Objetivos: Testar a hipótese de que a mucosa do intestino delgado proximal de crianças com diarréia persistente apresenta alterações morfométricas e estereológicas proporcionais ao estado nutricional. Métodos: estudo transversal, incluindo 65 pacientes pediátricos internados no período de maio de 1989 a novembro de 1991, com idade entre 4 meses e 5 anos , com diarréia de mais de 14 dias de duração, que necessitaram realizar biópsia de intestino delgado como parte do protocolo de investigação. A avaliação nutricional foi realizada pelos métodos de Gomez, Waterlow e pelos escores z para peso/ idade (P/I), peso/estatura (P/E) e estatura/idade (E/I), divididos em: eutróficos = z ≥ 2 DP e desnutridos z < -2dp; eutróficos = z ≥ 2 DP, risco nutricional = z < -1DP e desnutridos = z < -2DP; e de maneira contínua em ordem decrescente, utilizando-se as tabelas do NCHS. A captura e análise das imagens por programa de computador foi efetuada com o auxílio do patologista. Nos fragmentos de mucosa do intestino delgado, foram medidas a altura dos vilos, a profundidade das criptas, a espessura da mucosa, a espessura total da mucosa e a relação vilo/cripta, com aumento de 100 vezes. Com aumento de 500 vezes, foram medidas a altura do enterócito, a altura do núcleo e do bordo em escova. O programa computadorizado utilizado foi o Scion Image. A análise estereológica, foi feita com o uso de arcos ciclóides. Resultados: Para os escores z P/I, P/E e E/I, divididos em duas categorias de estado nutricional, não houve diferença estatisticamente significante quanto às medidas da altura dos vilos, profundidade das criptas, espessura da mucosa, espessura total da mucosa e relação vilo/cripta. A altura do enterócito foi a característica que apresentou maior diferença entre os grupos eutrófico e desnutrido, para os índices P/I e P/E, em 500 aumentos, sem atingir significância estatística. Quando os escores z foram divididos em 3 categorias de estado nutricional, a análise morfométrica digitalizada mostrou diferença estatisticamente significante para a relação vilo/cripta entre eutróficos e desnutridos leves e entre eutróficos e desnutridos moderados e graves (p=0,048). A relação vilo/cripta foi maior nos eutróficos. A avaliação nutricional pelos critérios de Waterlow e a análise estereológica não mostraram associação com o estado nutricional. Pelo método de Gomez, houve diferença estatisticamente significante para a altura do enterócito entre eutróficos e desnutridos de Grau III: quanto maior o grau de desnutrição, menor a altura do enterócito (r= -.3330; p = 0,005). As variáveis altura do enterócito, altura do núcleo do enterócito e do bordo em escova apresentaram uma clara associação com os índices P/I (r=0,25;p=0,038), P/E (r=0,029;p=0,019) e com o critério de avaliação nutricional de Gomez (r=-0,33;p=0,007), quando foram avaliadas pelo coeficiente de correlação de Pearson. A altura do núcleo mostrou associação com o índice P/I (r=0,24;p=0,054). A altura do bordo em escova mostrou associação com o índice P/I (r=0,26;p=0,032) e a avaliação nutricional de Gomez (r=-0,28;p=0,020). Conclusões: As associações encontradas entre o estado nutricional - avaliado de acordo com Gomez e os índices P/I e P/E - e as variáveis da mucosa do intestino delgado mostraram relação com o peso dos pacientes. Embora estas associações tenham sido de magnitude fraca a moderada, há uma tendência à diminuição do tamanho do enterócito, seu núcleo e seu bordo em escova à medida que aumenta o grau de desnutrição. / Objectives: To test the hypothesis that the proximal small intestinal mucosa of children with persistent diarrhea presents morphometric and stereologic changes, proportional to their nutritional status. Methods: We performed a cross-sectional study with 65 pediatric patients, with ages varying from 4 months to 5 years, who were admitted between May 1989 and November 1991 with persistent diarrhea for over 14 days. These patients were submitted to small intestinal biopsy, as part of the investigation protocol. The nutritional assessment was performed according to the methods proposed by Gomez, Waterlow, and through z-scores for weight/age (W/A), weight/height (W/H) and height/age (H/A) ratios, divided into: eutrophic = z ≥ 2SD and malnourished z < -2SD; eutrophic = z ≥ 2SD, nutritional risk z < -1SD and malnourished = z < -2SD; and continuously, in descending order, using the NCHS charts. Computer images were obtained and analyzed with a pathologist assistance. Villous height, crypt depth, mucosal thickness, total mucosal thickness, and villous/crypt ratio were measured in the fragments of the small intestinal mucosa, enlarged 100 times. When images were enlarged 500 times, enterocyte height, nuclear height and brush-border height were measured. The software used was Scion Image. Stereologic analysis was performed using cycloid arcs. Results: For W/A, W/H and H/A z-scores, divided into two nutritional status categories, no statistically significant difference was observed in regard to villous height, crypt depth, mucosal thickness, total mucosal thickness and villous/crypt ratio. Enterocyte height presented the most significant difference between eutrophic and malnourished groups, for the W/A and W/H ratios, with a 500x enlargement, although this difference was not statistically significant. When z-scores were subdivided into three nutritional status categories, a digital morphometric analysis showed a statistically significant difference for the villous/crypt ratio between the eutrophic and slightly malnourished group and the eutrophic and mild to severe malnourished group (P=0.048). The villous/crypt ratio was higher among eutrophic children. Nutritional assessment, according to Waterlow criteria, and stereologic analysis were not associated with nutritional status. According to Gomez’s method, a statistically significant difference in enterocyte height was observed between eutrophic and level III malnourished children: the higher the level of malnutrition, the more reduced the height of the enterocyte (r= -.3330; P=0.005). The variables enterocyte height, height of enterocyte nucleus and brush-border height presented a clear association with the W/A ratio (r=0.25; P=0.038), W/H ratio (r=0.029; P=0.019), as well as with Gomez’s criterion for nutritional status (r=-0.33; P=0.007), when evaluated through Pearson’s correlation coefficient. The height of the nucleus was associated with W/A ratio (r=0.24; p=0.054). Brush-border height was associated with W/A ratio and with Gomez’s nutritional assessment (r=-0.28; P=0.020). Conclusions: The observed associations between nutritional status – evaluated according to Gomez and W/A and W/H ratios – and the analyzed small intestinal mucosa variables showed a positive correlation with patients’ weight. Although these associations were of a slight to moderate magnitude, we observed a tendency of enterocyte size reduction, as well as a reduction in the size of its nucleus and brush-border, as the level of malnutrition increases.

Escherichia coli enteropatogênica (EPEC) é uma importante causa de diarreia infantil. EPEC adere no epitélio intestinal e causa uma lesão conhecida como attaching and effacing (A/E). Cepas recombinantes de Mycobacterium smegmatis (Smeg) e Mycobacterium bovis (BCG) foram construídas para expressar BfpA ou Intimina. Os genes dessas proteínas foram amplificadas por PCR do DNA genômico de EPEC e inseridos nos sítios de BamHI/KpnI do vetor pMIP12. Os plasmídeos construídos pMIP-bfpA e pMIP-intimina foram introduzidos, separadamente,nas cepas de Smeg e BCG. Clones recombinantes foram selecionados baseado na resistência a kanamicina e nomeados como rSmeg pMIP (bfpA ou intimina) and rBCG pMIP (bfpA ou intimina). A expressão dos genes bfpA e intimina foram detectados por Western blotting usando anticorpos primários policonais anti-BfpA e anti-intimina. A imunogenicidade dessas proteínas foi avaliada em camundongos C57BL/6 pela presença de anticorpos anti-BfpA e anti-intimina IgA e IgG nas fezes e soro, respectivamente. TNF-a e INF-g foram produzidas in vitro por céulas do baço de camundongos imunizados com a vacina recombinante com BfpA e Intimina. A adesão de EPEC (E2348/69) em células alvo Hep-2 foi bloqueada pelos anticorpos IgA ou IgG de camundongos imunizados com as vacinas recombinantes, mas não por anticorpos de animais não imunizados. Vacinas recombinantes contendo as proteínas BfpA e Intimina de EPEC podem ser candidatas promissoras. / Enteropathogenic Escherichia coli (EPEC) is an important cause of diarrhea in children. EPEC adheres to the intestinal epithelium and causes attaching and effacing (A/E) lesions. Recombinant Mycobacterium smegmatis (Smeg) and Mycobacterium bovis BCG strains were constructed to express either BfpA or intimin. The entire bfpA gene and a portion of the intimin gene were amplified by PCR from EPEC genomic DNA and inserted into the pMIP12 vector at the BamHI/KpnI sites. The pMIP bfpA and pMIP intimin vectors were introduced separately into Smeg and BCG. Recombinant clones were selected based on kanamycin resistance and designated rSmeg pMIP (bfpA or intimin) and rBCG pMIP (bfpA or intimin). The expres-sion of bfpA and intimin was detected by Western blotting using polyclonal anti-BfpA and anti-intimin primary antibodies. The immunogenicity of these proteins was assessed in C57BL/6 mice by assaying the feces and serum for the presence of anti-BfpA and anti-intimin IgA and IgG antibodies. TNF-a and INF-g were produced in vitro by spleen cells from mice immunized with recombinant BfpA, whereas TNF-g was produced in mice immunized with recombinant intimin. The adhesion of EPEC (E2348/69) to Hep-2 target cells was blocked by IgA or IgG antibodies from mice immunized with recombinant BfpA or intimin but not by antibodies from non-immunized mice. Immunogenic non-infectious vectors containing relevant EPEC virulence genes may be promising vaccine candidates.

Objetivos: Testar a hipótese de que a mucosa do intestino delgado proximal de crianças com diarréia persistente apresenta alterações morfométricas e estereológicas proporcionais ao estado nutricional. Métodos: estudo transversal, incluindo 65 pacientes pediátricos internados no período de maio de 1989 a novembro de 1991, com idade entre 4 meses e 5 anos , com diarréia de mais de 14 dias de duração, que necessitaram realizar biópsia de intestino delgado como parte do protocolo de investigação. A avaliação nutricional foi realizada pelos métodos de Gomez, Waterlow e pelos escores z para peso/ idade (P/I), peso/estatura (P/E) e estatura/idade (E/I), divididos em: eutróficos = z ≥ 2 DP e desnutridos z < -2dp; eutróficos = z ≥ 2 DP, risco nutricional = z < -1DP e desnutridos = z < -2DP; e de maneira contínua em ordem decrescente, utilizando-se as tabelas do NCHS. A captura e análise das imagens por programa de computador foi efetuada com o auxílio do patologista. Nos fragmentos de mucosa do intestino delgado, foram medidas a altura dos vilos, a profundidade das criptas, a espessura da mucosa, a espessura total da mucosa e a relação vilo/cripta, com aumento de 100 vezes. Com aumento de 500 vezes, foram medidas a altura do enterócito, a altura do núcleo e do bordo em escova. O programa computadorizado utilizado foi o Scion Image. A análise estereológica, foi feita com o uso de arcos ciclóides. Resultados: Para os escores z P/I, P/E e E/I, divididos em duas categorias de estado nutricional, não houve diferença estatisticamente significante quanto às medidas da altura dos vilos, profundidade das criptas, espessura da mucosa, espessura total da mucosa e relação vilo/cripta. A altura do enterócito foi a característica que apresentou maior diferença entre os grupos eutrófico e desnutrido, para os índices P/I e P/E, em 500 aumentos, sem atingir significância estatística. Quando os escores z foram divididos em 3 categorias de estado nutricional, a análise morfométrica digitalizada mostrou diferença estatisticamente significante para a relação vilo/cripta entre eutróficos e desnutridos leves e entre eutróficos e desnutridos moderados e graves (p=0,048). A relação vilo/cripta foi maior nos eutróficos. A avaliação nutricional pelos critérios de Waterlow e a análise estereológica não mostraram associação com o estado nutricional. Pelo método de Gomez, houve diferença estatisticamente significante para a altura do enterócito entre eutróficos e desnutridos de Grau III: quanto maior o grau de desnutrição, menor a altura do enterócito (r= -.3330; p = 0,005). As variáveis altura do enterócito, altura do núcleo do enterócito e do bordo em escova apresentaram uma clara associação com os índices P/I (r=0,25;p=0,038), P/E (r=0,029;p=0,019) e com o critério de avaliação nutricional de Gomez (r=-0,33;p=0,007), quando foram avaliadas pelo coeficiente de correlação de Pearson. A altura do núcleo mostrou associação com o índice P/I (r=0,24;p=0,054). A altura do bordo em escova mostrou associação com o índice P/I (r=0,26;p=0,032) e a avaliação nutricional de Gomez (r=-0,28;p=0,020). Conclusões: As associações encontradas entre o estado nutricional - avaliado de acordo com Gomez e os índices P/I e P/E - e as variáveis da mucosa do intestino delgado mostraram relação com o peso dos pacientes. Embora estas associações tenham sido de magnitude fraca a moderada, há uma tendência à diminuição do tamanho do enterócito, seu núcleo e seu bordo em escova à medida que aumenta o grau de desnutrição. / Objectives: To test the hypothesis that the proximal small intestinal mucosa of children with persistent diarrhea presents morphometric and stereologic changes, proportional to their nutritional status. Methods: We performed a cross-sectional study with 65 pediatric patients, with ages varying from 4 months to 5 years, who were admitted between May 1989 and November 1991 with persistent diarrhea for over 14 days. These patients were submitted to small intestinal biopsy, as part of the investigation protocol. The nutritional assessment was performed according to the methods proposed by Gomez, Waterlow, and through z-scores for weight/age (W/A), weight/height (W/H) and height/age (H/A) ratios, divided into: eutrophic = z ≥ 2SD and malnourished z < -2SD; eutrophic = z ≥ 2SD, nutritional risk z < -1SD and malnourished = z < -2SD; and continuously, in descending order, using the NCHS charts. Computer images were obtained and analyzed with a pathologist assistance. Villous height, crypt depth, mucosal thickness, total mucosal thickness, and villous/crypt ratio were measured in the fragments of the small intestinal mucosa, enlarged 100 times. When images were enlarged 500 times, enterocyte height, nuclear height and brush-border height were measured. The software used was Scion Image. Stereologic analysis was performed using cycloid arcs. Results: For W/A, W/H and H/A z-scores, divided into two nutritional status categories, no statistically significant difference was observed in regard to villous height, crypt depth, mucosal thickness, total mucosal thickness and villous/crypt ratio. Enterocyte height presented the most significant difference between eutrophic and malnourished groups, for the W/A and W/H ratios, with a 500x enlargement, although this difference was not statistically significant. When z-scores were subdivided into three nutritional status categories, a digital morphometric analysis showed a statistically significant difference for the villous/crypt ratio between the eutrophic and slightly malnourished group and the eutrophic and mild to severe malnourished group (P=0.048). The villous/crypt ratio was higher among eutrophic children. Nutritional assessment, according to Waterlow criteria, and stereologic analysis were not associated with nutritional status. According to Gomez’s method, a statistically significant difference in enterocyte height was observed between eutrophic and level III malnourished children: the higher the level of malnutrition, the more reduced the height of the enterocyte (r= -.3330; P=0.005). The variables enterocyte height, height of enterocyte nucleus and brush-border height presented a clear association with the W/A ratio (r=0.25; P=0.038), W/H ratio (r=0.029; P=0.019), as well as with Gomez’s criterion for nutritional status (r=-0.33; P=0.007), when evaluated through Pearson’s correlation coefficient. The height of the nucleus was associated with W/A ratio (r=0.24; p=0.054). Brush-border height was associated with W/A ratio and with Gomez’s nutritional assessment (r=-0.28; P=0.020). Conclusions: The observed associations between nutritional status – evaluated according to Gomez and W/A and W/H ratios – and the analyzed small intestinal mucosa variables showed a positive correlation with patients’ weight. Although these associations were of a slight to moderate magnitude, we observed a tendency of enterocyte size reduction, as well as a reduction in the size of its nucleus and brush-border, as the level of malnutrition increases.

A diarréia aguda é a segunda causa de morte em crianças < 5 anos em países emergentes. Anaeróbios estritos intestinais como B. fragilis enterotoxigênico e Clostridium difficile estão associados a este quadro infeccioso, assim como Escherichia coli diarreiogênica, Salmonella spp., Shigella spp. e Yersinia enterocolitica. Neste estudo, foi avaliada quantitativamente a presença de enteropatógenos diretamente das fezes. Amostras fecais de crianças com (110) e sem (150) diarréia foram analisadas. Todos os enteropatógenos avaliados foram detectados nas crianças com e sem diarréia, à exceção de Salmonella spp. e Y. enterocolitica que foram observados somente em fezes diarréicas. Os resultados sugerem uma relação bacteriana estreita e presentes em casos diarréicos ou não diarréicos. A presença de espécies EPEC/EHEC e de Shigella spp./EIEC mostraram valores estatisticamente significativos. / Diarrhea is a major cause of mortality and morbidity worldwide achieving children < 5 years old, and is second cause of death in emerging countries. Intestinal anaerobes like enterotoxigenic B. fragilis and Clostridium difficile are associated to acute diarrhea, as well as diarreiogenic Escherichia coli, Salmonella spp., Shigella spp. and Yersinia enterocolitica. In this study, it was evaluated quantitatively the presence of enteropathogens directly from fezes. Stools specimens from children with (110) and without (150) diarrhea were collected. All enteropathogens were detected in children with and without diarrhea except Salmonella spp. and Y. enterocolitica that were only observed in diarrheal fezes. This results suggest a tight bacterial relationship in both groups evaluated. The presence of EPEH/EHEC and Shigella spp./EIEC show statistically significant values.

Para determinar a prevalência e epidemiologia dos enteropatógenos bacterianos e parasitários na diarréia aguda infantil, foram estudadas 290 crianças menores de 24 meses com diarréia e 290 crianças controles, que procuraram o serviço de emergência do Hospital Infantil Arlinda Marques em João Pessoa, Nordeste do Brasil. Enteropatógenos foram identificados em 78,2% dos casos e em 12,4% dos controles; Escherichia coli enteroagregativa (EAEC) foi o patógeno mais freqüente sendo detectada em 25% dos casos e em 8,3% dos controles; seguida por E. coli enteropatogênica (EPEC) em 11% dos casos (dos quais 9,3% foram cepas atípicas) e em 0,3% dos controles; E. coli Enterotoxigência (ETEC) em 10% dos casos e 2,8% dos controles; Salmonella sp em 7,9% dos casos; Shigella sp em 4,1% dos casos; E. coli enteroinvasora (EIEC) em 1,7% dos casos; Campylobacter sp em 2,4% dos casos e enteroparasitas foram detectados em 15,5% dos casos e 1,0% dos controles. Infecções mistas foram verificadas em 32 (11%) casos e em apenas 1 (0,3%) controle. A faixa etária mais atingida foi a dos menores de um ano e as associações mais frequentes ocorreram entre EAEC + Salmonella e EAEC + EPEC atípica. Neste estudo foram identificados fatores de risco associados com episódios de diarréia em crianças de acordo com o agente etiológico bacteriano. As análises estatísticas demonstram uma importante associação de EAEC com diarreia aguda infantil em João Pessoa, Brasil, sendo a ingestão de leite de vaca em pó e a exposição a aglomerados e creche os fatores de risco mais associados a diarreia causada por EAEC. / In order to determine the prevalence and epidemiology of enteropathogens in acute infantile diarrhoea, 290 infants younger than 24 months of age with diarrhoea and 290 age-matched control subjects who came to ER of the Hospital Infantil Arlinda Marques in João Pessoa, Northeastern of Brazil were studied. Enteropathogens were identified in 78,2% of case infants and 12,4% of controls. Enteroagregative Escherichia coli (EAEC) was the most frequently found pathogen and was detected in 25,0% of cases and 8,3% of controls. The second most frequent pathogen was Enteropathogenic E. coli (EPEC), in 11,0% of cases and 0,3% of controls, followed by Enterotoxigenic E. coli (ETEC) in 10% of cases and 2,7% of controls; Salmonella sp was found in 7,9% of cases, Shigella sp in 4,1% of cases, Enteroinvasive E. coli (EIEC) in 1,7% of cases and Campylobacter sp in 2,4% of cases. Enteroparasites were detected in 15,5% of cases and 1,0% of controls. Mixed infections (more than one pathogen) were found in 32 (11%) of cases and in only 1 (0,3%) control. The most affected age group was of those smaller than 1 year of age and the most frequent associations were of EAEC + Salmonella e EAEC + atypical EPEC. In this study risk factors associated with episodes of diarrhoea among infants by bacterial etiological pathogens were identified. Statistical analysis demonstrated a significant association of Enteroagregative E. coli (EAEC) with acute infantile diarrhoea in João Pessoa, Brazil. The risk factors most strongly associated diarrhoea caused by EAEC were the ingestion of powdered cow milk and exposure to crowds and day care centres.

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Para determinar a prevalência e epidemiologia dos enteropatógenos bacterianos e parasitários na diarréia aguda infantil, foram estudadas 290 crianças menores de 24 meses com diarréia e 290 crianças controles, que procuraram o serviço de emergência do Hospital Infantil Arlinda Marques em João Pessoa, Nordeste do Brasil. Enteropatógenos foram identificados em 78,2% dos casos e em 12,4% dos controles; Escherichia coli enteroagregativa (EAEC) foi o patógeno mais freqüente sendo detectada em 25% dos casos e em 8,3% dos controles; seguida por E. coli enteropatogênica (EPEC) em 11% dos casos (dos quais 9,3% foram cepas atípicas) e em 0,3% dos controles; E. coli Enterotoxigência (ETEC) em 10% dos casos e 2,8% dos controles; Salmonella sp em 7,9% dos casos; Shigella sp em 4,1% dos casos; E. coli enteroinvasora (EIEC) em 1,7% dos casos; Campylobacter sp em 2,4% dos casos e enteroparasitas foram detectados em 15,5% dos casos e 1,0% dos controles. Infecções mistas foram verificadas em 32 (11%) casos e em apenas 1 (0,3%) controle. A faixa etária mais atingida foi a dos menores de um ano e as associações mais frequentes ocorreram entre EAEC + Salmonella e EAEC + EPEC atípica. Neste estudo foram identificados fatores de risco associados com episódios de diarréia em crianças de acordo com o agente etiológico bacteriano. As análises estatísticas demonstram uma importante associação de EAEC com diarreia aguda infantil em João Pessoa, Brasil, sendo a ingestão de leite de vaca em pó e a exposição a aglomerados e creche os fatores de risco mais associados a diarreia causada por EAEC. / In order to determine the prevalence and epidemiology of enteropathogens in acute infantile diarrhoea, 290 infants younger than 24 months of age with diarrhoea and 290 age-matched control subjects who came to ER of the Hospital Infantil Arlinda Marques in João Pessoa, Northeastern of Brazil were studied. Enteropathogens were identified in 78,2% of case infants and 12,4% of controls. Enteroagregative Escherichia coli (EAEC) was the most frequently found pathogen and was detected in 25,0% of cases and 8,3% of controls. The second most frequent pathogen was Enteropathogenic E. coli (EPEC), in 11,0% of cases and 0,3% of controls, followed by Enterotoxigenic E. coli (ETEC) in 10% of cases and 2,7% of controls; Salmonella sp was found in 7,9% of cases, Shigella sp in 4,1% of cases, Enteroinvasive E. coli (EIEC) in 1,7% of cases and Campylobacter sp in 2,4% of cases. Enteroparasites were detected in 15,5% of cases and 1,0% of controls. Mixed infections (more than one pathogen) were found in 32 (11%) of cases and in only 1 (0,3%) control. The most affected age group was of those smaller than 1 year of age and the most frequent associations were of EAEC + Salmonella e EAEC + atypical EPEC. In this study risk factors associated with episodes of diarrhoea among infants by bacterial etiological pathogens were identified. Statistical analysis demonstrated a significant association of Enteroagregative E. coli (EAEC) with acute infantile diarrhoea in João Pessoa, Brazil. The risk factors most strongly associated diarrhoea caused by EAEC were the ingestion of powdered cow milk and exposure to crowds and day care centres.