Multiple sclerosis (MS) is a chronic neurological disease characterized by the destruction of central nervous system (CNS) myelin. Although the neurotrophin, brain derived neurotrophic factor (BDNF) has a beneficial role in re-myelination and/or myelin repair, these effects are hampered by the over-expression of a transcriptional repressor isoform of methyl CpG binding protein 2 (MeCP2) called MeCP2E1. We hypothesize that following experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) -induced myelin damage, the immune system induction of the pathogenic MeCP2E1 isoform hampers the re-myelination and/or myelin repair process by repressing BDNF expression. Our research identified the temporal gene and protein expression changes of MeCP2E1, MeCP2E2 and BDNF in an EAE mouse model of MS, and correlated them with the changes in the neurological disability scores (NDS). Our results indicated MeCP2E1 mRNA levels are elevated in EAE animals which is responsible for the repressed BDNF production in the spinal cord that prevents re-myelination and/or myelin repair. / February 2016

Indiana University-Purdue University Indianapolis (IUPUI) / The immune system protects the body from foreign organisms. T cells and B cells are integral components of the ability of the immune system to generate focused immune responses. The development of specialized subsets of T helper cells is governed by transcription factors. Previous work demonstrated a requirement for the transcription factor PU.1 in the development of IL-9-secreting Th9 cells. Work in this dissertation demonstrates that the Th9 subset is not stable in vitro, and that PU.1 expression decreases during long-term culture. To examine a role for PU.1 in Th9-independent immunity we examined a model of multiple sclerosis termed experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). Mice that lack PU.1 expression in T cells (Sfpi1lck-/- mice) demonstrated more severe disease with attenuated recovery compared to control mice, and this was accompanied by an increase of T cells in the central nervous system. We also observed that following multiple routes of immunization Sfpi1lck-/- mice had increased numbers of T follicular helper (Tfh) cells and increased germinal center responses. This correlated with increased expression of the cytokine IL-21 and the surface protein CD40L in T cells that lacked PU.1 expression and resulted in increased numbers of germinal center B cells and antigen-specific antibody titers compared to control mice. The increased germinal center B cells and antibody titers were attenuated with blocking CD40L antibody but not with neutralizing IL-21 antibody. These results suggest that PU.1 limits the expression of CD40L on Tfh cells to regulate the humoral immune response. Together, the data in this dissertation demonstrate Th9-independent functions of PU.1. Moreover, this work shows that transcription factors promoting the development of one subset of T helper cells can simultaneously have negative effects on distinct T cell lineages.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal. / Swine postweaning diarrhea (PWD) is a disease of considerable economic importance and is commonly associated with Escherichia coli. However, the vimlence mechanisms of E. coli associated with PWD have not all been elucidated. In the present study, a collection of 32 porcine E. coli 045 strains isolated from PWD were examined genotypically for the presence of virulence detenninants and phenotypically for adherence to mammalian cells in vivo and in vitro and for the expression of virulence factors related to their pathogenicity. Our results indicated that these isolates did not possess the virulence determinants, LT, STap, STb, VT1, VT2, F4, F5, F6, and F41 of enterotoxigenic or verotoxigenic E. coll. However, the majority of the strains carry eae^-related nucleotide sequences and are able to induce attaching and effacing (A/E) lesions in experimentally inoculated gnotobiotic piglets in vivo and on pig ileal expiants in vitro. The A/E lésions induced by these strains were characterized by intimate adherence of bacteria to the intestinal epithelial cell membrane with effacement of the microvilli, identical to those observed in the natural infection of pigs and to those induced by human A/E E. coli (AEEC). We also observed that the severity and extent of A/E lésions appeared to be related to the time of onset and the severity of the diarrhea in the inoculated piglets indicating an implication of A/E lesions in the induction of diarrhea in the experimentally inoculated piglets. However, none of these 045 isolates exhibited localized adherence to HEp-2 cells. The A/E-positive 045 isolates expressed an antigenically related 97 kDa outer membrane protein. The amino-terminal sequence of this protein showed 100% identity in the stretch of all known thirteen amino acids to the EaeA protein derived from the eaeA genes of human enteropathogenic E. coli and enterohemorrhagic E. coli, indicating that it is the eaeA gene product of porcine A/E isolates. The EaeA protein of E. coli 045 is serologically related to the EaeA protein of rabbit and human AEEC strains. It has an apparent isoelectric point of 8.4, is located in the bacterial outer membrane and is exposed on the bacterial surface. Most notably, the capacity of 045 isolates to induce A/E lesions appears to be correlated to the production of the EaeA protein, suggesting that expression of the EaeA protein is important for bacterial attachment to and effacement of enterocytes. Thus, we demonstrated that the E. coli 045 isolates associated with PWD in pigs are AEEC and that expression of the EaeA protein plays an important role in the pathogenicity of these isolates. We suggest that E. coli isolates capable of inducing A/E lesions could be one of the causative agents of swine PWD. / Escherichia coli (E. colî) est une bactérie gram-négative appartenant à la famille des entérobactéries. Elle constitue une grande partie de la flore intestinale normale chez l'homme et les animaux. Toutefois, certaines souches peuvent entraîner des infections intestinales ou extra-intestinales (237). Actuellement, les souches de E. coli responsables d'infections intestinales peuvent être regroupées en sept différentes classes: E. coli entérotoxinogènes (ETEC); E. coli entéroinvasifs (EIEC); E. coli entéropathogènes (EPEC); E. coli entérohémorrhagiques (EHEC); E. coli vérotoxinogènes (VTEC); E. coli adhèrent de manière diffuse (DAEC); E. coli entéroaggregatifs (EAggEC) (214). E. coli est capable d'induire la diarrhée, via divers mécanismes. En effet, ce micro-organisme possède différents facteurs de virulence spécifiques interagissant avec la muqueuse intestinale. Les ETEC adhèrent à la muqueuse de l'intestin grêle, grâce à des adhésines fimbriaires, sécrètent des entérotoxines provocant ainsi une diarrhée aqueuse. Les EIEC envahissent les cellules épithéliales du côlon et entraînent une dysenterie (217). Les EPEC sont responsables d'un grand nombre de diarrhées infantiles. Ils sont définis comme des souches non-entéroinvasives qui ne produisent aucune entérotoxine classique (73). Les EPEC adhèrent intimement à la muqueuse intestinale causant la destruction des microvillosités. Ce type de phénomène est appelé communément des lésions attachantes et effaçantes (A/E). Le nom de AEEC a été attribué aux souches d’E. coli produisant ce type de lésions (73). Les EHEC sécrètent des vérotoxines (VT) et sont de plus en plus souvent incriminés dans des épidémies de colite hémorragique. Ces souches sont également des AEEC. Les VTEC produisent une vérotoxine. Quant aux infections induites par DAEC et par EAggEC, leur mécanisme pathogène demeure actuellement peu connu (214). Parmi les différentes catégories d'E. coli diarrhéiques, seuls les ETEC et les VTEC ont été formellement identifiés chez le porcelet (99). D'autres classes d'E. coli entéropathogènes existent probablement chez le porcelet; toutefois, leur rôle demeure méconnu. En période post-sevrage, la diarrhée constitue l'une des principales causes de morbidité et de mortalité (99). La pathogénicité de ce type de diarrhée apparaît beaucoup plus complexe que celle des diarrhées néonatales. Des agents infectieux tels que E. coli, le rotavirus et le coronavirus de la gastro-entérite transmissible sont régulièrement mis en évidence chez les porcelets diarrhéiques en période post-sevrage (99). Les E. coli sont impliqués dans 50% et plus de cas de diarrhée qui apparaissent généralement pendant la première semaine post-sevrage. La majorité des souches isolées chez ces porcelets appartiennent aux classes ETEC (155, 242), ou VTEC (122). Il existe toutefois d'autres souches d'E. coli impliquées dans les troubles de diarrhée post-sevrage. Au Québec, nous avons caractérisé des souches appartenant au sérogroupe 045 qui sont associées à la diarrhée post-sevrage du porcelet et à des lésions d'A/E. Cependant, le mécanisme impliqué dans le développement de ces diarrhées reste encore inconnu. Les objectifs de notre étude étaient multiples: (l) caractériser génotypiquement plusieurs souches 045 afin d'identifier la présence de facteurs de virulence spécifiques aux ETEC, VTEC et AEEC; (2) déterminer la capacité de ces souches à causer les lésions d'A/E au niveau de l'épithélium intestinal de porcelets gnotobiotiques et une toxicité au niveau des cellules HEp-2; (3) développer une technique in vitro permettant d'étudier la capacité des différentes souches d'E. coli 045 d'induire les lésions d'A/E; (4) identifier les principales structures membranaires d'E. coli responsables du développement des lésions d'A/E. Dans le but de caractériser génotypiquement des souches 045, nous avons démontré que les 32 souches d'E. coli 045 examinées étaient majoritairement négatives pour les sondes spécifiques aux entérotoxines LT, STap, STb, VT2 et pour les fimbriae F4 (K88), F5 (K99), F6 (987P) et F41 rencontrés chez ETEC et VTEC. Parmi ces souches, une seule était positive pour STb et trois l'étaient pour le fimbriae F4. De plus, les souches isolées ont été examinées aussi pour la présence de eaeA Ç"E. coli attaching and effacing") b^jA ("bundle-forming pili") et EAF ("E. coli adherence factor"). Ces gènes étant associés aux souches AEEC chez l'homme. Des 32 souches isolées, 25 hybridaient avec une sonde spécifique au gène eaeA et 11 avec une sonde spécifique à la protéine EAF. Cependant, aucune souche n'a réagit avec la sonde spécifique au gène bjpA. Ces résultats indiquent que les souches 045 n'appartiennent ni à la famille des ETEC ni à celle des VTEC, mais possèdent certains facteurs de virulence des AEEC. Dans le but de déterminer la capacité des souches 045 à provoquer les lésions d'A/E au niveau de l'épithélium intestinal de porcelets gnotobiotiques et une toxicité au niveau des cellules HEp-2, nous avons démontré que 10 des 12 souches eaeA-positives causent les lésions d'A/E chez les porcs nouveau-nés infectés expérimentalement, alors qu'aucune lésion d'A/E n'a été décelée avec les trois souches eaeA-négatives. De plus, nous avons observé un attachement intime des bactéries à la surface cellulaire et un effacement des microvillosités accompagnés d'une formation de structures en piédestal et en forme de coupe. Ces lésions semblent être identiques à celles décrites pour les souches d'EPEC chez l'homme. Cependant, contrairement aux souches AEEC humaines, aucune souche porcine n'a pu démontré une adhérence au niveau des cellules HEp-2. Chez le porc inoculé, nous avons pu observer une corrélation entre la sévérité des lésions et celle de la diarrhée. Cette observation indique que les lésions d'A/E pourraient être impliquées dans l'induction de la diarrhée. Nos résultats démontrent l'importance du gène eaeA dans les souches porcines. Nous avons également montré que les souches d'E. coli 045 font partie intégrante de la famille des AEEC. Nos résultats suggèrent aussi l'existence de différents mécanismes de pathogénicité chez les souches 045. Afin de déterminer la capacité des souches d'E. coli 045 à induire des lésions d'A/E, nous avons développé une nouvelle technique m vitro utilisant la culture de l'iléon de porcelet nouveau-né. Lors de l'inoculation des cultures avec des isolats 045, nous avons observé un attachement des bactéries et un effacement des microvillosités accompagnés de structures en piédestal et en forme de coupe. L'attachement initial des bactéries aux entérocytes a été observé deux à quatre heures après l'inoculation et les lésions de type A/E ont été observées huit heures après l'inoculation. Nous proposons ici un modèle in vitro permettant d'étudier la capacité des E. coli à causer des lésions de type A/E. Les résultats obtenus montrent que 22 des 24 isolais 045 eaeA-positifs induisent des lésions de type A/E dans les explants de l'iléon. De plus, in vitro, certaines souches sont plus pathogènes que d'autres. Cette différence de rapidité dans l'induction des lésions d'A/E est probablement due aux facteurs de virulence de la bactérie. Ces résultats indiquent que certains déterminants impliqués dans le développement des lésions d'A/E pourraient être présents dans certains isolats et absents dans d'autres. Utilisant des modèles in vitro et in vivo, nous avons aussi démontré que seuls les isolats eaeA-positïîs sont capables d'induire les lésions d'A/E typiques. Nos résultats suggèrent donc que le déterminant eaeA joue un rôle important dans l'induction des lésions d'A/E. Cependant, ti-ois isolats eaeA-positïîs n'ont pas induit ce type de lésions. Quatre hypothèses sont déjà suggérées: (l) une défectuosité du gène eaeA; (2) une régulation de l'expression du gène eaeA; (3) l'absence d'un déterminant dont la fonction est similaire au BFP; (4) ou alors l'intervention d'un facteur inconnu. Afin d'identifier les structures de surface d'E. coli du sérotype 045 impliquées dans le développement des lésions d'A/E, l'expression de la protéine EaeA ou intimine, produit du gène eaeA, a été déterminé sur gel de polyacrylamide (SDS-PAGE) et immunobuvardage. Les résultats obtenus montrent que la majorité (20/22) des souches attachantes et effaçantes d'E. coli expriment une protéine de 97 kDa, alors que cette protéine est absente dans les dix souches non attachantes et non effaçantes. D'autre part, la séquence d'acides aminés N-terminale de la protéine de 97 kDa démontre une homologie avec la protéine EaeA déduite par le gène eaeA des souches EPEC et EHEC humaines. Les résultats du séquençage protéique suggèrent également que la maturation de la protéine EaeA des AEEC ainsi que celle de la protéine EaeA des EPEC et des EHEC s'effectue au niveau du 40e acide aminé. Le premier acide aminé inconnu de la protéine de 97 kDa de la souche 045 porcine correspond au 40 acide aminé (asparagine) de la protéine EaeA des EPEC et des EHEC. Ces conclusions ont été obtenues par comparaison avec le gène eaeA. Une électrophorèse (isoelectric focusing) de la protéine EaeA purifiée par la technique d'immunoaffinité indique que le pl de la protéine EaeA est de 8.4 comparé au pl de 9.5 de la protéine EaeA des souches humaines (358). La protéine EaeA du sérotype 045 constitue une des protéines de la membrane externe des bactéries. Enfin, en utilisant le sémm polyclonal généré par une immunisation de lapin avec des E. coli porcins 045, ou RDEC-1 ou encore en utilisant des anticorps (E2348/69) d'origine humaine, nous avons observé des réactions sérologiques croisées chez différentes espèces animales. Nous avons produit des anticorps monoclonaux spécifiques à la protéine EaeA de souche porcine. L'hybridome Cil, dirigé spécifiquement contre la protéine EaeA, réagit avec une protéine EaeA des souches AEEC de lapin, mais ne reconnaît pas les souches d'origines humaine et canine. Cet anticorps monoclonal semble reconnaître la forme conformationnelle de l'épitope ainsi que sa forme dénaturée. Par immunobuvardage, cet anticorps réagit également avec la protéine EaeA de la souche de lapin (RDEC-1), mais ne réagit pas avec des souches d'origine humaine (E2348/69) ou canine (89-4221). Nous avons démontré, à l'aide d'anticorps polyclonaux, par immunobuvardage et ELISA, que les protéines EaeA sont spécifiques des sérogroupes 045, excepté pour la souche 81-4420. Dans la présente étude, nous avons observé par ELISA des variations dans la production des protéines EaeA parmi les isolats porcins A/E 045. Une ix n correlation significative (p < 0.05) a été observée entre la quantité de protéine EaeA exprimée et la sévérité des lésions d'A/E induites m vivo par les isolats du sérogroupe 045. Ces résultats montrent une corrélation entre la production de la protéine EaeA et la capacité d'induire les lésions d'A/E. D'autre part, la quantité de protéine EaeA produite in vitro, pourrait aussi déterminer la sévérité des lésions d'A/E in vivo. Utilisant une technique d'immunofluorescence (IF) et un test de sensibilité de la protéine EaeA à certaines protéases, nous avons démontré que la protéine EaeA est localisée A la surface de la bactérie. D'une part, l'anticorps Cil réagit avec la bactérie entière indiquant ainsi la présence de la protéine native EaeA à la surface bactérienne. D'autre part, la dégradation de la protéine EaeA de la souche 045 AEEC par la papaïne a été observée lorsque (a) la cellule bactérienne est intacte; (b) les OMPs et la protéine EaeA purifiée sont soumis à des concentrations croissantes de papaïne, indiquant que la protéine EaeA est exposée A la surface externe de la bactérie. La localisation sur la surface externe de la bactérie est probablement nécessaire pour que la protéine EaeA puisse se lier à un ligand présent sur les cellules de mammifères. En conclusion, nous avons démontré qu'E. coli du sérogroupe 045, associé à la diarrhée post-sevrage du porc, induit des lésions attachantes et effaçantes m vivo et in vitro. Ces souches sont donc des AEEC. Leur capacité d'induire des lésions d'A/E semble être liée à la présence du gène eaeA et non au gène bjpA ou au facteur EAF. Nos résultats suggèrent que la protéine EaeA du sérotype 045 joue um rôle important dans la pathogénicité de la bactérie. En tenant compte des différents sérogroupes et de la presence ou absence du gène bjpA, les isolats d’E. coli du sérogroupe 045 différent des EPEC humains. Cependant, ces isolats ressemblent beaucoup plus aux EPEC humains qu'à toute autre catégorie d'E. coli diarrhéique. Nous considérons donc que les isolats d'E. coli caractérisés dans cette étude sont des EPEC-porcins (EPEC-P).

But : La perte de l’intégrité de la barrière hémo-encéphalique (BHE) est l’une des caractéristiques principales de la sclérose en plaques. Cette augmentation de la perméabilité est associée à une désorganisation des molécules de jonction serrée et à une augmentation de l’expression de molécules d’adhérence essentielles à l’extravasation des cellules immunitaires. Identifier de nouvelles molécules impliquées dans ce processus est donc crucial pour le développement de nouvelles thérapies contre la sclérose en plaques visant à promouvoir l’intégrité de la BHE et à diminuer la migration des leucocytes dans le système nerveux central (SNC) au cours du processus neuro-inflammatoire. Dans cette étude, le rôle spécifique de la molécule d’adhérence ALCAM, qui est exprimé à la surface des cellules endothéliales de la BHE (CE-BHE) et de certains sous-types de leucocytes, a été évalué. Méthodologie : À l’aide d’une analyse protéomique exhaustive, notre laboratoire a identifié ALCAM comme étant une molécule d’adhérence surexprimée par les CE-BHE mises en culture dans un milieu pro-inflammatoire. Dans le but d’étudier le rôle spécifique d’ALCAM durant la diapédèse leucocytaire, nous avons induit chez des souris de type sauvages et des souris ALCAM déficientes l’encéphalite auto-immune expérimentale (EAE), le modèle animal de la sclérose en plaques. Le rôle d’ALCAM a aussi été étudié à l’aide d’un système d’adhérence sous flux laminaire. Cet appareil, qui imite un capillaire cérébral, permet de suivre en temps réel le mouvement des leucocytes, soumis à une pression physiologique, dans un tube couvert à sa base par des CE-BHE. Résultats : En utilisant ce système d’adhérence, j’ai pu démontrer que des anticorps dirigés contre ALCAM réduisent de façon significative le roulement et l’adhérence de monocytes CD14+ humains à la surface de CE-BHE. Par ailleurs, ces anticorps préviennent de façon marquée la diminution de la vitesse moyenne des cellules au cours de l’expérience. Par le fait même, j’ai aussi observé une réduction significative de l’extravasation des monocytes traités avec de l’anti-ALCAM au travers de CE-BHE dans un modèle statique de migration. Subséquemment, j’ai démontré que ces monocytes migrent plus rapidement et en plus grand nombre au travers d’une barrière constituée de cellules endothéliales méningées à comparer à des CE-BHE. Bien que des observations similaires ont été effectuées en utilisant des lymphocytes T CD4+ humains ex vivo, j’ai été incapable de reproduire ces résultats à l’aide de cellules Th1 et Th17 réactivées in vitro. Par opposition à nos données in vitro, j’ai découvert que les souris déficientes en ALCAM développent une EAE active plus sévère que celle observée chez des souris de type sauvages. Cette EAE est par ailleurs associée à une infiltration périvasculaire de lymphocytes T pro-inflammatoires et de monocytes/macrophages de type M1 plus marqué chez les souris ALCAM déficientes. L’induction d’une EAE par transfert adoptif, dans laquelle des cellules immunitaires de type sauvage réactivées par du MOG sont injectées à des souris déficientes en ALCAM, suggère que la pathophysiologie observée durant l’EAE active serait liée à l’absence d’ALCAM au niveau de la BHE. Une caractérisation de la barrière des souris ALCAM déficientes non immunisées a par la suite révélé une réduction de l’expression de certaines molécules de jonction serrée. Une analyse plus poussée a par ailleurs démontré qu’ALCAM est lié indirectement à des molécules de jonction serrée des CE-BHE, ce qui expliquerait l’augmentation de la perméabilité de celle-ci chez les souris déficientes en ALCAM. Une analyse de la perméabilité intercellulaire de la BHE effectuée in vitro a d’autre part corrélé ces résultats. Conclusion : Collectivement, nos données prouvent qu’ALCAM joue un rôle prépondérant dans la diapédèse des monocytes, mais pas des lymphocytes Th1 et Th17 au travers de la BHE. Par ailleurs, nos résultats suggèrent qu’ALCAM remplit une fonction biologique cruciale favorisant le maintien de l’intégrité de la BHE en agissant comme molécule adaptatrice intermédiaire entre les molécules de jonction serrées et le cytosquelette. De cette façon, l’absence d’ALCAM au niveau des CE-BHE promeut indirectement le recrutement de leucocytes pro-inflammatoires dans le SNC des souris atteintes de l’EAE en augmentant la perméabilité des vaisseaux sanguins de la BHE. / Aim: The loss of blood-brain barrier (BBB) integrity is a hallmark of multiple sclerosis. It is associated with a disorganization of junctional molecules and an upregulation of cell adhesion molecules essential for immune cell transmigration. Identifying novel key players involved in this process is thus crucial for the development of MS therapies aimed at promoting BBB integrity and decreasing leukocytes trafficking into the central nervous system (CNS) during neuroinflammation. In this study, the specific role of the adhesion molecule ALCAM, found on BBB endothelial cells (BBB-ECs) and subsets of leukocytes, was assessed. Methods: We first identified ALCAM as an important molecule upregulated during inflammation in a proteomic screen of in vitro cultured primary human BBB-ECs. In order to study the effects of ALCAM on leukocyte transmigration, both active and passive experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) was induced in ALCAM KO and WT animals. The specific role of ALCAM during leukocyte transmigration was also assessed using a modified adhesion assay under sheer-stress, in which leukocytes flow across a capillary-like channel lined with a monolayer of BBB-ECs under physiological pressure. Results: Using the modified adhesion assay, we demonstrated that anti-ALCAM blocking antibodies significantly reduce the rolling and the adhesion of human CD14+ monocytes interacting with primary human BBB-ECs, as well as prevent their overall decrease in velocity. Concurrently, we also observed a significant reduction in the migration of ex vivo CD14+ monocytes, across a monolayer of human BBB-ECs. These monocytes also migrated more rapidly and in higher number across meningeal endothelial cells, as compared to BBB-ECs. While similar observations were made using ex vivo CD4+ T lymphocytes, we failed to reproduce these results using in vitro activated Th1 and Th17 cells. In opposition to our in vitro data, ALCAM KO mice developed a more severe active EAE associated with a significant increase in perivascular infiltration of pro-inflammatory lymphocytes (Th1/Th17) and M1 monocytes/macrophages, as compared to WT controls. In addition, EAE transfer experiments, in which ALCAM KO mice received WT MOG-reactivated splenocytes, suggested that the pathophysiology observed in active EAE was linked to the absence of ALCAM on BBB-ECs. Phenotypic characterization of un-immunized ALCAM KO mice revealed a reduced expression of BBB junctional proteins. Further analysis showed that ALCAM is indirectly associated with tight junction molecules of the BBB-ECs, which explains the increased CNS parenchymal blood vessel in vivo permeability in ALCAM KO animals. Correlating with these data, primary culture of mouse brain BBB-ECs was shown to possess a lower TEER and an increased permeability coefficient. Conclusion: Collectively, our data provide evidence of the implication of ALCAM in monocyte transmigration, but not Th1 or Th17 lymphocyte diapedesis across CNS endothelium. Our results also point to a biologically crucial function of ALCAM in maintaining BBB integrity by acting as an adaptor molecule between tight junctions and the cytoskeleton. As such, the absence of ALCAM at the level of BBB-ECs indirectly promotes the recruitment of pro-inflammatory leukocytes in the CNS of EAE animals by increasing the BBB vessels permeability.

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La sclérose en plaques (SP) est une maladie neuro-inflammatoire caractérisée par l’invasion de cellules immunitaires périphériques dans le système nerveux central (SNC), entraînant une perte de myéline à des endroits bien délimités appelés « plaques » ou lésions. Les processus neuroinflammatoires sont associés au dommage des neurones et oligodendrocytes (OLs) en SP. Les mécanismes sous-tendant cette dégradation des OLs par les cellules immunitaires en SP sont toutefois encore mal compris. Les lymphocytes T CD4 activés, notamment les sous-types proinflammatoires Th1 et Th17, jouent un rôle clé dans la pathobiologie de la SP et de son modèle murin l’encéphalite auto-immune expérimentale (EAE). Nous avons donc choisi d’investiguer leur contribution à l’endommagement des OLs en neuroinflammation. Pour ce faire, nous avons premièrement caractérisé les interactions entre les lymphocytes Th17 et les OLs matures in vivo à l’aide de l’imagerie intravitale chez la souris EAE (microscopie deux photons) et in vitro en utilisant des cultures primaires humaines. Ceci nous a permis de mettre en évidence que les lymphocytes pro-inflammatoires Th17 adhèrent de façon prolongée aux OLs et leur causent plus de dommage que les lymphocytes anti-inflammatoires Th2. Après avoir établi que le contact avec les lymphocytes Th17 entraîne tout d’abord la perte des prolongements cellulaires puis la mort des OLs, nous avons identifié deux mécanismes à l’origine de ces dommages. En effet, tandis que la sécrétion de glutamate par les lymphocytes Th17 à proximité des OLs entraîne une perte des prolongements cellulaires de ces derniers et une diminution de leur capacité à myéliniser, la sécrétion de granzyme B mène à la mort des OLs. Dans le but de comprendre comment prévenir les dommages causés par les lymphocytes Th17 aux OLs en SP, nous avons par la suite étudié les mécanismes sous-tendant le contact entre les deux types cellulaires. Comme nous avons confirmé que les OLs matures n’expriment pas le MHC II au niveau protéique, nous avons caractérisé l’expression par les OLs de molécules d’adhérence cellulaire (CAMs) qui seraient susceptibles de sous-tendre l’adhérence des lymphocytes Th17. Nous avons découvert que cette interaction est notamment médiée par ALCAM, et que bloquer cette molécule permet de diminuer le dommage aux OLs médié par les Th17 in vitro. A l’inverse, l’expression et/ou la sécrétion d’ICAM-1 par les OLs semble avoir un effet protecteur face aux lymphocytes Th17. En résumé, nous avons distingué de nouveaux mécanismes impliqués dans le dommage aux OLs en neuroinflammation et identifié de nouvelles cibles thérapeutiques prometteuses pour la protection des OLs en SP. / Multiple Sclerosis (MS) is a neuroinflammatory disease characterized by infiltration of immune cells into the central nervous system (CNS), demyelination in multifocal areas called “plaques” or lesions, and damage to neurons and oligodendrocytes (OLs). The mechanisms underlying immune-mediated injury to OLs in MS remains only partially understood. Activated CD4 T cells, in particular pro-inflammatory subsets Th1 and Th17, play an important role in the pathobiology of MS and its animal model experimental autoimmune encephalitis (EAE). We set out to investigate their contribution to immune-mediated oligodendrocytic damage in neuroinflammation. We first characterized the interactions between Th17 cells and mature OLs in vivo using live imaging of EAE mice (two photon microscopy) and in vitro using human primary cell cultures. We found that pro-inflammatory Th17 cells form prolonged contacts with OLs and cause greater harm compared to anti-inflammatory Th2 cells. After demonstrating that contact with Th17 cells leads first to destruction of cell processes and then death of OLs, we identified two mechanisms underlying these deleterious impacts. Indeed, while secretion of glutamate by Th17 cells in contact with OLs is associated with damage to OLs cell processes and impairment of their myelinating capacity, secretion of granzyme B leads to OLs death. To better understand how to prevent Th17-mediated OLs injury in MS, we next studied mechanisms involved in the interaction between these two cell types. As we confirmed that mature OLs do not express MHC II at the protein level, we characterized expression of cell adhesion molecules (CAMs) by OLs that could mediate Th17 cell adhesion. We discovered that ALCAM contributes to OLs and Th17 cells interactions, and that blocking this olecule reduces Th17-mediated OL damage in vitro. Inversely, ICAM-1 expression and/or secretion by OLs seems to have a protective effect in neuroinflammatory conditions. In summary, we have uncovered new mechanisms implicated in OLs njury in neuroinflammation and have identified potential novel therapeutic targets for neuroprotection in MS.

Objectifs: Chez les patients atteints de sclérose en plaques (SEP), des lymphocytes pro-inflammatoires utilisent des molécules d’adhérence afin de parvenir à traverser la barrière hémo-encéphalique (BHE) et former des lésions multifocales dans le système nerveux central (SNC). Dans le contexte de la SEP, les lymphocytes CD4 auto-agressifs polarisés en TH17 (sécrétant de l’IL-17) sont reconnus comme contribuant à la formation des lésions. Le rôle des lymphocytes CD8 TC17 est quant à lui encore mal défini. L’identification de marqueurs de surface spécifiquement exprimés par les lymphocytes TH17 et TC17 faciliterait la caractérisation de ces sous-populations pathogéniques et fournirait de nouvelles cibles thérapeutiques pour traiter la SEP. Méthodologie: Nous avons identifié MCAM lors d’analyses protéomiques de cellules endothéliales de la BHE humaine et de lymphocytes T humains. Nous avons caractérisé le phénotype et la fonction de ces cellules exprimant MCAM ex vivo, in vitro, in situ et in vivo, à partir de matériel obtenu de témoins (contrôles), de patients atteints de SEP et d’animaux atteints d’encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE). Résultats: MCAM est exprimé à la fois par les cellules endothéliales de la BHE humaine et par une sous-population de lymphocytes T effecteurs mémoire CD161+ et CCR6+. Les lymphocytes CD4 et CD8 MCAM+ expriment plus d’IL-17, IL-22, GM-CSF et granzyme B (Gz B) que les lymphocytes MCAMneg. De plus, l’expression de MCAM est fortement augmentée à la surface des lymphocytes T CD4+ et CD8+ lors des poussées de SEP, alors que les traitements immunomodulateurs en diminuent l’expression. In situ, l’expression de MCAM par les cellules endothéliales de la BHE est plus marquée au site des lésions de SEP et d’EAE, et on retrouve des lymphocytes CD4 et CD8 MCAM+ au sein de ces infiltrats périvasculaires du SNC. In vitro, les lymphocytes CD8 MCAM+ causent plus de mort oligodendrocytaire et bloquer MCAM diminue la transmigration des CD8 TC17 et des CD4 TH17 à travers les cellules endothéliales de la BHE humaine. In vivo, dépléter les lymphocytes CD4 ou CD8 MCAM+ améliore les signes cliniques de l’EAE par transfert. Par ailleurs, l’expression de MCAM est régulée à la hausse à la surface des lymphocytes CD4 et CD8 de la souris transgénique TCR1640, un modèle animal d’EAE spontanée. Finalement, bloquer MCAM atténue les déficits neurologiques chroniques aussi bien du modèle d’EAE induite avec le MOG35-55 que du modèle d’EAE spontanée. Conclusion: Nos données démontrent que les lymphocytes encéphalitogéniques produisant de l’IL-17 et présentant une capacité effectrice et migratoire marquée expriment MCAM. MCAM pourrait servir de biomarqueur en SEP et constituer une cible thérapeutique valable pour traiter les conditions neuroinflammatoires. / Objective: In multiple sclerosis (MS), pro-inflammatory lymphocytes use adhesion molecules to cross the blood-brain barrier (BBB) and accumulate in central nervous system (CNS) lesions. CD4 T lymphocytes polarized into auto-aggressive encephalitogenic TH17 (IL-17 secreting) are known to partake in MS lesion formation. Much less is known about the role of CD8 TC17. Identification of specific surface markers and adhesion molecules expressed by TH17 and TC17 lymphocytes would allow further characterization of these pathogenic subsets and would provide new therapeutic targets in MS. Methodology: We identified MCAM in a proteomic screen of human BBB endothelial cells (ECs) and on a subset of T lymphocytes. We characterized the phenotype and function of MCAM-expressing cells ex vivo, in vitro and in situ using human and mouse material obtained from controls, MS subjects and Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (EAE) animals. Results: MCAM is expressed by human BBB-ECs and by human effector memory CD161+ and CCR6+ T lymphocytes. Both CD4 and CD8 MCAM+ lymphocytes express more IL-17, IL-22, GM-CSF and Gz B than MCAMneg lymphocytes. Moreover, MCAM is strikingly up-regulated in human on CD4+ and CD8+ T lymphocytes during MS relapses, while treatment decreases MCAM expression. In situ, MCAM+ CD8 and CD4 T lymphocytes are present in perivascular infiltrates of MS and EAE CNS specimens, while MCAM expression is up-regulated on BBB-ECs within lesions. In vitro, MCAM+ CD8 T lymphocytes display higher killing capacity of oligodendrocytes, and MCAM blockade reduces CD8 TC17 and CD4 TH17 transmigration across human BBB-ECs. In vivo, depletion of MCAM+ cells from reactivated CD4 T lymphocytes and from CD8 T lymphocytes decreases clinical symptoms in adoptive transfer EAE. Furthermore, expression of MCAM is up-regulated on CD4 and CD8 T lymphocytes in the TCR1640 transgenic mice, a model of spontaneous EAE. Finally, blocking MCAM in both MOG35-55-induced and spontaneous primary progressive EAE attenuates chronic neurological deficits. Conclusions: Our data demonstrate that encephalitogenic IL-17-producing lymphocytes with high effector and migratory capacity express MCAM, and that MCAM could serve as a biomarker for MS and a valuable target for the treatment neuroinflammatory conditions.

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Indiana University-Purdue University Indianapolis (IUPUI) / Multiple sclerosis (MS) is a disabling disease that afflicts an estimated two million people worldwide. The disease is characterized by degradation of the myelin sheath that insulates neurons of the central nervous system manifesting as a heterogeneous collection of symptoms. Two enzymes, protein arginine deaminases type 2 and 4 (PAD2 and PAD4) have been implicated to play an etiologic role in demyelination and neurodegeneration by catalyzing a post-translational modification of arginine peptide residues to citrulline. The pathogenesis of MS is poorly understood, though vitamin D deficiency is a well-associated risk factor for developing the disorder. Using the experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) model of MS we demonstrate vitamin D treatment to attenuate over-expression of PAD 2 and 4 in the brain and spine during EAE. In addition, we identify two molecules produced by peripheral immune cells, IFNɣ and IL-6, as candidate signaling molecules that induce PAD expression in the brain. We demonstrate vitamin D treatment to inhibit IFNɣ mediated up regulation of PAD2 and PAD4 both directly within the brain and by modulating PAD-inducing cytokine production by infiltrating immune cells. These results provide neuroprotective rational for the supplementation of vitamin D in MS patients. More importantly, these results imply an epigenetic link between vitamin D deficiency and the pathogenesis of MS that merits further investigation.