O desenvolvimento de resistência a múltiplas drogas na terapêutica do câncer é um importante obstáculo para o tratamento efetivo. Os mecanismos de resistência a múltiplas drogas ocasionam a redução intracelular de agentes quimioterápicos e, por conseqüência, estão envolvidos no fracasso no tratamento do câncer. Os principais genes envolvidos neste fenômeno são: o gene MDR1(multiple drug resisctance), que codifica uma glicoproteína de alto peso molecular, a P-gp; o gene MRP1, que codifica uma glicoproteína de 190 Kda, denominada proteína associada à resistência a múltiplas drogas; e o gene da LRP (proteína relacionada à resistência de pulmão). Alguns estudos sugerem que o colesterol pode estar envolvido diretamente com o fenômeno de resistência a múltiplas drogas, e que os lipídeos podem influenciar várias e complexas funções no MDR, por afetarem o transporte de drogas através da membrana plasmática. Além disso, células tumorais tem maior necessidade de colesterol devido a uma taxa de multiplicação mais elevada que as células normais. Neste estudo analisou-se a expressão dos genes MDR1, MRP1 e LRP em células de sarcoma uterino resistentes à doxorrubicina, e a influência de lipoproteínas. Houve aumento da expressão dos genes MDR1, MRP1 e LRP nas células tratadas com a LDL, sendo mais expressivo o gene MDR1. A HDL diminuiu a expressão dos genes MRP1 e LRP. No entanto, o gene MDR1 teve sua expressão diminuída somente em concentrações maiores. As células cultivadas em meio sem soro fetal apresentaram um elevado aumento na expressão destes genes. Em conclusão, as lipoproteínas podem modular a expressão dos genes MDR1, MRP1 e LRP e, assim, atuar na resistência a múltiplas drogas. / The development of multidrug resistance in anticancer therapy is an obstacle in the efficiency of the treatment. The multidrug resistance mechanism causes reduction of intracellular chemotherapeutical drugs. Therefore, it leads to treatment failure. There are three main multidrug resistance genes: MDR1, which codifies the P-gp (a high weight glycoprotein); MRP1, which codifies a 190 Kda glycoprotein; and, the LRP (lung resistance related protein) gene. Several reports suggest that cholesterol may be directly involved with the multidrug resistance phenomenon and that lipids may affect many complex functions in this regard, as the activity of the drug transport across the plasmatic membrane. Moreover, tumor cells have great cholesterol necessity due to the high cell multiplication rate. Here we described the MDR, MRP, LRP gene expression of a doxorubicin-resistant uterine sarcoma cell line under the influence of lipoproteins. LDL increased the expression of all genes, mainly MDR1. Treatment with HDL led to reduction of MRP and LRP expression. However, the MDR gene expression decreased only by higher concentrations of HDL. Cells grown in serumdeprived medium led to an increased expression of all the studied genes. Therefore, lipoproteins may modulate the MDR, MRP, LRP gene expression and, consequently, the cell resistance to drugs.

Dissertação (mestrado)—Fundação Universidade de Brasília, Programa de Pós-Graduação em Biologia Animal, 2018. / No câncer de mama as metástases estão intimamente relacionadas com modificações na matriz extracelular, onde a modificação mais proeminente observada em estudos recentes é o aumento da deposição de colágeno. As terapias atuais são pouco eficazes em impedir o desenvolvimento e progressão da doença, bem como a reincidência da mesma ao longo dos anos. Com o intuito de incrementar os efeitos da terapia, a associação entre a nanotecnologia e os fármacos utilizados busca melhorar aspectos do tratamento como a eficácia e diminuir os efeitos adversos relacionados ao seu uso. No presente trabalho um modelo de enxerto tumoral de células de carcinoma mamário murino (4T1®ATCC), a uma concentração de 4x104 células/50μL de meio de cultivo, enxertadas no flanco esquerdo de camundongos BalbC fêmeas foi utilizado para avaliação da eficácia do quimioterápico doxorrubicina associado a nanoemulsões e administração simultânea de losartana. Visando potencializar o efeito da terapia, a administração simultânea de losartana foi utilizada como uma tentativa de diminuir os níveis de deposição de colágeno na matriz extracelular de tecidos pulmonares e facilitar a chegada do fármaco aos sítios alvos por meio da ação descompressora dos vasos que permeiam o microambiente tumoral. O tratamento foi administrado por cinco dias consecutivos após quatro semanas do enxerto, nas concentrações de 20mg/kg para doxorrubicina em sua forma livre, 20mg/kg+ 40mg/kg para doxorrubicina livre e losartana, 40mg/kg para doxorrubicina associada a nanoemulsão e 40mg/kg + 40mg/kg para doxorrubicina associada a nanoemulsão e losartana, respectivamente. O acompanhamento in vivo do estado clínico dos camundongos ao longo de cinco semanas mostrou que o tratamento com nanoemulsão e losartana não foi tóxico, enquanto a doxorrubicina promoveu toxicidade que pôde ser observada no comportamento e aspecto físico dos camundongos. As avaliações ex vivo de materiais biológicos realizadas por meio de histologia, imunohistoquímica, ELISA e contagem de nódulos corroboram dados encontrados em estudos científicos, como o menor nível de colágeno nos grupos com administração simultânea de losartana e menor grau metastático. Concluiu-se que a doxorrubicina associada a nanoemulsões e administração de losartana não apresentou diferenças significativas em comparação à doxorrubicina em sua forma livre quando se trata da atividade antitumoral no sítio primário, mas foi capaz de diminuir o grau de colágeno encontrado nos tecidos, bem como as metástases nos tecidos pulmonares, não apresentando toxicidade significativa para os camundongos. / In breast cancer metastasis are closely related to changes in the extracellular matrix, where the most prominent modification observed in recent studies is the increase in collagen deposition. Current therapies are poorly effective in preventing the development and progression of the disease, as well as its recurrence over the years. In order to increase the effects of therapy, the association between nanotechnology and the drugs aims to improve treatment efficacy and to reduce adverse effects related to its use. In the present work a murine mammary carcinoma cell (4T1®ATCC) tumor graft model, at a concentration of 4x10 4 cells/50μl culture medium, grafted on the left flank of female BalbC mice was used to evaluate the efficacy of doxorubicin with nanoemulsions and simultaneous administration of losartan. In order to potentiate the effect of the therapy, the simultaneous administration of losartan was used as an attempt to decrease the levels of collagen deposition in the extracellular matrix of lung tissues and to facilitate the drug delivery at the target sites through the decompressive action of the vessels that permeate the tumor microenvironment. The treatment was administered for five consecutive days after four weeks of grafting, at concentrations of 20mg/kg for doxorubicin in its free form, 20mg/kg + 40mg/kg for free doxorubicin and losartan, 40mg/kg for doxorubicin associated with nanoemulsion and 40mg/kg + 40mg/kg for doxorubicin associated with nanoemulsion and losartan, respectively. In vivo monitoring of the clinical status of mice over five weeks showed that treatment with nanoemulsion and losartan was non-toxic, whereas doxorubicin promoted toxicity that could be observed in the behavior and physical appearance of the mice. Ex vivo evaluations of biological materials performed using histology, immunohistochemistry, ELISA and lung nodule counts corroborate data found in scientific studies, such as the lower level of collagen in the groups with simultaneous administration of losartan and lower metastatic degree. It was concluded that doxorubicin associated with nanoemulsions and administration of losartan did not present significant differences compared to doxorubicin in its free form when it treated the antitumor activity at the primary site, but was able to decrease the degree of collagen found in the tissues, as well as metastasis in the lung tissues, showing no significant toxicity to the mice.

Assim como o número de casos de câncer vem aumentando em nível global, a busca por abordagens terapêuticas visando uma maior eficácia com um menor poder de causar efeitos prejudiciais aos pacientes também vem crescendo. As antraciclinas e antracenodionas, as quais tem como exemplos, doxorrubicina (DOX) e mitoxantrona (MTX), respectivamente, são fármacos utilizados na quimioterapia em diversas neoplasias incluindo tumores sólidos e não sólidos tais como de mama, leucemias, linfomas, sarcomas etc. Embora sejam eficazes ao que se propõem, o tratamento com estas moléculas pode acarretar em efeitos secundários, tais como arritmias e insuficiência cardíaca. Estas drogas além de interagirem com o ferro e apresentarem capacidade de gerar espécies reativas de oxigénio (ROS), apresentam como principal mecanismo a inibição da enzima topoisomerase 2 (Top2). Os inibidores de PARP-1 emergiram como uma nova alternativa para tratar determinados tipos de neoplasias em que a letalidade sintética possa ser explorada. Além disto, já foi relatado que a toxicidade cardíaca induzida por DOX seja influenciada pela atividade de PARP-1. O objetivo desta tese foi, portanto, avaliar a influência da inibição de PARP-1 na toxicidade cardíaca de DOX e MTX em células cardíacas. Células foram incubadas durante 24h com DOX ou MTX na presença ou na ausência de inibidor de PARP-1. Ensaios de viabilidade, apoptose e genotoxicidade e foram realizados. Além disso, a fosforilação de proteínas envolvidas na resposta a danos no DNA (ATM, MRE-11 e H2AX) foram avaliadas por western blot e imunofluorescência. Os resultados demonstraram que a inibição de PARP-1, apesar de diminuir a concentração de ROS, diminui a viabilidade de células H9c2 tratadas com DOX ou MTX por aumentar a geração de quebras duplas no DNA induzida por estes fármacos. / As the number of people with cancer are globally increasing, the search for therapeutic approaches that increases efficiency decreasing harmful effects to patients is also growing, giving rise to cardio-oncology. Anthracyclines, e.g., doxorubicin (DOX), and anthracenediones, e.g., mitoxantrone (MTX), are drugs used in the chemotherapy of several cancer types, including solid and non-solid malignancies such as breast cancer, leukemia, lymphomas, and sarcomas. Although they are effective in tumor therapy, treatment with these two drugs may lead to side effects such as arrhythmia and heart failure. These drugs interact with iron to generate reactive oxygen species (ROS), target topoisomerase 2 (Top2), and impair mitochondria. PARP-1 inhibitors have emerged as a new alternative for treating certain types of malignancies in which the synthetic lethality can be exploited. Furthermore, it has been reported that DOX-induced cardiac cardiotoxicity is influenced by PARP-1 activity. The main goal of this thesis was, therefore, to evaluate PARP-1 inhibition influence in cardiac toxicity of DOX and MTX in cardiac cells. Cells were incubated for 24h with MTX or DOX in presence or absence of PARP-1 inhibitor. Viability, oxidative stress and genotoxicity assays have been conducted. Furthermore, phosphorylation of proteins involved in response to DNA damage (ATM, H2AX and MRE-11) were evaluated by western blot and immunofluorescence. Results demonstrated that inhibition of PARP-1, although decreasing ROS generation, decreases H9c2 cells viability after DOX or MTX by increasing DNA double strand break generation induced by these drugs.

A resistência à quimioterapia, a qual se constitui em um dos maiores desafios a serem superados durante o tratamento do cancer de mama, pode ser modulada por várias cascatas de sinalização cellular que levam ao aumento da sobrevivência celular. A via PI3K/Akt/mTOR é uma importante reguladora desse processo, visto que ela pode favorecer o crescimento tumoral após sua ativação por diversos receptores de fatores de crescimento, incluindo os receptores HER-2. Assim, nossa proposta foi investigar se a inibição dessa via poderia aumentar a sensibilidade de linhagens epiteliais mamárias humanas ao agente quimioterápico doxorrubicina. Também decidimos analisar o perfil de expressão gênica gerado por essa abordagem com o objetivo de compreender os mecanismos moleculares associados à resposta biológica. A rapamicina (um inibidor de mTOR) e a doxorrubicina foram utilizadas individualmente ou em combinação no tratamento de três linhagens epiteliais mamárias humanas: HB4a, C5.2 e SKBR3. A linhagem HB4a, uma linhagem derivada de epitélio mamário normal, expressa níveis basais do receptor HER-2. As outras duas linhagens expressam altos níveis desse receptor: a linhagem SKBR3 (derivada de adenocarcinoma mamário), expressa constitutivamente esse receptor e a linhagem C5.2 foi derivada da linhagem HB4a pela transfecção com o cDNA full-lenght do gene HER-2. A células foram tratadas com 20 nM de rapamicina associada ou não a doses de 30 nM a 1000 nM de doxorrubicina por 24, 48 e 72 horas. Após 24 horas, os resultados de citometria de fluxo mostraram que, enquanto as linhagens SKBR3 e C5.2 apresentaram indução de parada na fase G0/G1 do ciclo celular, a linhagem HB4a não demonstrou alterações significativas na distribuição do ciclo celular pelo tratamento com rapamicina. Esses resultados sugeriram que as linhagens SKBR3 e C5.2 foram mais sensíveis à rapamicina quando comparadas à linhagem HB4a. A doxorrubicina, por sua vez, induziu parada na fase S-G2/M do ciclo celular, a qual foi maior na linhagem HB4a comparada com as demais. De forma similar ao tratamento com doxorrubicina sozinha, o tratamento combinado também induziu parada em S-G2/M nas linhagens HB4a e C5.2. Assim, os efeitos da doxorrubicina foram predominantes aos da rapamicina na distribuição do ciclo celular no tratamento combinado nessas linhagens. Por outro lado, a linhagem SKBR3 mostrou um efeito proeminente da rapamicina, visto que sua associação com doxorrubicina induziu parada na fase G0/G1 do ciclo celular após exposição a 30 nM de doxorrubicina. Os ensaios de viabilidade celular mostraram que o tratamento combinado foi 20% mais eficiente na inibição do crescimento celular quando comparado à doxorrubicina sozinha nas três linhagens celulares, o que foi associado a uma redução de 2 vezes no IC50 da doxorrubicina. Para cada linhagem, os dados de microarray foram analisados usando o SAM (FDR 5%) para comparar os tratamento com doxorrubicina, rapamicina e o tratamento combinado aos seus respectivos controles. Considerando apenas as linhagens C5.2 e SKBR3, a anotação funcional dos genes modulados pelo tratamento combinado mostrou que os genes relacionados ao tratamento combinado estavam relacionados ao rearranjo de RNAs (splicing). Além disso, genes exclusivamente modulados pelo tratamento combinado mostrou funções associadas ao transporte intracellular enquanto que a resposta mediada por HER-2 no tratamento combinado incluiu alterçãoes na via do ubiquitina-proteossomo, glicólise e cadeia trasnportadora de elétrons. Em conjunto, nossos resultados pareceram afetar vias moleculares importantes relacionadas à sobrevivência tumoral em linhagens caracterizadas pela superexpressão de HER-2, o que foi associado a uma supressão de 2 vezes no IC50 da doxorrubicina. Esses dados ressaltam a relevância clínica da terapia combinada no contexto do HER-2, visto que essa associação pode ser capaz de reduzir a toxicidade dos pacientes submetidos à quimioterapia / Chemotherapy resistance, which is the major challenge to be overcome during breast cancer treatment, can be modulated by several signaling cascades that lead to increased cell survival. The PI3K/Akt/mTOR pathway is an important regulator of this process, as it can favour the tumor growth after its activation by several growth factor receptors, including HER-2 receptors. Thus, we proposed to investigate whether the inhibition of this pathway could improve the sensitivity of human HER-2-overexpressing breast epithelial cell lines to the chemotherapeutic agent doxorubicin. We also decided to analyze the gene expression profile generated by this approach to better understand the molecular mechanisms associated with the biological response. Rapamycin (a mTOR inhibitor) and doxorubicin were used individually or in combination on three human breast epithelial cell lines: HB4a, C5.2 e SKBR3. The HB4a cell, a normal mammary epithelial cell line, expresses basal levels of HER-2. The two other cell lines express high levels of this receptor: the SKBR3 cell (derived from a mammary adenocarcinoma) expresses constitutively this receptor.and the C5.2 cell was derived from HB4a cells transfected with the cDNA-full length of HER-2. The cells were treated with 20 M of rapamycin with or without 30nM to 1000nM of doxorubicin for 24, 48 and 72 hours. After 24 hours, the flow citometry results showed that while SKBR3 and C5.2 were arrested in G0/G1 phase, HB4a demonstrated no alterations in the cell cycle distribution after rapamycin treatment. These results showed that SKBR3 and C5.2 cells were more sensitive to rapamycin compared to HB4a. Doxorubicin, in turn, led the cells to a S-G2/M arrest which was greater in HB4a cells compared to SKBR3 and C5.2. Similarly to doxorubicin alone, the combined treatment also caused an increase of S-G2/M arrest in HB4a and C5.2 cells. So, doxorubicin effects were predominant to the rapamycin effects on the cell cycle distribution of the combined treatment in these cell lines. Otherwise, SKBR3 showed a predominant effect of rapamycin since its association with doxorubicin caused a G0/G1 arrest after exposure to 30 nM of doxorubicin. The viability assays showed that the combined treatment was 20% more effective in inhibiting cell growth than doxorubicin alone in the three cell lines, which was associated with a reduction in the IC50 of doxorubicin by 2-fold. For each cell line, microarray data were analyzed using SAM (FDR 5%) to compare doxorubicin, rapamycin and the combined treatment to the respective untreated cells. Considering only C5.2 and SKBR3 cells, Gene Ontology (GO) annotations of the genes modulated by the combined treatment showed altered genes related to RNA splicing. Moreover, genes exclusively modulated by the combined treatment showed altered functions related to intracellular trafficking whereas HER-2-mediated response to the combined treatment included changes in the ubiquitin-proteasome pathway, glycolysis and electron transport chain. Altogether, our results seemed to affect important molecular pathways related to tumor survival in HER-2- overexpressing cell lines, which was associated to a 2-fold suppression in the IC50 of doxorubicin. These findings highlight the clinical relevance of the rapamycin/doxorubicin combination therapy in HER-2 context, since this association could be able to decrease toxicity of patients undergoing chemotherapy

O objetivo deste trabalho foi estudar a permeação iontoforética da Doxorrubicina (DOX) em formulações semi-sólidas e testar a citotoxicidade destas formulações em cultura de células de melanoma com e sem a aplicação de corrente elétrica de baixa intensidade. O estudo de liberação da DOX das formulações (gel de Hidroxietilcelulose ? HEC, gel de quitosana e solução aquosa) mostrou que o gel de quitosana possuiu uma velocidade de liberação quase três vezes maior do que nas demais formulações. Os estudos de permeação passiva mostraram que o fármaco não atravessa a pele em quantidades detectáveis. No entanto, a iontoforese contribui significativamente não só na permeação da DOX, mas também na sua retenção cutânea. O gel de HEC foi o que levou a uma maior retenção cutânea do fármaco em comparação com as demais formulações. Nos estudos de citotoxicidade realizados em células de melanoma de camundongos, verificou-se que as formulações contendo DOX possuíram citotoxicidade maior comparadas ao controle (solução de DOX). Isso significa que os componentes de cada formulação contribuem no poder de citotoxicidade contra as células de melanoma. A solução de monoleína 5% em propilenoglicol apresentou maior atividade citotóxica dentre todas as formulações estudadas. Seus componentes, monoleína e propilenoglicol contribuem sinergicamente para sua atividade citotóxica, a qual é de aproximadamente 90% quando a concentração de DOX é de 20 ng/mL. Enquanto que em solução de DOX sua citotoxicidade é de aproximadamente 34% na mesma concentração. Foi feita a padronização dos estudos de aplicação de corrente elétrica em cultura de células, quanto a placa de cultura, número de células, volume do meio de cultura e ponte salina (utilizada para a passagem da corrente para o meio de cultura). A aplicação de 0,1 a 0,5 mA/cm2 de corrente elétrica não causou morte significativa para as células de melanoma quando aplicada por um período de 10 a 60 minutos. A citotoxicidade das formulações com e sem aplicação de corrente elétrica por 10 minutos não apresentaram diferença significativa. Porém, a aplicação de 20 minutos de corrente elétrica aumentou significativamente a citotoxicidade da DOX em solução aquosa. Conclui-se, resumidamente, que a aplicação de corrente elétrica de baixa intensidade aumentou a penetração da DOX através da pele e auxiliou a entrada do fármaco nas células tumorais, quando esta é dissolvida em solução aquosa. / The aim of this work was to study the iontophoretic delivery of Doxorubicin (DOX) dispersed in semi-solid formulations and test its citotoxicity activity on melanoma cell lines, with or without the application of a low intensity electrical current. The release study of DOX from the formulations (hydroxyethylcellulose ? HEC, chitosan gel and aqueous solution) showed that chitosan gel increased almost 3 times the diffusion coefficient of the drug when compared to a water solution. Passive permeation studies showed that the drug does not cross the skin in detected amounts. However, iontophoresis of DOX increased significantly not only the permeation but also the skin retention of the drug. HEC gel improved DOX skin retention when compared to other formulations. Cytotoxicity studies, performed in rat melanoma cell culture indicated that formulations containing DOX have high citotoxicity compared to the control (DOX solution). These results means that the components of the formulations probably contribute to melanoma cells death. Monoolein 5% solution in propileneglicol showed high citotoxicity compared to the other formulations. Its components act sinergically and produce a great citotoxicity: approximately 90% when the concentration of DOX is 20 ng/mL, whereas in DOX solution its citotoxicity is approximately 34% on this concentration. Standardization of the electrical current studies has been made as matter as the culture plate, number of cells, volume of culture medium and agar bridge (used to pass electrical current for the culture medium). The application of 0,1 to 0,5 mA/cm2 of electrical current during 10 to 60 minutes did not kill melanoma cell lines significantly. The cytotoxicity of DOX incorporated in water and semi-solid formulations are not statistical different in the presence or not of an electrical current for 10 minutes. However, 20 minutes of an electrical current raised significantly the citotoxicity effects of DOX in aqueous solution. In summary, the application of low intensity electrical current increases the penetration of DOX through the skin and helps the drug to enter into the tumor cells, when dispersed in water solution

A resistência à quimioterapia, a qual se constitui em um dos maiores desafios a serem superados durante o tratamento do cancer de mama, pode ser modulada por várias cascatas de sinalização cellular que levam ao aumento da sobrevivência celular. A via PI3K/Akt/mTOR é uma importante reguladora desse processo, visto que ela pode favorecer o crescimento tumoral após sua ativação por diversos receptores de fatores de crescimento, incluindo os receptores HER-2. Assim, nossa proposta foi investigar se a inibição dessa via poderia aumentar a sensibilidade de linhagens epiteliais mamárias humanas ao agente quimioterápico doxorrubicina. Também decidimos analisar o perfil de expressão gênica gerado por essa abordagem com o objetivo de compreender os mecanismos moleculares associados à resposta biológica. A rapamicina (um inibidor de mTOR) e a doxorrubicina foram utilizadas individualmente ou em combinação no tratamento de três linhagens epiteliais mamárias humanas: HB4a, C5.2 e SKBR3. A linhagem HB4a, uma linhagem derivada de epitélio mamário normal, expressa níveis basais do receptor HER-2. As outras duas linhagens expressam altos níveis desse receptor: a linhagem SKBR3 (derivada de adenocarcinoma mamário), expressa constitutivamente esse receptor e a linhagem C5.2 foi derivada da linhagem HB4a pela transfecção com o cDNA full-lenght do gene HER-2. A células foram tratadas com 20 nM de rapamicina associada ou não a doses de 30 nM a 1000 nM de doxorrubicina por 24, 48 e 72 horas. Após 24 horas, os resultados de citometria de fluxo mostraram que, enquanto as linhagens SKBR3 e C5.2 apresentaram indução de parada na fase G0/G1 do ciclo celular, a linhagem HB4a não demonstrou alterações significativas na distribuição do ciclo celular pelo tratamento com rapamicina. Esses resultados sugeriram que as linhagens SKBR3 e C5.2 foram mais sensíveis à rapamicina quando comparadas à linhagem HB4a. A doxorrubicina, por sua vez, induziu parada na fase S-G2/M do ciclo celular, a qual foi maior na linhagem HB4a comparada com as demais. De forma similar ao tratamento com doxorrubicina sozinha, o tratamento combinado também induziu parada em S-G2/M nas linhagens HB4a e C5.2. Assim, os efeitos da doxorrubicina foram predominantes aos da rapamicina na distribuição do ciclo celular no tratamento combinado nessas linhagens. Por outro lado, a linhagem SKBR3 mostrou um efeito proeminente da rapamicina, visto que sua associação com doxorrubicina induziu parada na fase G0/G1 do ciclo celular após exposição a 30 nM de doxorrubicina. Os ensaios de viabilidade celular mostraram que o tratamento combinado foi 20% mais eficiente na inibição do crescimento celular quando comparado à doxorrubicina sozinha nas três linhagens celulares, o que foi associado a uma redução de 2 vezes no IC50 da doxorrubicina. Para cada linhagem, os dados de microarray foram analisados usando o SAM (FDR 5%) para comparar os tratamento com doxorrubicina, rapamicina e o tratamento combinado aos seus respectivos controles. Considerando apenas as linhagens C5.2 e SKBR3, a anotação funcional dos genes modulados pelo tratamento combinado mostrou que os genes relacionados ao tratamento combinado estavam relacionados ao rearranjo de RNAs (splicing). Além disso, genes exclusivamente modulados pelo tratamento combinado mostrou funções associadas ao transporte intracellular enquanto que a resposta mediada por HER-2 no tratamento combinado incluiu alterçãoes na via do ubiquitina-proteossomo, glicólise e cadeia trasnportadora de elétrons. Em conjunto, nossos resultados pareceram afetar vias moleculares importantes relacionadas à sobrevivência tumoral em linhagens caracterizadas pela superexpressão de HER-2, o que foi associado a uma supressão de 2 vezes no IC50 da doxorrubicina. Esses dados ressaltam a relevância clínica da terapia combinada no contexto do HER-2, visto que essa associação pode ser capaz de reduzir a toxicidade dos pacientes submetidos à quimioterapia / Chemotherapy resistance, which is the major challenge to be overcome during breast cancer treatment, can be modulated by several signaling cascades that lead to increased cell survival. The PI3K/Akt/mTOR pathway is an important regulator of this process, as it can favour the tumor growth after its activation by several growth factor receptors, including HER-2 receptors. Thus, we proposed to investigate whether the inhibition of this pathway could improve the sensitivity of human HER-2-overexpressing breast epithelial cell lines to the chemotherapeutic agent doxorubicin. We also decided to analyze the gene expression profile generated by this approach to better understand the molecular mechanisms associated with the biological response. Rapamycin (a mTOR inhibitor) and doxorubicin were used individually or in combination on three human breast epithelial cell lines: HB4a, C5.2 e SKBR3. The HB4a cell, a normal mammary epithelial cell line, expresses basal levels of HER-2. The two other cell lines express high levels of this receptor: the SKBR3 cell (derived from a mammary adenocarcinoma) expresses constitutively this receptor.and the C5.2 cell was derived from HB4a cells transfected with the cDNA-full length of HER-2. The cells were treated with 20 M of rapamycin with or without 30nM to 1000nM of doxorubicin for 24, 48 and 72 hours. After 24 hours, the flow citometry results showed that while SKBR3 and C5.2 were arrested in G0/G1 phase, HB4a demonstrated no alterations in the cell cycle distribution after rapamycin treatment. These results showed that SKBR3 and C5.2 cells were more sensitive to rapamycin compared to HB4a. Doxorubicin, in turn, led the cells to a S-G2/M arrest which was greater in HB4a cells compared to SKBR3 and C5.2. Similarly to doxorubicin alone, the combined treatment also caused an increase of S-G2/M arrest in HB4a and C5.2 cells. So, doxorubicin effects were predominant to the rapamycin effects on the cell cycle distribution of the combined treatment in these cell lines. Otherwise, SKBR3 showed a predominant effect of rapamycin since its association with doxorubicin caused a G0/G1 arrest after exposure to 30 nM of doxorubicin. The viability assays showed that the combined treatment was 20% more effective in inhibiting cell growth than doxorubicin alone in the three cell lines, which was associated with a reduction in the IC50 of doxorubicin by 2-fold. For each cell line, microarray data were analyzed using SAM (FDR 5%) to compare doxorubicin, rapamycin and the combined treatment to the respective untreated cells. Considering only C5.2 and SKBR3 cells, Gene Ontology (GO) annotations of the genes modulated by the combined treatment showed altered genes related to RNA splicing. Moreover, genes exclusively modulated by the combined treatment showed altered functions related to intracellular trafficking whereas HER-2-mediated response to the combined treatment included changes in the ubiquitin-proteasome pathway, glycolysis and electron transport chain. Altogether, our results seemed to affect important molecular pathways related to tumor survival in HER-2- overexpressing cell lines, which was associated to a 2-fold suppression in the IC50 of doxorubicin. These findings highlight the clinical relevance of the rapamycin/doxorubicin combination therapy in HER-2 context, since this association could be able to decrease toxicity of patients undergoing chemotherapy

Orientador: Paula Schimidt Gaiolla / Coorientador: Elenize Jmas Pereira / Banca: Lisiane de Almeida Martins / Banca: Silméia Jamas Cazan / Resumo: A doxorrubicina (DOX) é um medicamento amplamente utilizado como agente quimioterápico, tendo eficácia no tratamento de inúmeros tipos de cânceres. Entretanto, o uso desse medicamento pode proporcionar efeitos indesejáveis, como a cardiotoxidade. Diferentes mecanismos têm sido propostos para a cardiotoxicidade induzida pela doxorrubicina, como o estresse oxidativo, inflamação e alterações da matriz extracelular, levando ao processo de remodelação cardíaca. Chá verde (Camellia sinensis), uma das bebidas mais populares em todo o mundo, tem demonstrado uma relação positiva entre o seu consumo habitual e a proteção contra doenças cardiovasculares e contra alguns tipos de neoplasias. Isso se deve as propriedades antioxidantes, antiinflamatórias, antiapoptóticas encontradas nas catequinas, presentes no chá verde. Portanto, é possível que o mesmo atenue os afeitos cardiotóxicos da doxorrubicina, retardando o processo de remodelação cardíaca. O objetivo do presente estudo foi avaliar se o extrato de chá verde atenua a remodelação cardíaca induzida pela doxorrubicina, por meio da avaliação de variáveis bioquímicas, celulares, intersticiais e variáveis morfofuncionais cardíacas. Para isso, foram utilizados ratos Wistar machos com peso de 300 á 350 gramas. Esses animais foram divididos em 4 grupos: CP (controle) que receberam ração padrão e administração intraperitoneal de solução salina, CCV (controle + chá verde) que receberam ração adicionada de extrato de chá verde e administração intraperitoneal de solução salina, DX (doxorrubicina) que receberam ração padrão e administração intraperitoneal de doxorrubicina e DX-CV (doxorrubicina + chá verde) que receberam ração adicionada de extrato de chá verde e administração intraperitoneal de doxorrubicina. A ração foi ofertada por 35 dias e no 33◦ dia foi feita a infusão de doxorrubicina ou de solução salina foram na mesma proporção... / Abstract: Doxorubicin (DOX) is a widely used drug as a chemotherapeutic agent having efficacy in the treatment of numerous cancers. However, use of this drug may provide undesirable effects such as cardiotoxicity. Various mechanisms have been proposed for doxorubicin cardiotoxicity, such as oxidative stress, inflammation and alterations in the extracellular matrix, leading to cardiac remodeling. Green tea (Camellia sinensis), the most popular drinks in the world, has demonstrated a positive relationship between regular consumption and protection against cardiovascular disease and some types of cancer. This is the antioxidant, anti-inflammatory, antiapoptotic found in catechins present in green tea. It is therefore possible that it mitigates the cardiotoxic fond of doxorubicin, slowing the process of cardiac remodeling. The aim of this study was to evaluate whether the green tea extract attenuates cardiac remodeling induced by doxorubicin, through the evaluation of biochemical variables, cell phones, and interstitial cardiac morphofunctional variables. For this, was used male Wistar rats weighing 250 to 300 grams. These animals were divided into 4 groups: CP (control) received standard chow and intraperitoneal administration of saline, CCV (control + green tea) receiving feed added green tea extract and intraperitoneal administration of saline, DX (Doxorubicin) who received standard chow and intraperitoneal administration of doxorubicin and DX-CV (doxorubicin + green tea) fed diets with added green tea extract and intraperitoneal administration of doxorubicin. The feed was supplied for 35 days and on day 33◦ doxorubicin or infusion of saline solution were carried out in the same ratio (20 mg / kg single dose) and the animals were euthanized 48 hours after drug injection. The rats were subjected to the echocardiography before and 48 hours after injection of doxorubicin. Was conducted evaluation of oxidative stress by spectrophotometry ... / Mestre

Centro Universitário de Patos de Minas / Caryocar brasiliense is a plant popularly known as pequi, native from the Brazilian cerrado , and is widely used in Brazilian cookery. Its fruit presents a high level - carotenes (which is a pro-vitamin A), retinol and vitamin C. These are efficient antioxidizing components, and they scavenging free radicals and prevent mutagenic action of physical and chemical agents. However, in high concentrations it may have mutagenic and recombinogenic effects. So to valuate the genotoxic effects of the pequi we prepared aqueous extracts of pequi (AEP) in concentrations of 1%, 5% and 10%. For this we used the wing spot test in Drosophila melanogaster (Somatic Mutation And Recombination Test SMART). The SMART was fulfilled through the following crossings: 1) standard cross (ST); flare3 virgin females (flr3/TM3, Bds) were crossed with mwh/mwh males; 2) HB High Bioactivation Cross which ORR (ORR, flr3/TM3, Bds) virgin females were crossed with mwh/mwh males. From these crossings, we obtained two kinds of descendents: marked heterozygote (MH - mwh +/+ flr3); balanced heterozygote (BH - mwh +/+TM3, Bds). 72-hour larvae from both crossings were treated with different concentrations of AEP (1%, 5% e 10%). Distilled water and doxorubicin (DXR) (0,125mg/mL) were respectively used as negative and positive controls. The present study aimed the valuating the genotoxic effects of AEP and its antigenotoxic effects against the genotoxic action of DXR (0,125mg/mL). The results obtained demonstrated that AEP induced a statistically significant increase in the frequency of mutant spots, when compared to negative control in all concentrations of HB crossi and only in the concentration of 10 % of ST crossi. In the analysis of HB descendents, we observed a recombinogenic effect of AEP, only when metabolized by P-450. When associated to DXR, there may be an overpotentiality of the genotoxic effect of this chemotherapy. This way, we may conclude that, in these experimental conditions and in the tested concentrations, the aqueous extract of pequi presented a mutagenic and recombinogenic potential. / A Caryocar brasiliense é uma planta, conhecida popularmente como pequi, nativa do cerrado brasileiro, amplamente utilizada na culinária brasileira. O fruto do pequizeiro apresenta alto teor de carotenos (que é uma pro-vitamina A) e retinol e vitamina C. Esses compostos são eficientes antioxidantes, seqüestrando radicais livres e prevenindo a ação mutagênica de agentes físicos e químicos. Contudo, em altas concentrações, podem ter efeitos recombinogênicos e mutagênicos. Para avaliar os efeitos genotóxicos do pequi foram preparados extratos aquosos do pequi (EAP) nas concentrações de 1%; 5% e 10%. Para tanto, utilizou-se o teste da mancha da asa em Drosophila melanogaster (Somatic Mutation And Recombination Test SMART). O SMART foi realizado por meio dos seguintes cruzamentos: 1) cruzamento Padrão (ST Standard Cross): fêmeas virgens flare3 (flr3/TM3, Bds) foram cruzadas com machos mwh/mwh; 2) cruzamento de alta bioativação (HB High Bioactivation Cross ), no qual fêmeas virgens ORR (ORR, flr3/TM3, Bds) foram cruzadas com machos mwh/mwh. Desses cruzamento foram obtidos dois tipos de descendentes: heterozigoto marcado (MH - mwh +/+ flr3); heterozigoto balanceado (BH - mwh +/+ TM3, Bds). Larvas de 72 horas, de ambos cruzamentos, foram tratadas com diferentes concentrações de EAP (1%, 5% e 10%). Como controles negativo e positivo foram utilizados, respectivamente, água destilada e doxorrubicina (DXR) (0,125mg/mL). O trabalho teve como objetivo avaliar os efeitos genotóxicos do EAP e seus efeitos antigenotóxicos contra a ação genotóxica da DXR (0,125mg/mL). Os resultados obtidos demonstraram que o EAP induziu um aumento, estatisticamente significativo, na freqüência de manchas mutantes quando comparado com o controle negativo em todas as concentrações do cruzamento HB e somente na concentração de 10% do cruzamento ST. Na análise dos descentes BH observou-se efeito recombinogênico, do EAP, somente quanto metabolizado pelas P-450. Quando associado a DXR ocorre uma potencialização do efeito genotóxico desse quimioterápico. Portanto, pode-se concluir que, nestas condições experimentais e nas concentrações testadas, o extrato aquoso de pequi apresentou um potencial mutagênico e recombinogênico. / Mestre em Genética e Bioquímica

O objetivo do presente estudo visa o desenvolvimento de um copolímero em bloco constituído por metacrilato de metila (MMA) e de dimetilaminoetila (DMAEMA), tendo como macroniciador poli--caprolactona dibromada (Br-PCL-Br), e que permite formar nanocápsulas sensíveis ao pH, contendo ou não o tripeptídeo leucina-ácido aspártico-valina (LDV) na superfície para a vetorização ativa de anti-neoplásicos. Os métodos envolveram diferentes abordagens sintéticas testadas, sendo que a técnica de transferência eletrônica por regeneração de ativadores (ATRP-ARGET) permitiu obter o copolímero PCL-P(MMA-DMAEMA)2 de forma mais prática e com rendimentos entre 30 e 70%. Por fim, o tripeptídeo LDV foi conjugado ao copolímero por meio do ligante metacrilato de 2-isocianato de etila (IEM). Um método por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) foi adaptado para a quantificação da doxorrubicina e as nanopartículas foram preparadas por nanoprecipitação e avaliadas quanto à capacidade de expandir em diferentes pHs e citotoxicidade em células de câncer de mama. Os resultados do copolímero demonstram, por análises de infravermelho (IR-FT), sinais característicos em 2900 cm-1 e 1720 cm-1 correspondentes às funções –CH e –C=O. A análise de ressonância magnética nuclear de hidrogênio (RMN 1H) mostra a caracterização das cadeias hidrocarbônicas do copolímero, sendo que os deslocamentos químicos em 2,8 ppm e 3,8 ppm correspondem aos sinais dos grupamentos –CH2-N do DMAEMA e -OCH3 do MMA. As nanocápsulas preparadas a partir do copolímero expandiram de diâmetro quando expostas à pH ácido. Uma vez que o PMMA foi identificado como componente mais citotóxico, o copolímero foi otimizado por meio da redução da quantia de MMA. A quantificação da doxorrubicina encapsulada nas nanopartículas preparadas a partir dos copolímeros não otimizado (ARGET-A) e otimizado (ARGETB) foi de 61,42% e 64,88%, respectivamente. No estudo de citotoxicidade, as nanopartículas preparadas a partir do copolímero ARGET-B apresentaram-se eficazes no controle da proliferação celular de MCF-7. Conclui-se que o método de síntese ATRP-ARGET-B foi o mais apropriado para a produção do copolímero empregado no desenvolvimento de nanopartículas pH responsivas eficazes no 6 controle da proliferação de células tumorais. Ainda, existe a possibilidade do emprego do copolímero contendo o tripeptídeo LDV para alcançar uma vetorização ativa em células de câncer por meio da interação com integrinas específicas. Entretanto, até o presente, não foi realizada a avaliação das nanopartículas contendo LDV. / The objective of the present study looks for the development of a block copolymer constituted by methyl methacrylate (MMA) and dimethylaminoethyl methacrylate (DMAEMA), having poly--caprolactone dibromated (Br-PCL-Br) as a macroinitiator and, that could form pH sensible nanocapsules with or without the tripeptide leucineaspartic acid-valine (LDV) in its surface for active vectorization of anti-neoplasics. The methods employed different synthetic approaches tested, being that the activator regenerated by eletron transfer technique (ATRP-ARGET) allowed to obtain the copolymer PCL-P(MMA-DMAEMA)2 in a practicle way and with incomes between 30 and 70%. Finally, the tripeptide LDV was linked to the copolymer through the 2- isocyanatoethyl methacrylate (IEM). A high performance liquid chromatography method (HPLC) was adapted to doxorubicin quantification and, the nanopartircles were prepared by nanoprecipitation and evaluated conserning its ability to expand in different environments and citotoxycity in mammary cancer cells. The results from the copolymer demonstrated, by infrared (FT-IR), characteristic signals of 2900 cm-1 and 1720 cm-1 from the functions –CH and –C=O. And hydrogen nuclear magnetic resonance (RMN 1H) analysis allowed the characterization of the hydrogen-carbonic chains of the copolymer, being that the chemical displacement in 2,8 ppm and 3,8 ppm corresponds to the signals of the groups –CH2-N from DMAEMA and –O-CH3 from MMA. The nanocapsules prepared from the copolymer expanded its diameter when exposed to acidic pH. Once PMMA was identified as the most toxic component the copolymer was optimized by the reduction of MMA amount. Doxorubicin quantification in the nanocapsules prepared with the copolymers not optimized (ARGET-A) and optimized (ARGET-B) was 61,42% and 64,88%, respectively. In the cytotoxicity study, the nanocapsules prepared from copolymer ARGET-B showed to be efficient to control the cellular proliferation of MCF-7. It can be concluded that the ATRP-ARGET-B method was the more appropriate one for the copolymer production, which was employed in nanocapsules pH responsive effective to control 8 tumor proliferation. Besides, there is the possibility to use the copolymer functionalized with LDV to achieve an active delivery to cancer cells by it interaction with specific integrins. However, till the present, it was not realized the evaluation of the nanocapsules with LDV.

Objetivos: Simular um ajuste de dose em pacientes com sobrepeso e com obesidade que utilizam a doxorrubicina (DOX), que proporcione curvas de concentração plasmática e concentrações máximas (Cmáx) semelhantes às de pacientes com peso normal. Metodologia: Determinou-se as concentrações plasmáticas de DOX em pacientes com câncer de mama após a administração i.v. de 60 mg/m2, com ajuste de dose pelo BSA e com tempo de infusão de 40 minutos (0,66 h). As pacientes foram divididas em três grupos: a) pacientes com peso normal (IMC até 24,9) (n = 3); b) pacientes com sobrepeso (IMC 25,0 – 29,9) (n = 5); c) pacientes com obesidade (IMC acima 30,0) (n = 2). Os tempos de coleta utilizados foram: 0,66, 1,66, 8,66, e 24,66 h. Os perfis farmacocinéticos da DOX foram avaliados após quantificação da DOX através de metodologia por CLAE desenvolvida e validada. Resultados e Discussão: Os parâmetros farmacocinéticos ASC e Cmáx foram analisados por abordagem não-compartimental e compartimental. Em ambas as análises encontraram-se diferenças significativas (α = 0,05) entre os grupos com sobrepeso e com obesidade comparados com o grupo com peso normal para ASC e diferenças significativas entre o grupo com sobrepeso comparado ao grupo de pacientes com peso normal para o Cmáx. Após simulação de ajuste de dose pelo peso e pelo IMC, para as pacientes com sobrepeso e obesas, obtivemos novos valores de ASC e Cmáx. Houve diferenças significativas (α = 0,05) para o grupo de pacientes com sobrepeso comparado ao grupo com peso normal para a ASC e nenhuma diferença significativa entre os grupos estudados para Cmáx. Os percentuais de diferença da ASC e Cmáx do grupo das pacientes com sobrepeso e obesas comparados com o grupo de pacientes com peso normal foram diminuindo quando a dose era ajustada pelo peso e IMC. Conclusões: O ajuste de dose pelo índice BSA, comumente usado na prática clínica, não produz concentrações plasmáticas iguais em grupos de pacientes com peso normal e com sobrepeso, indicando que outros índices devem ser considerados, como peso e IMC. / Objectives: to simulate a dose adjustment in patients with overweight and obesity using doxorrubicin (DOX), providing plasma concentrations similar to those of patients with normal weight. Methodology: plasma concentrations of DOX were determined in patients with breast cancer after the iv. administration of 60 mg/m2 of DOX, adjusted by the BSA and with an infusion time of 40 minutes (0.66 h). The patients were divided into three groups: (a) patients with normal weight (BMI < 24.9) (n = 3); b) patients with overweight (BMI 25.0 – 29,9) (n = 5); c) patients obese (BMI > 30.0) (n = 2). Samples were collected at 0.66, 1.66, 8.66, and 24,66 h. DOX's pharmacokinetic profiles were evaluated after quantification of DOX using a new HPLC method developed and validated. Results and discussion: pharmacokinetic parameters (AUC and Cmax) were analyzed by non-compartmental and compartmental approaches. Significant differences (α = 0.05) between overweight and obese groups when compared with the normal weight group were found with respect to AUC and significant difference between the group with overweight compared to the patients with normal weight was found for Cmax. After simulating the dose adjustment by weight and by BMI for overweight and obese patients, new values for Cmax ASC were calculated. The new values obtained using both weight and BMI were closer to the normal group than those obtained with the BSA. The percentage of difference of ASC and Cmax of the overweight and obese group compared with the Group of patients with normal weight were lower when the dose was adjusted by weight and IMC. Conclusions: dose adjustment index BSA, commonly used in clinical practice, produced different plasma concentrations in groups of patients with normal weight, overweight, and obese, indicating that other indexes must be considered, such as weight and BMI.