Rotavírus (RV) é um importante patógeno viral que causa diarreia em leitões e indivíduos jovens de várias outras espécies animais. RV dos grupos A, B, C e E foram descritos como causa de diarreia em suínos. Este estudo reúne achados histopatológicos, imunohistoquímicos e de reação em cadeia da polimerase com transcriptase reversa (RT-PCR) presentes em quatro surtos de diarreia causados por RV de um e de múltiplos grupos na região sul do Brasil. Vacinação para RV não era aplicada em nenhuma das granjas estudadas. Necropsia, exames histológicos e imuni-histoquímicos foram realizados em 34 suínos de maternidade que apresentavam diarreia severa, além disso, realizou-se cultivo bacteriano e RT-PCR para RV dos grupos A, B e C, vírus da gastroenterite transmissível (TGEV), vírus da diarreia epidêmica dos suínos (PEDV), sapovírus (SaV), norovírus (NoV) e kobuvírus (Aichi vírus C) em 30 dessas amostras. Desidratação e conteúdo pastoso a líquido no cólon foram observados em todos os suínos. Exame histológico revelou atrofia de vilosidades em 29 casos, vacuolização de enterócitos em 27 casos e debris celulares na lâmina própria em 20 casos. Houve marcação imunohistoquímica positiva em 21 casos. RT-PCR foi positiva para RV em 20 casos e RV do grupo C foi o mais frequentemente detectado, presente em 17 amostras. Cultivo e isolamento de Escherichia coli ocorreu em todos os casos e quatro destes foram de E. coli α-hemolítica. Em 15 amostras houve isolamento de Clostridium sp. Sapovirus foi detectado em oito amostras, duas amostras foram positivas para norovírus e detectou-se kobuvírus em 11 animais. Os achados histológicos foram consistentes com infecção por RV e a imuno-histoquímica revelou dois padrões de marcação para o agente no intestino delgado. Os resultados de RT-PCR mostraram que o RV do grupo C foi o principal agente detectado neste estudo. O isolamento de E. coli e a detecção de SaV os destacou como agentes associados à infecção por RV. A detecção de kobuvírus o enfatiza como um novo candidato em associação com RV. / Rotavirus is an important viral pathogen causing diarrhea in piglets and other animal species worldwide. Groups A, B, C and E have been described causing diarrhea in swine. This study reunites histopathological, immunohistochemical and reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR) findings present in four outbreaks of diarrhea caused by single and multiple groups of rotavirus in the south of Brazil. None of the herds studied applied vaccination against rotavirus. Necropsy, histological examination and immunohistochemistry were performed in 34 nursing piglets that presented severe diarrhea, bacterial culture and reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR) for rotavirus from groups A, B and C, transmissible gastroenteritis virus (TGEV), porcine epidemic diarrhea virus (PEDV), sapovirus (SaV), norovirus (NoV) and kobuvirus (Aichi virus C) were carried out in 30 of the animals necropsied. Additionally, RT-PCR was performed in fecal pools from two outbreaks. Dehydration and fluid to pasty contents were observed in the colon of all 34 swine examined. Histological examination revealed villus atrophy in 29 cases, vacuolation of enterocytes in 27 cases and necrotic debris in the lamina propria of 20 cases. IHC was positive in 21 samples. RT-PCR was positive for rotavirus in 20 samples and group C rotavirus was the most frequently detected, present in 17 samples. Escherichia coli was isolated from all cases, and in four cases, it was α-hemolytic. Clostridium sp. was isolated from 15 samples. Sapovirus was detected in eight samples, samples from two animals were positive for norovirus and kobuvirus was detected from 11 samples. Histological findings were consistent with rotavirus infection and immunohistochemistry revealed two patterns of staining for rotavirus in the small intestine. RT-PCR results have shown group C rotavirus as the main agent detected in this study. The isolation of Escherichia coli and the detection of sapovirus highlighted them as possible agents associated to rotavirus infection. Kobuvirus detection has emphasized it as a new candidate in the association with rotavirus.

Submitted by Jorge Silva (jorgelmsilva@ufrrj.br) on 2018-05-03T19:48:33Z No. of bitstreams: 1 2016 - Lara Patricia Santos Carrasco.pdf: 1457762 bytes, checksum: 82c38851cf4f7b3e95d40cfbb6f7ddee (MD5) / Made available in DSpace on 2018-05-03T19:48:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016 - Lara Patricia Santos Carrasco.pdf: 1457762 bytes, checksum: 82c38851cf4f7b3e95d40cfbb6f7ddee (MD5) Previous issue date: 2016-02-16 / Tritrichomonas foetus has been recently recognized as an important cause of diarrhea in various countries. The aim of this study was to diagnose and treat the infection by T. foetus in cats treated at HVPA of UFRRJ, identify the clinical relevance of this parasite, the risk factors, presence of co-infections and clinical response to treatment. In this study, were admitted 100 felines, from different breeds, both sexes and from 16 weeks of age. As inclusion criteria, patients had to have diarrhea history for more than three weeks, with little success of clinical response to treatments previously used. From the stool samples obtained by colon washing or spontaneous defecation it was conducted direct examination of stool, centrifugal flotation technique and real-time PCR. Of the 100 cats selected for this study, 10% had T. foetus infection. Most positive animals were over one year old (70%) and only 30% had up to 1 year old. Cats were 80% purebred and 20% were animals mongrel. The clinical signs present were diarrhea (60%), weight loss (10%), hemoatochezia (30%) and presence of mucus in the stool (20%). Only two animals were positive for the antigen of FeLV virus, and theses showed more severe case of diarrhea. Three animals showed co-infections with other enteropathogens (30%), one with Giardia, one with Cryptosporidium and one with Cystoisospora. All treated animals showed clinical improvement with the administrations of ronidazole at a dose 30mg/kg every 24 hours during 14 days and showed no recurrence until the recent time. We can conclude that T. foetus infection is an important differential diagnosis in cats with chronic diarrhea, which cats of any age and regardless of whether purebred or not, may have the infection, other enteropathogens needs to be investigated in all cases and the treatment was effective in the resolution of clinical signs of all treated cats. / Tritrichomonas foetus foi recentemente reconhecido como um importante agente etiol?gico de diarreia em diversos pa?ses. O objetivo deste estudo foi diagnosticar e tratar a infec??o por T. foetus nos gatos atendidos no HVPA da UFRRJ, identificar a relev?ncia cl?nica deste parasita, os fatores de risco, a presen?a de co- infec??es e resposta cl?nica ao tratamento. Neste trabalho, foram admitidos 100 animais da esp?cie felina, de diferentes ra?as, de ambos os sexos e a partir de 16 semanas de idade. Como crit?rio de inclus?o, os pacientes deveriam apresentar hist?rico de diarreia a mais de tr?s semanas, com pouco sucesso de resposta cl?nica para terap?uticas previamente institu?das. A partir das amostras de fezes obtidas por coleta via lavagem do colon dos animais e pelo ato de defeca??o espont?nea, foram realizados os m?todos do exame direto das fezes, t?cnica de centrifugo flutua??o e PCR em tempo real. Dos 100 gatos que foram selecionados para esta pesquisa, 10% apresentaram infec??o por T. foetus. A maioria dos animais positivos estavam na faixa et?ria acima de um ano (70%) e apenas 30% tinha at? um ano de idade. Os gatos eram 80% de ra?a pura e 20% eram animais sem ra?a definida. Os sinais cl?nicos apresentados por esses gatos foram diarreia (60%), perda de peso (10%), hematoquezia (30%) e presen?a de muco nas fezes (20%). Apenas dois animais infectados eram positivos para o ant?geno do v?rus da FeLV, e estes apresentaram um quadro mais severo de diarreia. Tr?s animais apresentaram coinfec??es com outros enteropat?genos (30%), um com Giardia sp, um com Cryptosporidium e outro com Cystoisospora. Todos os gatos tratados apresentaram melhora cl?nica com a administra??o do f?rmaco ronidazol na dose de 30 mg/Kg a cada 24 horas por 14 dias, n?o apresentando recidiva da diarreia at? o recente momento. Podemos concluir que a infec??o por T. foetus ? um importante diagn?stico diferencial em felinos com diarreia cr?nica, que gatos de qualquer idade e independente de ser de ra?a pura ou n?o, podem apresentar a infec??o, que a co- infec??o com outros enteropat?genos necessita ser investigada em todos os casos e que o tratamento foi efetivo na resolu??o dos sinais cl?nicos de todos os gatos tratados.

Orientador: Rodrigo Tavanelli Herandes / Banca: Josias Rodrigues / Banca: Ricardo Seiti Yamatogi / Resumo: Escherichia coli diarreiogênica (ECD) representa uma das principais causas da diarreia infantil. Com base em seus mecanismos de virulência, podemos classificá-la em seis patotipos distintos: E. coli enteropatogênica (EPEC), E. coli enterotoxigênica (ETEC), E. coli enteroinvasora (EIEC), E. coli produtora da toxina Shiga (STEC), E. coli enteroagregativa (EAEC) e E. coli que adere difusamente (DAEC). O objetivo deste estudo foi investigar a prevalência de ECD, entre crianças diarreicas (Pacientes) e crianças saudáveis (Controles), menores de cinco anos de idade, na cidade de Botucatu/SP. Foram analisadas amostras de fezes de 200 crianças com diarreia, atendidas no Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Botucatu, entre os meses de Março de 2013 a Setembro de 2014, e 200 crianças saudáveis. Isolados de E. coli foram classificados nos distintos patotipos de ECD pela pesquisa de marcadores de virulência específicos através de PCR e, posteriormente, foram caracterizados quanto ao padrão de aderência em células HeLa e resistência à drogas antimicrobianas. Os isolados portadores do locus of enterocyte effacement (eae+) foram submetidos ao teste de FAS (Fluorescence Actin Staining), para avaliar a capacidade desses isolados em induzir a lesão attaching and effacing (AE). Ademais, os isolados de EPEC e STEC tiveram seu antígeno somático (O), e flagelar (H) determinados. ECD foi isolada de 18,0% das crianças diarreicas, e em 19,0% das crianças saudáveis, sendo que nenhum patotipo de ECD pode ser individualmente associado com a doença diarreica (P0,05). O patotipo EAEC foi o mais frequente, tendo sido detectado em igual proporção entre crianças diarreicas e saudáveis (10,0%). Dentre os isolados de EPEC, 16 provenientes das fezes de crianças com diarreia e 18 provenientes de crianças saudáveis, somente um foi capaz de aderir às células HeLa no padrão localizado (AL), sendo esse o único isolado classificado... / Abstract: Diarrheagenic Escherichia coli (DEC) comprises a major cause of child hood diarrhea. Based on their virulence mechanisms, DEC can be classified into six distinct pathotypes: enteropathogenic E. coli (EPEC), enterotoxigenic E. coli (ETEC), enteroinvasive E. coli (EIEC), enteroaggregative E. coli (EAEC), enterohemorrhagic E. coli (EHEC) and diffusely adherent E. coli (DAEC). This study aims to investigate the prevalence of DEC among diarrheal children (patients) and healthy children (controls), up to five years of age in Botucatu/SP. We analyzed stool samples from 200 children with diarrhea attended at Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Botucatu, between March/2013 and September/2014, and 200 healthy children. E. coli isolates were classified in different pathotypes by detection of virulence markers (by PCR) and then, characterized regarding its adherence pattern to HeLa cells and antimicrobial resistance drugs. Isolates carrying the locus of enterocyte effacement (eae+) were submitted to FAS test (Fluorescence Actin Staining), to evaluate the ability of these isolates to induce attaching and effacing lesion (AE). In addition, EPEC and STEC isolates, had their somatic (O) and flagellar (H) antigens determined. DEC was isolated from 18.0% of diarrheal children, and 19.0% of healthy children, and none of the DEC pathotypes could be individually associated with the diarrheal disease (P>0.05). EAEC was the most frequent DEC pathotype, being detected in equal proportion between patients and controls (10.0%). Among the EPEC isolates, 16 from patients and 18 from controls, only one was able to produce the localized adherence (LA) pattern to HeLa cells, being this isolate the only typical EPEC (tEPEC) identified in this study. The remains EPEC isolates were classified as aEPEC (atypical EPEC), and detected in 8.0 and 8.5% of the patients and controls, respectively. STEC and ETEC were detected in only one child from each studied ... / Mestre

Planejou-se um estudo com o objetivo de se avaliar os níveis plasmáticos de vitamina A, carotenóides e proteína ligadora de retinol (RBP) em 311 crianças, de 7 meses a onze anos de idade, com história de infecções das vias aéreas superiores (IVAS), pneumonia e diarréia, residentes na área urbana da Cidade de São Paulo, Brasil, e atendidas na santa Casa de Misericórdia de São Paulo. As crianças foram classificadas de acordo com seus níveis de vitamina A e carotenóides segundo o critério proposto pelo Interdepartmental Committee on Nutrition for National Defense (ICNND). Para caracterizar estado nutricional das crianças determinou-se o hematócrito e foram realizadas dosagens de hemoglobina e proteinas plasmáticas, medidas antropométricas e avaliação do consumo dietético de alimentos fontes de carotenóides e vitamina A, pelo método da freqüência de consumo alimentar. Os niveis plasmáticos de vitamina A (ug/dl) e RBP (mg/dl) foram mais baixos (p<0,05) nos grupos diarréia e pneumonia (15,2 ug/dl e 1,7 mg/dl; 15,2 ug/dl e 0,7 mg/dl, respectivamente), quando comparados com os grupos IVAS e testemunha (19,0 ug/dl; 2,4 mg/dl e 18,8 ug/dl; 2,6 mg/dl, respectivamente). Os níveis de carotenóides foram mais baixos nos três grupos de estudo em relação ao grupo testemunha (p<0,05). Trinta e quatro pacientes internados do grupo pneumonia foram divididos aleatóriamente, em dois sub-grupos: testemunha (com tratamento de rotina hospitalar) e experimental (tratamento de rotina mais suplementação com 200.000 UI de palmitato de retinila hidromiscível). Após cerca de uma semana da administração de vitamina A, foi verificado aumento estatisticamente significante (p<0,05) nas médias dos niveis de vitamina A (experimental: 26,5 ug/dl; testemunha: 24,1 ug/dl) e RBP (experimental: 2,2 mg/dl; testemunha: 2,9 mg/dl) nos dois grupos, em relação aos niveis basais de vitamina A (experimental: 14,1 ug/dl; testemunha: 16,1 ug/dl) e RBP (experimental: 0,8 mg/dl; testemunha: O, 6 mg/dl)· Não houve diferenças estatísticas quando foram comparadas as médias dos niveis de vitamina A nos grupos experimental e testemunha, após a suplementação (26,5 ug/dl e 24,1 ug/dl, respectivamente). O estudo sugere que os baixos níveis circulantes de vitamina A podem ser conseqüência da reduzida mobilização da vitamina A durante a fase de infecção, devido a baixa disponibilidade de RBP. / The present study was carried out in order to assess the plasma levels of vitamin A, carotenoids and retinol binding protein (RBP) of three-hundred and eleven children aged from seven months to eleven years, who had a history of upper respiratory infection (URI), pneumonia and diarrhoea. The children were resident in the urban area of the Municipality of São Paulo, Brazil, and were seen at the \"Santa Casa de Misericórdia de São Paulo\" Hospital. The Interdepartmental Committee on Nutrition for National Defense (ICNND) criterion was used to classify the children according to their plasma vitamin A and carotenoid levels. Other measurements such as hemoglobin, hematocrit and plasma proteins dosage, anthropometry, as well as vitamin A and carotenoids qualitative intake, evaluated through the food frequency method, were taken in order to characterize the nutritional status of the children. The data shows that plasma vitamin A (ug/dl) and RBP (mg/dl) levels in the diarrhoea (15.2 ug/dl; 1.7 mg/dl) and pneumonia (15.2 ug/dl; 0.7 mg/dl) groups were lower (p<0.05) than those observed in the control (18.8 ug/dl; 2.6 mg/dl) and URI (19.0 J.lg/dl; 2.4 mg/dl) groups. The plasma carotenoid levels were lower in all study groups when compared to the control group (p<0.05). Thirty four hospitalized patients from the pneumonia group were randomly allocated into two groups. The experimental group, besides the routine treatment, received 200.000 UI of aqueous retinyl palmitate oral solution, whereas the control group recei ved only the routine treatment. This clinical trial showed that after one week there was a statistically signif icant (p<0.05) increase in average levels of vitamin A (experimental group: 14.1 ug/dl --> 26.5 ug/dl; control group: 16.1 ug/dl --> 24.1 ug/dl) and RBP (experimental group: O. 8 mg/dl --> 2. 2 mg/dl; control group: 0.6 mg/dl --> 2.9 mg/dl) in both groups as from the baseline. When the final average levels of vitamin A (26.5 ug/dl and 24.1 ug/dl) were compared, any statistically significant difference was found between the groups. This study suggests that low levels of circulating plasma vitamin A maybe a consequence of a reduced mobilization of this vitamin during infectious disease due to low plasma RBP levels.

O objetivo deste trabalho foi avaliar misturas (blends) de acidificantes e seus sais como alternativas aos antimicrobianos melhoradores do desempenho de leitões na fase de creche. Foi realizado um experimento em blocos casualizados, com 34 dias de duração para testar cinco tratamentos. Para o período de 1 a 14 dias, os tratamentos foram: Am (antimicrobiano) - dieta pré-inicial com 0,004% de sulfato de colistina (40 ppm); A1 (acidificante 1) - pré-inicial com 0,5% do blend 1 (contendo ácido fórmico, 145.000 ppm; ácido fosfórico, 85.000 ppm); A2 (acidificante 2) - pré-inicial com 0,15% do blend 2 (butirato de sódio, 64.000 ppm) e 0,4% do blend 3 (ácido láctico, 620.000 ppm; ácido fórmico, 40.000 ppm); A3 (acidificante 3) - pré-inicial com 0,8% do blend 4 (ácido propiônico, 198.000 ppm; ácido acético, 196.000 ppm; ácido fórmico, 196.000 ppm; ácido fosfórico, 21.000 ppm; ácido cítrico, 8.500 ppm); A4 (acidificante 4) - dieta basal com 0,6% do blend 4 e 0,15% do blend 5 (ácido benzóico, 590.000 ppm; ácido fórmico, 70.000 ppm; ácido fosfórico, 50.000 ppm; ácido cítrico, 40.000 ppm). Para o período de 14 a 34 dias, os tratamentos foram: Am - dieta inicial com 0,004% de sulfato de colistina; A1 - inicial com 0,3% do blend 1; A2 - inicial com 0,1% do blend 2 e 0,3% do blend 3; A3 - inicial com 0,6% do blend 4; A4 - inicial com 0,5% do blend 4 e 0,1% do blend 5. Foram utilizados 160 leitões Topigs recém-desmamados, com idade média em torno de 24 dias e peso inicial de 6,69±1,82 kg. Foram alocados quatro leitões (dois machos castrados e duas fêmeas) em cada baia (unidade experimental). Para os dados de desempenho e freqüência de diarréia, foram utilizadas 8 repetições (blocos) por tratamento. Ao final do experimento, um animal de cada baia, dos 4 primeiros blocos, foi abatido para análise da morfologia intestinal, pH estomacal e cecal e morfometria de órgãos. Durante a fase pré-inicial, o tratamento A2 (combinação dos blends 2 e 3) proporcionou melhor peso aos 14 dias (P14) (P=0,03) e ganho diário de peso (GDP) (P=0,04) que o tratamento A3 (blend 4), e melhor conversão alimentar (CA) (P=0,004) que o tratamento Am (antimicrobiano). Para o período total, o tratamento A4 (blends 4 e 5) apresentou melhor CA (P=0,0006) que o tratamento Am (antimicrobiano). Os tratamentos não afetaram (P>0,05) a freqüência de diarréia e o pH estomacal. O tratamento A4 (blends 4 e 5) apresentou menor valor de pH cecal (P=0,015) que o tratamento Am e menor valor de peso relativo do pâncreas (P=0,013), comparado aos tratamentos Am e A2. Para morfologia intestinal, o tratamento A2 proporcionou menores valores de profundidade de cripta (PC) (P=0,03) do jejuno que os tratamentos A3 e Am e maior relação altura de vilosidade:profundidade de cripta (P=0,04) do jejuno que os tratamentos A1 e A3. A análise econômica, no período de 1 a 14 dias, mostrou que os acidificantes propiciaram custos por kg de GDP, no mínimo, 4,09% inferiores ao antimicrobiano (Am). No período de 1 a 34 dias, os tratamentos A1 e A4 apresentaram custos por kg de GDP até 1,08% menores que o Am. Assim, o presente estudo mostrou que misturas de ácidos orgânicos, inorgânicos e seus sais podem ser uma alternativa viável aos antimicrobianos melhoradores do desempenho de leitões na fase de creche. / The purpose of this work was to evaluate several acidifier blends as alternatives to antimicrobial growth promoters of weanling pigs. A 34-d randomized complete block design experiment was carried out to compare five treatments. For 1-14 d experimental period, the treatments were: Am (antimicrobial) - pre-starter diet with 0.004% of colistin sulfate (40 ppm); A1 (acidifier 1) - pre-starter diet with 0.5% of blend 1 (containing formic acid, 145,000 ppm; phosphoric acid, 85,000 ppm); A2 (acidifier 2) - pre-starter diet with 0.15% of blend 2 (butyric acid, 64,000 ppm) and 0.4% of blend 3 (lactic acid, 620,000 ppm; formic acid, 40,000 ppm); A3 (acidifier 3) - pre-starter diet with 0.8% of blend 4 (propionic acid, 198,000 ppm; acetic acid, 196,000 ppm; formic acid, 196,000 ppm; phosphoric acid, 21,000 ppm; citric acid, 8,500 ppm); and A4 (acidifier 4) - pre-starter diet with 0.6% of blend 4 and 0.15% of blend 5 (benzoic acid, 590,000 ppm; formic acid, 70,000 ppm; phosphoric acid, 50,000 ppm; citric acid, 40,000 ppm). For 14-34 d experimental period, the treatments were: Am - starter diet with 0.004% of colistin sulfate; A1 - starter diet with 0.3% of blend 1; A2 - starter diet with 0.1% of blend 2 and 0.3% of blend 3; A3 - starter diet with 0.6% of blend 4; and A4 - starter diet with 0.5% of blend 4 and 0.1% of blend 5. One hundred and sixty Topigs 24-d-weaned pigs, with 6.69±1.82 kg live weight were allotted to 20 suspended pens, with four pigs (two castrated male and two female) per pen (experimental unit). For performance and diarrhea incidence data, 8 replications per treatment were used. On 34th day of experimental period, an animal of each pen of first 4 blocks was slaughtered for small intestine morphology, stomach and caecum pH and organs morphometry. For 1-14 d experimental period, treatment A2 (combination of blends 2 and 3) gave better body weight at 14th day (BW14) (P=.03) and average daily gain (ADG) (P=.04) than treatment A3 (blend 4), and better feed conversion (FC) (P=.004) than treatment Am (antimicrobial). For total experimental period (1-34 d), treatment A4 (blends 4 and 5) gave better FC (P=.0006) than treatment Am (antimicrobial). Treatments did not affect (P>.05) diarrhea frequency and stomach pH. Treatment A4 (blends 4 and 5) gave lower pH value (P=.015) than treatment Am and smaller relative pancreas weight (P=.013) than treatments Am and A2. For intestinal morphology, treatment A2 provided smaller (P=.003) jejunum crypt depth (CD) than treatments A3 and Am, and bigger (P=.04) ratio of jejunum villus height:crypt depth than treatments A1 and A3. Economical analysis showed, for 1-14 d experimental period, that the acidifiers provided cost per kg of ADG at least 4.09% lower than antimicrobial (Am). For 1-34 d experimental period, treatments A1 and A4 showed cost per kg of ADG until 1.08% lower than Am. Therefore, this study showed that blends of organic and inorganic acids and their salts can be viable alternatives to antimicrobial growth promoters of weanling pigs.

Escherichia coli enteropatogênica (EPEC) é uma importante causa de diarreia infantil. EPEC adere no epitélio intestinal e causa uma lesão conhecida como attaching and effacing (A/E). Cepas recombinantes de Mycobacterium smegmatis (Smeg) e Mycobacterium bovis (BCG) foram construídas para expressar BfpA ou Intimina. Os genes dessas proteínas foram amplificadas por PCR do DNA genômico de EPEC e inseridos nos sítios de BamHI/KpnI do vetor pMIP12. Os plasmídeos construídos pMIP-bfpA e pMIP-intimina foram introduzidos, separadamente,nas cepas de Smeg e BCG. Clones recombinantes foram selecionados baseado na resistência a kanamicina e nomeados como rSmeg pMIP (bfpA ou intimina) and rBCG pMIP (bfpA ou intimina). A expressão dos genes bfpA e intimina foram detectados por Western blotting usando anticorpos primários policonais anti-BfpA e anti-intimina. A imunogenicidade dessas proteínas foi avaliada em camundongos C57BL/6 pela presença de anticorpos anti-BfpA e anti-intimina IgA e IgG nas fezes e soro, respectivamente. TNF-a e INF-g foram produzidas in vitro por céulas do baço de camundongos imunizados com a vacina recombinante com BfpA e Intimina. A adesão de EPEC (E2348/69) em células alvo Hep-2 foi bloqueada pelos anticorpos IgA ou IgG de camundongos imunizados com as vacinas recombinantes, mas não por anticorpos de animais não imunizados. Vacinas recombinantes contendo as proteínas BfpA e Intimina de EPEC podem ser candidatas promissoras. / Enteropathogenic Escherichia coli (EPEC) is an important cause of diarrhea in children. EPEC adheres to the intestinal epithelium and causes attaching and effacing (A/E) lesions. Recombinant Mycobacterium smegmatis (Smeg) and Mycobacterium bovis BCG strains were constructed to express either BfpA or intimin. The entire bfpA gene and a portion of the intimin gene were amplified by PCR from EPEC genomic DNA and inserted into the pMIP12 vector at the BamHI/KpnI sites. The pMIP bfpA and pMIP intimin vectors were introduced separately into Smeg and BCG. Recombinant clones were selected based on kanamycin resistance and designated rSmeg pMIP (bfpA or intimin) and rBCG pMIP (bfpA or intimin). The expres-sion of bfpA and intimin was detected by Western blotting using polyclonal anti-BfpA and anti-intimin primary antibodies. The immunogenicity of these proteins was assessed in C57BL/6 mice by assaying the feces and serum for the presence of anti-BfpA and anti-intimin IgA and IgG antibodies. TNF-a and INF-g were produced in vitro by spleen cells from mice immunized with recombinant BfpA, whereas TNF-g was produced in mice immunized with recombinant intimin. The adhesion of EPEC (E2348/69) to Hep-2 target cells was blocked by IgA or IgG antibodies from mice immunized with recombinant BfpA or intimin but not by antibodies from non-immunized mice. Immunogenic non-infectious vectors containing relevant EPEC virulence genes may be promising vaccine candidates.

A diarreia ainda persiste como um problema de saúde pública, sendo uma das principais causas de mortalidade infantil nos países em desenvolvimento, principalmente em crianças abaixo de 5 anos. Este estudo teve por objetivo avaliar a etiologia das diarreias agudas em crianças de 0 a 5 anos atendidas no Hospital Universitário da USP em um estudo caso-controle. As fezes de 260 casos e 58 controles foram coletadas por suabe retal e conservadas em meio Cary-Blair até o momento da semeadura. As bactérias pesquisadas foram Escherichia coli diarreiogênicas (EPEC, EIEC, EAEC, EHEC, ETEC), Salmonella sp, Shigella sp, Yersinia enterocolitica e Campylobacter sp. Os meios de cultura utilizados para isolamento das bactérias foram Ágar SS e Ágar MacConkey. Após incubação por 24 horas a 37ºC, as bactérias foram identificadas fenotipicamente utilizando-se EPM-MILI-Citrato. Posteriormente, as bactérias enteropatogênicas foram aglutinadas com anti-soros específicos polivalentes. Para isolamento de Campylobacter sp foi utilizado Ágar Karmalli incubado a 42ºC por 48 horas em microaerofilia. Foram também pesquisados os fatores de virulência de Escherichia coli por colony-blot, utilizando sondas genéticas marcadas radioativamente. Os agentes virais pesquisados foram Rotavírus e Adenovírus em 134 crianças utilizando-se kit ROTA-VIKIA ADENO pelo método imunocromatográfico. Neste trabalho foi possível observar que a prevalência dos agentes foi: EPEC - casos: 34(13%), controles: 5(8,6%); EAEC - casos: 27(10,3%), controles: 8(13,7%); EIEC - casos: 5(1,9%); controles: 0, Shigella sonnei - casos: 7(2,7%); controles: 0, Shigella flexneri - casos: 4(1,5%), controles: 0; Salmonella - casos: 7(2,7%), controles: 1(1,7%); Campylobacter sp - casos: 4(1,5%), controles: 0; Rotavírus - casos: 21(17,3%), controles: 1(7,7%); Adenovírus - casos: 6(5%), controles: 1(7,7%) e Rotavírus + Adenovírus - casos: 2(1,7%), controles: 1(7,7%). O agente etiológico mais encontrado foi Rotavirus e se caracterizou como o único patógeno que apresentou significância estatística entre casos e controles (p<0,01). Ocorreu uma maior prevalência de EPEC atípica em relação à EPEC típica, dados concordantes com outros trabalhos. Houve predominância de Shigella sonnei em relação à Shigella flexneri, resultados divergentes encontrados em estudos anteriores. Rotavirus foi o enteropatógeno mais prevalente, sendo que nove crianças acometidas estavam desidratadas. Dez crianças tiveram infecção mista entre os agentes isolados. Em dezessete crianças do grupo controle (sem diarreia) foram encontrados agentes patogênicos, a saber: EPEC (5), EAEC (8), Salmonella (1) e Rotavirus + Adenovirus (1). / Diarrhea remains an important problem worldwide and has been characterized as one of the main causes of infant death in developing countries, especially in children under five years old. The aim of this study was to evaluate the etiology of acute diarrhea in children by case-control attended in São Paulo University Hospital. Fecal samples of 260 cases and 58 matched controls were collected by rectal swabs and conserved in Cary-Blair medium until the moment of seeding. Researched bacterial were diarrheiogenic Escherichia coli (EPEC, EIEC, EAEC, EHEC and ETEC), Salmonella sp, Shigella sp, Yersinia enterocolitica and thermophilic Campylobacter sp. Cultures for bacterium isolation were made in SS agar and MacConkey agar. After incubation at 37ºC by 24 h, bacteria were tested using biochemical tests (EPM-MILI-Citrato). For Campylobacter isolation was used Karmali agar at 42ºC by 48 h in 5% CO2. Colony-blot hybridization using specific radiolabelled DNA probes was used to identify diarrheiogenic E. coli. Rotavirus and Adenovirus were sought in 121 cases and 13 controls by ROTA-VIKIA ADENO by immunochromatographic assay. The prevalence of the pathogens were as follows: EPEC - cases: 34 (13%), controls: 5 (1,9%); EAEC - cases: 27 (10,3%), controls: 8 (13,7%); EIEC - cases: 5 (1,9%), controls: 0; Shigella sonnei - cases: 7 (2,7%), controls: 0; Shigella flexneri - cases: 4 (1,5%), controls: 0; Salmonella - cases: 7 (2,7%), controls: 1 (1,7%); Campylobacter sp - cases: 4 (1,5%), controls: 0; Rotavirus - cases: 21 (17,3%), controls - 1 (7,7%); Adenovirus - cases: 6 (5%), controls: 1 (7,7%) and Rotavirus + Adenovirus - cases: 2 (1,7%), controls: 1 (7,7%). The main etiologic agent found was Rotavirus, which was the only pathogen significant between cases and controls (p<0,01). Atypical EPEC had major prevalence comparing to typical EPEC. Shigella sonnei was more isolated than Shigella flexneri, a different result found in other studies. Ten children had mixed infection between the isolated agents. In seventeen children of the control group (without diarrhea) were found pathogens, that is: EPEC (5), EAEC (8), Salmonella (1) and Rotavirus + Adenovirus (1).

Escherichia coli enteropatogênica (EPEC) é um dos principais agentes de diarréia em crianças nos países em desenvolvimento. Esse patótipo pode ser classificado em dois grupos: EPEC típica (t-EPEC) e EPEC atípica (a-EPEC). O objetivo principal deste estudo foi traçar o perfil plasmidial de 78 amostras de a-EPEC bem como investigar em 72 amostras a presença de genes de virulência descritos em outros patótipos de DEC para procura de um marcador de virulência específico deste grupo de amostras. Foi detectada a presença de alguns genes de virulência como: pet (5,5%), pic (2,7%), astA (18%), efa1/lifA, toxB (2,7%), ldaH (8,3%) e ehly1 (4,2%). Os perfis plasmidiais obtidos permitiram verificar que entre as 78 amostras analisadas, 12 não possuem plasmídio, 33 possuem plasmídios entre 50 a 90 kb e 38 possuem plasmídios entre 90 a 124 kb. A pesquisa dos grupos de incompatibilidade revelou que os grupos IncFIB e IncF são os mais freqüentes entre as amostras de a-EPEC. Os resultados de RFLP do DNA plasmidial das amostras do sorotipo O55:H7 sugeriu que existem seqüências de nucleotídeos comuns entre os plasmídios. Os dados obtidos também permitiram inferir a existência de fragmentos de DNA plasmidial comum entre amostras de EHEC O157:H7 e amostras de a-EPEC O55:H7. A função biológica dos plasmídios de a-EPEC e a relação com o plasmídio pO157 necessitam de estudos complementares. / Escherichia coli (EPEC) is one of the main agents of diarrhea in children in developing countries. This pathotype can be classified in two groups: typical EPEC (t-EPEC) and atypical EPEC (a-EPEC). The aim of this study was to determine the plasmid profile of 78 strains of a-EPEC and investigate 72 strains for the presence of virulence genes described in other DEC. It was detected the presence of some virulence genes: pet (5,5%), pic (2,7%), astA (18%), efa1/lifA, toxB (2,7%), ldaH (8,3%) e ehly1 (4,2%). The plasmid profiles obtained allowed us to verify that among the 78 samples analyzed, 12 did not have plasmids, 33 strains have plasmids ranging between 50 and 90 kb, and 38 have plasmids ranging between 90 to 124 kb. Incompatibility groups analysis revealed that IncFIB and IncF groups are the most frequent among the samples of a-EPEC. RFLP analysis of plasmid DNA of strains of serotype O55:H7 suggested that there are nucleotide sequences common to the plasmids. The data also allowed inferring the existence of fragments of plasmid DNA common to EHEC O157:H7 and a-EPEC O55:H7. The biological function of aEPEC plasmid and the relationship with pO157 requires further studies.

Diarrheal diseases are a global public health burden, killing 1.8 million people annually. Diarrhea disproportionately affects children and those in poverty. Most diarrheal cases can be prevented through safe drinking water, basic hygiene and/or sanitation measures, with drinking water interventions having the most impact on reducing diarrheal disease. There is no generally agreed-upon field method for determining biosand water filter effectiveness that is usable in low-resource communities. A pilot study was conducted of potential field use indicators, including the Colilert coliform presence/absence (P/A) test, hydrogen sulfide, alkalinity, hardness, pH, and fluorescently labeled latex microspheres. The study included both laboratory and field testing. The Colilert P/A test had the highest correlation to the United States Environmental Protection Agency standard method (IDEXX Quanti-trays), but more data are needed before making a recommendation. This study adds to understanding about evaluation of biosand water filters and provides preliminary data to address the need for a field use indicator for biosand water filters.

Cryptosporidiosis is a common diarrheal disease caused by intestinal infection with the apicomplexan parasite Cryptosporidium, in humans usually either with C. hominis or C. parvum. Unfortunately, given a large burden of disease in children and immunocompromised people like AIDS patients, the only currently approved treatment, nitazoxanide, is unreliable for these patient populations. To address the urgent need for new drugs for the most vulnerable populations, large phenotypic screening efforts have been established to identify anti-Cryptosporidium growth inhibitors in vitro (hits). However, in the absence of a gold standard drug, the in vitro and in vivo characteristics that should be used to prioritize screening hits are not known. This thesis is focused on identifying promising anti-Cryptosporidium hits and drug leads, and using them to establish validated methods to guide hit-to-lead studies for anti-Cryptosporidium drug development. A re-analysis of our phenotypic screen of the Medicines for Malaria Venture Open Access Malaria Box identified a promising C. parvum growth inhibitor, MMV665917. It had similar in vitro activity against C. hominis, C. parvum Iowa, and C. parvum field strains, and it was amenable to preliminary structural activity relationship studies using commercially available variants, with one variant demonstrating nanomolar potency. Furthermore, MMV665917 was effective in vivo in an acute interferon-γ mouse model of cryptosporidiosis; and it appeared to cure an established infection in the chronic NOD SCID gamma (NSG) mouse model, unlike nitazoxanide, paromomycin, and clofazimine. We hypothesized that anti-Cryptosporidium activity in the highly immunocompromised chronic NSG mouse model might relate to compounds being capable of killing and eliminating parasites (cidal), rather than only preventing growth (static). To test this, we developed a novel in vitro parasite persistence assay that showed that MMV665917 was potentially cidal, whereas nitazoxanide, paromomycin and clofazimine appeared static. This pharmacodynamic assay also provided the concentration of compound required to maximize rate of parasite elimination, which could help design in vivo experiments. To further characterize compounds based on mechanism of action, we developed a range of in vitro medium-throughput life-stage assays. To validate and gain value from the assays, a “learner set” of compounds from our in-house screens and collaborations were tested in all of the in vitro assays and in the in vivo NSG mouse model. Using these assays, it was possible to group molecules based on chemical class/mechanism of action. Because compounds from distinct groups showed activity in the NSG mouse model, these methods could be used to obtain a diverse set of early-stage Cryptosporidium inhibitors for prioritization. Furthermore, compounds that appeared static in the in vitro parasite persistence assay did not have activity in the NSG mouse model. In summary, we report the identification and development of a highly promising initial lead, MMV665917, and report a range of in vitro assays that can be used to prioritize anti-Cryptosporidium hits and leads.