O vírus da cinomose canina (CDV) e o vírus parainfluenza canino (CPIV) afetam uma ampla variedade de hospedeiros e encontram-se distribuídos mundialmente. O CDV é considerado um dos mais importantes agentes infecciosos dentro das populações caninas. Este vírus é o agente causal da cinomose, uma doença potencialmente letal em membros das famílias Canidae, Mustelidae e Procionidae, sendo recentemente detectado como causa de morbidade e mortalidade em carnívoros aquáticos e grandes felinos. O CPIV, por sua vez, é altamente contagioso entre cães, podendo infectar roedores e gatos em infecções experimentais. Geralmente, o CPIV produz uma traqueobronquite aguda auto-limitante, porém pode atuar sinergicamente com outros agentes infecciosos, como o CDV, causando sinais clínicos mais graves. Como em nosso meio são escassas as informações sobre estes vírus, o presente estudo visou aprofundar os conhecimentos sobre a prevalência de CDV e CPIV em cães e felinos silvestres mantidos em cativeiro. Para tanto, soros destes animais foram testados em busca de anticorpos neutralizantes contra amostras padrão do CDV (Rockborn e Snyder Hill) e do CPIV (V660). Inicialmente, foram testados soros de 173 cães de rua mantidos em canis municipais em Novo Hamburgo e Porto Alegre, RS. A prevalência de anticorpos neutralizantes anti-CDV frente às amostras de vírus da cinomose Rockborn e Snyder Hill, foi de 9,3 % e 4,1 %, respectivamente. Somente dois cães apresentaram títulos de anticorpos considerados protetores contra CDV Rockborn (igual ou maior que 100) e nenhum soro apresentou título de anticorpos neutralizantes considerado protetor para a amostra Snyder Hill (igual ou maior que 100). Contra a amostra de parainfluenza canino V660, a prevalência de anticorpos neutralizantes encontrada foi de 51,4 %. Conclui-se, portanto, que a população de cães de rua amostrada apresenta poucos indícios de contato prévio com CDV, sugerindo grande susceptibilidade à cinomose. Por outro lado, o CPIV parece circular amplamente nesta população. Na segunda parte do presente estudo, como no Brasil não existem relatos sobre CDV e CPIV em felinos silvestres, buscou-se verificar a possibilidade da ocorrência dessas infecções em felinos silvestres brasileiros. Para tanto, foram testados soros de 84 felinos silvestres de seis diferentes espécies nativas do Brasil (Leopardus tigrinus, Puma concolor, Leopardus wiedii, Herpailurus yaguarondi, Panthera onca), todos mantidos em cativeiro em criatórios de distintas regiões do País. Todos os felinos amostrados apresentaram-se soronegativos frente às amostras de CDV e CPIV utilizadas. Estes resultados indicam que CDV e CPIV parecem não circular nas populações de felinos silvestres amostradas. / Canine distemper virus (CDV) and canine parainfluenza virus (CPIV) infect a great variety of hosts ranges and are distributed worldwide. CDV is one of the most important infectious agents in dogs. This virus may cause potentially lethal disease among members of the Canidae, Mustelidae and Procionidae families. It has also caused diseases of significant morbidity and mortality in aquatic carnivores and large felids. CPIV, on its turn, is highly contagious among dogs, whilst rodents and cats are susceptible to experimental infections. CPIV is usually associated with an acute selflimiting tracheobronchitis. However, it can act sinergistically with other infectious agents, such as CDV, and cause clinical signs of variable severity. As information on CDV and CPIV infections in our millieu are scarce, this study was carried out aiming to increase knowledge on the prevalence of CDV and CPIV in stray dogs as well as in captive Brazilian wild felids. In order to have an estimate on such prevalences, sera from these animals were tested for neutralizing antibodies to CDV strains Rockborn and Snyder Hill, and to CPIV strain V660. Initially, 173 sera from stray dogs kept in kennels from the municipalities of Novo Hamburgo and Porto Alegre, RS, were examined. The prevalences of neutralizing antibodies to CDV strains Rockborn and Snyder Hill were 9.3 % and 4.1 %, respectively. Only two dogs had antibody levels which could be correlated to protection (that is, titre ≥ 100) to CDV Rockborn whereas no sera presented antibody titres high enough to be considered protective to CDV strain Snyder Hill (that is, titre ≥ 100). Regarding CPIV, the prevalence of anti-V660 neutralizing antibodies was 51.4 %. It can be concluded that the stray dog populations under study shows few serological evidence of previous contact with CDV and seem largely susceptible to CDV infections. On the other hand, CPIV seems to circulate widely in the examined population. In the second part of this study, as there are no reports on CDV and CPIV infections in wild felids in Brazil, it was aimed to determine whether there would be any evidence of such infections among some of such species. For that, 84 sera from wild felids of six different Brazilian native species (Leopardus tigrinus, Puma concolor, Leopardus wiedii, Herpailurus yaguarondi, Panthera onca), all kept in captivity in different regions of the country, were tested for neutralizing antibodies to both CDV and CPIV. All wild felid sera tested were negative for antibodies to the two strains of CDV as well as to CPIV. These results indicate that CDV and CPIV do not seem to circulate among the wild felid populations examined.

O vírus da cinomose canina (CDV) e o vírus parainfluenza canino (CPIV) afetam uma ampla variedade de hospedeiros e encontram-se distribuídos mundialmente. O CDV é considerado um dos mais importantes agentes infecciosos dentro das populações caninas. Este vírus é o agente causal da cinomose, uma doença potencialmente letal em membros das famílias Canidae, Mustelidae e Procionidae, sendo recentemente detectado como causa de morbidade e mortalidade em carnívoros aquáticos e grandes felinos. O CPIV, por sua vez, é altamente contagioso entre cães, podendo infectar roedores e gatos em infecções experimentais. Geralmente, o CPIV produz uma traqueobronquite aguda auto-limitante, porém pode atuar sinergicamente com outros agentes infecciosos, como o CDV, causando sinais clínicos mais graves. Como em nosso meio são escassas as informações sobre estes vírus, o presente estudo visou aprofundar os conhecimentos sobre a prevalência de CDV e CPIV em cães e felinos silvestres mantidos em cativeiro. Para tanto, soros destes animais foram testados em busca de anticorpos neutralizantes contra amostras padrão do CDV (Rockborn e Snyder Hill) e do CPIV (V660). Inicialmente, foram testados soros de 173 cães de rua mantidos em canis municipais em Novo Hamburgo e Porto Alegre, RS. A prevalência de anticorpos neutralizantes anti-CDV frente às amostras de vírus da cinomose Rockborn e Snyder Hill, foi de 9,3 % e 4,1 %, respectivamente. Somente dois cães apresentaram títulos de anticorpos considerados protetores contra CDV Rockborn (igual ou maior que 100) e nenhum soro apresentou título de anticorpos neutralizantes considerado protetor para a amostra Snyder Hill (igual ou maior que 100). Contra a amostra de parainfluenza canino V660, a prevalência de anticorpos neutralizantes encontrada foi de 51,4 %. Conclui-se, portanto, que a população de cães de rua amostrada apresenta poucos indícios de contato prévio com CDV, sugerindo grande susceptibilidade à cinomose. Por outro lado, o CPIV parece circular amplamente nesta população. Na segunda parte do presente estudo, como no Brasil não existem relatos sobre CDV e CPIV em felinos silvestres, buscou-se verificar a possibilidade da ocorrência dessas infecções em felinos silvestres brasileiros. Para tanto, foram testados soros de 84 felinos silvestres de seis diferentes espécies nativas do Brasil (Leopardus tigrinus, Puma concolor, Leopardus wiedii, Herpailurus yaguarondi, Panthera onca), todos mantidos em cativeiro em criatórios de distintas regiões do País. Todos os felinos amostrados apresentaram-se soronegativos frente às amostras de CDV e CPIV utilizadas. Estes resultados indicam que CDV e CPIV parecem não circular nas populações de felinos silvestres amostradas. / Canine distemper virus (CDV) and canine parainfluenza virus (CPIV) infect a great variety of hosts ranges and are distributed worldwide. CDV is one of the most important infectious agents in dogs. This virus may cause potentially lethal disease among members of the Canidae, Mustelidae and Procionidae families. It has also caused diseases of significant morbidity and mortality in aquatic carnivores and large felids. CPIV, on its turn, is highly contagious among dogs, whilst rodents and cats are susceptible to experimental infections. CPIV is usually associated with an acute selflimiting tracheobronchitis. However, it can act sinergistically with other infectious agents, such as CDV, and cause clinical signs of variable severity. As information on CDV and CPIV infections in our millieu are scarce, this study was carried out aiming to increase knowledge on the prevalence of CDV and CPIV in stray dogs as well as in captive Brazilian wild felids. In order to have an estimate on such prevalences, sera from these animals were tested for neutralizing antibodies to CDV strains Rockborn and Snyder Hill, and to CPIV strain V660. Initially, 173 sera from stray dogs kept in kennels from the municipalities of Novo Hamburgo and Porto Alegre, RS, were examined. The prevalences of neutralizing antibodies to CDV strains Rockborn and Snyder Hill were 9.3 % and 4.1 %, respectively. Only two dogs had antibody levels which could be correlated to protection (that is, titre ≥ 100) to CDV Rockborn whereas no sera presented antibody titres high enough to be considered protective to CDV strain Snyder Hill (that is, titre ≥ 100). Regarding CPIV, the prevalence of anti-V660 neutralizing antibodies was 51.4 %. It can be concluded that the stray dog populations under study shows few serological evidence of previous contact with CDV and seem largely susceptible to CDV infections. On the other hand, CPIV seems to circulate widely in the examined population. In the second part of this study, as there are no reports on CDV and CPIV infections in wild felids in Brazil, it was aimed to determine whether there would be any evidence of such infections among some of such species. For that, 84 sera from wild felids of six different Brazilian native species (Leopardus tigrinus, Puma concolor, Leopardus wiedii, Herpailurus yaguarondi, Panthera onca), all kept in captivity in different regions of the country, were tested for neutralizing antibodies to both CDV and CPIV. All wild felid sera tested were negative for antibodies to the two strains of CDV as well as to CPIV. These results indicate that CDV and CPIV do not seem to circulate among the wild felid populations examined.

O vírus da cinomose canina (CDV) e o vírus parainfluenza canino (CPIV) afetam uma ampla variedade de hospedeiros e encontram-se distribuídos mundialmente. O CDV é considerado um dos mais importantes agentes infecciosos dentro das populações caninas. Este vírus é o agente causal da cinomose, uma doença potencialmente letal em membros das famílias Canidae, Mustelidae e Procionidae, sendo recentemente detectado como causa de morbidade e mortalidade em carnívoros aquáticos e grandes felinos. O CPIV, por sua vez, é altamente contagioso entre cães, podendo infectar roedores e gatos em infecções experimentais. Geralmente, o CPIV produz uma traqueobronquite aguda auto-limitante, porém pode atuar sinergicamente com outros agentes infecciosos, como o CDV, causando sinais clínicos mais graves. Como em nosso meio são escassas as informações sobre estes vírus, o presente estudo visou aprofundar os conhecimentos sobre a prevalência de CDV e CPIV em cães e felinos silvestres mantidos em cativeiro. Para tanto, soros destes animais foram testados em busca de anticorpos neutralizantes contra amostras padrão do CDV (Rockborn e Snyder Hill) e do CPIV (V660). Inicialmente, foram testados soros de 173 cães de rua mantidos em canis municipais em Novo Hamburgo e Porto Alegre, RS. A prevalência de anticorpos neutralizantes anti-CDV frente às amostras de vírus da cinomose Rockborn e Snyder Hill, foi de 9,3 % e 4,1 %, respectivamente. Somente dois cães apresentaram títulos de anticorpos considerados protetores contra CDV Rockborn (igual ou maior que 100) e nenhum soro apresentou título de anticorpos neutralizantes considerado protetor para a amostra Snyder Hill (igual ou maior que 100). Contra a amostra de parainfluenza canino V660, a prevalência de anticorpos neutralizantes encontrada foi de 51,4 %. Conclui-se, portanto, que a população de cães de rua amostrada apresenta poucos indícios de contato prévio com CDV, sugerindo grande susceptibilidade à cinomose. Por outro lado, o CPIV parece circular amplamente nesta população. Na segunda parte do presente estudo, como no Brasil não existem relatos sobre CDV e CPIV em felinos silvestres, buscou-se verificar a possibilidade da ocorrência dessas infecções em felinos silvestres brasileiros. Para tanto, foram testados soros de 84 felinos silvestres de seis diferentes espécies nativas do Brasil (Leopardus tigrinus, Puma concolor, Leopardus wiedii, Herpailurus yaguarondi, Panthera onca), todos mantidos em cativeiro em criatórios de distintas regiões do País. Todos os felinos amostrados apresentaram-se soronegativos frente às amostras de CDV e CPIV utilizadas. Estes resultados indicam que CDV e CPIV parecem não circular nas populações de felinos silvestres amostradas. / Canine distemper virus (CDV) and canine parainfluenza virus (CPIV) infect a great variety of hosts ranges and are distributed worldwide. CDV is one of the most important infectious agents in dogs. This virus may cause potentially lethal disease among members of the Canidae, Mustelidae and Procionidae families. It has also caused diseases of significant morbidity and mortality in aquatic carnivores and large felids. CPIV, on its turn, is highly contagious among dogs, whilst rodents and cats are susceptible to experimental infections. CPIV is usually associated with an acute selflimiting tracheobronchitis. However, it can act sinergistically with other infectious agents, such as CDV, and cause clinical signs of variable severity. As information on CDV and CPIV infections in our millieu are scarce, this study was carried out aiming to increase knowledge on the prevalence of CDV and CPIV in stray dogs as well as in captive Brazilian wild felids. In order to have an estimate on such prevalences, sera from these animals were tested for neutralizing antibodies to CDV strains Rockborn and Snyder Hill, and to CPIV strain V660. Initially, 173 sera from stray dogs kept in kennels from the municipalities of Novo Hamburgo and Porto Alegre, RS, were examined. The prevalences of neutralizing antibodies to CDV strains Rockborn and Snyder Hill were 9.3 % and 4.1 %, respectively. Only two dogs had antibody levels which could be correlated to protection (that is, titre ≥ 100) to CDV Rockborn whereas no sera presented antibody titres high enough to be considered protective to CDV strain Snyder Hill (that is, titre ≥ 100). Regarding CPIV, the prevalence of anti-V660 neutralizing antibodies was 51.4 %. It can be concluded that the stray dog populations under study shows few serological evidence of previous contact with CDV and seem largely susceptible to CDV infections. On the other hand, CPIV seems to circulate widely in the examined population. In the second part of this study, as there are no reports on CDV and CPIV infections in wild felids in Brazil, it was aimed to determine whether there would be any evidence of such infections among some of such species. For that, 84 sera from wild felids of six different Brazilian native species (Leopardus tigrinus, Puma concolor, Leopardus wiedii, Herpailurus yaguarondi, Panthera onca), all kept in captivity in different regions of the country, were tested for neutralizing antibodies to both CDV and CPIV. All wild felid sera tested were negative for antibodies to the two strains of CDV as well as to CPIV. These results indicate that CDV and CPIV do not seem to circulate among the wild felid populations examined.

O vírus da cinomose canina (CDV) é um importante patógeno de cães domésticos e carnívoros selvagens. A infecção pelo CDV é relevante a nível mundial e está associada com alta morbidade e mortalidade. Em diversos países a cinomose é considerada controlada pelo uso de vacinas, no entanto, no Brasil ainda é endêmica, principalmente devido ao grande número de animais não domiciliados. Além disso, surtos em cães e várias espécies de animais silvestres ocorrem com frequência, dizimando populações ameaçadas. As vacinas vivas atenuadas são seguras para cães, mas seu uso não é aconselhado em espécies altamente suscetíveis à infecção pelo CDV. Também os relatos de surtos de cinomose em cães supostamente vacinados levantam a hipótese de que as vacinas disponíveis no mercado podem não ser eficientes frente a algumas cepas de campo. Com o objetivo de gerar dados acerca dos mecanismos de evolução do CDV e desenvolver e testar a eficácia de uma vacina bivalente inativada contra o vírus da raiva (RABV) e CDV a presente tese será apresentada na forma de dois artigos científicos. Ainda, um artigo de revisão sobre os modelos animais utilizados para obtenção de informações sobre o vírus do sarampo utilizando a infecção de CDV em furões e cães foi publicada e será apresentada na presente tese. No primeiro artigo, foi analisada a ocorrência de recombinação homóloga em genomas de CDV e detectou-se oito possíveis vírus recombinantes, incluindo um evento de recombinação entre uma cepa de campo e uma cepa vacinal atenuada, sugerindo que o uso de vacinação com vírus vivo atenuado pode influenciar a evolução do CDV. No segundo trabalho, uma vacina recombinante bivalente inativada baseada em RABV expressando as glicoproteínas do envelope do CDV, hemaglutinina e proteína de fusão, mostrou-se eficiente na proteção contra infecção por CDV em furões quando utilizado um protocolo prime/boost. Finalmente, foi publicada uma revisão de literatura sobre os modelos animais utilizados para obtenção de informações sobre a patogênese do vírus do sarampo utilizando a infecção com o vírus da cinomose. / Canine distemper virus (CDV) is an important pathogen of domestic dogs and wild carnivores. CDV infection is globally relevant and it is associated with high morbidity and mortality. In several countries, distemper is considered controlled by vaccination, however, in Brazil it is still endemic, mainly due to the large number of non-domiciliated animals. In addition, outbreaks in dogs and various species of wild animals occur frequently, decimating threatened populations. Live attenuated vaccines are safe for dogs, but their use is not advised in species that are highly susceptible to CDV infection. Also, reports of canine distemper in supposedly vaccinated dogs raise the hypothesis that commercially available vaccines may not be effective against some wild type strains. In order to investigate the mechanisms of CDV evolution and to develop and assess the efficacy of an inactivated bivalent vaccine against rabies virus and CDV, this thesis will be presented in the form of two scientific papers. Furthermore, a review article on the animal models used to gain information on measles virus using CDV infection in ferrets and dogs has been published and will be presented in this thesis. In the first paper, the occurrence of homologous recombination in CDV genomes was analyzed and eight possible recombinant viruses were detected, including a recombination event between a wild type strain and an attenuated vaccine strain, suggesting that the use vaccines based on attenuated live virus may influence CDV evolution. In the second study, an inactivated bivalent recombinant vaccine based on RABV expressing CDV envelope glycoproteins, hemagglutinin and fusion protein, proved to be effective in protecting against CDV infection in ferrets when using a prime/boost protocol. Finally, a literature review was published on the animal models used to obtain information on the pathogenesis of measles virus using infection with canine distemper virus.

O vírus da cinomose canina (VCC) é um patógeno viral, altamente, contagioso que pode causar doença sistémica letal, em cães e outros carnívoros em toda parte do mundo. Os cães afetados podem apresentar sintomas gastrentéricos, respitatórios e nervosos. As manifestações clínicas da doença inclue depressão, diarréia, vómito, desidratação, hiperqueratose dos coxins e focinho e espasmos musculares ou paresia de membros pélvicos, a qual pode persistir por longos períodos. Cães infectados, com sintomas clínicos de VCC, foram estudados para detecção do RNA viral pela técnica de PCR e Nested-PCR. Neste estudo, amplificou-se o gene da nucleoproteína (NP) em células mononucleares do sangue periférico (linfócitos), urina e saliva, de cães infectados com VCC, para detectar o genoma do mesmo, por RT-PCR, em diferentes amostras clínicas. A identificação do RNA viral foi concluída com sucesso, pelo método de RT-PCR, utilizando 2 pares de \"primers\" específicos do gene da nucleoproteína (NP). A técnica de RT-PCR, descrita neste etudo, pode ser um sistema de ensaio útil para determinar se cães suspeitos de infecção, por VCC, tenha níveis detectáveis de genes. Os resultados demonstram que a técnica de RT-PCR é exequível para o diagnóstico laboratorial de cinomose canina. / Canine distemper vírus (CDV) is a highly contagious Viral pathogen which may cause lethal systemic in dogs and other carnivores throughout the world. Affected dogs show gastrointestinal and respiratory clinical slgns, and frequently develop clinical signs in the central nervous system (CNS). Clinical manifestations of the disease include depression, progressive loss of weight, dehydration, hyperkeratosis of the foot pads and nose, nervous symptoms and muscular spasms or posterior paralysis which may perslst for long periods. Infected dogs with clinical symptoms for CDV, were by detection of viral RNA by Polymerase Chaln Reaction (PCR) and Nested PCR. In this study,w e determinebdy the RT-PCRth e presenceo f nucleoprotein (NP) gene in peripheral blood mononuclear cells, urine and saliva from dogs infected with CDV. The goals of this study was to detect CDV renome by RT-PCR in different clinical samples. In this study, Identificatlon of NP mRNA was successfully achieved by using the RT-PCR method with two sets of NP gene specific primers. The RT-PCR technique described in thls study, may provide a useful assay system to determine whether the dogs suspected of CDV infection have detectable leveis of CDV genes. The results demonstrate that RT-PCR technique is rapid, sensitivity and specificity for vírus diagnosis.

Submitted by Ubirajara Cruz (ubirajara.cruz@gmail.com) on 2017-05-12T13:41:13Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertacao_Maureen_Fernandes.pdf: 925477 bytes, checksum: adc4b50d524df10be1448912c874f299 (MD5) / Approved for entry into archive by Aline Batista (alinehb.ufpel@gmail.com) on 2017-05-12T21:22:55Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertacao_Maureen_Fernandes.pdf: 925477 bytes, checksum: adc4b50d524df10be1448912c874f299 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-05-12T21:22:55Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertacao_Maureen_Fernandes.pdf: 925477 bytes, checksum: adc4b50d524df10be1448912c874f299 (MD5) Previous issue date: 2015-12-03 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio Grande do Sul - FAPERGS / O objetivo deste trabalho foi a expressão da região conservada da proteína do nucleocapsídeo do vírus da cinomose (aa 222-316) em Escherichia coli e posterior avaliação de suas propriedades antigênicas e imunogênicas. Para tal, a região conservada do gene da proteína do nucleocapsídeo do vírus da cinomose canina (NP CDV) foi selecionada e codón otimizada para expressão em E. coli. O gene sintético foi inserido em um vetor pAE e clonado em cepas E. coli TOP10F. A proteína recombinante foi expressa em E. coli cepa Star e purificada por cromatografia de afinidade. A concentração de proteína obtida após purificação foi aproximadamente 300 mg/mL. A expressão da proteína recombinante NP do CDV (rCDVNP) foi confirmada por eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) e Western blot utilizando anticorpos monoclonais anti His tag. A antigenicidade da rCDVNP foi demonstrada por Western blot e ELISA indireto, empregando soros de cães positivos e negativos para cinomose canina. A rCDVNP foi inoculada em galinhas e imunoglobulina Y (IgY) foi purificada a partir da gema de ovo, utilizando o método de delipidação com água destilada acidificada e precipitação com sulfato de amônia. A purificação de IgY foi confirmada por SDS-PAGE e a concentração média de IgY que se obteve foi 28,55 mg/mL. A produção de IgY anti-rCDVNP foi analisada por Western blot e ELISA indireto. Os resultados demonstraram que o gene sintético codificante da região conservada da NP do CDV foi clonado com sucesso utilizando o vetor pAE em E. coli, resultando posteriormente na expressão de porção da NP na forma recombinante. A rCDVNP demonstrou ser antigênica, uma vez que os soros de cães positivos para cinomose canina reconheceram a proteína. A rCDVNP foi imunogênica após inoculação em galinhas, sendo possível o isolamento e purificação de alta concentração de IgY específica a partir de gema de ovo. Estes resultados sugerem que tanto a rCDVNP quanto a IgY anti-rCDVNP produzida podem ser utilizadas como ferramentas úteis em ensaios de imunodiagnóstico da cinomose canina. / The purpose of this study was the expression of the conserved region of Canine distemper virus nucleocapsid protein (aa 222-316) in Escherichia coli and subsequent evaluation of its antigenic and immunogenic properties. The conserved region of Canine distemper virus nucleocapsid (CDV NP) gene was selected and codon optimized for E. coli expression. The synthetic gene was inserted in a pAE vector and cloned into E. coli TOP10F strain. The recombinant protein was expressed in E. coli Star strain and purified by affinity chromatography. The protein yield after purification was approximately 300 mg/mL. Recombinant CDV NP (rCDVNP) expression was confirmed by sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and Western blot analysis by using His-Tag monoclonal antibodies. The rCDVNP antigenicity was demonstrated by Western blot and ELISA, employing positive and negative CDV dog sera. The rCDVNP was inoculated in hens and immunoglobulin Y (IgY) was isolated and purified from egg yolk, according the delipidation method with acidified distilled water and the precipitation method with ammonium sulfate. The purification of IgY was confirmed by SDS-PAGE and the mean yield of IgY was 28.55 mg/mL. The production of IgY anti-rCDVNP was analyzed by Western blot and ELISA assays. The results showed that the synthetic gene coding the conserved region of the NP CDV was successfully cloned using pAE vector in E. coli, resulting in the expression of a recombinant NP. The rCDVNP proved to be antigenic, since distemper positive dog sera recognized the protein. The rCDVNP proved to be immunogenic after inoculation in hens and it was possible to isolate and purify high concentration of specific IgY from egg yolk. These results suggest that both rCDVNP as IgY anti-rCDVNP produced can be used as useful tools in immunodiagnostic assays of canine distemper.

O vírus da cinomose canina (VCC) é um patógeno viral, altamente, contagioso que pode causar doença sistémica letal, em cães e outros carnívoros em toda parte do mundo. Os cães afetados podem apresentar sintomas gastrentéricos, respitatórios e nervosos. As manifestações clínicas da doença inclue depressão, diarréia, vómito, desidratação, hiperqueratose dos coxins e focinho e espasmos musculares ou paresia de membros pélvicos, a qual pode persistir por longos períodos. Cães infectados, com sintomas clínicos de VCC, foram estudados para detecção do RNA viral pela técnica de PCR e Nested-PCR. Neste estudo, amplificou-se o gene da nucleoproteína (NP) em células mononucleares do sangue periférico (linfócitos), urina e saliva, de cães infectados com VCC, para detectar o genoma do mesmo, por RT-PCR, em diferentes amostras clínicas. A identificação do RNA viral foi concluída com sucesso, pelo método de RT-PCR, utilizando 2 pares de \"primers\" específicos do gene da nucleoproteína (NP). A técnica de RT-PCR, descrita neste etudo, pode ser um sistema de ensaio útil para determinar se cães suspeitos de infecção, por VCC, tenha níveis detectáveis de genes. Os resultados demonstram que a técnica de RT-PCR é exequível para o diagnóstico laboratorial de cinomose canina. / Canine distemper vírus (CDV) is a highly contagious Viral pathogen which may cause lethal systemic in dogs and other carnivores throughout the world. Affected dogs show gastrointestinal and respiratory clinical slgns, and frequently develop clinical signs in the central nervous system (CNS). Clinical manifestations of the disease include depression, progressive loss of weight, dehydration, hyperkeratosis of the foot pads and nose, nervous symptoms and muscular spasms or posterior paralysis which may perslst for long periods. Infected dogs with clinical symptoms for CDV, were by detection of viral RNA by Polymerase Chaln Reaction (PCR) and Nested PCR. In this study,w e determinebdy the RT-PCRth e presenceo f nucleoprotein (NP) gene in peripheral blood mononuclear cells, urine and saliva from dogs infected with CDV. The goals of this study was to detect CDV renome by RT-PCR in different clinical samples. In this study, Identificatlon of NP mRNA was successfully achieved by using the RT-PCR method with two sets of NP gene specific primers. The RT-PCR technique described in thls study, may provide a useful assay system to determine whether the dogs suspected of CDV infection have detectable leveis of CDV genes. The results demonstrate that RT-PCR technique is rapid, sensitivity and specificity for vírus diagnosis.

O vírus da cinomose canina (CDV) é um importante patógeno de cães domésticos e carnívoros selvagens. A infecção pelo CDV é relevante a nível mundial e está associada com alta morbidade e mortalidade. Em diversos países a cinomose é considerada controlada pelo uso de vacinas, no entanto, no Brasil ainda é endêmica, principalmente devido ao grande número de animais não domiciliados. Além disso, surtos em cães e várias espécies de animais silvestres ocorrem com frequência, dizimando populações ameaçadas. As vacinas vivas atenuadas são seguras para cães, mas seu uso não é aconselhado em espécies altamente suscetíveis à infecção pelo CDV. Também os relatos de surtos de cinomose em cães supostamente vacinados levantam a hipótese de que as vacinas disponíveis no mercado podem não ser eficientes frente a algumas cepas de campo. Com o objetivo de gerar dados acerca dos mecanismos de evolução do CDV e desenvolver e testar a eficácia de uma vacina bivalente inativada contra o vírus da raiva (RABV) e CDV a presente tese será apresentada na forma de dois artigos científicos. Ainda, um artigo de revisão sobre os modelos animais utilizados para obtenção de informações sobre o vírus do sarampo utilizando a infecção de CDV em furões e cães foi publicada e será apresentada na presente tese. No primeiro artigo, foi analisada a ocorrência de recombinação homóloga em genomas de CDV e detectou-se oito possíveis vírus recombinantes, incluindo um evento de recombinação entre uma cepa de campo e uma cepa vacinal atenuada, sugerindo que o uso de vacinação com vírus vivo atenuado pode influenciar a evolução do CDV. No segundo trabalho, uma vacina recombinante bivalente inativada baseada em RABV expressando as glicoproteínas do envelope do CDV, hemaglutinina e proteína de fusão, mostrou-se eficiente na proteção contra infecção por CDV em furões quando utilizado um protocolo prime/boost. Finalmente, foi publicada uma revisão de literatura sobre os modelos animais utilizados para obtenção de informações sobre a patogênese do vírus do sarampo utilizando a infecção com o vírus da cinomose. / Canine distemper virus (CDV) is an important pathogen of domestic dogs and wild carnivores. CDV infection is globally relevant and it is associated with high morbidity and mortality. In several countries, distemper is considered controlled by vaccination, however, in Brazil it is still endemic, mainly due to the large number of non-domiciliated animals. In addition, outbreaks in dogs and various species of wild animals occur frequently, decimating threatened populations. Live attenuated vaccines are safe for dogs, but their use is not advised in species that are highly susceptible to CDV infection. Also, reports of canine distemper in supposedly vaccinated dogs raise the hypothesis that commercially available vaccines may not be effective against some wild type strains. In order to investigate the mechanisms of CDV evolution and to develop and assess the efficacy of an inactivated bivalent vaccine against rabies virus and CDV, this thesis will be presented in the form of two scientific papers. Furthermore, a review article on the animal models used to gain information on measles virus using CDV infection in ferrets and dogs has been published and will be presented in this thesis. In the first paper, the occurrence of homologous recombination in CDV genomes was analyzed and eight possible recombinant viruses were detected, including a recombination event between a wild type strain and an attenuated vaccine strain, suggesting that the use vaccines based on attenuated live virus may influence CDV evolution. In the second study, an inactivated bivalent recombinant vaccine based on RABV expressing CDV envelope glycoproteins, hemagglutinin and fusion protein, proved to be effective in protecting against CDV infection in ferrets when using a prime/boost protocol. Finally, a literature review was published on the animal models used to obtain information on the pathogenesis of measles virus using infection with canine distemper virus.

Submitted by Simone Souza (simonecgsouza@hotmail.com) on 2017-10-18T12:42:59Z No. of bitstreams: 1 DISS_2014_Leticya Lerner Lopes.pdf: 2057200 bytes, checksum: 5e81c161d271f2cc49db59d9720875b7 (MD5) / Approved for entry into archive by Jordan (jordanbiblio@gmail.com) on 2017-11-07T15:49:22Z (GMT) No. of bitstreams: 1 DISS_2014_Leticya Lerner Lopes.pdf: 2057200 bytes, checksum: 5e81c161d271f2cc49db59d9720875b7 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-11-07T15:49:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DISS_2014_Leticya Lerner Lopes.pdf: 2057200 bytes, checksum: 5e81c161d271f2cc49db59d9720875b7 (MD5) Previous issue date: 2014-02-28 / CAPES / O vírus da cinomose canina (VCC) é um vírus RNA, que pertence ao gênero Morbillivírus e família Paramyxoviridae. A capacidade de resposta imune, assim como sua virulência são fatores críticos para a invasão viral dos tecidos epiteliais e do sistema nervoso central (SNC). O VCC é o maior responsável pelas encefalites em cães, acometendo diversas idades. O objetivo desse estudo foi detectar o VCC nos cães com sinais neurológicos encaminhados para necropsia no Laboratório de Patologia Veterinária da Universidade Federal de Mato Grosso (LPV-UFMT). Durante um período de um ano, 85% (68/80) dos cães necropsiados tinham lesões microscópicas compatíveis com encefalomielite causada pelo VCC. Desses, 67.6% (46/68) foram confirmadas positivas através da imuno-histoquímica (IHQ). Microscopicamente, as lesões do SNC foram classificadas em encefalite desmielinizante aguda em 15.2% (7/46) dos cães, em subaguda em 73.9% (34/46) e crônica em 10.8% (5/46) dos cães. O cerebelo foi principal órgão a apresentar marcação positiva na IHQ (97.8%). O VCC é responsável pelos sinais neurológicos em cães principalmente abaixo de um ano de idade. A cinomose demonstrou sua relevância dentro da população canina de Cuiabá, sendo necessário ao nosso entendimento, caracterizar a estirpe viral relacionada à região. / Canine distemper virus (CDV) is a RNA virus classified under the genus Morbillivirus within the family of Paramyxoviridae. The time of onset of the immune response and, likely, also the virulence of the virus are critical factors in the extent of viral invasion of epithelial tissues and of the central nervous system. The CDV is the most responsible of encephalitis in dogs from different ages. In this study, the aim was to detected CDV in dogs with neurologicals signs referred for necropsy at the Laboratory of Veterinary Pathology, Federal University of Mato Grosso (LPV-UFMT).Over a period of 1 year, 85% (68/80) of the dogs necropsied had microscopic lesions compatible encephalomyelitis by CDV. Which 67.6% (46/68) were confirmed by immunohistochemistry (IHC). Microscopically, the CNS lesions were classified demyelinating encephalitis in 15.2% (7/46) to acute, 73.9% (34/46) in subacute and 10.8% (5/46) to chronic. The cerebellum (97.8%) was the main target organ to verify positivity in the IHC. Canine distemper virus is a pathogen responsible for neurological clinical signs in dogs mainly under one year of age. Distemper demonstrated its relevance within the canine population of Cuiabá, being necessary to our understanding, characterizing the viral strain related to the region.

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:46:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 157447 bytes, checksum: 535cd3ca6a89ff6d3d230a356a1b6922 (MD5) Previous issue date: 2004-02-19 / Observations of clinical cases suspected of distemper, attended at the Veterinary Hospital at the Federal University of Viçosa, indicate that the dogs vaccinated in stores which commercialize agropecuary products showed a greater frequency of the disease compared to the ones vaccinated at veterinary clinics. Having as the objective of this study the evaluation of the answer to the vaccines commercialized in different stores and following or not the vaccination protocol indicated by the literature, the antibody titers against the distemper in dogs serum in the urban area of the city of Viçosa-MG was determined. To carry out this experiment, a blood serum sample was obtained from each of the 150 selected dogs. These animals were healthy and were between six months to six years old. The animals belong to several breeds and both sex. The dogs were selected following pre-established characteristics to form five groups of 30 animals each: A) dogs vaccinated in veterinary clinics following the literature patterns; B) dogs vaccinated in veterinary clinics not following the indicated protocol; C) dogs vaccinated in agropecuary product stores following the indicated protocol; D) dogs vaccinated in agropecuary product stores not following the indicated protocol; E) dogs not vaccinated. The antibody titers were measured in each animal serum through the serum neutralizing test. According to the results of this study, it was concluded that the vaccination against distemper is important, considering the difference between the titers of vaccinated and non-vaccinated dogs. There is no difference in relation to vaccinating in veterinary clinics or agropecuary product stores, if the vaccination is carried out following the vaccination protocol indicated by the literature. The quality of the vaccines commercialized in veterinary clinics and agropecuary products stores should be evaluated due to the great percentage of negative titer and titers below the ones considered protective in all the vaccinated dogs groups. / Observações de casos clínicos suspeitos de cinomose, atendidos no Hospital Veterinário da Universidade Federal de Viçosa, indicam que os cães vacinados em lojas que comercializam produtos agropecuários apresentam maior freqüência da doença, quando comparados aos cães vacinados em clínicas veterinárias. Com o objetivo de avaliar a resposta às vacinas comercializadas em diferentes estabelecimentos e seguindo ou não o protocolo de vacinação indicado pela literatura, foi determinado o título de anticorpos contra a cinomose no soro de cães da área urbana do município de Viçosa-MG. Para tanto, uma amostra de soro sanguíneo foi obtida de cada um dos 150 cães selecionados. Estes animais estavam sadios e tinham entre seis meses e seis anos de idade. Os animais pertenciam a diversas raças e eram de ambos os sexos. Os cães foram selecionados segundo características pré-estabelecidas para compor cinco grupos de 30 animais: A) cães vacinados em clínicas veterinárias, seguindo o protocolo indicado na literatura; B) cães vacinados em clínicas veterinárias, não seguindo o protocolo indicado; C) cães vacinados em lojas de produtos agropecuários, seguindo o protocolo indicado; D) cães vacinados em lojas de produtos agropecuários, não seguindo o protocolo indicado; E) cães não vacinados. O título de anticorpos foi mensurado no soro de cada animal, por meio do teste de soroneutralização. De acordo com os resultados deste estudo, pôde-se concluir que a vacinação contra cinomose é importante, considerando a diferença encontrada entre o título de anticorpos dos cães vacinados e não vacinados. Não há diferença em vacinar os cães contra cinomose em clínicas veterinárias ou em lojas de produtos agropecuários, desde que a vacinação seja realizada seguindo o protocolo indicado pela literatura. A qualidade das vacinas comercializadas em clínicas veterinárias e lojas de produtos agropecuários devem ser avaliadas, diante da grande porcentagem de títulos negativos e de títulos abaixo do considerado protetor em todos os grupos de cães vacinados.