As mucopolissacaridoses (MPS) são um grupo de doenças metabólicas hereditárias causadas pela deficiência de enzimas lisossomais específicas, que causam alterações físicas e/ou comportamentais crônicas e progressivas. Um fenótipo comportamental é um padrão característico de observações motoras, cognitivas, linguísticas e sociais consistentemente associado a uma condição biológica. Tal fenótipo pode ser um transtorno mental ou outras características de comportamento não necessariamente associadas a transtornos. No caso específico das mucopolissacaridoses, embora haja diversos relatos na literatura sobre as altas taxas de ocorrência de problemas de comportamento na síndrome de Sanfilippo (MPS III), muito pouco é conhecido sobre as características comportamentais das outras entidades (MPS I, II, IV, VI e VII). Este trabalho pretendeu avaliar e descrever as alterações psiquiátricas encontradas em 22 pacientes com MPS atendidos em três serviços de genética clínica (4 MPS I, 5 MPS II, 1 MPS III, 4 MPS IV, 7 MPS VI, 1 MPS VII). As avaliações foram feitas através de instrumentos específicos, traduzidos e validados para nossa população, a saber: K-SADS PL, ATA, CARS, CGAS; e um instrumento traduzido, mas ainda sem validação brasileira: Escalas de Comportamento Adaptativo de Vineland. Os resultados mostraram que esses indivíduos apresentam altas taxas de transtornos mentais ao longo da vida, comportamento adaptativo deficitário e funcionamento global prejudicado. Além disso, observou-se um grande impacto familiar da doença, abandono escolar por falta de condições de acesso e de preparo da própria escola, grande dependência dos indivíduos avaliados e sobrecarga de um único cuidador, geralmente a mãe. Também ficou evidente o peso trazido pelo próprio tratamento, traduzido em uma recusa em aceitar novas propostas clínicas oferecidas. Concluiu-se que a população estudada é altamente vulnerável dos pontos de vista pessoal, familiar e social, sendo necessários mais estudos para seu melhor conhecimento e elaboração de programas e políticas de atendimento mais direcionados para suas necessidades / Mucopolysaccharidoses (MPS) are a group of hereditary metabolic diseases caused by deficient lysossomal enzymes, that lead to progressive physic and/or behavioral abnormalities. A behavioral phenotype is a characteristic pattern of motor, cognitive, linguistic and social observations, consistently associated to a biological condition. That phenotype may be a mental disorder or other behavioral characteristics not necessarily associated to any specific disorder. Referring to MPS, altohugh there are several descriptions of high ocurrence of behavioral problems in patients with Sanfilippo Syndrome (MPS III), the knowledge about behavioral characteristics of the other types of MPS is scarce. This work intended to analyse and describe psychiatric alterations in 22 patients with MPS from three services of medical genetics. Evaluation was made using specific instruments, translated and validated for use with brazilian population: K-SADS-PL, ATA, CARS, CGAS; and one instrument translated but not validated for brazilian population: Vineland Adaptive Behavior Scales. Results showed high lifetime prevalence of mental disorders, deficient adaptive behavior, and poor global functioning. Besides, it was observed intense familiar impact, high drop out rates from school, highly dependent individuals, and excessive burden for the caretaker. It was also evidenced the burden of the treatment itself. The conclusion was that this population is extremely vulnerable, and that it is necessary the realization of more studies for the better understanding of its specific necessitites

Os estudos de associação de genoma inteiro têm encontrado alguns marcadores associados a doenças notoriamente hereditárias com herança complexa, mas, muitas vezes, estes marcadores somente explicam uma pequena parte da herdabilidade. Este relativo insucesso é atribuído, entre outras causas, à epistasia, ou seja, interação entre diferentes locos genéticos. A busca por epistasia é complexa e exige intensos recursos computacionais. Diversos métodos têm sido propostos para abordar este problema, incluindo métodos estatísticos tradicionais, busca estocástica e métodos heurísticos. Poucos destes métodos são capazes de processar as grandes massas de dados produzidas nos estudos caso-controle de genoma inteiro, e ainda menos métodos buscam conjuntos de três ou mais marcadores. A busca exaustiva de conjuntos de marcadores epistáticos é inviável hoje em dia para estes conjuntos, mas o algoritmo BOOST (WAN et al., 2010) mostrou que ela é relativamente fácil para pares de locos, em especial com o uso de placas gráficas como processadores (GPGPU). Partindo deste recente sucesso, propomos um algoritmo em fases para a busca de trios de locos que interagem, utilizando a busca de pares como passo inicial, uma abordagem ainda não utilizada. Outra ideia fundamental do algoritmo proposto é a extensão da concepção de trio de marcadores para um trio de blocos haplotípicos, onde cada bloco é formado por marcadores próximos entre si. Usando os dados do WTCCC, o Troost (de TRio+bOOST) sugeriu trios potencialmente epistáticos em todas a sete doenças. Quando submetidos à confirmação em amostra independente, os trios não puderam ser confirmados, exceto os trios para diabetes tipo 1 (T1D). Duzentos e oito trios foram confirmados para T1D, com baixos valores-P e genótipos combinados de risco com altas razões de chances. Os SNPs que compõem estes trios estão todos na região MHC, sabidamente associada à doença, exceto por um deles que está no cromossomo cinco e não havia sido previamente relacionado à T1D. / Genome-wide association studies have found some markers associated with diseases with complex inheritance. However, these markers explain only a fraction of the previously estimated heritability of the trait. This relative failure has been credited, among other causes, to epistasis, i.e. the interaction among genotypes at different loci. The search for epistasis is complex and requires intense computational resources. Many methods have been proposed to approach this problem, including traditional statistics, stochastic search, and heuristic methods. Few of them are capable of extracting, from the large amount of data produced in genome-wide case-control studies, useful information about sets of markers associated with the trait in question. Exhaustive search of sets of interacting markers is unfeasible nowadays for sets of three or more markers, but the BOOST algorithm (WAN et al., 2010) showed that the search is relatively easy for pairs of SNPs, in particular with the use of graphic cards for general processing (GPGPU). Starting from this recent success, we propose an algorithm in phases for the search for trios of interacting loci, using the search for pairs as the initial step, an approach not tried yet, to our knowledge. Another important idea of our algorithm is the extension of the concept of trio of markers to a trio of haplotypic blocks, where each block is formed by neighbor markers. Using data from WTCCC, the Troost (from TRio+bOOST) algorithm suggested potentially epistatic trios in all seven diseases. When submitted to a confirmation in an independent sample, the results could not be confirmed, except for type-1 diabetes (T1D). Two hundred eight trios were confirmed for T1D, with low p-values and risk combined genotypes with high odds ratio. The SNPs that form those trios are all in the MHC region, which is known to be strongly associated to T1D, except by one SNP in chromosome five that has not been previously associated with T1D.

Os estudos de associação de genoma inteiro têm encontrado alguns marcadores associados a doenças notoriamente hereditárias com herança complexa, mas, muitas vezes, estes marcadores somente explicam uma pequena parte da herdabilidade. Este relativo insucesso é atribuído, entre outras causas, à epistasia, ou seja, interação entre diferentes locos genéticos. A busca por epistasia é complexa e exige intensos recursos computacionais. Diversos métodos têm sido propostos para abordar este problema, incluindo métodos estatísticos tradicionais, busca estocástica e métodos heurísticos. Poucos destes métodos são capazes de processar as grandes massas de dados produzidas nos estudos caso-controle de genoma inteiro, e ainda menos métodos buscam conjuntos de três ou mais marcadores. A busca exaustiva de conjuntos de marcadores epistáticos é inviável hoje em dia para estes conjuntos, mas o algoritmo BOOST (WAN et al., 2010) mostrou que ela é relativamente fácil para pares de locos, em especial com o uso de placas gráficas como processadores (GPGPU). Partindo deste recente sucesso, propomos um algoritmo em fases para a busca de trios de locos que interagem, utilizando a busca de pares como passo inicial, uma abordagem ainda não utilizada. Outra ideia fundamental do algoritmo proposto é a extensão da concepção de trio de marcadores para um trio de blocos haplotípicos, onde cada bloco é formado por marcadores próximos entre si. Usando os dados do WTCCC, o Troost (de TRio+bOOST) sugeriu trios potencialmente epistáticos em todas a sete doenças. Quando submetidos à confirmação em amostra independente, os trios não puderam ser confirmados, exceto os trios para diabetes tipo 1 (T1D). Duzentos e oito trios foram confirmados para T1D, com baixos valores-P e genótipos combinados de risco com altas razões de chances. Os SNPs que compõem estes trios estão todos na região MHC, sabidamente associada à doença, exceto por um deles que está no cromossomo cinco e não havia sido previamente relacionado à T1D. / Genome-wide association studies have found some markers associated with diseases with complex inheritance. However, these markers explain only a fraction of the previously estimated heritability of the trait. This relative failure has been credited, among other causes, to epistasis, i.e. the interaction among genotypes at different loci. The search for epistasis is complex and requires intense computational resources. Many methods have been proposed to approach this problem, including traditional statistics, stochastic search, and heuristic methods. Few of them are capable of extracting, from the large amount of data produced in genome-wide case-control studies, useful information about sets of markers associated with the trait in question. Exhaustive search of sets of interacting markers is unfeasible nowadays for sets of three or more markers, but the BOOST algorithm (WAN et al., 2010) showed that the search is relatively easy for pairs of SNPs, in particular with the use of graphic cards for general processing (GPGPU). Starting from this recent success, we propose an algorithm in phases for the search for trios of interacting loci, using the search for pairs as the initial step, an approach not tried yet, to our knowledge. Another important idea of our algorithm is the extension of the concept of trio of markers to a trio of haplotypic blocks, where each block is formed by neighbor markers. Using data from WTCCC, the Troost (from TRio+bOOST) algorithm suggested potentially epistatic trios in all seven diseases. When submitted to a confirmation in an independent sample, the results could not be confirmed, except for type-1 diabetes (T1D). Two hundred eight trios were confirmed for T1D, with low p-values and risk combined genotypes with high odds ratio. The SNPs that form those trios are all in the MHC region, which is known to be strongly associated to T1D, except by one SNP in chromosome five that has not been previously associated with T1D.

Introdução: A maioria das doenças lisossômicas são herdadas como traços recessivos, mas a mucopolissacaridose tipo II (MPS II) é de herança ligada ao cromossomo X. As doenças ligadas ao cromossomo X possuem um importante impacto para as famílias devido ao risco que as heterozigotas apresentam em ter um filho afetado. A maioria das heterozigotas para as doenças ligadas ao cromossomo X são clinicamente assintomáticas. Em relação à MPS II somente dez mulheres afetadas foram relatadas na literatura. Entretanto, nenhum estudo foi realizado para a avaliação da presença de sinais sutis da doença nessas heterozigotas. Objetivo: o objetivo principal desse estudo foi a identificação de sinais clínicos sutis e bioquímicos relacionados à MPS II nas heterozigotas para essa doença e adicionalmente estabelecer a associação desses achados com o padrão de inativação do cromossomo X. Métodos: esse foi um estudo observacional e transversal. Essas mulheres foram classificadas como heterozigotas e não heterozigotas baseadas na análise molecular do gene da iduronato sulfatase (IDS). Ambos grupos foram comparados com relação às seguintes variáveis: dados clínicos, achados do exame físico, cariótipo, padrão de inativação do cromossomo X (ensaio HUMARA), atividades da IDS em leucócitos e plasma, níveis de glicosaminoglicanos na urina, tomografia computadorizada de abdomen e coluna e ressonância magnetica de crânio. Resultados: Quarenta mulheres pertencentes a 24 famílias foram avaliadas. De acordo com a análise do DNA 22 foram classificadas em heterozigotas e 18 em não heterozigotas. Não foi encontrada nenhuma anormalidade no exame físico (n=40), cariótipo (n=31/40) ou na TC de coluna (n=31/40). A incidência de abortamento também não apresentou diferenças entre essas mulheres. Entretanto, a atividade da IDS em plasma (p<0,001) e em leucócitos (p<0,001) apresentaram níveis inferiores nas heterozigotas. A correção de Bonferroni foi aplicada e não foi encontrada nenhuma diferença entre os grupos dentre as variáveis analisadas. Também em relação ao padrão de inativação do cromossomo X não foi observada diferença esntre as heterozigotas e não heterozigotas. Conclusões: Esse é o primeiro estudo sistemático realizado em heterozigotas para MPS II. Não foi encontrada nenhuma evidência de manifestações clínicas sutis ou sinais radiológicos da doença MPS II nessas mulheres. Nossos achados sugerem que não existe relação entre a ausência dos sinais clínicos nessas mulheres e a ocorrência de um padrão favorável de desvio da inativação do cromossomo X. Esses dados sugerem que a MPS II apresenta uma baixa penetrância nas heterozigotas. / Introduction: Most lysosomal diseases are inherited as recessive traits, but muchopolysaccharidosis type II (MPS II) presents X-linked inheritance. The X-linked disorders have an important impact for families because the risk heterozygous present of having an affected child. Most heterozygotes for X-linked disorders are clinically asymptomatic. Regarding MPS II only ten affected females have been reported in the literature. However, none study has been taken in order to evaluate subtle signs of the disease in heterozygotes. Objective: The main objective of this study was to identify subtle clinical and biochemical signs of MPS II in heterozygotes for this disease, and to correlate the findings with the pattern of X chromosome inactivation presented by these women. Methods: This was an observational, transversal and controlled study. The women were classified as heterozygote or non-heterozygote based on molecular analysis of the iduronate sulfatase (IDS) gene. Both groups were compared between regarding clinical data, physical exam findings, karyotype, pattern of X inactivation (HUMARA assay), IDS activity in leukocytes and plasma, glycosaminoglicans levels in urine, computadorized tomography scans of abdomen and spine, and brain magnetic resonance imaging. Results: Forty women from 24 families were evaluated. According to DNA analysis, 22 women were classified as heterozygote and 18 as non-heterozygotes. We did not found any abnormality in physical examination (n=40), karyotype (n=31/40) or spine CT scans (n=31/40). The incidence of miscarriage also did not differ between these females. However, IDS activities in plasma (p<0.001) and in leukocyte (p<0.001) were lower in heterozygotes. Applying the Bonferroni’s correction, we did not find any difference between the groups regarding the variables analyzed. Also the pattern of X chromosome inactivation was not different between heterozygotes and non-heterozygotes. Conclusion: This is the first systematic study performed in heterozygotes for MPS II. We did not find any evidence of subtle clinical manifestations or radiological signs of MPS II disease in these females. Our findings suggest that there is no relation between the absence of clinical signs in these women and the occurrence of a favorable skewing pattern of X chromosome inactivation. This data suggests that MPS II is a disease which shows low penetrance in heterozygotes.

Submitted by Ana Maria Fiscina Sampaio (fiscina@bahia.fiocruz.br) on 2012-08-29T21:44:32Z No. of bitstreams: 1 Taisa Manuela Bonfim Machado. Migração estrutura populacional Tese 2012.pdf: 1095441 bytes, checksum: 16e3cea3a6b286c226470a459e5720fb (MD5) / Made available in DSpace on 2012-08-29T21:44:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Taisa Manuela Bonfim Machado. Migração estrutura populacional Tese 2012.pdf: 1095441 bytes, checksum: 16e3cea3a6b286c226470a459e5720fb (MD5) Previous issue date: 2012 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz. Salvador, Bahia, Brasil / A migração é o fator evolutivo capaz de dispersar a diversidade genética entre populações, inserindo novas características fenotípicas e genotípicas. A dinâmica matrimonial, juntamente como a estrutura da população são fatores que podem alterar a frequência destas características. Exemplo dessas características são as doenças genéticas, onde a frequência e distribuição destas auxilia na compreensão da influência de fatores evolutivos em uma população. No município de Monte Santo, localizado no interior da Bahia, foram encontradas doenças genéticas com elevada frequência, como mucopolissacaridose do tipo VI e fenilcetonúria. Existem evidências que algumas doenças mostram associação entre a raça e o risco de sua ocorrência. Dados moleculares mostraram que na Bahia a contribuição africana é de 47,2%, entretanto, dados baseados em classificação fenotípica apontam para o aumento da contribuição europeia com o afastamento do litoral. Para inferir a origem de algumas doenças genéticas em Monte Santo foram analisados marcadores informativos de ancestralidade autossômicos (AT3-I/D, APO, PV92 e SB19.3 genotipados por PCR; GC*1F e GC*1S por PCR/RFLP; e os marcadores FYnull, CKMM e LPL por PCR em tempo real) e marcadores uniparentais do mtDNA (sequenciamento da região HVS-I) e do cromossomo Y (marcador YAP por PCR; DYS 199, 92R7 e M207 por PCR/RFLP; e M60, PN2, PN3, M34, M89, M9 por sequenciamento). Assim, através da identificação da origem desses marcadores foi possível inferir a contribuição das populações que formaram a população de Monte Santo, e a origem de algumas das alterações gênicas responsáveis pelas doenças genéticas aqui estudadas (síndrome de Treacher Collins, hipotireoidismo congênito, fenilcetonúria, mucopolissacaridose tipo VI, surdez hereditária não sindrômica e osteogênese imperfeita). Os dados do cromossomo Y e dos autossômicos apontam para maior contribuição europeia, e os resultados dos marcadores mitocondriais para elevada contribuição africana e ameríndia. A elevada contribuição europeia tanto paterna quanto autossômica sugere origem europeia para as mutações c.35delG e R252W, responsáveis por aproximadamente 24% dos casos de surdez hereditária não sindrômica e por todos os casos de fenilcetonúria, respectivamente. A mucopolissacaridose do tipo VI tem como causa a mutação p.H178L, a presença desta alteração apenas em pacientes brasileiros, que compartilham o mesmo haplótipo intragênico sugere origem autóctone. Além de marcadores moleculares também foram analisados os tipos de casamentos (endogâmicos, exogâmicos e entre imigrantes) e sua frequência no município. Foi observada elevada frequência de casamentos endogâmicos e baixa taxa de migração, sugerindo crescimento populacional interno. Além disso, a maioria da população reside em povoados, cujo tamanho varia de 113 a 582 pessoas por povoado. Nesta cidade 80% da população tem renda mensal equivalente a meio salário mínimo, o que explica a baixa taxa de migração por ausência de atrativos econômicos. Avaliando os casamentos dentro das genealogias dos afetados é possível observar que a maioria deles é filho de pais consanguíneos. Estes resultados mostram que o elevado grau de endogamia e endocruzamento assim como possível efeito fundador e deriva genética estão associados ao aumento da frequência e manutenção das doenças genéticas neste município. / Migration is the evolutionary factor able to disperse the genetic diversity among populations, inserting new phenotypic and genotypic characteristics. The dynamic of marriage and population structure are factors that may maintain or eliminate these characteristics. Examples of these traits are genetic diseases, where the frequency of these helps in understanding the evolutionary factors influence in a population. In Monte Santo city, situated in county of Bahia, were found genetic diseases with high frequency such as mucopolysaccharidosis type VI and phenylketonuria. It has been shown that some diseases have an important racial factor in determining risk of its occurrence. Molecular results show that in Bahia the African contribution is 47.2%. However, phenotypic classification data show an increase of European contribution with the distance from the coast. To infer the origin of some genetic disease in Monte Santo were analyzed autosomal ancestry informative markers (AT3-I/D, APO, PV92 and SB19.3 genotyped by PCR, GC*1F and GC*1S by PCR/RFLP and FYnull, CKMM and LPL genotyped by real time PCR) and uniparental markers of mtDNA (sequencing of the HVS-I region) and the Y chromosome (YAP marker by PCR; DYS199, 92R7 and M207 by PCR/RFLP, and M60, PN2, PN3, M34, M89, M9 by sequencing). Thus, by identifying the origin of these markers was possible to infer the contribution of the populations that formed Monte Santo, and the origin of some genetic mutations responsible for genetic diseases studied here (Treacher-Collins syndrome, congenital hypothyroidism, phenylketonuria, mucopolysaccharidosis type VI, hereditary non-syndromic deafness and osteogenesis imperfecta). The Y chromosome and autosomal results indicate greater European contribution, and the results from mtDNA show high contribution of African and Amerindian contribution. The high European contribution both paternal and autosomal suggests European origin for the c.35delG and R252W mutations, responsible for approximately 24% of cases of hereditary non-syndromic deafness and all phenylketonuria cases, respectively. The mucopolysaccharidosis type VI is caused by p.H178L mutation, the presence of this mutation only in Brazilian patients, who share the same intragenic haplotype suggest an autochthonous origin. In addition to molecular markers were also analyzed the types of marriages (endogamic, exogamous and between immigrant) and how often they occur in the city. We observed a high frequency of endogamic marriages and low migration rates, suggesting internal population growth. The population of Monte Santo is characterized by division into villages, where the majority of the population, the number of inhabitants varies from 113 to 582 people per village. In this city 80% of the population has income equivalent to half the minimum wage, which reinforces the absence of compelling economic and low migration rate. Evaluating the marriages inside the genetic diseases pedigree families can be observed that most of those affected are children of consanguineous parents. These results suggest that the high degree of inbreeding as well as the occurrence of founder effect and genetic drift were associated with increased frequency and maintenance of genetic diseases in the city.

Introdução: A maioria das doenças lisossômicas são herdadas como traços recessivos, mas a mucopolissacaridose tipo II (MPS II) é de herança ligada ao cromossomo X. As doenças ligadas ao cromossomo X possuem um importante impacto para as famílias devido ao risco que as heterozigotas apresentam em ter um filho afetado. A maioria das heterozigotas para as doenças ligadas ao cromossomo X são clinicamente assintomáticas. Em relação à MPS II somente dez mulheres afetadas foram relatadas na literatura. Entretanto, nenhum estudo foi realizado para a avaliação da presença de sinais sutis da doença nessas heterozigotas. Objetivo: o objetivo principal desse estudo foi a identificação de sinais clínicos sutis e bioquímicos relacionados à MPS II nas heterozigotas para essa doença e adicionalmente estabelecer a associação desses achados com o padrão de inativação do cromossomo X. Métodos: esse foi um estudo observacional e transversal. Essas mulheres foram classificadas como heterozigotas e não heterozigotas baseadas na análise molecular do gene da iduronato sulfatase (IDS). Ambos grupos foram comparados com relação às seguintes variáveis: dados clínicos, achados do exame físico, cariótipo, padrão de inativação do cromossomo X (ensaio HUMARA), atividades da IDS em leucócitos e plasma, níveis de glicosaminoglicanos na urina, tomografia computadorizada de abdomen e coluna e ressonância magnetica de crânio. Resultados: Quarenta mulheres pertencentes a 24 famílias foram avaliadas. De acordo com a análise do DNA 22 foram classificadas em heterozigotas e 18 em não heterozigotas. Não foi encontrada nenhuma anormalidade no exame físico (n=40), cariótipo (n=31/40) ou na TC de coluna (n=31/40). A incidência de abortamento também não apresentou diferenças entre essas mulheres. Entretanto, a atividade da IDS em plasma (p<0,001) e em leucócitos (p<0,001) apresentaram níveis inferiores nas heterozigotas. A correção de Bonferroni foi aplicada e não foi encontrada nenhuma diferença entre os grupos dentre as variáveis analisadas. Também em relação ao padrão de inativação do cromossomo X não foi observada diferença esntre as heterozigotas e não heterozigotas. Conclusões: Esse é o primeiro estudo sistemático realizado em heterozigotas para MPS II. Não foi encontrada nenhuma evidência de manifestações clínicas sutis ou sinais radiológicos da doença MPS II nessas mulheres. Nossos achados sugerem que não existe relação entre a ausência dos sinais clínicos nessas mulheres e a ocorrência de um padrão favorável de desvio da inativação do cromossomo X. Esses dados sugerem que a MPS II apresenta uma baixa penetrância nas heterozigotas. / Introduction: Most lysosomal diseases are inherited as recessive traits, but muchopolysaccharidosis type II (MPS II) presents X-linked inheritance. The X-linked disorders have an important impact for families because the risk heterozygous present of having an affected child. Most heterozygotes for X-linked disorders are clinically asymptomatic. Regarding MPS II only ten affected females have been reported in the literature. However, none study has been taken in order to evaluate subtle signs of the disease in heterozygotes. Objective: The main objective of this study was to identify subtle clinical and biochemical signs of MPS II in heterozygotes for this disease, and to correlate the findings with the pattern of X chromosome inactivation presented by these women. Methods: This was an observational, transversal and controlled study. The women were classified as heterozygote or non-heterozygote based on molecular analysis of the iduronate sulfatase (IDS) gene. Both groups were compared between regarding clinical data, physical exam findings, karyotype, pattern of X inactivation (HUMARA assay), IDS activity in leukocytes and plasma, glycosaminoglicans levels in urine, computadorized tomography scans of abdomen and spine, and brain magnetic resonance imaging. Results: Forty women from 24 families were evaluated. According to DNA analysis, 22 women were classified as heterozygote and 18 as non-heterozygotes. We did not found any abnormality in physical examination (n=40), karyotype (n=31/40) or spine CT scans (n=31/40). The incidence of miscarriage also did not differ between these females. However, IDS activities in plasma (p<0.001) and in leukocyte (p<0.001) were lower in heterozygotes. Applying the Bonferroni’s correction, we did not find any difference between the groups regarding the variables analyzed. Also the pattern of X chromosome inactivation was not different between heterozygotes and non-heterozygotes. Conclusion: This is the first systematic study performed in heterozygotes for MPS II. We did not find any evidence of subtle clinical manifestations or radiological signs of MPS II disease in these females. Our findings suggest that there is no relation between the absence of clinical signs in these women and the occurrence of a favorable skewing pattern of X chromosome inactivation. This data suggests that MPS II is a disease which shows low penetrance in heterozygotes.

Introdução: A maioria das doenças lisossômicas são herdadas como traços recessivos, mas a mucopolissacaridose tipo II (MPS II) é de herança ligada ao cromossomo X. As doenças ligadas ao cromossomo X possuem um importante impacto para as famílias devido ao risco que as heterozigotas apresentam em ter um filho afetado. A maioria das heterozigotas para as doenças ligadas ao cromossomo X são clinicamente assintomáticas. Em relação à MPS II somente dez mulheres afetadas foram relatadas na literatura. Entretanto, nenhum estudo foi realizado para a avaliação da presença de sinais sutis da doença nessas heterozigotas. Objetivo: o objetivo principal desse estudo foi a identificação de sinais clínicos sutis e bioquímicos relacionados à MPS II nas heterozigotas para essa doença e adicionalmente estabelecer a associação desses achados com o padrão de inativação do cromossomo X. Métodos: esse foi um estudo observacional e transversal. Essas mulheres foram classificadas como heterozigotas e não heterozigotas baseadas na análise molecular do gene da iduronato sulfatase (IDS). Ambos grupos foram comparados com relação às seguintes variáveis: dados clínicos, achados do exame físico, cariótipo, padrão de inativação do cromossomo X (ensaio HUMARA), atividades da IDS em leucócitos e plasma, níveis de glicosaminoglicanos na urina, tomografia computadorizada de abdomen e coluna e ressonância magnetica de crânio. Resultados: Quarenta mulheres pertencentes a 24 famílias foram avaliadas. De acordo com a análise do DNA 22 foram classificadas em heterozigotas e 18 em não heterozigotas. Não foi encontrada nenhuma anormalidade no exame físico (n=40), cariótipo (n=31/40) ou na TC de coluna (n=31/40). A incidência de abortamento também não apresentou diferenças entre essas mulheres. Entretanto, a atividade da IDS em plasma (p<0,001) e em leucócitos (p<0,001) apresentaram níveis inferiores nas heterozigotas. A correção de Bonferroni foi aplicada e não foi encontrada nenhuma diferença entre os grupos dentre as variáveis analisadas. Também em relação ao padrão de inativação do cromossomo X não foi observada diferença esntre as heterozigotas e não heterozigotas. Conclusões: Esse é o primeiro estudo sistemático realizado em heterozigotas para MPS II. Não foi encontrada nenhuma evidência de manifestações clínicas sutis ou sinais radiológicos da doença MPS II nessas mulheres. Nossos achados sugerem que não existe relação entre a ausência dos sinais clínicos nessas mulheres e a ocorrência de um padrão favorável de desvio da inativação do cromossomo X. Esses dados sugerem que a MPS II apresenta uma baixa penetrância nas heterozigotas. / Introduction: Most lysosomal diseases are inherited as recessive traits, but muchopolysaccharidosis type II (MPS II) presents X-linked inheritance. The X-linked disorders have an important impact for families because the risk heterozygous present of having an affected child. Most heterozygotes for X-linked disorders are clinically asymptomatic. Regarding MPS II only ten affected females have been reported in the literature. However, none study has been taken in order to evaluate subtle signs of the disease in heterozygotes. Objective: The main objective of this study was to identify subtle clinical and biochemical signs of MPS II in heterozygotes for this disease, and to correlate the findings with the pattern of X chromosome inactivation presented by these women. Methods: This was an observational, transversal and controlled study. The women were classified as heterozygote or non-heterozygote based on molecular analysis of the iduronate sulfatase (IDS) gene. Both groups were compared between regarding clinical data, physical exam findings, karyotype, pattern of X inactivation (HUMARA assay), IDS activity in leukocytes and plasma, glycosaminoglicans levels in urine, computadorized tomography scans of abdomen and spine, and brain magnetic resonance imaging. Results: Forty women from 24 families were evaluated. According to DNA analysis, 22 women were classified as heterozygote and 18 as non-heterozygotes. We did not found any abnormality in physical examination (n=40), karyotype (n=31/40) or spine CT scans (n=31/40). The incidence of miscarriage also did not differ between these females. However, IDS activities in plasma (p<0.001) and in leukocyte (p<0.001) were lower in heterozygotes. Applying the Bonferroni’s correction, we did not find any difference between the groups regarding the variables analyzed. Also the pattern of X chromosome inactivation was not different between heterozygotes and non-heterozygotes. Conclusion: This is the first systematic study performed in heterozygotes for MPS II. We did not find any evidence of subtle clinical manifestations or radiological signs of MPS II disease in these females. Our findings suggest that there is no relation between the absence of clinical signs in these women and the occurrence of a favorable skewing pattern of X chromosome inactivation. This data suggests that MPS II is a disease which shows low penetrance in heterozygotes.

As mucopolissacaridoses (MPS) são um grupo de doenças metabólicas hereditárias causadas pela deficiência de enzimas lisossomais específicas, que causam alterações físicas e/ou comportamentais crônicas e progressivas. Um fenótipo comportamental é um padrão característico de observações motoras, cognitivas, linguísticas e sociais consistentemente associado a uma condição biológica. Tal fenótipo pode ser um transtorno mental ou outras características de comportamento não necessariamente associadas a transtornos. No caso específico das mucopolissacaridoses, embora haja diversos relatos na literatura sobre as altas taxas de ocorrência de problemas de comportamento na síndrome de Sanfilippo (MPS III), muito pouco é conhecido sobre as características comportamentais das outras entidades (MPS I, II, IV, VI e VII). Este trabalho pretendeu avaliar e descrever as alterações psiquiátricas encontradas em 22 pacientes com MPS atendidos em três serviços de genética clínica (4 MPS I, 5 MPS II, 1 MPS III, 4 MPS IV, 7 MPS VI, 1 MPS VII). As avaliações foram feitas através de instrumentos específicos, traduzidos e validados para nossa população, a saber: K-SADS PL, ATA, CARS, CGAS; e um instrumento traduzido, mas ainda sem validação brasileira: Escalas de Comportamento Adaptativo de Vineland. Os resultados mostraram que esses indivíduos apresentam altas taxas de transtornos mentais ao longo da vida, comportamento adaptativo deficitário e funcionamento global prejudicado. Além disso, observou-se um grande impacto familiar da doença, abandono escolar por falta de condições de acesso e de preparo da própria escola, grande dependência dos indivíduos avaliados e sobrecarga de um único cuidador, geralmente a mãe. Também ficou evidente o peso trazido pelo próprio tratamento, traduzido em uma recusa em aceitar novas propostas clínicas oferecidas. Concluiu-se que a população estudada é altamente vulnerável dos pontos de vista pessoal, familiar e social, sendo necessários mais estudos para seu melhor conhecimento e elaboração de programas e políticas de atendimento mais direcionados para suas necessidades / Mucopolysaccharidoses (MPS) are a group of hereditary metabolic diseases caused by deficient lysossomal enzymes, that lead to progressive physic and/or behavioral abnormalities. A behavioral phenotype is a characteristic pattern of motor, cognitive, linguistic and social observations, consistently associated to a biological condition. That phenotype may be a mental disorder or other behavioral characteristics not necessarily associated to any specific disorder. Referring to MPS, altohugh there are several descriptions of high ocurrence of behavioral problems in patients with Sanfilippo Syndrome (MPS III), the knowledge about behavioral characteristics of the other types of MPS is scarce. This work intended to analyse and describe psychiatric alterations in 22 patients with MPS from three services of medical genetics. Evaluation was made using specific instruments, translated and validated for use with brazilian population: K-SADS-PL, ATA, CARS, CGAS; and one instrument translated but not validated for brazilian population: Vineland Adaptive Behavior Scales. Results showed high lifetime prevalence of mental disorders, deficient adaptive behavior, and poor global functioning. Besides, it was observed intense familiar impact, high drop out rates from school, highly dependent individuals, and excessive burden for the caretaker. It was also evidenced the burden of the treatment itself. The conclusion was that this population is extremely vulnerable, and that it is necessary the realization of more studies for the better understanding of its specific necessitites

Orientador: Edi Lúcia Sartorato / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-25T22:58:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Miranda_PauloMauriciodoAmorDivino_D.pdf: 3949549 bytes, checksum: 8cd1e0647087ac34cd2bc0ed5d096d0b (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: A Neuropatia Óptica Hereditária de Leber (LHON) e a Atrofia Óptica Autossômica Dominante (ADOA ou OPA1) são doenças caracterizadas pela perda da visão bilateral, devido a uma degeneração do nervo óptico. Ambas as doenças apresentam também acuidade visual reduzida, discromatopsia, palidez do nervo óptico e escotoma central ou centrocecal. A LHON é causada por mutações no DNA mitocondrial (mtDNA), onde três dessas mutações representam 95% dos casos (mutações primárias principais G11778A, T14484C e G3460A) e as mutações subsequentes representam apenas 5% do total (mutações raras). A ADOA é causada por mutações (mais de 300) no gene nuclear OPA1. Embora os mecanismos moleculares precisos envolvidos no desenvolvimento das duas doenças ainda não são bem compreendidos, foi demonstrado que LHON e ADOA possuem um defeito comum de acoplamento da fosforilação oxidativa. Nesses dois casos, a hipótese é de que as mutações no mtDNA e no gene OPA1 afetariam a integridade mitocondrial, resultando em uma diminuição do fornecimento de energia para os neurônios do nervo óptico. É possível que no Brasil a presença e frequência das alterações da relacionadas à LHON e ADOA sejam diferentes das encontradas em outras partes do mundo. Por isso, o presente estudo teve como principais objetivos rastrear mutações e haplogrupos associadas à LHON e detectar mutações no gene OPA1 em pacientes brasileiros com hipótese diagnóstica de LHON e com Neuropatia Óptica de etiologia a esclarecer. Também foi objetivo otimizar o método de PCR Multiplex Alelo-Específico e padronizar as plataformas de alto rendimento TaqMan® OpenArray® e Iplex Gold/Maldi TOF MS para o rastreamento da LHON. Foram avaliados 101 pacientes, sendo 67 com hipótese diagnóstica de LHON e 34 com neuropatia óptica de etiologia a esclarecer. As mutações da LHON foram detectadas por meio de PCR-RFLP e PCR Multiplex Alelo-Específico. As mutações raras da LHON e do gene nuclear OPA1 (10 principais éxons) foram rastreadas por sequenciamento direto. Foram encontradas mutações da LHON em 36 casos (83.3% com a mutação G11778A e 16.7% com a mutação T14484C). Não foi encontrada a mutação G3460A. Também não foram encontradas mutações raras da LHON e nem mutações relacionadas à ADOA. Haplogrupos de origem africana (L1/L2 e L3) foram mais frequentes no estudo. Foi otimizado o método de PCR Multiplex Alelo-Específico e padronizadas as plataformas TaqMan® OpenArray® e Iplex Gold/Maldi TOF, os quais se mostraram reprodutivos, eficientes e eficazes. A análise molecular das mutações da LHON e do OPA1 foi importante para a confirmação do diagnóstico de 35% dos casos clínicos típicos de LHON e para a elucidação 35% casos de neuropatia óptica de etiologia a esclarecer / Abstract: The Leber Hereditary Optic Neuropathy (LHON) and Autosomal Dominant Optic Atrophy (ADOA) are diseases characterized by loss of vision in both eyes due a degeneration of the optic nerve. Both diseases also exhibit reduced visual acuity, dyschromatopsia, optic nerve and central scotoma or centrocecal. The LHON is caused by mutations in mitochondrial DNA (mtDNA), where three of these mutations account for 95% of cases (major primary mutations G11778A, T14484C and G3460A) and subsequent mutations account for only 5% of the total (rare mutations). The ADOA is caused by mutations (more than 300) in the nuclear gene OPA1. Although the precise molecular mechanisms involved in the development of the two diseases are not well understood, it was shown that LHON and ADOA have a common defect coupling of oxidative phosphorylation. In both cases, the hypothesis is that mutations in mtDNA and OPA1 gene affect mitochondrial integrity, resulting in a decrease in the supply of energy to the neurons of the optic nerve. It is possible that in Brazil the presence and frequency of changes related to LHON and ADOA be different from those found in other parts of the world. Therefore, the present study had two main objectives track haplogroups and mutations associated with LHON and detect mutations in the OPA1 gene in Brazilian patients with a diagnosis of LHON and optic neuropathy of unknown etiology. Another objective was to optimize the method of PCR Multiplex allele-specific and standardize platforms high throughput TaqMan® OpenArray® and Iplex Gold/Maldi TOF MS for screening of LHON. 101 patients were evaluated, 67 with a diagnosis of LHON and 34 with optic neuropathy of unknown etiology. LHON mutations were detected by PCR-RFLP and allele-specific multiplex PCR. Rare mutations of LHON and nuclear gene OPA1 (top 10 éxons) were screened by direct sequencing. LHON mutations were found in 36 cases (83.3% with the G11778A mutation and 16.7% with the T14484C mutation). Not the G3460A mutation. Nor rare mutations of LHON and ADOA or related mutations were found. Haplogroups of African origin (L1/L2 and L3) were more frequent in the study. The method of allele-specific multiplex PCR was optimized and standardized the TaqMan® OpenArray® and iPLEX Gold/Maldi TOF platforms which are shown reproductive, efficient and effective. Molecular analysis of mutations of LHON and ADOA was important to confirm the diagnosis of 35% of the typical clinical cases of LHON and to elucidate 35% cases of optic neuropathy of unknown etiology. Besides being useful also in the prognosis of each patient, for the phenotypic expression of the LHON and ADOA may vary with different genetic background in our population of individuals / Doutorado / Genetica Animal e Evolução / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

INTRODUÇÃO: Na última década surgiu uma nova técnica, o sequenciamento de nova geração, que, contrário ao método tradicional de Sanger, permite o sequenciamento em paralelo e em larga escala de múltiplos genes, ou até mesmo todos os genes humanos, a menor custo e com uma análise mais acelerada. Essa técnica possibilitou a descoberta de novos genes responsáveis por diversas doenças mendelianas, sendo rapidamente incorporada no contexto clínico. OBJETIVOS: comparar os resultados das técnicas de Sanger e sequenciamento de nova geração em amostras controle; introduzir a técnica de sequenciamento de nova geração no contexto clínico nas casuísticas de doenças ósseas genéticas e RASopatias; avaliar a sensibilidade diagnóstica desta técnica em amostras sem dados clínicos fornecidos. MÉTODOS: o sequenciamento de nova geração (sob a forma de um painel de genes customizado ou do exoma) foi realizado em amostras com mutações identificadas previamente por Sanger e em dois grupos de doenças mendelianas, 144 pacientes com doenças ósseas e 79 com RASopatias, além de 90 amostras sem dados clínicos conhecidos (45 casos e 45 controles). A técnica de Sanger foi aplicada em 29 amostras de doenças ósseas e em 81 amostras para confirmação de variantes identificadas pelo sequenciamento de nova geração. RESULTADOS: A sensibilidade da técnica de sequenciamento de nova geração foi estimada em 95,92% e a especificidade em 98,77%. Na casuística de doenças ósseas, a sensibilidade diagnóstica das amostras sequenciadas por Sanger foi de 69% (20/29), por painel customizado, 60% (75/125) e por exoma, 63% (12/19). Na casuística de RASopatias, a sensibilidade diagnóstica através do exoma foi de 46% (36/79). Como resultado deste trabalho, dois genes novos associados a RASopatias (LZTR1 e SOS2) e um associado a uma displasia esquelética (PCYT1A) foram identificados. Na análise das amostras sem conhecimento prévio da hipótese clínica foi obtida uma sensibilidade diagnóstica de 46,67% (21/45), mas que chegou a 73,08% (14/26) para as hipóteses de erros inatos do metabolismo. CONCLUSÕES: Foi demonstrado que a sensibilidade e a especificidade da técnica do sequenciamento de nova geração são altas e correspondentes a valores encontrados por outros grupos na literatura. Essa técnica foi considerada apropriada não apenas no contexto de pesquisa, demonstrado aqui pela descoberta de três novos genes associados a doenças mendelianas, como também para análises clínicas. Neste estudo a técnica foi aplicada com sucesso no contexto clínico, seja pelo painel customizado, seja pelo exoma, com uma positividade semelhante à encontrada pela técnica de Sanger. Mesmo na análise de amostras sem história clínica prévia foi possível identificar variantes patogênicas em quase metade dos casos, e numa porcentagem ainda maior quando a doença era um erro inato do metabolismo. Essa sensibilidade é comparável à obtida pela espectroscopia de massas em Tandem aplicada à triagem de múltiplas condições simultaneamente, o que sugere que a técnica do sequenciamento de nova geração poderá ser incorporada ao programa de triagem neonatal no futuro, ampliando o emprego de testes genéticos em complementaridade aos testes bioquímicos tradicionais / INTRODUCTION: In the last decade a new technique, the next generation sequencing, has emerged, which, contrary to the traditional Sanger method, performs parallel and high-throughput sequencing of multiple genes, or even all human genes, at a lower cost and with a faster analysis. This technique allowed the discovery of new genes responsible for several Mendelian diseases and has been quickly incorporated into the clinical context. OBJECTIVES: to compare the results of Sanger technique and next generation sequencing in control samples; to apply the next generation sequencing technique in the clinical practice to the cases of genetic skeletal disorders and RASopathies; to evaluate the diagnostic yield of this technique in samples without clinical data provided. METHODS: Next generation sequencing (in the form of a customized gene panel or exome) was performed in samples with mutations previously identified by Sanger sequencing and in two groups of Mendelian diseases, 144 patients with skeletal disorders and 79 patients with RASopathies, besides 90 samples with unknown clinical data (45 cases and 45 controls). The Sanger technique was applied in 29 samples of skeletal disorders and in 81 samples for confirmation of variants identified by next generation sequencing. RESULTS: The sensitivity of the next generation sequencing technique was estimated at 95.92% and the specificity at 98.77%. In the case of skeletal disorders, the diagnostic yield of the samples sequenced by Sanger was 69% (20/29), by customized panel, 60% (75/125), and by exome, 63% (12/19). In the individuals with RASopathies, the diagnostic yield through exome sequencing was 46% (36/79). As a result of this study, two new genes associated with RASopathies (LZTR1 and SOS2) and one associated with a skeletal dysplasia (PCYT1A) were identified. In the analysis of the samples without previous knowledge of the clinical hypothesis, a total diagnostic yield of 46.67% (21/45) was obtained, but it was up to 73.08% (14/26) in the group with hypothesis of inborn errors of metabolism. CONCLUSIONS: It was demonstrated that the sensitivity and specificity of the next generation sequencing technique are high and are similar to values found by other groups in the literature. The technique was considered appropriate not only for research, as demonstrated here by the identification of three new genes associated to Mendelian diseases, but also for clinical analysis. In this study the technique was successfully applied in the clinical context, both by customized panel and by exome, with positivity similar to that obtained by the Sanger technique. Even in the analysis of samples with no previous clinical history, it was possible to identify pathogenic variants in almost half of the cases, and an even greater percentage was obtained when the disease was an inborn error of metabolism. This sensitivity is comparable to that obtained by Tandem mass spectroscopy applied to multi-condition screening, suggesting that the next generation sequencing technique may be incorporated in the future into the neonatal screening program, increasing the use of genetic testing in complementarity to the biochemical tests