Orientador: Dirlei Antônio Berto / Coorientador: Alessandro Borges Amorim / Banca: Marcos Livio Panhoza Tse / Banca: Urbano dos Santos Ruiz / Resumo: Dois experimentos (E) foram realizados com o objetivo de avaliar os efeitos do ácido fumárico e de uma mistura de acidificantes a base de formiato de cálcio, lactato de cálcio e ácidos graxos de cadeia média (cáprico e caprílico) nas dietas de leitões, sobre o desempenho e frequência de diarreia (E 1), peso relativo de órgãos, pH, morfometria e microbiota intestinal (E 2). Foram utilizados 192 (E 1) e 24 (E 2) leitões, desmamados com idade média de 21 dias, distribuídos num delineamento experimental de blocos completamente ao acaso com arranjo fatorial 2x2 (ausência e presença de ácido fumárico x ausência e presença da mistura de acidificantes) dos tratamentos, seis repetições de oito e de um animal por parcela, respectivamente, para o E 1 e E 2. No E 1, com duração de 41 dias, os tratamentos foram: Controle: sem produto acidificante + 40ppm de colistina; AF: Presença de ácido fumárico e ausência da mistura de acidificantes; MA: Presença da mistura de acidificante e ausência do ácido fumárico e AF+MA: Presença do ácido fumárico e da mistura de acidificantes. No E 2, com duração de 14 dias, foi utilizada a dieta Pré Inicial I e avaliados os mesmos tratamentos do E 1. Não houve efeito dos tratamentos (P>0,05) no desempenho, incidência de diarreia, pH gastrintestinal e morfometria do duodeno dos leitões, porem, a adição da mistura de acidificantes reduziu (P<0,05) o peso relativo do intestino grosso e a adição do ácido fumárico aumentou o peso relativo do pâncreas e reduziu (P<0,05) a altura de vilosidade do jejuno e a contagem de coliformes totais e Escherichia coli no ceco. A inclusão de ácido fumárico e da mistura de acidificantes nas dietas de leitões desmamados contendo antibiótico melhorador de desempenho não se justifica, contudo, o ácido fumárico exerce ação inibitória sobre a população de coliformes totais e de Escherichia coli / Abstract: Two experiments (E) were conducted to evaluate the effects of fumaric acid and an organic acid blend compound of calcium formate, calcium lactate and medium chain fatty acids (capric and caprylic) in piglets diets on performance and frequency of diarrhea (E 1), relative organ weight, pH, morphometry and intestinal microbiota (E 2). One hundred and ninety two (E 1) and twenty four (E 2) piglets weaned at 21 days, distributed in a randomized block design with a 2x2 factorial arrangement of treatments (absence x presence of fumaric acid and absence x presence of acidifying product), six replications of eight and one pig per pen were used, respectively, for E 1 and E 2. In E 1, lasting 41 days, the treatments were: Control - No acidifying + 40 ppm of colistin sulfate; AF - Presence of fumaric acid and absence of acidifying product; MA - Presence of acidifying product and absence of fumaric acid and AF+MA: presence of fumaric acid and acidifying product. In E 2, lasting 14 days, Pré-Starter I diet was used and assessed the same treatments of E 1. There were no treatment effects (P>.05) in performance, incidence of diarrhea, gastrointestinal pH and morphometry of the duodenum of piglets, however, the addition of organic acid blend reduced (P<.05) the relative weight of the large intestine and the addition of fumaric acid increased the relative weight of the pancreas and decreased (P<.05) the villus height of jejunum and number of total coliforms and Escherichia coli in the cecum. The inclusion of fumaric acid and the organic acid blend in the diets of weaned piglets containing antibiotic is not justified, however, fumaric acid exerts an inhibitory effect on the population of coliforms and Escherichia coli / Mestre

Master of Science / Department of Diagnostic Medicine/Pathobiology / Weiping Zhang / Enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC) strains are the most common bacterial cause of diarrhea. ETEC bacterial adherence to the small intestinal epithelial cells and delivery of enterotoxins cause diarrhea in children living in developing countries and international travelers. Currently, there are no vaccines licensed for ETEC associated children’s diarrhea and travelers’ diarrhea. Recently, toxoid fusion 3xSTa[subscript N12S]-mnLT[subscript R192G/L211A] (toxoid fusion), adhesin MEFA (multiepitope fusion antigen) CFA/I/II/IV (CFA MEFA), and toxoid-adhesin MEFA CFA/I/II/IV-3xSTa[subscript N12S]-mnLT[subscript R192G/L211A] (CFA-toxoid MEFA) are demonstrated to induce neutralizing antitoxin and/or anti-adhesin antibodies in intraperitoneal (IP) or subcutaneous (SC) immunized mice, suggesting these antigens are potential candidates for ETEC subunit vaccines. However, these antigens have not been examined for immunogenicity using intradermal (ID) or intramuscular (IM) routes, the routes perhaps are more suitable for human vaccine administration. In this study, toxoid fusion 3xST[subscript aN12S]-mnLT[subscript R192G/L211A], CFA/I/II/IV MEFA, alone or combined, or toxoid-adhesin MEFA CFA-3xSTa[subscript N12S]-mnLT[subscript R192G/L211A] were ID or IM immunized to mice (8 mice per group) induced antigen-specific antibodies were titrated, and antibody neutralization activities were assessed in vitro. Data showed that mice ID or IM immunized with the toxoid fusion 3xSTa[subscript N12S]-mnLT[subscript R192G/L211A] antigen developed anti-LT and anti-STa antibodies and mice immunized with the CFA/I/II/IV MEFA developed antibody responses to all seven adhesins (CFA/I, CS1-CS6). In addition, mice co-administered ID or IM with toxoid fusion 3xSTa[subscript N12S]-mnLT[subscript R192G/L211A] and CFA/I/II/IV MEFA, or with toxoid-adhesin MEFA CFA-3xSTa[subscript N12S]-mnLT[subscript R192G/L211A] developed antibodies to both toxins and all seven adhesins. Antibody neutralization studies of the serum samples of the immunized mice showed that the induced antibodies neutralized enterotoxicity of LT and STa and/or inhibited adherence of ETEC or E. coli bacteria producing any of these seven adhesins. These data confirmed immunogenicity of these ETEC subunit vaccine target antigens and provide useful information for vaccine development against ETEC diarrhea.

A diarréia é o principal evento clínico observado no período neonatal em leitões (como conseqüência das doenças entéricas). Além de contribuir para piora no ganho de peso diário e conversão alimentar do animal causa aumento na mortalidade e gastos com medicamentos. O presente trabalho teve como objetivo determinar a freqüência dos principais agentes virais (rotavírus), bacterianos (E. coli, Clostridium perfringens tipo A e C e Clostridium difficile) e parasitários (coccídeos e Cryptosporidium spp.) envolvidos na diarréia neonatal em leitegadas caso (com diarréia) e controle (sem diarréia). Foram examinadas 276 amostras de fezes provenientes de 147 leitegadas com diarréia e 129 leitegadas sem diarréia, com idade variando entre 1 e 7 dias de vida em 28 unidades produtoras de leitões localizados no Estado do Rio Grande do Sul. Entre as amostras coletadas, 29,34% (81/276) foram positivas para pelo menos um agente pesquisado. Os coccídeos (20/276) e o C. perfringens tipo A (19/276) foram os agentes mais freqüentes. Nenhum dos enteropatógenos pesquisados obteve diferença significativa (p>0,05) entre as leitegadas caso e controle. Apenas o rotavírus (p=0,20) e o C. perfringens tipo A (p=0,16) apresentaram tendência de serem mais freqüentes em leitegadas com diarréia. Uma forte associação foi observada entre a ocorrência das diarréias e leitegadas mais novas (p<0,014). Foi observada pela primeira vez no Brasil a infecção pelo C. difficile, em 13,6% (17/132) das amostras, todavia a presença das toxinas nas fezes não teve relação com a diarréia. Os resultados obtidos indicam a necessidade de cuidados especiais quando da coleta de amostras para diagnósticos de monitoria de diarréias no período neonatal, pois é alta a chance de se obterem resultados falso positivos naqueles casos em que as doenças estiverem ocorrendo numa forma endêmica. / Diarrhea is the main clinical event occurring in pigs in the neonatal period,(as consequence of enteric disease). Besides contributing to losses in daily weight gain and feed conversion, diarrhea causes increased mortality and medication costs. The present work aimed to determine the frequency of the main viral agents (rotavirus), bacterial (E. coli, Clostridium perfringens type A and C and Clostridium difficile) and parasitic (coccidian and Cryptosporidium spp.) involved in neonatal diarrhea in case groups (with diarrhea) and controls (without diarrhea). We examined 276 fecal samples originating from 147 litters with diarrhea and 129 litters without diarrhea, with ages varying between 1 and 7 days, in 28 pig units of the state of Rio Grande do Sul, Brazil. Among the examined samples, 29.34% (81/276) were positive for at least one agent. Coccidia (20/276) and C. perfringens type A (19/276) were the most frequently isolated agents. None of the enteropathogens studied showed significant difference (p>0.05) between case and control litters. Only rotavirus (p=0.20) and C. perfringens A (p=0.16) had a tendency to present higher frequency in piglets with diarrhea. A strong association was observed between occurrence of diarrhea and litters with smaller age (p<0,014). Infection with C. difficile was diagnosed for the first time in Brazil, in 13.6% (17/132) samples; however the presence of the toxin in feces was not related to diarrhea. The present results suggest the need for special attention when sampling for the diagnosis or monitoring diarrhea in the neonatal period, as chances for obtaining false-positive results are high, especially when diseases are occurring endemically.

Disenteria de inverno é uma doença causada pelo coronavírus bovino que afeta animais adultos. Descrevem-se dois surtos de disenteria de inverno em rebanhos leiteiros nos municípios de Viamão e Vespasiano Corrêa, Rio Grande do Sul. A doença foi reproduzida experimentalmente em dois bovinos adultos. O quadro clínico se caracterizou por diarréia, inicialmente líquida esverdeada com estrias de sangue e muco, que em alguns animais, evoluiu para coloração marrom escura à sanguinolenta e que persistiu, em média, cinco dias. Na propriedade de Vespasiano Corrêa os animais apresentaram sinais respiratórios como tosse e corrimento nasal. Diminuição na produção de leite e no consumo de alimentos, além de graus variados de depressão foram também observados. Foi detectada a presença do coronavírus bovino nas fezes e secreção nasal dos animais pela técnica da nested RT-PCR. Foi realizada necropsia de um animal naturalmente infectado que morreu devido à doença. Na necropsia, observou-se mucosas pálidas, conteúdo sanguinolento com presença de grande quantidade de coágulos, principalmente no cólon espiral e petéquias na mucosa do cólon. No cólon espiral, foram observados os principais achados histológicos que incluíram criptas dilatadas sem epitélio de revestimento, ou revestidas por epitélio pavimentoso e/ou cuboidal, às vezes, com núcleos grandes e nucléolos proeminentes. Algumas criptas eram preenchidas por debris necróticos e polimorfonucleares. Amostra de fezes de um animal naturalmente infectado foi usada, através de uma suspensão administrada via oral e nasal, para tentar induzir infecção experimental em 3 bovinos de 20 meses. Foi observada diarréia em dois desses animais, no 5º dia após a inoculação. Esses animais foram eutanasiados ao 2º e 3º dias de diarréia. As lesões histológicas dos casos experimentais foram semelhantes àquelas do caso natural. Na imuno-histoquímica anti-coronavírus bovino (8F2) em cortes de tecido incluído em parafina do cólon espiral, houve marcação positiva no citoplasma de enterócitos das criptas, nos debris necróticos dessas criptas e em macrófagos na lâmina própria, tanto no caso natural como nos experimentais. Nos casos experimentais, também foi observada marcação imuno-histoquímica positiva em duodeno, jejuno, íleo, ceco, cólon descendente e epitélio de revestimento dos cornetos nasais. / Winter dysentery is caused by bovine coronavírus that affects adult animals. This report describes two outbreaks of the disease in dairy herds located in the counties of Viamão and Vespasiano Corrêa, Rio Grande do Sul. The disease was induced experimentally in two adult cattle. The most significant clinical sign was profuse and watery diarrhea, which ranged from greenish to brownish coloration with occasional blood streaks and mucus to a bloody diarrhea. In one herd, animals showed respiratory signs such as cough and nasal discharge. Most cases persisted for 5 days and also included depression, decreased milk production, and diminished food intake. The presence of bovine coronavirus was detected in feces and nasal secretions of animals by nested RTPCR. Necropsy was performed in one animal naturally affected and died due to the disease and revealed pale mucosa, sanguineous contents, and blood clots particularly within the spiral colon and pinpoint hemorrhages on the colonic mucosa. Histopathological lesions were predominant in the spiral colon and consisted of a high number of dilated crypts without epithelium or with replaced pavement epithelium with occasional immature cuboidal cells, which sometimes showed enlarged nucleus and prominent nucleolus. Some crypts were filled with epithelial desquamation and polymorphonuclear cells. Fecal samples from one naturally infected animal were used as a suspension and inoculated orally and nasal in three 20-month-old heifers. Diarrhea was observed in 2 of them and started on the 5th day post infection. These animals were euthanized at the second and third days of diarrhea. The histological lesions of experimental cases were similar to the natural case. Anti-bovine coronavirus (8F2) immunostaining was applied on paraffin embedded sections of the spiral colon and showed positive reactions in the cytoplasm of the infected crypt epithelium, sloughed necrotic cells, and within macrophages in the lamina propria of both, natural and experimental cases. Positive reactions were also seen in duodenum, jejunum, ileum, cecum, descending colon and the epithelium lining the nasal turbinate from experimental cases.

p. 1-112 / Submitted by Santiago Fabio (fabio.ssantiago@hotmail.com) on 2013-04-10T18:15:14Z No. of bitstreams: 1 Tese _ Maria Efigenia.pdf: 1177812 bytes, checksum: e7ab5f7bbee1bf8001e5519270ae0b07 (MD5) / Approved for entry into archive by Rodrigo Meirelles(rodrigomei@ufba.br) on 2013-04-13T20:13:39Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Tese _ Maria Efigenia.pdf: 1177812 bytes, checksum: e7ab5f7bbee1bf8001e5519270ae0b07 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-04-13T20:13:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese _ Maria Efigenia.pdf: 1177812 bytes, checksum: e7ab5f7bbee1bf8001e5519270ae0b07 (MD5) Previous issue date: 2009 / Objetivo: avaliar o efeito da suplementação dietética com o antioxidante N-acetilcisteína (NAC), oferecido a crianças com diarréia persistente. Método: trata-se de um ensaio clínico, duplo-cego, randomizado, controlado com placebo no qual foram estudadas 55 crianças, de ambos os sexos, com idades entre 02 e 36 meses, atendidas em um hospital pediátrico com diagnóstico de diarréia persistente ( 14 dias de duração). Os pacientes foram distribuídos, randomicamente, em dois grupos que receberam como dieta padrão o iogurte natural integral e a suplementação dietética com 3g de N-ACC(28 crianças) ou placebo(27 crianças) duas vezes ao dia. Estas crianças foram mantidas em uma unidade metabólica, onde o peso, a ingestão dietética de soro de reidratação oral e água, assim como as perdas fecais, urinárias e por vômitos, foram mensuradas durante todo o estudo e analisadas a cada 24 horas. Foram realizadas avaliações antropométricas e bioquímicas no momento do internamento e da alta do estudo. Resultados: Ao final do período de observação, os dados mostraram que a mediana de duração da diarréia (h) e de perda fecal (ml/kg/dia) foram menores em favor do grupo teste, embora sem significância estatística. Conclusão: Este estudo demonstra que a utilização de NAC como suplemento na dieta de crianças com diarréia persistente pode proporcionar vantagem terapêutica em comparação com a alimentação convencional. / Salvador

p. 1-38 / Submitted by Santiago Fabio (fabio.ssantiago@hotmail.com) on 2013-04-22T18:31:53Z No. of bitstreams: 1 2222.pdf: 561666 bytes, checksum: ebfdba1c6ab3fc6216c180b8b833b776 (MD5) / Approved for entry into archive by Maria Creuza Silva(mariakreuza@yahoo.com.br) on 2013-05-04T17:28:47Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2222.pdf: 561666 bytes, checksum: ebfdba1c6ab3fc6216c180b8b833b776 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-05-04T17:28:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2222.pdf: 561666 bytes, checksum: ebfdba1c6ab3fc6216c180b8b833b776 (MD5) Previous issue date: 2008 / Introdução: No Brasil, a vigilância epidemiológica das doenças transmitidas por alimentos (VE-DTA) iniciou-se em 1999. O objetivo desse estudo é descrever a epidemiologia dos surtos de DTA no Brasil para desenvolver estratégias para prevenir futuros surtos. Material e métodos: Foi desenvolvido um estudo ecológico dos surtos de DTA ocorridos no Brasil e notificados à Secretaria de Vigilância em Saúde (SVS) do Ministério da Saúde (MS), entre 1999 a 2006. Os dados foram analisados utilizando-se o pacote estatístico EpiInfo versão 6.04d e SPSS versão 13.0. Resultados: De 1999 a 2006, a VE-DTA recebeu notificação de 5.370 surtos, com 1.587.920 expostos, 108.793 doentes e 60 óbitos. A mediana de doentes foi sete (intervalo: 1 – 2.723), da incidência entre expostos foi de 71,4% (intervalo: 0,1 – 100,0) e do coeficiente de letalidade de 0% (intervalo: 0 – 75,0). As notificações foram recebidas de 24 UF e a região Sul notificou 50,9% dos surtos. Nos surtos com etiologia conhecida (50,2% - 2695/5370), 83,5% foram causados por bactérias, 14,1% por vírus, 1,4% por produtos químicos e 1% por parasitas. Os agentes etiológicos mais freqüentes foram: Salmonella spp em 42,1% (1134/2695) e Staphylococcus spp em 20,4%. Alimentos contendo ovos crus ou mal cozidos foram o principal veículo de transmissão, sendo a causa de 818 (22,4%) surtos, seguidos por alimentos mistos (17,5%), receitas com carnes vermelhas (11,8%), sobremesas (11,1%), água (8,7%), múltiplos alimentos (7,1%) e leite e derivados (6,9%). Dos 4.126 com local conhecido, a maior parte ocorreu nas residências (45,5%); restaurantes (19,1%) e instituições de ensino (11,0%). Surtos na comunidade apresentaram a maior razão de casos por local (144,2 – 17.753/124), seguidos por instituições com internação (64,3), eventos (45,7) e festas (40,5). Nas residências ocorreram as maiores proporções de óbitos (49,3% - 25/57). Conclusões: No período estudado houve aumento do número de surtos notificados e uma melhoria na qualidade da informação, à medida que as UF implantaram e utilizaram o sistema da VE-DTA. Neste sentido, recomenda-se aperfeiçoar as estratégias de segurança alimentar para que a população consuma produtos saudáveis, isentos de contaminação; implantar a VE-DTA nos demais municípios e aprimora qualidade das investigações dos surtos,para que de forma mais sensível, rápida e contínua, as equipes sejam capazes de identificar, controlar e prevenir a ocorrência de surtos. / Salvador

Os vírus entéricos causam infecções que podem ocasionar uma alta morbidade e mortalidade em cães. A diarreia se destaca como o principal sinal clínico e a subsequente desidratação pode causar a morte do animal. O Carnivore protoparvovirus 1 (CPV-2), Canine mastadenovirus A tipo 1 (CAdV-1), o Canine coronavirus (CCoV), o Canine rotavirus (CRV) e o Canine distemper virus (CDV) são considerados os principais agentes que causam gastroenterite viral aguda em cães jovens. O objetivo deste trabalho foi detectar a presença destas cinco espécies virais na população de cães do Brasil. Para isto, foram coletados 325 suabes retais de cães com ou sem diarreia, jovens (> 6 meses) e adultos (< 6 meses), com ou sem histórico de vacinação e de diversas regiões do Brasil. As amostras foram analisadas através da reação em cadeia da polimerase (PCR) ou transcrição reversa seguida de PCR (RT-PCR) utilizando iniciadores específicos para cada um dos agentes virais. Resultaram 81% (264/325) das amostras positivas para um destes vírus, das quais 30,7% (100/325) foram positivas para o CPV-2, 25,5% (83/325) para o CDV, 17,2% (56/325) para o CCoV, 4,6% (15/325) para o CRV e 2,7% (9/ 325) para o CAdV-1. Algumas amostras apresentaram co-infecções, sendo que as espécies mais predominantemente encontradas em co-infecções foram o CDV e CPV-2 em 15,4% (50/325) e 15,0% (49/325), respectivamente, seguidos do CCoV em 10,1% (33/325,), CRV em 3,0% (10/325) e CAdV-1 em 1,5% (5/325) das amostras. A associação viral mais observada foi CDV e CPV-2 em 31/325 (9,5%) amostras positivas para ambos os vírus. Em conclusão, os resultados demonstram que CPV-2, CDV e CCoV são os principais vírus entéricos patogênicos que circularam no Brasil entre os anos de 2008 e 2014, infectando mais frequentemente animais jovens. / Enteric viruses cause infections that lead to high morbidity and mortality. Diarrhea is the main clinical sign, whose subsequent dehydration can cause death of the animal. Carnivore protoparvovirus 1 (CPV-2), Canine mastadenovirus A (CAdV-1), Canine coronavirus (CCoV), Canine rotavirus (CRV) and Canine distemper virus (CDV) are considered the main agents that cause acute viral gastroenteritis in young dogs. The aim of this study was the detection of these five viral species in dogs from Brazil. Rectal swabs from 325 dogs, puppies (< six months old), adult dogs (> 6 months old), with or without a history of vaccination, were collected from various regions of the country. The samples were analyzed by polymerase chain reaction (PCR) or reverse transcription following followed by PCR (RT-PCR) using oligonucleotides specific for each one of this virus. As result, 81% (264/325) of the samples were observed to be positive for at least one virus, 30,7% (100/325) were positive for CPV-2, 25,5% (83/325) for CDV, 17,2% (56/325) for CCoV, 4,6% (14/325) for CRV and 2,7% (9/325) for CAdV-1. Some samples showed co-infection, where the species most predominantly found were CDV and CPV-2 with 15,4% (50/325) and 15,0% (49/325), respectively, followed by CCoV with 10,1% (33/325,), CRV with 3,0% (10/325) and CAdV-1 1,5% (5/325). The most observed viral association was CDV and CPV-2, with 31/325 (9,5%) positive samples for both viruses. In conclusion, the results showed that CPV-2, CDV and CCoV are the main pathogenic enteric viruses that circulated in Brazil between the years 2008 and 2014, infecting more frequently puppies.

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:50:11Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2006-12-31 / Escherichia coli enteroagregativa (EAEC) é um patógeno emergente, associado à doença diarréica, que apresenta como característica o padrão de adesão agregativo (AA) a superfície de células HEp-2. O fenótipo AA está associado à presença de um plasmídeo de 65 MDa, conhecido como plasmídeo pAA, detectado através de uma sonda genética denominada de CVD432 ou simplesmente AA. Algumas amostras de EAEC, entretanto, apresentam o padrão AA, mas não são portadoras do plasmídeo. No plasmídeo pAA estão presentes vários genes relacionados com as propriedades de virulência, dentre os quais aqueles que codificam as adesinas fimbrias AAF (“Aggregative Adherence Factor” - AAF/I, AAF/II e AAF/III), o regulador de transcrição AggR, a proteína antiagregação (Aap) e as toxinas Pet e EAST1. Outros fatores de virulência de EAEC são codificados por genes cromossômicos, entre eles, a enterotoxina ShET1, o sideróforo Yersiniabactin (irp2), uma ORF críptica (Shf), e uma a-hemolisina. A maioria dos estudos sobre mecanismos de virulência de EAEC compreende amostras que apresentam o padrão AA e que reagem com a sonda AA, ou seja, as amostras de EAEC típicas. Pouco se conhece sobre a presença de potenciais fatores de virulência em amostras de EAEC sonda-negativas, descritas por nós como EAEC atípicas. Neste estudo analisamos 28 amostras de EAEC atípicas isoladas de crianças com diarréia (N = 18) e sem diarréia (N = 10) provenientes de várias cidades brasileiras quanto à presença de seqüências genéticas associadas aos fatores de virulência codificados no plasmídeo pAA e no cromossomo. A maioria das amostras era portadora de dois ou mais genes de virulência, sendo a média dois; porém, duas amostras controles foram negativas para todos os marcadores de virulência pesquisados. Os genes astA, pet, shf, shET/1/pic, irp2 e hly foram encontrados mais freqüentemente em amostras isoladas de casos do que de controles. Quatro amostras apresentaram o gene aggR e em uma delas foi encontrado também as seqüências genéticas aafA e aap. A combinação dos genes astA e shf, foi encontrada em 16 (57%) amostras e 7 (25%) amostras eram portadoras das sequências genéticas astA, shf e irp2.Entre as amostras estudadas, os marcadores genéticos codificados por genes plasmidiais, astA, relacionada a produção de EAST1, e shf associada a uma ORF críptica, foram os mais freqüentes (61%) e apresentaram uma freqüência significantemente maior nos casos do que nos controles estudados (P = 0,003 e P = 0,020, respectivamente). A maioria das amostras de EAEC atípicas estudadas reagiu com um dos 175 antissoros utilizados, sendo que alguns desses, como os sorogrupos O42, O126 e O162 foram os mais freqüentes e encontrados apenas nas amostras isoladas de casos. A análise do perfil plasmidial de 12 amostras isoladas de crianças com diarréia mostrou a presença de mais de um plasmídeo de alto peso molecular na maioria das amostras estudadas. Duas amostras, uma contendo apenas um plasmídeo e uma outra sem nenhum plasmídeo foram então selecionadas para caracterização dos genes envolvidos no padrão AA. A amostra RN691-2 portadora de um único plasmídeo e apresentando resistência antimicrobiana múltipla, foi submetida a experimentos de transformação, conjugação e cura, não sendo possível à obtenção de um transformante, transconjugante ou mesmo a amostra isogênica sem o plasmídeo. Com o objetivo de identificar o(s) gene(s) envolvidos no padrão AA da amostra RN153-1, sem nenhum plasmídeo, foi construída uma biblioteca genômica e identificado um clone-cosmídeo, designado pVIII-F-1, que apresentou o padrão AA em células HEp-2 de maneira semelhante à amostra selvagem. Para localizar o gene necessário para a adesão, o clone cosmídeo foi submetido a mutagênese com o transposon mini-Tn10 (CmR), sendo identificado o mutante pVIII-F-1 / Escherichia coli enteroaggregative (EAEC) is emerging as a significant diarrheal pathogen. EAEC is defined by its characteristic “stacked brick” aggregative adherence (AA) pattern of adherence to HEp-2 cells. Most EAEC strains harbor a 60 to 65-MDa virulence plasmid (pAA). A 1-Kb fragment of pAA, referred to as the AA probe or CVD432, has been widely used for epidemiological studies. The pAA also encodes AA fimbrae (AAF) I, II, and III; the transcriptional activator AggR; enteroaggregative heatstable enterotoxin 1 (EAST1); a 104-KDa cytotoxin designated Pet; the cryptic secreted protein Shf; and a novel antiaggregation protein (dispersin) encoded by the aap gene. In addition to the pAA plasmid, some EAEC strains express putative virulence factors that are encoded on the chromosome, including a 116-KDa secreted mucinase (Pic), yersiniabactin (Irp2), and the E. coli a-hemolysin (a-Hly). Shigella enterotoxin 1 (ShET1) is encoded by the antisense strand of the pic gene. Few studies have evaluated the prevalence of EAEC markers in probe-negative strains, reported by us as atypical EAEC. By using atypical EAEC strains isolated in a case-control study, we assessed the prevalence of putative virulence factors, such as AAF/I, AAF/II, AAF/III, AggR, Aap, EAST-1, Pet, Shf, ShET1/Pic, Irp2, and a-Hly, in an attempt to identify their roles as enteric virulence factors. The majority of strains carried two or more of the genes, with two being the modal value; but two strains isolated from a control did not test positive for any of the factors. The AAF, aggR, and aap genes were present in only a minority of strains. The astA, pet, shf, ShET1/pic, irp2 and hly genes were found more frequently in the patients than in the controls. The combination astA and shf was found in 16 strains (57%), followed by 7 strains (25%) possessing the combination astA, shf, and irp2. The common virulence markers found in strains included the Pet, EAST1, Shf, Irp2, ShET1/Pic, and Hly virulence markers. EAST1 and Shf were the most frequently detected markers (61%) in strains and were found to be significantly associated with diarrhea (P = 0,003 and P = 0,020, respectively). The majority (75%) of the EAEC isolates reacted with one of the antisera used. It was interesting that the strains belonging to serogroups O42, O126 and O162 were detected only in children with diarrhea.Plasmid analysis of 12 strains isolated from diarrhea showed that the majority of strains contained large plasmids. Two strains, one carrying only one plasmid (MA691-2) and another one any plasmid (RN153-1), were chosen for genetic studies on the identification of genes responsible for the AA phenotype. Plasmid from MA691-2 strain was transferred to E. coli K12 and no transformant or transconjugant harboring the plasmid or isogenic derivative strain lacking the plasmid was identified. A genomic cosmid library of EAEC RN153-1 was generated in E. coli K12, and the resulting clones were screened for aggregative adherence to HEp-2 cells. One cosmid clone, pVIII-F-1, exhibited the same adherence as the wild-type, albeit to a lesser extent. Transposon mutagenesis was utilized to identify the region of cosmid pVIII-F-1 responsible for the aggregative phenotype. Plasmid pBSL181 carrying mini-Tn10 / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

O presente estudo teve como objetivo avaliar a frequência dos fatores de virulência em amostras de Escherichia (E.) coli isoladas de leitões desmamados. Para a classificação de cepas de E. coli do patotipo ETEC, foram coletados suabes retais de leitões com idade entre 25-40 dias (fase de creche) com sinal clínico de diarreia, em granjas dos estados do Rio Grande do Sul, Santa Catarina e Paraná, totalizando 456 amostras. Para isolamento e caracterização bacteriana, foram utilizados métodos fenotípicos e moleculares. Foi realizada a análise estatística da frequência dos fatores de virulência e dos virotipos, para as fímbrias F4, F5, F6, F18, F41 e toxinas LT, STa, STb e STx2e. Das 456 amostras analisadas, 287 apresentaram crescimento significativo de E. coli. As maiores frequências observadas foram para as fímbrias F4 e F18 e para as enterotoxinas LT, STa e STb. Os virotipos mais frequentes foram F18-STa, F4-LT-STa-STb, F4-STa, F4-LT-STb e F18-STa-STx2e. Noventa e três amostras (32,4%) não apresentaram nenhum gene dos fatores analisados. Foi observada a associação significativa entre amostras positivas para a fímbria F4 e as toxinas LT, STa e STb; entre a fímbria F18 e as toxinas STa e STx2e; entre a fímbria F5 e todas as toxinas. Os genes de toxinas mais detectados (LT, STb) apresentaram associação significativa (P<0,02). A beta-hemólise foi observada em 47,4% das amostras e houve associação (P<0,0001) entre as amostras hemolíticas e os fatores de virulência F4, F18, STa e STx2e. Em relação à consistência das fezes, observou-se associação entre as fezes com consistência líquida e F4 e STa. Com base nos resultados obtidos, conclui-se que a ETEC é um importante agente etiológico de diarreia em leitões desmamados. Em diversas amostras (32,4%) não foram detectados fatores de virulência, sugerindo a ação de outros fatores e/ou agentes desencadeantes de diarreia. E além destes, existem várias hipóteses para explicar esta discrepância, as quais foram revisadas neste trabalho. / The frequency of virulence factors in strains of Escherichia (E.) coli isolated from weaned piglets was assessed. For classification of the strains of enterotoxigenic pathotypes of E. coli, rectal swabs were collected from 25-40 days old nursery piglets with clinical signs of diarrhea in the states of Rio Grande do Sul, Santa Catarina and Paraná, totaling 456 samples. For isolation and bacterial characterization of the samples, phenotypic and molecular tests were used. The results of frequency of virulence factors and virotypes to fimbriae F4, F5, F6, F18, F41 and toxins LT, STa, STb and STx2e were submitted to statistical analysis. Out of 456 samples, 287 showed significant growth of E. coli. The highest frequency was observed for F4 and F18 fimbriae and LT, STa and STb enterotoxins. The most prevalent virotypes were F18-STa, F4-LT-STa-STb, STa-F4, F4-LT-STa-STb and F18-STx2e. Ninety-three samples (32.4%) were negative for virulence genes. There was a significant association between positive samples for F4 fimbriae and enterotoxins LT, STa and STb; between the F18 fimbriae and STa and STx2e; between F5 fimbriae and all enterotoxins. The most frequent toxins (LT, STb) presented significant association (P<0.02). Beta-hemolysis was observed in 47.4% of the samples and there was a association (P<0.0001) between hemolysis and fimbriae F4, F18, STa and STx2e. Regarding stool consistency, it was observed a association between liquid consistency and F4 and STa. Based on the results, it can be concluded that ETEC is an important agent of diarrhea in weaned pigs. In several samples (32.4%) virulence factors were not detected, suggesting the action of other factors and/or agents inducing diarrhea. And besides these, there are other hypotheses to explain this discrepancy, which were reviewed in this work.

Made available in DSpace on 2015-12-10T14:23:44Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2015-02-27. Added 1 bitstream(s) on 2015-12-10T14:29:44Z : No. of bitstreams: 1 000851519.pdf: 1178190 bytes, checksum: 6da71571493874117e3f938393027381 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Escherichia coli diarreiogênica (ECD) representa uma das principais causas da diarreia infantil. Com base em seus mecanismos de virulência, podemos classificá-la em seis patotipos distintos: E. coli enteropatogênica (EPEC), E. coli enterotoxigênica (ETEC), E. coli enteroinvasora (EIEC), E. coli produtora da toxina Shiga (STEC), E. coli enteroagregativa (EAEC) e E. coli que adere difusamente (DAEC). O objetivo deste estudo foi investigar a prevalência de ECD, entre crianças diarreicas (Pacientes) e crianças saudáveis (Controles), menores de cinco anos de idade, na cidade de Botucatu/SP. Foram analisadas amostras de fezes de 200 crianças com diarreia, atendidas no Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Botucatu, entre os meses de Março de 2013 a Setembro de 2014, e 200 crianças saudáveis. Isolados de E. coli foram classificados nos distintos patotipos de ECD pela pesquisa de marcadores de virulência específicos através de PCR e, posteriormente, foram caracterizados quanto ao padrão de aderência em células HeLa e resistência à drogas antimicrobianas. Os isolados portadores do locus of enterocyte effacement (eae+) foram submetidos ao teste de FAS (Fluorescence Actin Staining), para avaliar a capacidade desses isolados em induzir a lesão attaching and effacing (AE). Ademais, os isolados de EPEC e STEC tiveram seu antígeno somático (O), e flagelar (H) determinados. ECD foi isolada de 18,0% das crianças diarreicas, e em 19,0% das crianças saudáveis, sendo que nenhum patotipo de ECD pode ser individualmente associado com a doença diarreica (P0,05). O patotipo EAEC foi o mais frequente, tendo sido detectado em igual proporção entre crianças diarreicas e saudáveis (10,0%). Dentre os isolados de EPEC, 16 provenientes das fezes de crianças com diarreia e 18 provenientes de crianças saudáveis, somente um foi capaz de aderir às células HeLa no padrão localizado (AL), sendo esse o único isolado classificado... / Diarrheagenic Escherichia coli (DEC) comprises a major cause of child hood diarrhea. Based on their virulence mechanisms, DEC can be classified into six distinct pathotypes: enteropathogenic E. coli (EPEC), enterotoxigenic E. coli (ETEC), enteroinvasive E. coli (EIEC), enteroaggregative E. coli (EAEC), enterohemorrhagic E. coli (EHEC) and diffusely adherent E. coli (DAEC). This study aims to investigate the prevalence of DEC among diarrheal children (patients) and healthy children (controls), up to five years of age in Botucatu/SP. We analyzed stool samples from 200 children with diarrhea attended at Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Botucatu, between March/2013 and September/2014, and 200 healthy children. E. coli isolates were classified in different pathotypes by detection of virulence markers (by PCR) and then, characterized regarding its adherence pattern to HeLa cells and antimicrobial resistance drugs. Isolates carrying the locus of enterocyte effacement (eae+) were submitted to FAS test (Fluorescence Actin Staining), to evaluate the ability of these isolates to induce attaching and effacing lesion (AE). In addition, EPEC and STEC isolates, had their somatic (O) and flagellar (H) antigens determined. DEC was isolated from 18.0% of diarrheal children, and 19.0% of healthy children, and none of the DEC pathotypes could be individually associated with the diarrheal disease (P>0.05). EAEC was the most frequent DEC pathotype, being detected in equal proportion between patients and controls (10.0%). Among the EPEC isolates, 16 from patients and 18 from controls, only one was able to produce the localized adherence (LA) pattern to HeLa cells, being this isolate the only typical EPEC (tEPEC) identified in this study. The remains EPEC isolates were classified as aEPEC (atypical EPEC), and detected in 8.0 and 8.5% of the patients and controls, respectively. STEC and ETEC were detected in only one child from each studied ... / FAPESP: 2013/05170-1