Une des caractéristiques des cellules cancéreuses réside dans la modification de leur capacité à répondre à divers stress par rapport à des cellules saines. La modulation afférente de l'expression de gènes peut se produire à deux niveaux : transcriptionnel et post-transcriptionnel. La plupart des efforts de compréhension ont été axés sur l'étude la régulation transcriptionnelle. Néanmoins, une façon efficace et rapide de modifier l'expression des gènes est la capacité de réguler le " pool d'ARNm " pré-existant en intervenant au niveau post-transcriptionnel. Aussi, les modifications de la stabilité de l'ARNm et/ou de l'efficacité de traduction dans un contexte particulier tel que le stress tumoral et faisant intervenir des interactions ARN/protéines sont de plus en plus étudiés dans le cas des cancers. Une compréhension plus approfondie de ces mécanismes permettra de mieux comprendre 1/ l'implication des protéines liant l'ARN (RBP) dans le développement tumoral et 2/ considérer le développement de thérapies ciblées contre le cancer. Nous nous sommes concentrés sur l'étude d'une RBP pertinente vis à vis du cancer, mais très peu étudiée sur cette problématique : la protéine Staufen1 (Stau1). Stau1 est un membre de la famille des protéines qui lient l'ARN double-brin. Cette RBP contribue à la régulation post-transcriptionnelle de nombreux gènes par son implication dans des mécanismes qui vont promouvoir le transport, la dé-répression de la traduction et l'induction de la dégradation d'ARN messagers (ARNm) spécifiques. Stau1 apparait également comme un régulateur spécifique de l'expression génique intervenant dans un contexte particulier de stress cellulaire, contexte familier aux tumeurs en cours de développement. Les transcrits régulés par Stau1 se classent dans un large éventail de catégories fonctionnelles et il est intéressant de noter qu'une grande proportion d'entre eux code pour des protéines impliquées dans la régulation de processus biologiques cellulaires critique dans le développement de cancers. De part son rôle de régulateur de l'expression génique et son implication dans la réponse au stress cellulaire, nous avons émis l'hypothèse que la modification de l'expression de Stau1 puisse avoir un impact à différent niveaux sur le développement et la progression tumorale. Ce projet de thèse s'est orienté sur deux axes 1) l'étude de l'expression de Stau1 en condition de stress cellulaire et 2) l'effet de la répression de Stau1 sur le développement tumoral. / One of the characteristics of cancer cells lies in the modification of their ability to adapt to various stresses compared to healthy cells. The afferent modulation of gene expression can occur at two levels: transcriptional and post-transcriptional. Most of the efforts for understanding the gene expression process are focused on transcriptional regulation study. However, a quick and effective way to modify gene expression is the ability to regulate the "mRNA pool" by intervening in post-transcriptional level. Besides, changes in mRNA stability and/or translation efficiency in a context such as cellular stress in tumors and interactions involving RNA / protein are increasingly studied in the case of cancers. A deeper knowledge of these mechanisms will allow a better understanding of 1 / the involvement of RNA binding proteins (RBP) in tumor development and the 2 / the consideration of the development of targeted cancer therapies. We focused on the study of a relevant RBP for cancer development process, but very few studies have been undertaken on this issue: the Staufen1 protein (Stau1). Stau1 is a family member of double-stranded RNA-binding proteins. This RBP contributes to the post-transcriptional regulation of many genes through its involvement in mechanisms that will promote the transport, the derepression of translation and the induction of degradation of specific RNA transcripts (mRNA). Stau1 also appears as a regulator of specific genes expressed in respond to cellular stress induced by an unfavorable tumor microenvironment. The transcripts regulated by Stau1 can be divided into a wide range of functional categories. Interestingly, a large proportion of Stau1 targets encode proteins which regulate many critical biological cell processes in cancer development. Regarding Stau1 regulatory role and its involvement in the response to cellular stress, we made assumptions that the modification of Stau1 expression could have an impact on various levels of development and tumor progression. This project will be considered from two aspects 1/ the study of Stau1 expression under cellular stress 2/ the impact of Stau1 repression on tumor development.

Les cellules tumorales circulantes (CTC) sont des cellules présentes en très faible proportion (une cellule pour un million de cellules normales) dans la circulation sanguine, et qui jouent un rôle important dans le processus de métastase responsable de la majorité des décès de patients atteints de cancer. La détection du cancer à un stade précoce augmente les chances de survie des patients. Le but de ce travail a été de développer un ensemble de technologies permettant de mieux caractériser et détecter les CTC.Nous avons concentré notre étude sur les cellules ayant un phénotype hybride, entre épithélial et mésenchymal, qui pourraient correspondre à des CTC de plus fort potentiel métastatique compte tenu du rôle joué par la transition épithelio-mésenchymateuse dans ce processus. Nous avons tout d’abord isolé, par immunofluorescence et cytométrie en flux, une lignée cellulaire de cancer (A549, le carcinome de poumon humain) co-exprimant la E- et la N-cadhérine, de sorte qu’elle puisse être utilisée comme modèle de CTC dans le développement de nouvelles techniques de détection. Nous avons en particulier adapté le système de microscopie de fluorescence et d’analyse d'images PathfinderTM à haut-débit de la société Imstar S.A. pour identifier efficacement quelques milliers de cellules A549 mélangées à du sang de patient, après une étape de filtration par la taille. Afin d’améliorer l’identification des cellules hybrides, nous avons évalué la technique de transfert de Förster résolue en temps qui pourrait révéler avec un excellent rapport signal/bruit la présence à la membrane cellulaire d’agrégats compacts de N- et E-cadhérines. Enfin, afin d’augmenter le nombre de biomarqueurs simultanément détectés par immunofluorescence nous avons contribué à la mise au point de nanocristaux semi-conducteurs fluorescents conjugués avec un anticorps dirigé contre une protéine d'intérêt. Au final, nos résultats fournissent un ensemble de technologies qui pourront être utilisées pour améliorer la détection et la caractérisation des CTC. / Circulating tumor cells (CTCs) are rare cells (one in millions of normal cells) in blood circulatory system playing a key role in the process of metastasis, which is responsible for the majority of death of patients with cancer. Detecting cancer at early stage can give patients higher chances of survival. The aim of this work is to develop a set of technologies capable of characterizing and detecting the CTCs. We restricted our study to CTCs with hybrid phenotype, between epithelial and mesenchymal, that could correspond to circulating cells with the highest metastatic potential, considering the relation of the Epithelial to Mesenchymal Transition to cancer. Using immunofluorescence and flow cytometry, we first isolated a cancer cell line (A549, human lung carcinoma) co-expressing E- and N-cadherin, which is further used as a CTC model in the development of new detection techniques. In particular, we showed that the high throughput automated fluorescence microscope and image processing Imstar S.A. PathfinderTM system can recover efficiently a few thousands of A549 cells spiked in a blood sample, after an initial size-filtering step. We also used time-gated Fluorescence Resonant Energy Transfer to investigate the presence of E- and N-cadherin clusters at the cell membrane that could enhance the detection sensitivity of hybrid phenotype. Finally, in view of increasing the number of simultaneous biomarkers detection by immunofluorescence we contributed to the development of fluorescent semiconductor nanocrystals conjugated with antibody directed against the protein of interest. Altogether, our results provide a set of technologies that can be used to improve the detection and characterization of CTCs.

Auf Adenoviren (Ads) basierende Vektoren wurden als ein gezielter Anti-Krebs-Wirkstoff entwickelt, der erfolgversprechende Resultate in prä-klinischen Studien erzielen konnte. Solche onkolytischen Ads sind zwar in klinischen Studien generell als sicher eingestuft worden, konnten jedoch die therapeutischen Erwartungen nicht erfüllen. In dieser Doktorarbeit konnte, unter Verwendung der Genexpressionsprofile von Ovarialkarzinom-Zellen, der epitheliale Phänotyp als Hindernis für allgemein verwendete onkolytische Ads, die auf den Coxsackie- und Adenovirusrezeptor (CAR) oder CD46 ausgerichtet sind, identifiziert werden. Der Zugang zu den Virus-Rezeptoren war zwingend an Zelldepolarisation und den Verlust der epithelialen Zonulae occludens und adherens gekoppelt, was Merkmale der Epithelial-zu-Mesenchymal-Transition (EMT) darstellt. Bedeutsam ist in diesem Zusammenhang, dass Tumore in situ als auch Xenograft-Tumore zum größten Teil aus Epithelzellen oder epithelial/mesenchymalen (E/M) Hybrid-Zellen bestehen. Diese E/M Hybrid-Zellen sind die einzigen Zellen, welche an Zellkulturbedingungen adaptieren, wo sie durch EMT während weiterem Passagieren in Mesenchymzellen differenzieren. Bemerkenswert ist hierbei die Tatsache, dass nur Mesenchymzellen und E/M Hybrid-Zellen, die sich im EMT-Prozess befanden, sensitiv zu viraler Onkolyse waren. In Versuchen, die festgestellte Resistenz zu überwinden, wurde herausgefunden, dass bisher nur wenig erforschte Adenovirus-Serotypen (Ad3, Ad7, Ad11 und Ad14), welche einen anderen Rezeptor als CAR oder CD46 auf Zellen benutzen, besser geeignet sind, um polarisierte Epithelzellgewebe zu infizieren. Diese Ads induzierten EMT-ähnliche Prozesse in Ovarialkarzinom-Kulturen mit epithelialem Phänotyp, was zu deren effizienter Onkolyse führte. Die vorliegende Arbeit trägt somit zur Aufklärung der Diskrepanz zwischen der Virustherapie-Effizienz in vivo und in vitro bei und bietet Anhaltspunkte für die Konstruktion von zukünftigen onkolytischen Ads. / Vectors based on adenoviruses have been designed as targeted anti-cancer therapeutics that showed promising results in pre-clinical applications. In clinical trials, these oncolytic adenoviruses have generally been proved safe in patients, but have fallen short of their expected therapeutic value. In this thesis the susceptibility of primary ovarian cancer cells to oncolytic adenoviruses was studied in order to identify cellular mechanisms that confer resistance to virotherapy. Using gene expression profiling of cancer cells either resistant or susceptible to viral oncolysis, it was discovered that the epithelial phenotype of ovarian cancer represents a barrier to infection by commonly used oncolytic adenoviruses targeted to coxsackie- and adenovirus receptor (CAR) or CD46. Accessibility to viral receptors was critically linked to depolarization and the loss of tight and adherens junctions, both hallmarks of epithelial-mesenchymal transition (EMT). Importantly, tumors in situ as well as xenograft tumors derived from primary ovarian cancer cells mostly contained epithelial cells and cells that are in an epithelial/mesenchymal (E/M) hybrid stage. These E/M cells are the only xenograft-derived cells that can be cultured and with passaging undergo EMT to differentiate into mesenchymal cells. Notably, only mesenchymal cells and E/M cells in the process of EMT were susceptible to viral oncolysis. In attempts to overcome the observed resistance, it was found that thus far little explored adenovirus serotypes (Ad3, Ad7, Ad11, and Ad14), which use cellular receptor(s) other than CAR and CD46, have superior oncolytic abilities on polarized epithelial tissue. This study therefore contributes to the clarification of observed discrepancies between virotherapy performances in vitro and in vivo and gives a rationale for the construction of future oncolytic adenoviruses.

La transition épithélio-mésenchymateuse (EMT) confère un phénotype agressif aux cancers du sein avec la perte de leurs jonctions épithéliales intercellulaires, leur polarité et identité, et l’acquisition des caractéristiques mésenchymateuses accompagnées de l’invasion et la résistance à la chimiothérapie. Cependant, les mécanismes et les signaux associés qui régissent ces dysfonctionnements au cours de l’EMT des cancers du sein demeurent encore mal connus. Dans cette étude, nous avons entrepris de comparer deux modèles génétiques des cellules MCF-7 du cancer du sein en EMT induite par l’expression constitutive de Snail ou l’invalidation de WISP-2. Nous avons trouvé que les répresseurs des E-cadhérines tels que Slug, Zeb1/2, Twist et Snail étaient surexprimés dans les cellules en EMT avec l’induction d’un phénotype triple-négatif (TN), la perte du récepteur aux oestrogènes, GPR30, et le gain du pouvoir invasif dans le collagène de type I. De plus,l’expression ectopique de Snail dans les cellules transfectées supprime aussi les transcrits de WISP-2. L’EMT est accompagnée de la dominance de plusieurs voies de signalisation proinvasives impliquant les protéines GαGβγ, PKCα, AKT et l’induction de c-Jun. Nous avons mis en évidence l’activation du cycle cellulaire et l’inhibition de l’axe p27/cyclindependent kinase CDK3 responsable de la promotion de la croissance cellulaire. De manière intéressante, le traitement des cellules en EMT avec les inhibiteurs des GαGβγ (BIM-46187, Gallein), PKCα (Gö6976, MT477, sh-RNAs) et de la cascade de signalisation PI3K/AKT (wortmannin) réduit leur potentiel invasif. Par contre, les inhibiteurs sélectifs des récepteurs HER et des voies de signalisation MAPK/SAPK n’ont aucun effet sur les deux modèles d’EMT signant leur indépendance à ces voies oncogéniques. L’ensemble de nos résultats suggèrent que les protagonistes de signalisation représentés par les GαGβγ, PKCα et PI3K/AKT peuvent être considérés comme de potentiels biomarqueurs prédictifs et des cibles thérapeutiques dans la prise en charge des cancers du sein TN en EMT. / The epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) confers an aggressive subtype to breast cancers (BC) following disruption of intercellular junctions, epithelial cell polarity, induction of mesenchymal traits, invasive growth and chemotherapy resistance. However, the mechanisms underlying the EMT and its associated signaling dysfunctions in BC are still poorly understood. Here, we have undertaken a comparative study in two genetic models of MCF-7 breast cancer cells induced to EMT by WISP-2 silencing and Snail transformation.We report that the E-cadherin repressors Slug, Zeb1/2 and Twist were overexpressed in these EMT cells. They induced a triple negative phenotype (loss of estrogen ERα and progesterone PRA/PRB receptors, no HER2 amplification), combined with loss of the GPR30 ER and promotion of invasive growth in collagen gels. Ectopic Snail expression suppressed WISP-2 transcripts and down-regulated WISP-2 gene promoter expression in transfected cells. The EMT caused dominance of several proinvasive pathways including GαGβγ subunits, PKCα, AKT and c-Jun induction, coupled with growth responses (more cells at S and G2/M phases of the cell cycle), in line with inhibition of the p27kip1/cyclin-dependent kinase CDK3 cascade. RNA interference or selective inhibitors targeting GαGβγ subunits (BIM-46187, gallein), PKCα (Gö6976, MT477, sh-RNAs) and PI3K-AKT (wortmannin) alleviated the invasive phenotype. In contrast, MCF-7 cells in EMT showed signalingindependence to inhibitors of HER family tyrosine kinases and the mitogen- and stressactivated protein kinases. Our study suggests that the signaling protagonists GαGβγ, PKCα and PI3K-AKT are promising candidates as predictive molecular biomarkers and therapeutic targets in the management of clinical BC in EMT.

La formation des métastases est un processus en plusieurs étapes à travers lequel les cellules néoplasiques se détachent de la tumeur primaire pour constituer des tumeurs secondaires à distance. Les capacités à migrer et à envahir, des cellules tumorales sont cruciales dans la cascade métastatique. Selon le type cellulaire et les stimuli présents dans le microenvironnement tumoral, les cellules peuvent se déplacer collectivement ou individuellement selon un programme de migration mésenchymateuse ou amiboïde. Différentes voies de signalisation sont liées à la régulation de la motilité cellulaire. Les GTPases Rho (Rac1, Cdc42 et RhoA) contrôlent la migration en régulant la dynamique du cytosquelette d’actine, la contraction acto-myosine et les microtubules. Rac1 régule la motilité mésenchymateuse en favorisant la formation des lamellipodes via un complexe multiprotéique, le « Wave Regulatory Complex (WRC) » et RhoA contrôle la motilité amiboïde en favorisant la contraction du cytosquelette d'acto-myosine. Les protéines Ral (RalA et RalB) appartenant à une autre famille de petites G, ont été récemment impliquées dans la régulation de la migration cellulaire. RalB, à travers le complexe « Exocyst » joue un rôle essentiel dans la motilité. Dans ce travail de thèse, nous avons étudié les mécanismes moléculaires par lesquels la voie RalB/Exocyste contrôle la motilité et l'invasion cellulaire. La première partie de ce travail démontre que l’Exocyste interagit avec SH3BP1, une protéine GAP (GTPase Activating Protein) (projet 1). Nous montrons que l’interaction entre SH3BP1 et Rac1 est nécessaire à l’activité de Rac1 au front de migration. Dans le projet 2, nous montrons que l’Exocyste interagit directement avec WRC, ce qui est un élément clé de la polymérisation de l'actine. Cette interaction est nécessaire à la localisation du complexe WRC au front de migration où il contrôle la formation de protrusions membranaires. Dans de nombreux carcinomes, la transition épithélio-mésenchymateuse (EMT) joue un rôle important dans la promotion de la migration, l’invasion et la formation des métastases. Le projet 3 a permis de mieux caractériser la plasticité de migration et l’invasion des cellules cancéreuses post-EMT et d’étudier la contribution de Ral dans l'invasion des cellules post-EMT. Nous montrons qu’après l’EMT les cellules envahissent la matrice individuellement ? en utilisant la contraction du cytosquelette d'acto-myosine. Nous montrons que RalB est nécessaire à l’invasion des cellules post-EMT, et à la contractilité cellulaire. Nous proposons que le rôle de RalB dans l'invasion passe par GEF-H1 qui est une protéine GEF (Guanine Nucleotide Exchange Factor) de Rho associée à l’Exocyste. Dans la dernière partie de ce manuscrit, nous présentons le logiciel « AVeMap » que nous avons développé afin d’automatiser la quantification des paramètres de la migration cellulaire.En résumé, dans ce travail de thèse nous montrons que la voie Ral/Exocyste est un organisateur moléculaire nécessaire à l’exécution à la fois de la motilité cellulaire contrôlée par Rac1 et à la motilité contrôlée par Rho. / Metastasis is a multistep process by which cancer cells migrate away from the primary neoplastic mass to give rise to secondary tumors at distant sites. Thus, the acquisition of motility and invasive traits by tumor cells is a crucial step for metastasis to occur. Depending on the cell type and the environment, cells can move collectively keeping stable cell-cell contacts or as individual cells, which translocate by exploiting either mesenchymal or amoeboid motility programs.Different molecules and pathways have been linked to the regulation of cell motility. Rho small GTPases (Rac1, Cdc42 and RhoA) control cell migration through their actions on actin assembly, actomyosin contractility and microtubules. Rac1 drives mesenchymal-type motility by promoting lamellipodia formation via the Wave Regulator Complex (WRC). On the contrary, amoeboid motility is governed by RhoA which promotes cell movement via the generation of actomyosin contractile force. Another family of small GTPases, the Ral proteins, was recently involved in the regulation of cell migration. RalB, through the mobilization of its main effector the Exocyst complex, was shown to play an essential role in cell motility. In this work of thesis we investigated the molecular mechanisms through which RalB/Exocyst pathway controls cell motility and invasion.In the first part of this manuscript we show that Exocyst interacts with the RacGAP SH3BP1 (project 1). In mesenchymal moving cells Exocyst/SH3BP1 interaction is required to organize membrane protrusion formation by spatially regulating the activity of Rac1 at the cellular front. In addition, in project 2, we show that the Exocyst binds to the wave regulator complex (WRC), a key promoter of actin polymerization. We provide evidences for Exocyst to be involved in driving the WRC to the leading edge of motile cells, where it can stimulate actin polymerization and membrane protrusions. Reactivation of a developmental program termed epithelial-mesenchymal transition (EMT) was recently shown to promote motility, invasion and metastasis of neoplastic cells. Tumor cells undergoing EMT loose cell-cell contacts acquire a fibroblastoid phenotype and invade the surrounding tissues as individual cells. In project 3 we characterized the invasion plasticity of cancer cells after EMT and we investigated the molecular contribution of Ral to post-EMT invasion. We showed that upon EMT cells disseminate individually in a Rho-driven fashion exploiting the generation of actomyosin force to deform the extracellular matrix. We document that RalB silencing severely impairs actomyosin contractility and dissemination of post-EMT cells. We hypothesize that RalB regulates invasion by controlling the dynamics of the Rho pathway via the Exocyst-associated RhoGEF GEF-H1 in post-EMT cells. Finally, in the last part of this thesis manuscript, we present the PIV-based “AVeMap” software which has been developed to quantify in a fully automated way cell migration and its parameters (Project 4).Taken together the results presented in this thesis manuscript point out the Ral/Exocyst pathway as a key molecular organizer of the execution of both Rac1- and Rho-driven motility programs.

L’immunologie anti-tumorale et l’immunothérapie ont connu dernièrement de grandes avancées avec la mise en évidence du processus d’immuno-surveillance et le développement de plusieurs approches vaccinales. Il n’en demeure pas moins que l’induction d’une réponse immunitaire anti-tumorale se traduit peu par l’éradication de la tumeur. Comme phénomène dynamique et interactif, la réponse cytotoxique anti-tumorale implique les effecteurs cytotoxiques et les cibles tumorales; pourtant, le microenvironnement tumoral et sa plasticité influent largement sur l’efficacité de celle-là. Avec l’appui de récentes données expérimentales, il apparaît crucial de prendre en compte la susceptibilité tumorale à la lyse par les effecteurs cytotoxiques anti-tumoraux, notamment les lymphocytes T cytotoxiques (CTLs), et plus particulièrement dans un contexte de plasticité cellulaire. Ainsi, le principal objectif de mes travaux de thèse est de saisir le rôle de la Transition Épithélio-Mésenchymateuse (EMT) dans la susceptibilité des cellules tumorales à la lyse par les CTLs dans des modèles cellulaires de cancer du sein. Nos résultats montrent que l’EMT est capable d’induire une diminution de la susceptibilité des cellules mésenchymateuses à la lyse spécifique. Elle engage de ce fait de multiples acteurs. Tout d’abord, dans les deux modèles d’étude, il s’avère que l’EMT est capable de réguler négativement l’expression de la molécule HLA-A2. Ensuite, dans le premier modèle expérimental, nous avons établi que l’EMT induit une altération de la signalisation au niveau de la synapse immunologique. De plus, le régulateur de l’autophagie, Becline 1, joue un rôle crucial dans l’induction de la diminution de la sensibilité à la lyse par les lymphocytes T-CD8+ suite à l’induction de l’EMT. Dans le deuxième modèle d’étude, le mécanisme mis en jeu par l’EMT pour réguler la susceptibilité des cellules mésenchymateuses à la lyse par les CTLs se manifeste dans l’induction du facteur de transcription inducteur des propriétés de cellules souches cancéreuses, le KLF4 ainsi que via la régulation négative de l’expression du miR-7. Ensemble, ces résultats élucident de nouveaux mécanismes d’échappement des cellules tumorales malignes à la lyse par les lymphocytes T-CD8+ suite à l’induction de l’EMT. Cette étude soutient ainsi l’importance du ciblage des facteurs de transcription inducteurs de l’EMT et responsables de la plasticité cellulaire afin de neutraliser leur fonction. Cela pourrait aider à construire une nouvelle stratégie pour mieux contrôler l’échappement des cellules tumorales invasives à la lyse spécifique et in fine pour garantir une immunothérapie plus efficace contre le cancer. / The anti-tumor immunology and immunotherapy have recently undergone major breakthroughs, with the identification of immune surveillance process and the development of several vaccine approaches. However, the fact remains that the induction of an antitumor immune response is still not effective enough. Certainly, the antitumor cytotoxic response is a dynamic and interactive phenomenon, involving cytotoxic effectors and tumor targets, but its effectiveness is considerably influenced by the tumor microenvironment and its plasticity. Recent studies support the importance of taking into account the tumor susceptibility to lysis by anti-tumor cytotoxic effectors, notably Cytotoxic T Lymphocytes (CTLs), especially in a context of cellular plasticity. On the grounds of these studies, this research aims at understanding the role of Epithelial to Mesenchymal Transition (EMT) in the susceptibility of tumor cells to CTLs mediated lysis in different models of breast cell carcinoma. Our results reveal that EMT is able to induce a decrease in the susceptibility of mesenchymal cells to specific lysis. It calls therefore multiple actors. First, in both study models, it turns out that the EMT is able to downregulate the expression of HLA-A2 molecule. Then, in the first experimental model, we show that EMT induces an alteration of signalling at the immunological synapse. Moreover, the regulator of autophagy, Beclin 1, plays a crucial role in the induction of reduced susceptibility to lysis by T-CD8+ lymphocytes following induction of EMT. In the second experimental model, we show that the mechanisms used by EMT to regulate the susceptibility of mesenchymal cells to lysis by CTLs involve the induction of the transcription factor inducing cancer stem cells properties, KLF4, as well as the downregulation of miR-7 expression. Together, these results shed light on new mechanisms used by malignant tumor cells to escape to lysis by T-CD8+ lymphocytes following the induction of EMT. Thus, this study advocates the importance of targeting transcription factors, which are inducers of EMT and responsible for cellular plasticity, in order to neutralize their function. These insights may prove useful for the development of new strategies aimed at better controlling the escape of invasive tumor cells to specific lysis, and ultimately ensuring a more effective immunotherapy against cancer.

Les cellules tumorales circulantes (CTCs) sont des cellules tumorales provenant de la tumeur primaire et/ou des métastases que l’on retrouve dans la circulation sanguine. Les plus agressives d’entre elles peuvent envahir les organes distants pour former des métastases. Leur faible nombre parmi la multitude de cellules sanguines rend difficile leurs détections et leurs études. C'est pourquoi, le challenge actuel est de pouvoir mettre en culture ces cellules.Dans le cadre de l’éude clinique nationale COLOSPOT, notre laboratoire a pu recueillir des échantillons de patients atteints d’un cancer colorectal métastatique. Grâce à ces prélèvements sanguins, 9 lignées dérivées de CTCs ont pu être établies : CTC-MCC-41, CTC-MCC-41.4, CTC-MCC-41.5A-G.Dans ce projet de thèse, les 9 lignées cellulaires ont été caractérisées au niveau du génome, du transcriptome, du protéome, du sécrétome et fonctionnel, et comparées à des lignées cellulaires tumorales primaires et métastatiques connues, comme effectuée précédemment sur la lignée CTC-MCC-41 (Cayrefourcq et al. 2015)Cette analyse très complète a montré malgré des profils génétiques très différents, toutes les lignées CTCs ont les caractéristiques d’un phénotype intermédiaire épithélial/mésenchymal, des propriétés de cellules souches, la mutation BRAFV600E et la capacité d’éviter divers processus de lutte contre les cellules tumorales comme la résistance à l’anoïkis et l’échappement au système immunitaire. Les études fonctionnelles ont montré que les CTC-MCC pouvaient induire rapidement la formation de tubes avec des cellules endothéliales in vitro, signe d'un potentiel angiogénique.La seconde partie de ce travail de thèse a été d’étudier la transition épithélio-mésenchymateuse (EMT) in vitro. Ce phénomène est une étape clé du processus métastatique des CTCs et implique diverses transformations des cellules à divers niveaux : morphologique, protéique et transcriptomique. Trois méthodes différentes ont été testées pour induire l’EMT au sein des lignées CTCs impliquant deux différents modes d’induction et deux modes de culture. Ces changements ont pu être observés dans les lignées témoins, validant les expérimentations effectuées. Cependant, l’EMT n’a pas été clairement observée sur les lignées CTCs.En conclusion, ces analyses suggèrent que les CTC coliques cultivés à partir de biopsies liquides séquentielles, effectuée durant le traitement d’un même patient, ont des caractéristiques communes. Mais la sélection des clones, avec un phénotype distinct, résistant au traitement, a été observée. D'autres études avec ces lignées CTC-MCC sont en cours, évaluant leur capacité à induire des tumeurs résistantes à des médicaments spécifiques ou à analyser la contribution épigénétique. Ces données peuvent fournir des indications pour la découverte de nouveaux biomarqueurs permettant d'identifier les sous-populations de CTC les plus agressives et pour la mise au point de nouveaux médicaments pour inhiber les CTCs initiatrices de métastases dans le cancer du côlon. / Circulating tumor cells (CTCs) are tumor cells that have been shed from the primary tumor and/or metastases into the bloodstream. The most aggressive ones can invade distant organs to form metastases. Their low number among the multitude of blood cells makes difficult their detection and study. This is why the current challenge in this field of expertise is to be able to culture them ex vivo.In the national COLOSPOT clinical study, our team was able to collect samples of patients with metastatic colorectal cancer. From blood samples of only one patient, 9 cancer cell lines derived from CTCs could be established: CTC-MCC-41, CTC-MCC-41.4, CTC-MCC-41.5A-G.In this project, the 9 CTC-MCC lines have been characterized at the genome, transcriptome, proteome, secretome and functional levels, and compared with primary and metastatic commercial colon cancer cell lines, as previously done on the CTC-MCC-41 line (Cayrefourcq et al., Cancer Res. 2015)These analyses have shown that despite their very different genetic profiles, all CTCs have the characteristics of an epithelial/mesenchymal intermediate phenotype, stemcell like characteristics, with BRAFV600E mutation, and the ability to avoid biological processes such as the resistance to anoïkis and the escape to the immune system. Moreover, functional studies have shown that all CTC-MCC lines can rapidly induce tubes formation with endothelial cells in vitro, a sign of an angiogenic potential.The second part of this thesis work was to study the epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) in vitro. This phenomenon is a key step in the metastatic process and involves several cell transformations at various levels: morphological, proteomic and transcriptomic. Three different methods have been tested to induce EMT within these CTC-MCC lines involving two different induction and culture modes. These changes could be observed in the control lines, validating the experiments carried out. However, EMT has not been clearly observed yet on the CTC-MCC lines.In conclusion, this longitudinal study suggest that colorectal CTCs cultured from sequential liquid biopsies, performed during treatment of the same patient, have common characteristics. However, our results strongly suggest that no clonal selection, with a distinct phenotype, resistant to treatment, has occurred. Further studies with these CTC-MCC lineages are in process, evaluating their ability to induce in vivo drug-resistant tumors or to analyze the epigenetic contribution. These data may provide guidance for the discovery of new biomarkers to identify the most aggressive CTC subpopulations and for the development of novel drugs to inhibit metastases-competent CTCs in colon cancer.

Les facteurs de transcription inducteurs de la transition épithélio-mésenchymateuse (EMT) sont fréquemment réactivés de manière aberrante dans de nombreux cancers. Dans les carcinomes, ils favorisent dans les étapes précoces le développement tumoral en inhibant les systèmes de sauvegarde tels que la sénescence ou l'apoptose et à terme dans les étapes finales, promeuvent la formation de métastases. Dans le cadre du mélanome nous avons mis en évidence des fonctions antagonistes de ces facteurs : il était connu que ZEB2 et SNAIL2 sont impliqués dans la délamination de la crête neurale et la détermination mélanocytaire mais de manière inattendue ZEB2 et SNAIL2 sont aussi exprimés dans les mélanocytes adultes normaux et leur expression est diminuée au cours de la progression maligne, au profit des facteurs ZEB1 et TWIST1. Ce changement de profil d'expression est un facteur de mauvais pronostic pour les patients. Mes travaux ont permis de montrer que cet effet antagoniste passe par la régulation de MITF, le facteur clef du développement mélanocytaire. ZEB2 et SNAIL2 exercent une fonction oncosuppressive en activant l'expression de MITF et en promouvant la différenciation mélanocytaire. Au contraire, ZEB1 et TWIST1 jouent un rôle oncogénique en inhibant MITF et favorisent l'acquisition de propriétés de cellules souches. J'ai poursuivi l'étude de la fonction oncogénique de Twist1 in vivo dans un modèle murin de mélanome induit par l'oncogène BRAFV600. J'ai ainsi mis en évidence que l'expression conjointe de Twist1 et de BRAFV600 entraîne la formation de mélanomes agressifs, dédifférenciés et invasifs. Enfin, j'ai analysé et caractérisé l'implication de ces facteurs dans le processus de résistance aux thérapies ciblées anti-BRAF dans les mélanomes BRAFV600E. J'ai démontré que ZEB1 peut contribuer à la résistance aux inhibiteurs de BRAF. En effet, l'expression de ZEB1 est augmentée dans des cellules de mélanomes résistantes (innée ou acquise), par rapport aux cellules sensibles. Tandis que l'expression de ZEB1 favorise l'émergence de cellules résistantes, cibler ZEB1 augmente la sensibilité des cellules à l'inhibiteur de BRAF et resensibilise les cellules résistantes, mettant en évidence l'intérêt de cette combinaison d'un point de vue thérapeutique / Embryonic transcription factors inducers of Epithelial to Mesenchymal Transition (EMT-TFs) are frequently and aberrantly reactivated in many cancers. In carcinomas they promote, in early stage, tumor development by inhibiting the failsafe programs of the cell like senescence and apoptosis, and in final stages, they promote metastases formation. In melanoma we highlighted antagonist’s functions of these factors: it was known that ZEB2 and SNAIL2 were involved in delamination of neural crest cells and melanocytes determination but unexpectedly, ZEB2 and SNAIL2 are also expressed in normal adult melanocytes and their expression is decreased during malignant progression, for the benefit of ZEB1 and TWIST1 factors. This change in expression profiling is a factor of poor prognosis for patients. The results I provide show that this antagonistic effect might go through the regulation of MITF, the key factor in the development of melanocytic. ZEB2 and SNAIL2 exert an oncosuppressive function by activating the expression of MITF and promoting melanocytic differentiation. On the contrary, ZEB1 TWIST1 plays an oncogenic role in inhibiting MITF and promotes the acquisition of stem cells properties. In order to go deeper in the study of TWIST1 oncogenic functions, I used an in vivo Melanoma murine model induced by the BRAFV600 oncogene. I thus put in evidence that the combined expression of TWIST1 and BRAFV600 leads to the formation of aggressive, dedifferentiated and invasive melanoma. Finally, I analyzed and characterized the involvement of these factors in the process of resistance to targeted therapies against BRAFV600E melanomas. I demonstrated that ZEB1 may contribute to BRAF inhibitors resistance. Indeed, ZEB1 expression is increased in resistant (innate or acquired) melanomas cells, compared to sensitive cells. While ZEB1 expression promotes the emergence of resistant cells, targeting ZEB1 increases the sensitivity to BRAF inhibitor and sensitizes resistants cells, highlighting the interest of this combination from a therapeutic point of view

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Most animal cells adopt an approximately spherical shape when entering mitosis. This process has been termed mitotic rounding. It ensures the correct morphogenesis of the mitotic spindle and, in turn, successful cell division. When cells acquire a round shape at the entry of mitosis, they need to mechanically deform the surrounding tissue to do so. Previous studies suggest that the forces necessary for this deformation emerge from the contractility of the mitotic actin cortex. In fact, at the onset of mitosis, cortical contractility was found to be upregulated giving rise to an increased cell surface tension which drives the mitotic cell into a spherical shape. In a growing tumor, an increasing cell density generates a compressive mechanical stress which would likely lead to an increasing mechanical obstacle for mitotic rounding. Indeed, mechanical confinement or external pressure have been shown to hamper cell proliferation in tumor spheroids. Thus, it has been hypothesized that the actin cortex of cancer cells exhibits oncogenic adaptations that allow for ongoing mitotic rounding and division inside tumors. In fact, it was shown that the human oncogene Ect2 contributes to mitotic rounding through RhoA activation and that Ras overexpression promotes mitotic rounding. Epithelial-mesenchymal transition (EMT) is a cellular transformation in which epithelial cells loose epithelial polarity and intercellular adhesiveness gaining migratory potential. EMT, a hallmark in cancer progression, is commonly linked to early steps in metastasis promoting cancer cell invasiveness. Moreover, EMT was connected to cancer stem cells and the outgrowth of secondary tumors, suggesting that EMT may also be important for cell proliferation in a tumor. In this work, I investigated the role of EMT in actin cortex mechanics and mitotic rounding. To assess cortex mechanics, I measured the mechanical properties of the actin cortex in mitosis, in particular cortical stiffness and contractility before and after EMT. Furthermore, I also determined the mechanical changes of the actin cortex of interphase cells upon EMT; mechanics of interphase cells may critically influence mitotic rounding as interphase cells are a major constituent of the surrounding of a mitotic cell which needs to be deformed in the process of rounding. For our cortex-mechanical measurements, I used an established dynamic cell confinement assay based on atomic force microscopy. I show striking cortex- mechanical changes upon EMT that are opposite in interphase and mitosis. They are accompanied by a strong change in the activity of the actomyosin master regulators Rac1 and RhoA. Concomitantly, I characterize cortex-mechanical changes induced by Rac1 and RhoA signaling. In particular, I show that Rac1 inhibition restores epithelial cortex mechanics in post-EMT cells. Furthermore, I give evidence that EMT, as well as Rac1 activity changes induce actual changes in mitotic rounding in spheroids embedded in mechanically confining, covalently crosslinked hydrogels. Overall, I give evidence that EMT-induced changes results in a softer and less contractile cortex in interphase and a stiffer and more contractile cortex in mitotic cells, and it correlates with increased proliferation in confined environment.:Summary Zusammenfassung Acknowledgements 1-Introduction 1.1-The actin cortex 1.1.1-Regulation of actin cortex polymerization 1.1.2-Rho-GTPases in actin cortex regulation 1.1.3-The actin cortex in cell shape regulation and mitotic rounding 1.1.4-Experimental approaches to measure actin cortex mechanics 1.1.5-AFM cell confinement assay – a new tool for actin cortex-mechanical measurements 1.2-Epithelial-mesenchymal transition in cancer progression and metastasis 1.2.1-EMT effects on cell proliferation 1.2.2-EMT effects on Rho-GTPases activities 1.2.3-EMT effects on transcription factors 1.3-Outline of the thesis 2-Pharmacological induction of EMT 3-Mechanical changes of actin cortex mechanics upon EMT 3.1-Cell volume change during AFM confinement 3.2-Interphase and mitotic actin cortex mechanical changes upon EMT 3.3- Rho-GTPases activity changes upon EMT 4- Molecular perturbations of the cortex and their impact on cortex mechanics 5-Mitotic rounding in confined cell spheroids before and after EMT 5.1-The effect of cortex regulators on confined spheroids upon EMT 6-Time-dependence of actin cortex mechanics in breast epithelial cells 6.1-Rheology of actin cortex as a thin active film 6.2-Viscoelasticity of the actin cortex in relation to malignancy 7-Discussion 8-Outlook 8.1-Mitosis duration and quiescence in confined spheroids 8.2-Signalling cascades that trigger EMT-induced cortex-mechanical phenotype 8.2-Membrane tension upon EMT 9-Bibliography 10-Appendix 10.1-Abbreviations 10.2-Symbols / Die meisten tierischen Zellen nehmen beim Eintritt in die Mitose eine annähernd kugelförmige Form an. Dieser Vorgang wird als mitotische Aufrundung bezeichnet. Sie sorgt für die korrekte Morphogenese der mitotischen Spindel und damit für eine erfolgreiche Zellteilung. Wenn Zellen beim Eintritt der Mitose eine runde Form annehmen, müssen sie das umgebende Gewebe mechanisch verformen. Frühere Studien legen nahe, dass die für diese Verformung erforderlichen Kräfte aus der Kontraktilität des mitotischen Aktin-Cortexes resultieren; zu Beginn der Mitose führt ein Anstieg der kortikalen Kontraktilität zu einer erhöhten Zelloberflächenspannung, die die mitotische Zelle in eine kugelförmige Form treibt. Bei einem wachsenden Tumor erzeugt eine zunehmende Zelldichte einen Kompressionsdruck, der vermutlich ein zunehmendes mechanisches Hindernis für die mitotische Aufrundung darstellt. Es wurde gezeigt, dass mechanische Begrenzung oder äußerer Druck die Zellproliferation in Tumorsphäroiden hemmen. Es wurde daher die Hypothese aufgestellt, dass der Aktinkortex von Krebszellen onkogene Anpassungen aufweist, die eine fortlaufende mitotische Aufrundung und Zellteilung innerhalb von Tumoren ermöglichen. Weiterhin wurde gezeigt, dass das humane Onkogen Ect2 durch RhoA-Aktivierung zur mitotischen Aufrundung beiträgt und dass die Überexpression von Ras die mitotische Aufrundung fördert. Die epithelial-mesenchymale Transition (EMT) ist eine zelluläre Transformation, bei der Epithelzellen die epitheliale Polarität und die interzelluläre Adhäsivität verlieren und Migrationspotential gewinnen. EMT, ein Kennzeichen für das Fortschreiten von Krebs, ist häufig mit frühen Schritten der Metastasierung und einer Steigerung der Invasivität von Krebszellen verbunden. Darüber hinaus wird die EMT mit Krebsstammzellen und der Entstehung von Sekundärtumoren in Verbindung gebracht, was darauf hindeutet, dass die EMT auch für die Zellproliferation in einem Tumor wichtig sein könnte. In dieser Arbeit wurde die Bedeutung der EMT für die Mechanik des Aktinkortex und die mitotische Aufrundung untersucht. Die mechanischen Eigenschaften des Zellkortexes, insbesondere die kortikale Steifheit und Kontraktilität, wurden in mitotischen und nicht-adhärenten Interphasezellen gemessen vor und nach der EMT. Die Mechanik von Interphasenzellen kann die mitotische Aufrundung entscheidend beeinflussen, da Interphasenzellen ein Hauptbestandteil der Umgebung einer mitotischen Zelle sind, die während des Aufrundungsprozesses deformiert werden muss. Für meine kortexmechanischen Messungen verwendete ich einen etablierten Assay, der auf Rasterkraftmikroskopie basiert. Ich konnte ausgeprägte kortexmechanische Veränderungen durch die EMT feststellen, die in Interphase und Mitose entgegengesetzt sind. Diese kortikalen Veränderungen gehen mit einer starken Modifikation der Aktivitäten der Actomyosin-Hauptregulatoren Rac1 und RhoA einher. Weiterhin konnte ich kortexmechanische Veränderungen charakterisieren, die durch Rac1- und RhoA- Signale induziert werden. Insbesondere zeige ich, dass die Rac1-Hemmung die epitheliale Kortexmechanik in Post-EMT-Zellen wiederherstellt. Darüber hinaus fand ich Hinweise darauf, dass EMT- und Rac1-Aktivitätsänderungen zu einer Änderung der mitotischen Aufrundung in eingebetteten Sphäroiden führen. Insgesamt zeigen die Daten in dieser Arbeit klare Hinweise darauf, dass EMT-induzierte Veränderungen zu einem weicheren und weniger kontraktilen Kortex in der Interphase und einem steiferen und kontraktileren Kortex in mitotischen Zellen führen und mit einer erhöhten Proliferation in mechanisch begrenzten Zellumgebungen korrelieren.:Summary Zusammenfassung Acknowledgements 1-Introduction 1.1-The actin cortex 1.1.1-Regulation of actin cortex polymerization 1.1.2-Rho-GTPases in actin cortex regulation 1.1.3-The actin cortex in cell shape regulation and mitotic rounding 1.1.4-Experimental approaches to measure actin cortex mechanics 1.1.5-AFM cell confinement assay – a new tool for actin cortex-mechanical measurements 1.2-Epithelial-mesenchymal transition in cancer progression and metastasis 1.2.1-EMT effects on cell proliferation 1.2.2-EMT effects on Rho-GTPases activities 1.2.3-EMT effects on transcription factors 1.3-Outline of the thesis 2-Pharmacological induction of EMT 3-Mechanical changes of actin cortex mechanics upon EMT 3.1-Cell volume change during AFM confinement 3.2-Interphase and mitotic actin cortex mechanical changes upon EMT 3.3- Rho-GTPases activity changes upon EMT 4- Molecular perturbations of the cortex and their impact on cortex mechanics 5-Mitotic rounding in confined cell spheroids before and after EMT 5.1-The effect of cortex regulators on confined spheroids upon EMT 6-Time-dependence of actin cortex mechanics in breast epithelial cells 6.1-Rheology of actin cortex as a thin active film 6.2-Viscoelasticity of the actin cortex in relation to malignancy 7-Discussion 8-Outlook 8.1-Mitosis duration and quiescence in confined spheroids 8.2-Signalling cascades that trigger EMT-induced cortex-mechanical phenotype 8.2-Membrane tension upon EMT 9-Bibliography 10-Appendix 10.1-Abbreviations 10.2-Symbols