD5) / Agentes das Ordens Rickettsiales, Haemosporida e Rhizobiales são causadores de enfermidades que acometem várias espécies animais, podendo representar um risco à saúde dos mesmos, inclusive de seres humanos. Aves carnívoras podem infestar-se e infectar-se com muitas espécies de parasitas, incluindose carrapatos e hemoparasitas, sendo os hábitos de predação fatores de favorecimento à transmissão e translocação de diversos agentes etiológicos. O objetivo deste estudo foi pesquisar, por meio de métodos indiretos (Reação de Imunofluorescência Indireta - RIFI) e diretos (esfregaços sanguíneos, PCR em Tempo Real e PCR Convencional) os agentes das Famílias Anaplasmataceae (Ehrlichia, Anaplasma, Neorickettsia), Bartonellaceae (Bartonella spp.) e Ordem Haemosporida (Plasmodium, Haemoproteus e Leucocytozoon) em ectoparasitas e amostras de sangue de aves carnívoras, realizando-se um estudo filogenético dos agentes encontrados. Para tanto, procedeu-se à colheita de 121 amostras de sangue total e 88 amostras de soro de aves pertencentes às Ordens Accipitriformes, Falconiformes, Strigiformes e Cathartiformes, capturadas nos estados de São Paulo e Rio de Janeiro. Em relação aos ectoparasitas, foram recolhidas três larvas e uma ninfa ingurgitada de carrapatos do gênero Amblyomma de um gavião carijó (Rupornis magnirostris) no Estado de São Paulo. Na RIFI para E. chaffeensis e A. phagocytophilum, 03 (3,41%) e 05 (5,68%) amostras apresentaram sororreatividade, respectivamente. Todas as amostras testadas na RIFI para E. canis mostraram-se negativas. Na avaliação de esfregaços sanguíneos corados pelo Giemsa, não foram encontradas estruturas compatíveis com hemoparasitas. Em relação a PCR em Tempo Real (qPCR), não foram encontrados animais PCR positivos para Ehrlichia chaffeensis (gene vlpt) e Anaplasma phagocytophilum (gene msp-2). Na qPCR Multiplex para Ehrlichia spp., Anaplasma spp. (gene groE) e... / Rickettsiales, Haemosporida and Rhizobiales agents cause diseases that affect various animal species, including humans. Carnivorous birds become infested and infected with many species of parasites, including ticks and hemoparasites, and the predation habits favoring transmission and translocation of various etiological agents. The aim of this study was to investigate, using indirect methods (Immunofluorescence - IFAT) and direct methods (blood smears, Real-Time PCR and Conventional PCR) agents of Families Anaplasmataceae (Ehrlichia, Anaplasma, Neorickettsia), Bartonellaceae (Bartonella spp.) and Haemosporida Order (Plasmodium, Haemoproteus and Leucocytozoon) in ectoparasites and blood samples carnivorous birds, performing a phylogenetic study of these agents. Therefore, we collected 121 blood samples and 88 serum samples from birds belonging to the Accipitriformes, Falconiformes, Strigiformes and Cathartiformes Orders, captured in the states of São Paulo and Rio de Janeiro. Regarding the ectoparasites, we collected three larvae and one engorged nymphal Amblyomma ticks of a Rupornis magnirostris in São Paulo. At IFAT for E. chaffeensis and A. phagocytophilum, 03 (3.41%) and 05 (5.68%) samples showed seroreactivity, respectively. Blood smears stained by Giemsa were analyzed and hemoparasites were not found. Regarding the Real-Time PCR (qPCR), in multiplex qPCR for Ehrlichia spp., Anaplasma spp. (groE gene) and Bartonella spp. (nuoG gene) observed 12 samples positive for Anaplasma spp. (9.91%). In conventional PCR-based 16SrRNA gene for Anaplasmataceae and cytochrome B gene for hemosporidia, eight birds were PCR positive for Ehrlichia spp (6.61%, five in PCR for E. chaffeensis and three in PCR for E. canis), three for Haemoproteus spp (2.48%) and Plasmodium spp (0.83%). In phylogenetic analysis, four samples of Ehrlichia spp. positioned on the same branch Ehrlichia identified in wild animals in Brazil and the US human isolate. The ...

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:26:04Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-02-26Bitstream added on 2014-06-13T20:33:42Z : No. of bitstreams: 1 cassiano_gc_me_sjrp.pdf: 5020075 bytes, checksum: 3cff0abab9c0ce6b6d89b1c811d80e65 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Responsável por 300 a 500 milhões de novas infecções e 1,5 a 3 milhões de mortes por ano no mundo inteiro, a malária continua sendo a principal doença parasitária. Se importante é o combate contra os parasitos, importante também é o conhecimento dos aspectos de incidência, distribuição, especificidade de hospedeiros, além do conhecimento de fatores biológicos e moleculares que determinam a distribuição destes. Neste cenário, um dos principais parâmetros analisados para o controle e monitoramento da malária é a detecção de espécies de Plasmodium nos vetores capazes de infectarem humanos. Embora existam diversas metodologias com este fim, a maioria delas apresenta algumas limitações. O objetivo do presente estudo foi desenvolver um método que permita a identificação do P. falciparum, do P. malariae e das variantes do P. vivax no vetor. Uma PCR foi padronizada, utilizando iniciadores contra regiões específicas do gene CS. A PCR-RFLP foi utilizada para distinguir as variantes do P. vivax. A eficiência da metodologia desenvolvida foi comparada com uma nested-PCR, utilizando Anopheles infectados experimentalmente. Um total de 90 mosquitos foram infectados artificialmente com P. vivax (n = 30), P. falciparum (n = 30) e P.malariae (n = 30). Estes mosquitos infectados, juntamente com outros 30 não infectados foram avaliados em relação a identificação do Plasmodium por nested PCR e com o CS-PCR. A nested PCR para o P. vivax, P. falciparum e P. malariae identificou 19, 16 e 21 mosquitos positivos, respectivamente; enquanto o CS-PCR detectou em 17, 14 e 16 mosquitos, respectivamente. A comparação entre os dois métodos revelou uma boa concordância (κ = 0,723, 0,867 e 0,657, respectivamente, para P. vivax, P. falciparum... / Malaria remains the most serious vector-borne disease, affecting some 300-500 million people annually, causing 1.5-3 million deaths. Is important the fight against the parasites, but it is also important the knowledge of the incidence, host specificity, molecular and biological factors determining the distribution of these parasites. In this scenario, identification of the human-specific Plasmodium species in the mosquito host is an essential component for planning and monitoring of malaria control operations. However, most of the detection methods show some potential limitations. The objective of this study was development an effective assay for detecting Plasmodium falciparum, Plasmodium malariae and Plasmodium vivax variants in Anopheles mosquitoes. A PCR was development targeting the CS gene. A PCR-RFLP was used to distinguish the P. vivax variants VK210, VK247 and P. vivax-like. The new PCR assay was compared against a nested PCR using artificially infected Anopheles mosquitoes. A total of 90 mosquitoes were artificially infected with P. vivax (n = 30), P. falciparum (n = 30) and P. malariae (n = 30). These infected mosquitoes along with another 30 unfed mosquitoes were checked for the identification of Plasmodium by nested PCR and with the CS-PCR. Nested PCR for P. vivax, P. falciparum and P. malariae detected positive infection in 19, 16 and 21 mosquitoes respectively; whereas CS-PCR detected in 17, 14 and 16 mosquitoes, respectively. The comparison revealed a close agreement between the two assays (κ = 0.723, 0.867 and 0.657, respectively for P. vivax, P. falciparum and P. malariae groups). Subsequently, PCR-RFLP efficiently discriminate P. vivax variants... (Complete abstract click electronic access below)

Made available in DSpace on 2014-12-02T11:16:51Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-02-28Bitstream added on 2014-12-02T11:21:18Z : No. of bitstreams: 1 000784203.pdf: 2707587 bytes, checksum: 60463c95eda02952a5fde820ad4e0531 (MD5). Added 1 bitstream(s) on 2015-11-19T17:38:36Z : No. of bitstreams: 1 000784203_20160228.pdf: 79467 bytes, checksum: 21171e215aeff9c2ee4e0d2294237064 (MD5) Bitstreams deleted on 2016-02-29T12:16:28Z: 000784203_20160228.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2016-02-29T12:17:26Z : No. of bitstreams: 1 000784203.pdf: 2707582 bytes, checksum: 3f7192c7784f1822d5d754fa4604956e (MD5). Added 1 bitstream(s) on 2016-03-07T17:59:40Z : No. of bitstreams: 1 000784203_20180228.pdf: 109002 bytes, checksum: 424f5f1795170ba23918fbed01d7890b (MD5) Bitstreams deleted on 2018-03-02T12:40:00Z: 000784203_20180228.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2018-03-02T12:40:57Z : No. of bitstreams: 1 000784203.pdf: 2707585 bytes, checksum: 744cb15abdfa0446e7f2731acecf8660 (MD5) / Infecções por nematódeos gastrintestinais causam consideráveis perdas na pecuária. Haemonchus spp. é o principal nematódeo que acometem bovinos e ovinos principalmente em regiões tropicais e subtropicais. Portanto este estudo teve por objetivo avaliar metodologias de diagnóstico baseado em analises morfológicas e moleculares de larvas infectantes e adultos de Haemonchus spp. Foram utilizados 23 bezerros e 20 cordeiros naturalmente infectados por nematódeos gastrintestinais. Antes da necropsia dos animais, fezes foram coletadas para realização de coproculturas e obtenção de larvas infectantes, que foram morfometricamente analisadas. Logo após o sacrifício dos animais, os abomasos foram removidos e congelados, para posterior recuperação dos exemplares de Haemonchus spp. que foram armazenados em álcool 70º. No caso dos ovinos, os parasitas permaneceram estocados em alcool 70º por mais de um ano antes de serem analisados, enquanto que os parasitas dos bovinos foram armazenados por apenas quatro meses. O diagnóstico morfológico dos Haemonchus machos foi realizado por meio da análise de sínlofe e mensuração de espículos. Os mesmos parasitas utilizados na análise morfológica foram submetidos à análise molecular, com utilização da PCR, com os primers 52/154, 75/86 e Hplacbotu. A técnica padrão ouro para identificação de Haemonchus similis foi análise de espículos e para Haemonchus placei foi PCR com os primes HplacBotu. Todas as amostras de ovinos foram consideradas como sendo de Haemonchus contortus, devido à especificidade parasitária e nenhuma evidencia de outras espécies de Haemonchus nas análises moleculares. Os resultados demonstraram diferença estatística no comprimento da distância entre o final da L3 e o final da bainha das larvas infectantes das três espécies. Houve sobreposição de medidas de apenas 1,26% entre as espécies H. placei e H. contortus. Na análises moleculares o par ... / Nematodes gastrointestinal infection causes considerable losses in the livestock industry. Haemonchus spp. is major nematode that affects cattle and sheep mainly in tropical and subtropical region. Therefore, the aim of the present study was to assess diagnosis methodologies based in morphological and molecular analysis of infective larvae and adults of Haemonchus spp. Twenty-three calves and twenty lambs naturally infected with gastrointestinal nematodes were utilized. Before necropsy of animals, faecal samples were collated for preparing faecal cultures and obtaining infective larvae that were morphometrically analyzed. After the euthanasia of animals the abomasums were removed and frozen for posterior recovered Haemonchus specimens that were stored in alcohol 70º. In the case sheep, the parasites remained stored in alcohol 70º for more than one year before be analyzed, while the parasites of cattle were stored for only four months. The morphological diagnosis of males Haemonchus spp. was released by synlophe analysis and spicule measurements. The same parasites used in the morphological analysis were submitted in the molecular analysis, using PCR, with primers 52/159, 75/86 and HplacBotu. The “gold standard” method used to identify Haemonchus similis was spicules analysis and to identify Haemonchus placei was PCR with the primers HplacBotu. All Haemonchus specimens recovered from sheep were assumed to be Haemonchus contortus based on host specificity, and because the molecular analysis did not show any evidence of other Haemonchus species. The results presented statistic differences in the sheath tail length of infective larvae of three species. There was overlapping of measurements was only 1.26% between H.contortus and H. placei. In the espicule analysis also were observed same overlapping of measurements that caused misidentification of H. placei and H. contortus. In relation the synlophe most samples ...

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:23:09Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2012-07-06Bitstream added on 2014-06-13T19:49:57Z : No. of bitstreams: 1 oliveira_fm_me_araca.pdf: 788257 bytes, checksum: 350efb1f930e09b50897c9123c540f6f (MD5) / A leishmaniose visceral é uma doença em franca expansão no Brasil e que tem a participação de algumas espécies animais na manutenção de seu ciclo. Este trabalho objetivou investigar a presença de Leishmania spp. em morcegos de área endêmica para leishmaniose visceral e investigar a participação destes animais como possíveis reservatórios desta zoonose. Avaliou-se a presença de DNA dos parasitas, por meio da PCR, em amostras de baço e pele de 375 quirópteros originários de 19 cidades do Estado de São Paulo, Brasil, áreas endêmicas e com transmissão intensa para leishmaniose visceral. A amplificação de kDNA de Leishmania spp. por PCR foi positiva em 4,53% dos quirópteros, sendo que a maior positividade foi observada em amostras de baço (94,1%) e dois animais foram positivos tanto para amostras de pele como de baço; a presença de DNA do gene SSU 18S rRNA de Trypanosoma spp., também investigada, foi positiva em 4,53% das amostras sendo 23,5% positivas somente na amostra de baço, 76,5% somente na amostra de pele. Um animal apresentou positividade tanto para Leishmania spp. como para Trypanosoma spp. Os resultados indicam a ocorrência de Leishmania spp. em quirópteros da área endêmica para leishmaniose visceral, indicando a possibilidade de serem reservatórios desta zoonose / Visceral leishmaniasis is a disease with increasing incidence in Brazil and that has some animal species contributing to its maintenance. This study aimed at investigating the presence of Leishmania spp. in bats from an endemic area for visceral leishmaniasis, in order to assess its participation as possible potential reservoirs for this zoonosis. We collected spleen and skin samples of 375 bats from 19 cities in the State São Paulo, Brazil, areas of intense visceral leishmaniasis transmission. kDNA Leishmania ssp. amplification by PCR was positive in 4.53% bats and a higher positivity was seen in spleen samples (94.1%); two bats were positive for both skin and spleen samples. Trypanosoma spp. genomic DNA amplification was also investigated and 4.53% of the samples were positive, 23.5% of these were positive only for spleen, 76.5% for skin. One bat was positive for both Leishmania spp. and Trypanosoma spp. DNA amplification. These results demonstrate the occurrence of Leishmania spp. in bats from endemic area for visceral leishmaniasis, indicating the possibility of these being reservoirs of this zoonosis

Submitted by MAYARA LÚCIA DEL CISTIA null (mayara_ldc@hotmail.com) on 2016-06-22T17:02:08Z No. of bitstreams: 1 DissertaçãoMestrado2016_MAYARA_LUCIA_DEL_CISTIA.pdf: 6292986 bytes, checksum: 65cf54ead8c847cc5c6ad551395790c9 (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Paula Grisoto (grisotoana@reitoria.unesp.br) on 2016-06-23T19:19:30Z (GMT) No. of bitstreams: 1 delcistia_ml_me_arafcf.pdf: 6292986 bytes, checksum: 65cf54ead8c847cc5c6ad551395790c9 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-06-23T19:19:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 delcistia_ml_me_arafcf.pdf: 6292986 bytes, checksum: 65cf54ead8c847cc5c6ad551395790c9 (MD5) Previous issue date: 2016-05-31 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / As leishmanioses são um grupo de doenças causadas pelo gênero Leishmania e colocam em risco 350 milhões de pessoas no mundo. Após o sequenciamento do genoma de algumas espécies de Leishmania spp., estudos moleculares de suas formas celulares (amastigotas e promastigotas) trouxeram informações importantes sobre sua biologia e potencial aplicação no aperfeiçoamento ou desenvolvimento de técnicas diagnósticas e terapêuticas. Nesse contexto, este projeto visou avaliar o gene LinJ.36.419 de Leishmania infantum (syn. Leishmania chagasi) e seu produto quanto a potencial aplicação no dsenvolvimento de novas abordagens diagnósticas. Ensaios de PCR quantitativa mostraram que a expressão deste gene é maior em formas amastigotas, estágio responsável pela manifestação da doença, podendo corresponder a um potencial marcador diagnóstico. Um fragmento de 255 aminoácidos da proteína Lc36 foi caracterizado quanto ao seu potencial antigênico utilizando ensaio imunoenzimático (ELISA). Os resultados mostraram especificidade de 74% e sensibilidade de 78% (99% de confiança), com acurácia de 76%, em uma população escolhida randomicamente. Análises adicionais mostraram reação cruzada pouco significativa para soro de cães infectados com Leptospira interrogans e Toxoplasma gondii, e revelaram reação cruzada contra soro de cães infectados por Babesia canis e Ehrlichia canis, todos organismos infecciosos comuns em cães. Análises de bioinformática mostraram que a proteína Lc36 possui um domínio denominado DNA polimerase sigma (COG5260) comum a vários organismos, associado a atividades de replicação, recombinação e reparo de ácidos nucléicos, o qual pode ser responsável pelas reações cruzadas observadas. Dessa forma, outro fragmento (297 aminoácidos) da proteína Lc36, sem a região de domínio conservado, foi expresso para nova caracterização do potencial antigênico com o objetivo de melhorar a especificidade do teste em estudo para aplicação em diagnóstico sorológico de leishmaniose visceral canina. Adicionalmente, bons resultados foram obtidos com ensaios para avaliar a potencial aplicação do gene Lc36 em diagnóstico molecular de leishmaniose visceral por meio do par de oligonucleotídeos RT36 específicos para L.infantum. Os ensaios mostraram que a reação foi capaz de detectar cerca de 5 células do parasita, revelando elevada sensibilidade do teste. Dessa forma, ambos os testes avaliados neste trabalho se mostraram promissores e serão explorados em projetos futuros. / Leishmaniasis are diseases caused by Leishmania genus protozoan and endanger 350 million people worldwide. After genomic sequencing of Leishmania spp., molecular studies of their cycle forms (amastigotes and promastigotes) brought important information, which can contribute to the development of new diagnostic approaches and treatments. In this study we evaluated the potencial application of the Leishmania infantum (syn. Leishmania chagasi) gene Lc.36.4190 and its encoded protein for development of new diagnostic approaches. Quantitative PCR assays showed that the gene is more expressed in intracellular amastigotes, the stage related to the clinical manifestation of these diseases, thus presenting potential to be a diagnostical target. We evaluated antigenic features of a 255 aminoacids fragment of the Lc36 protein using immunoenzimatic assay (ELISA). The results showed specificity of 74% and sensibility of 78% (99% of confidence) and accuracy of 76%, in a randomically chosen population. Additional analysis showed low cross-reaction against Leptospira interrogans and Toxoplasma gondii, and showed cross-reaction against Babesia canis and Ehrlichia canis, all infective organisms common in dogs. Bioinformatics analysis showed that the protein Lc36 contains one DNA polymerase sigma domain (COG5260) found on several organisms, being related to nucleic acid replication, recombination and repair, and might be related to the crossreactions observed. Thus, another fragment (297 aminoacids) of the Lc36 protein, without the conserved domain region, was expressed for a new antigenic characterization to improve the specificity of the canine visceral leishmaniasis serological test. Moreover, good results were obtained on experiments performed to evaluate the potential application of the Lc36 gene on molecular diagnostics using a L. infantum specific pair of primers, RT36. The assays detected approximately 5 parasites, which displays a good sensibility result. Therefore, both serological and molecular tests evaluated in this study are promising and will be explored in future studies.

Orientador: Ricardo Luiz Dantas Machado / Banca: Mauro Toledo Marrelli / Banca: Carlos Eugênio Cavasini / Resumo: Responsável por 300 a 500 milhões de novas infecções e 1,5 a 3 milhões de mortes por ano no mundo inteiro, a malária continua sendo a principal doença parasitária. Se importante é o combate contra os parasitos, importante também é o conhecimento dos aspectos de incidência, distribuição, especificidade de hospedeiros, além do conhecimento de fatores biológicos e moleculares que determinam a distribuição destes. Neste cenário, um dos principais parâmetros analisados para o controle e monitoramento da malária é a detecção de espécies de Plasmodium nos vetores capazes de infectarem humanos. Embora existam diversas metodologias com este fim, a maioria delas apresenta algumas limitações. O objetivo do presente estudo foi desenvolver um método que permita a identificação do P. falciparum, do P. malariae e das variantes do P. vivax no vetor. Uma PCR foi padronizada, utilizando iniciadores contra regiões específicas do gene CS. A PCR-RFLP foi utilizada para distinguir as variantes do P. vivax. A eficiência da metodologia desenvolvida foi comparada com uma nested-PCR, utilizando Anopheles infectados experimentalmente. Um total de 90 mosquitos foram infectados artificialmente com P. vivax (n = 30), P. falciparum (n = 30) e P.malariae (n = 30). Estes mosquitos infectados, juntamente com outros 30 não infectados foram avaliados em relação a identificação do Plasmodium por nested PCR e com o CS-PCR. A nested PCR para o P. vivax, P. falciparum e P. malariae identificou 19, 16 e 21 mosquitos positivos, respectivamente; enquanto o CS-PCR detectou em 17, 14 e 16 mosquitos, respectivamente. A comparação entre os dois métodos revelou uma boa concordância (κ = 0,723, 0,867 e 0,657, respectivamente, para P. vivax, P. falciparum... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Malaria remains the most serious vector-borne disease, affecting some 300-500 million people annually, causing 1.5-3 million deaths. Is important the fight against the parasites, but it is also important the knowledge of the incidence, host specificity, molecular and biological factors determining the distribution of these parasites. In this scenario, identification of the human-specific Plasmodium species in the mosquito host is an essential component for planning and monitoring of malaria control operations. However, most of the detection methods show some potential limitations. The objective of this study was development an effective assay for detecting Plasmodium falciparum, Plasmodium malariae and Plasmodium vivax variants in Anopheles mosquitoes. A PCR was development targeting the CS gene. A PCR-RFLP was used to distinguish the P. vivax variants VK210, VK247 and P. vivax-like. The new PCR assay was compared against a nested PCR using artificially infected Anopheles mosquitoes. A total of 90 mosquitoes were artificially infected with P. vivax (n = 30), P. falciparum (n = 30) and P. malariae (n = 30). These infected mosquitoes along with another 30 unfed mosquitoes were checked for the identification of Plasmodium by nested PCR and with the CS-PCR. Nested PCR for P. vivax, P. falciparum and P. malariae detected positive infection in 19, 16 and 21 mosquitoes respectively; whereas CS-PCR detected in 17, 14 and 16 mosquitoes, respectively. The comparison revealed a close agreement between the two assays (κ = 0.723, 0.867 and 0.657, respectively for P. vivax, P. falciparum and P. malariae groups). Subsequently, PCR-RFLP efficiently discriminate P. vivax variants... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Orientador: Alessandro Francisco Talamini do Amarante / Banca: Kátia Denise Saraiva Bresciani / Banca: Lucia Helena O'Dwyer de Oliveira / Resumo: Infecções por nematódeos gastrintestinais causam consideráveis perdas na pecuária. Haemonchus spp. é o principal nematódeo que acometem bovinos e ovinos principalmente em regiões tropicais e subtropicais. Portanto este estudo teve por objetivo avaliar metodologias de diagnóstico baseado em analises morfológicas e moleculares de larvas infectantes e adultos de Haemonchus spp. Foram utilizados 23 bezerros e 20 cordeiros naturalmente infectados por nematódeos gastrintestinais. Antes da necropsia dos animais, fezes foram coletadas para realização de coproculturas e obtenção de larvas infectantes, que foram morfometricamente analisadas. Logo após o sacrifício dos animais, os abomasos foram removidos e congelados, para posterior recuperação dos exemplares de Haemonchus spp. que foram armazenados em álcool 70º. No caso dos ovinos, os parasitas permaneceram estocados em alcool 70º por mais de um ano antes de serem analisados, enquanto que os parasitas dos bovinos foram armazenados por apenas quatro meses. O diagnóstico morfológico dos Haemonchus machos foi realizado por meio da análise de sínlofe e mensuração de espículos. Os mesmos parasitas utilizados na análise morfológica foram submetidos à análise molecular, com utilização da PCR, com os primers 52/154, 75/86 e Hplacbotu. A técnica padrão ouro para identificação de Haemonchus similis foi análise de espículos e para Haemonchus placei foi PCR com os primes HplacBotu. Todas as amostras de ovinos foram consideradas como sendo de Haemonchus contortus, devido à especificidade parasitária e nenhuma evidencia de outras espécies de Haemonchus nas análises moleculares. Os resultados demonstraram diferença estatística no comprimento da distância entre o final da L3 e o final da bainha das larvas infectantes das três espécies. Houve sobreposição de medidas de apenas 1,26% entre as espécies H. placei e H. contortus. Na análises moleculares o par ... / Abstract: Nematodes gastrointestinal infection causes considerable losses in the livestock industry. Haemonchus spp. is major nematode that affects cattle and sheep mainly in tropical and subtropical region. Therefore, the aim of the present study was to assess diagnosis methodologies based in morphological and molecular analysis of infective larvae and adults of Haemonchus spp. Twenty-three calves and twenty lambs naturally infected with gastrointestinal nematodes were utilized. Before necropsy of animals, faecal samples were collated for preparing faecal cultures and obtaining infective larvae that were morphometrically analyzed. After the euthanasia of animals the abomasums were removed and frozen for posterior recovered Haemonchus specimens that were stored in alcohol 70º. In the case sheep, the parasites remained stored in alcohol 70º for more than one year before be analyzed, while the parasites of cattle were stored for only four months. The morphological diagnosis of males Haemonchus spp. was released by synlophe analysis and spicule measurements. The same parasites used in the morphological analysis were submitted in the molecular analysis, using PCR, with primers 52/159, 75/86 and HplacBotu. The "gold standard" method used to identify Haemonchus similis was spicules analysis and to identify Haemonchus placei was PCR with the primers HplacBotu. All Haemonchus specimens recovered from sheep were assumed to be Haemonchus contortus based on host specificity, and because the molecular analysis did not show any evidence of other Haemonchus species. The results presented statistic differences in the sheath tail length of infective larvae of three species. There was overlapping of measurements was only 1.26% between H.contortus and H. placei. In the espicule analysis also were observed same overlapping of measurements that caused misidentification of H. placei and H. contortus. In relation the synlophe most samples ... / Mestre

Os parasitas pertencentes ao gênero Leishmania têm distribuição ubíqua. Este táxon inclui Leishmania infantum chagasi, agente etiológico da leishmaniose visceral nas Américas, uma zoonose negligenciada cujas metodologias diagnósticas acumulam uma série de limitações, requerendo a validação e padronização de metodologias diagnósticas satisfatórias. Vários fatores estão relacionados à patogênese causada por este protozoário, entre eles a catepsina L-like, uma cisteíno protease envolvida em processos regulatórios metabólicos e infecciosos. Portanto, este trabalho teve como objetivo avaliar a eficácia do gene de catepsina L-like isoforma CPA como alvo de diagnóstico molecular e como marcador filogenético que permita a compreensão das variações intraespecíficas e elucidem a história evolutiva de L. infantum chagasi no Brasil. Foram utilizados 44 isolados de L. infantum chagasi de diferentes estados brasileiros. Os fragmentos do gene de catepsina L-like foram amplificados, purificados, sequenciados, alinhados manualmente e analisados por métodos filogenéticos de máxima parcimônia e inferência bayesiana. As sequências geradas foram usadas para pesquisar e sintetizar iniciadores a serem usados em reações específicas para o parasita alvo. O gene de catepsina L-like não mostrou variabilidade intraespecífica entre os isolados analisados, sugerindo um evento recente de introdução do mesmo nas Américas. O par de iniciadores propostos amplificou o DNA alvo de isolados de L. infantum chagasi, sendo efetivo na amplificação de DNA em concentrações de até 10-11g / &micro;l. O marcador proposto não apresentou reações cruzadas com outros hemoparasitas de importância clínica. Quando utilizado para o diagnóstico em um painel de amostras clínicas de cães, obteve-se uma frequência de positividade de 49,03% (102/208), contrastando com o valor de 14,42% (30/208) obtido com o marcador para o gene do espaçador ribossomal interno ITS. Quando testado em amostras de flebotomíneos se obteve um valor de 6,25% e em amostras de pacientes humanos o valor foi de 14,28%. Os marcadores também foram eficazes em amplificar DNA extraído de amostras de urina, de sangue fixado em papel filtro e mesmo em amostras de swab de lesões conjuntivas. Este conjunto de parâmetros permite inferir que o CatLeish- PCR é sensível e específico para o diagnóstico de L. infantum chagasi podendo ser aplicado tanto em pesquisas clínicas quanto em inquéritos epidemiológicos de vigilância. / The parasites belonging to the Leishmania genus have a wide distribution. This taxon includes Leishmania infantum chagasi, the etiologic agent of Visceral Leishmaniasis in the Americas, a neglected zoonosis that requires the validation and standardization of satisfactory diagnostic methodologies. Several factors are related to the pathogenesis caused by this protozoan, as Catepsin L-like, a cysteine protease involved in regulatory and infectious processes. Given this information this work aimed to evaluate the effectiveness of Cathepsin L-like isoform CPA as a target for molecular diagnosis and as a phylogenetic marker that allows understanding the intraspecific variations and the evolutionary history of L. infantum chagasi in Brazil. We used 44 isolates of L. infantum chagasi from different Brazilian states. The cathepsin L-like gene fragments were amplified, purified, sequenced, manually aligned and analyzed by maximum parsimony and Bayesian inference methods. The sequences generated were researched to construction of oligonucleotide primers to be used in reactions specific to the target parasite. The Cathepsin L-like gene did not show intraspecific variability among the isolates analyzed, suggesting a recent event of introduction of the same in the Americas. The pair of proposed primers amplified the target DNA of L. infantum chagasi isolates, being effective in DNA amplification at concentrations of up to 10-11g/&micro;l. The proposed marker did not present cross-reactions with other hemoparasites of clinical importance. When used for the diagnosis in a panel of clinical samples of dogs obtained a positive frequency of 49.03% (102/208), against the 14.42% (30/208) to ribosomal ITS marker. Samples of sandflies obtained a value of 6.25% and in humans the value was 14.28%. The markers were also effective in blood samples fixed on filter paper and even in samples from conjunctival lesion swabs. This set of parameters allows to infer that CatLeish-PCR is a sensitive and specific marker for the diagnosis of L. infantum chagasi in clinical and epidemiological surveys.