CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / O monitoramento da sensibilidade antifÃngica em espÃcies de Candida de origem veterinÃria à uma prÃtica recente e os mecanismos envolvidos ainda nÃo foram completamente elucidados. Considerando que o arsenal de drogas antifÃngicas à limitado e que o fenÃmeno de resistÃncia tem se tornado mais freqÃente, a compreensÃo deste fenÃmeno e a busca por alternativas terapÃuticas se fazem necessÃrias. Dessa forma, o presente trabalho teve como objetivo monitorar a sensibilidade in vitro de Candida spp. oriundas de animais, com Ãnfase na resistÃncia aos azÃlicos mediada por bombas de efluxo e na avaliaÃÃo da atividade do imidazÃlico levamisol sobre o crescimento destas leveduras. Para tanto, em um primeiro momento, foram avaliados 126 isolados de Candida, sendo 19 C. albicans, 17 C. famata, 5 C. guilliermondii, 8 C. krusei, 29 C. parapsilosis, 48 C. tropicalis, dos quais 22 foram isolados de rapinantes, 32 de periquitos do sertÃo, 56 de papagaios, 7 de araras canindà e 3 de um ouriÃo-cacheiro. Todas as cepas foram submetidas ao teste de microdiluiÃÃo em caldo, ante a anfotericina B, itraconazol, fluconazol, segundo metodologia padronizada pelo Clinical Laboratory Standards Institute (documento M27-A3). As concentraÃÃes inibitÃrias mÃnimas (CIMs) variaram de 0,03125 a 2 Âg/mL, 0,125 a 250 Âg/mL e de 0,03125 a 125 Âg/mL para anfotericina B, fluconazol e itraconazol, respectivamente. Dos 126 isolados avaliados por microdiluiÃÃo, 33 (26,2%) foram resistentes aos azÃlicos, sendo 7 (5,6%) resistentes somente a fluconazol, 1 (0.8%) resistente somente ao itraconazol e 24 (19%) resistentes a ambas as drogas. Em um segundo momento, todas estas cepas resistentes aos derivados azÃlicos, mais 20 C. albicans e 3 C. tropicalis resgatadas da nossa coleÃÃo de leveduras resistentes de origem veterinÃria, foram submetidas ao teste de inibiÃÃo de bomba de efluxo com prometazina, perfazendo um total de 56 cepas resistentes a azÃlicos. Dessa forma, as CIMs de fluconazol e itraconazol sofreram reduÃÃes significativas de 2 a 250 e de 16 a 4000 vezes, respectivamente. Investigou-se, ainda, a atividade antifÃngica do levamisol contra 12 C. albicans, 12 C. krusei, 12 C. parapsilosis e 12 C. tropicalis, sendo obtidas CIMs e concentraÃÃes fungicidas mÃnimas que variaram de 0,58 a 2,34 mg/mL e de 2,34 a 9,37 mg/mL, respectivamente. Paralelamente, foi demonstrado que o levamisol inibe a formaÃÃo do biofilme de C. albicans e C. tropicalis, bem como interfere na manutenÃÃo do biofilme maduro. Os dados apontam que a resistÃncia aos derivados azÃlicos Ã, pelo menos em parte, mediada por bombas de efluxo, bem como demonstram o potencial antifÃngico do imidazÃlico levamisol e sua capacidade de inibir o biofilme de cepas de Candida spp. oriundas de animais. / Monitoring of the antifungal susceptibility of Candida species from veterinary sources is a recent practice and the mechanisms involved in antifungal resistance have not been completely elucidated. Considering that the antifungal arsenal is limited and that antifungal resistance has become more frequent, the comprehension of this phenomenon and the pursuit for therapeutic alternatives are necessary. Thus, the present work aimed at monitoring the in vitro susceptibility of Candida spp. isolated from animals, with emphasis on efflux pump-mediated azole resistance and on the evaluation of the effect of the imidazole levamisole on the growth of these yeasts. For such, in a first approach, 126 Candida isolates (19 C. albicans, 17 C. famata, 5 C. guilliermondii, 8 C. krusei, 29 C. parapsilosis, 48 C. tropicalis), out of which 22 were recovered from raptors, 32 from cactus parakeets, 56 from Amazon parrots, 7 from blue-and-gold macaws and 3 from a Brazilian porcupine. All isolates were submitted to broth microdilution test against amphotericin B, itraconazole and fluconazole, according to the methodology recommended by the Clinical Laboratory Standards Institute (document M27-A3). The MICs ranged from 0.03125 to 2 Âg/mL, 0.125 to 250 Âg/mL and 0.03125 to 125 Âg/mL for amphotericin B, fluconazole and itraconazole, respectively. Out of 126 evaluated isolates, 33 (26.2%) were resistant to azoles, with 7 (5.6%) isolates resistant to fluconazole, 1 (0.8%) isolate resistant to itraconazole and 24 (19%) resistant to both drugs. In a second approach, all these azole resistant isolates, plus 20 C. albicans and 3 C. tropicalis that were recovered from our collection of resistant yeasts from veterinary sources, were submitted to the efflux pump inhibition assay with promethazine, with a total of 56 azole resistant isolates. Thus, MICs for fluconazole and itraconazole significantly reduced from 2 to 250 times for fluconazole and from 16 to 4000 times for itraconazole. The antifungal activity of levamisole against 12 C. albicans, 12 C. krusei, 12 C. parapsilosis and 12 C. tropicalis, was also evaluated, and MICs and minimum fungicidal concentrations varying from 0.58 to 2.34 mg/mL and from 2.34 to 9.37 mg/mL were obtained, respectively. Parallelly, it was demonstrated that levamisole significantly inhibits biofilm formation and interferes with the maintenance of mature biofilms. These data show that azole resistance is partially mediated by efflux-pumps and demonstrate the antifungal potential of the imidazole levamisole and its capacity of inhibiting the biofilm of strains of Candida spp. from animals.

Made available in DSpace on 2014-08-20T13:32:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dissertacao_carolina_felix.pdf: 7826200 bytes, checksum: 4432d1e031f9b3b4bdbc3946dbb901e0 (MD5) Previous issue date: 2013-08-28 / Transport proteins related to drug efflux play an important role not only in the acquisition of drug-resistant phenotypes, but also in virulence of M. tuberculosis. The main objective of this study was to analyze the regulation of genes encoding the protein Rv1258c Tap considering the expression of genes Rv1255c and Rv1257c. RNA was extracted from cultures of M. bovis BCG overexpressing Rv1255c and Rv1257c, as well as a control strain containing the vector pVV16, and qRT-PCR of the Rv1258c gene was performed. RT-PCR was performed using RNA isolated previously from M. tuberculosis CDC1551, in order to verify that Rv1255c, Rv1256c, Rv1257c and Rv1258c genes are all connected to a transcript. The strain M. bovis BCG, expressing a red fluorescent protein under control of the promoter Rv1258c (pVVTapPro) was grown in the presence of streptomycin and glycine to verify the induction of the promoter. The qRT-PCR showed a downregulation of the gene in the strain overexpressing Rv1258c and Rv1257c, but no difference was observed in the strain overexpressing Rv1255c compared with the control. An increase in fluorescence was observed in the strain containing the promoter of the tap in the presence of 1 mg/L of streptomycin in comparison with the control. A two-fold induction of gene Tap was also observed in the presence of 1.6 mM glycine. The results suggest a role for Rv1257c in the regulation Tap expression. Moreover, the induction of Tap by streptomycin supports the importance of this protein in multidrugresistant M. tuberculosis. The effect of glycine on Tap promoter suggest a physiological role in cellular detoxification for this efflux pump. In conclusion, this study reinforces the need to obtain a deeper knowledge about the Tap protein operon and its regulation, in order to assist in the development of inhibitors of this efflux pump and possibly other mechanisms of induced resistance. / Proteínas transportadoras relacionada ao efluxo de drogas desempenham um papel importante não só na aquisição de fenótipos resistentes aos fármacos, mas também na virulência de M. tuberculosis. O principal objetivo deste estudo foi analisar a regulação do gene Rv1258c codificador da proteína Tap considerando a expressão dos genes Rv1255c e Rv1257c. RNA foi extraído a partir de culturas de M. bovis BCG superexpressando Rv1255c e Rv1257c, bem como de uma cepa controle contendo o vector pVV16 realizando o qRT-PCR do gene Rv1258c. RT-PCR foi realizada com RNA previamente isolado de M. tuberculosis CDC1551, a fim de verificar se o Rv1255c, Rv1256c, Rv1257c e Rv1258c genes estão todos ligados em um transcrito. A cepa M. bovis BCG, expressando uma proteína fluorescente vermelha sob o controle do promotor do Rv1258c (pVVTapPro) foi cultivado na presença de estreptomicina e glicina para verificar a indução deste promotor. O qRT-PCR demonstrou uma regulação negativa do gene Rv1258c na cepa sobre expressando Rv1257c, mas não foi observada diferença na cepa sobre expressando Rv1255c em comparação com o controle. Um aumento de fluorescência foi observada na cepa contendo o promotor da Tap na presença de 1 mg/L de estreptomicina, em comparação com o controle. Uma indução de duas vezes do gene Tap foi também observada na presença de glicina 1,6 mM. Os resultados sugerem um papel para o gene Rv1257c na regulação da expressão Tap. Além disso, a indução da Tap por estreptomicina apoia a importância desta proteína na multidroga-resistência de M. tuberculosis. O efeito da glicina no promotor da Tap sugere um papel fisiológico de detoxificação celular para essa bomba de efluxo. Em conclusão este estudo reforça a necessidade de se obter um conhecimento mais aprofundado a respeito do operon da proteína Tap e sua regulação, de maneira a auxiliar no desenvolvimento de inibidores dessa bomba de efluxo e possivelmente de outros mecanismos de resistência induzida.

P. aeruginosa e espécies de Acinetobacter são causas comuns de diversas infecções em pacientes hospitalizados, principalmente nos internados em centros de tratamento intensivo. Além disso, esses microrganismos se destacam por apresentarem resistência, intrínseca e adquirida, a várias classes de antibióticos, conferindo à bactéria fenótipos de multirresistência e panresistência. O objetivo deste estudo foi avaliar a participação de integrons (elementos genéticos que carreiam genes de resistência), de genes codificadores de metalo--lactamases, da perda de porinas (canais protéicos da membrana externa), e da atividade de efluxo aumentada, como determinantes do fenótipo de multirresistência e panresistência. Foram estudadas 147 P. aeruginosa e 57 Acinetobacter spp. isolados de pacientes hospitalizados no Hospital Universitário da Universidade Federal de Juiz de Fora, no período de 2003 a 2006. O perfil de sensibilidade destes isolados foi determinado por disco de difusão e utilizado para classificá-las como multirresistentes (MDR) e não multirresistentes (n-MDR). A variabilidade clonal dos isolados foi investigada por PFGE. Os isolados pertencentes aos grupos MDR e n-MDR foram investigados quanto a presença de integrons de classe 1, 2 e 3, por PCR e análise de RFLP. Os cassetes gênicos contidos nestes integrons, assim como genes codificadores de carbapenemases (ex. IMP, VIM e SPM), foram detectados por PCR e identificados por seqüenciamento. Avaliação da expressão gênica de bombas de efluxo (mexB, mexY, mexD e adeB) e de porina (OprD) foi conduzida por real-time RT-PCR. Os dados apresentados para os isolados do grupo MDR foram comparados àqueles do grupo n-MDR e a associação entre os determinantes de resistência e o fenótipo MDR foi calculada estatisticamente. Fenótipo de multiresistência foi observado em 42,2% e 84,2% das P. aeruginosa e Acinetobacter spp. estudadas. Nenhum isolado bacteriano apresentou fenótipo panresistente. Em 65 (44,2%) dos isolados de P. aeruginosa, foram detectados integrons de classe 1. Esses elementos apresentaram relação estatisticamente significativa com fenótipos MDR em P. aeruginosa. Entretanto, a maioria desses integrons não carreava nenhum cassete gênico (43/65) ou continham apenas cassetes gênicos de resistência a aminoglicosídeos (19/65). Entre os isolados de Acinetobacter spp., 11 (17,5%) apresentaram integrons de classe 1 e 30 (47,6%) integrons de classe 2. Apenas os últimos foram estatisticamente associados com fenótipos MDR. A pesquisa de metalo--lactamase (MBL) revelou a produção de enzimas SPM em 24 isolados de P. aeruginosa. Os estudos de expresão gênica demonstraram que, entre os sistemas de efluxo mais relatados para P. aeruginosa, MexXY-OprM foi o que mostrou maior diferença entre o nível de expressão dos grupos MDR e n-MDR, sugerindo que este sistema de efluxo desempenha importante papel no fenótipo MDR. Diminuição, em média de 66,4%, da produçãode OprD também foi um padrão encontrado nos isolados MDRem relação aos n-MDR. Dois grupos clonais de P. aeruginosa e dois de Acinetobacter spp. foram predominantes e tiveram relação com presença de integrons, produção de SPM-1 e com fenótipo MDR. Portanto, esse fenótipo pode ser consequência de acúmulo de determinantes de resistência em clones específicos. / The non-fermenting pathogenic bacteria Pseudomonas aeruginosa and Acinetobacter spp. are important causes of nosocomial infections. Theses species are often associated with a multidrug resistance (MDR) phenotype, due to intrinsic and acquired resistance genes. Some determinants of resistance, such as integrons, carbapenemases, overexpression of efflux systems and porins loss may be associated with the MDR phenotype. The aim of this study was to evaluate the association of non-MDR and MDR phenotypes in P. aeruginosa and Acinetobacter spp. to the presence of integrons and carbapenemases encoding genes, the overexpression of mexY, mexB, mexD and adeB genes and loss of the outer membrane protein, OprD. These resistance determinants were evaluated in 147 P. aeruginosa and 57 Acinetobacter spp., isolated from in-patients of University Hospital of UFJF. Isolates with different PFGE and non-susceptibility profiles were grouped according to MDR or non-MDR phenotypes. PCR and real-time RT-PCR were used to investigate the presence of class 1, 2 and 3 integrons and carbapenemase encoding genes and the expression of mexY, mexB, mexD and adeB efflux pumps and OprD porin, respectively. Class 1 integrons were one of the most common genetic elements present in MDR P. aeruginosa (44,2%), but the phenotype could not be attributed to these elements, since they showed empty (43/65) or only aminoglycoside gene cassettes (19/65). Class 2 integrons were the most common genetic elements in MDR Acinetobacter spp., and this association was statistically significant. SPM encoding gene was the only carbapenemase gene found in P. aeruginosa and, predominantly, in the PFGE cluster A. Expression of MexXY-OprM determined by real-time RT-PCR was the highest variable between MDR and non-MDR P. aeruginosa isolates (almost 10-fold). Reduction of 66.4% in OprD expression was observed in MDR P. aeruginosa, in comparison with non-MDR ones. It is concluded that the most important genetic determinants in the MDR phenotype of P. aeruginosa were SPM-1 production, followed by MexXY-OprM over expression and diminished production of OprD, while class 2 integrons was the most important genetic determinant of MDR phenotype in A. baumannii.

Os óxidos de colesterol modulam o desenvolvimento da aterosclerose por mediarem a síntese, captação e exportação de colesterol, além de inflamação e citotoxicidade na parede arterial. O exercício físico regular previne e regride a lesão aterosclerótica, por melhorar o perfil lipídico, transporte reverso de colesterol e defesas antioxidantes. A proteína cinase ativada por AMP (AMPK) é um importante mediador dos efeitos metabólicos do exercício físico. Em macrófagos, sua ativação vincula-se ao aumento no efluxo de colesterol e diminuição na captação de LDL. Entretanto, não está claro se o treinamento físico modula as concentrações de óxidos de colesterol, refletindo seu benefício sobre a prevenção da aterosclerose, e se esses efeitos podem ser mediados pela AMPK. O objetivo do presente estudo foi avaliar, em camundongos dislipidêmicos, o papel de 6 semanas de treinamento físico aeróbio sobre: o infiltrado de colesterol arterial e a distribuição de óxidos de colesterol no arco aórtico e no plasma; a expressão gênica de proteínas envolvidas na metabolização de óxidos de colesterol na parede arterial; e o efeito da ativação da AMPK em macrófagos, in vitro, sobre a concentração dos óxidos de colesterol e expressão de genes envolvidos na metabolização de óxidos de colesterol. Para tanto, camundongos machos knockout para apolipoproteína E, com 16 semanas de idade, alimentados com dieta padrão, foram incluídos no estudo. O treinamento físico foi realizado em esteira, 15 m/min, por 60 min, 5 dias/semana, durante 6 semanas. Lípides plasmáticos e glicose foram determinados por ensaio enzimático e glicosímetro, respectivamente, antes e após o treinamento físico. Colesterol arterial e óxidos de colesterol foram avaliados por cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massa. A expressão de genes envolvidos no metabolismo de lípides foi avaliada RT-qPCR. Os resultados foram comparados por ANOVA de um fator com pós-teste de Newman-Keuls ou teste t de Student. Peso corporal, colesterol total, TG, HDL-c, glicose e óxidos de colesterol no plasma foram semelhantes entre os grupos. O treinamento físico aumentou a concentração de 7alfa-OH C (70%) e reduziu a de colesterol (32%) na aorta. Além disso, o exercício físico aumentou a expressão gênica da Cyp27a1 (54%), Cd36 (75%), Cat (70%), Prkaa1 (AMPKalfa1) (40%) e Prkaa2 (AMPKalfa2) (51%) e reduziu Abcg1 (31%), Olr1 (LOX-1) (65%), Cyp7b1 (35%) e Ch25h (48%). Nenhuma alteração foi observada na expressão de Abca1, Nr1h3 (LXRalfa) e Nr1h2 (LXRbeta). Nos macrófagos, a ativação da AMPK por AICAR, reduziu o conteúdo de 7alfa-OH C após estimulo com HDL2. O tratamento com AICAR aumentou a expressão gênica de Abca1 (52%) e Cd36 (220%) e diminuiu Prkaa1 (19%) e Cyp27a1 (47%), e não alterou Abcg1, Nr1h3 e Nr1h2. Em conclusão, em camundongos dislipidêmicos, o treinamento físico aeróbio, por 6 semanas, aumentou a concentração de 7 beta -OH C, o que se vincula à maior expressão de Cd36 no arco aórtico. A rápida difusão de óxidos de colesterol, como via complementar ao transporte reverso de colesterol, pode também ser favorecida pelo aumento e redução, respectivamente, na expressão de Cyp27a1 e Cyp7b1, favorecendo maior liberação de 27-OH C das células. Juntamente com suas ações diretas que beneficiam o transporte reverso de colesterol, previamente descritas o treinamento físico diminui a concentração de colesterol na parede arterial, prevenindo a aterosclerose. Baseado nos ensaios in vitro a ativação da AMPK não parece contribuir para o aumento das concentrações de óxidos de colesterol após treinamento físico / Oxysterols modulate the development of atherosclerosis by mediating cholesterol synthesis, uptake and exportation as well as inflammation and cytotoxicity in the arterial wall. Regular physical exercise prevents and regresses atherosclerosis by improving lipid metabolism, reverse cholesterol transport and antioxidant defenses. AMP-activated protein kinase (AMPK) plays an important role in the beneficial metabolic adaptations of physical exercise. In macrophages, its activation is related to the enhancement in cholesterol efflux and reduction in LDL uptake. However, it is not clear whether exercise training benefits in atherosclerosis is mediated by its action in oxysterols concentrations, and whether this can be modulated by AMPK. The aim of this study was to evaluate the role of a 6-week aerobic exercise training program in dyslipidemic mice in the arterial and plasma accumulation of cholesterol and oxysterols subspecies; expression of genes related to oxysterols metabolisms in the aortic arch, and the effect of AMPK activation in macrophage on the concentration of oxysterols and expression of genes linked to oxysterols metabolism. Sixteen-week-old male apoE knockout mice fed a chow diet were included in the protocol. Animals were trained in a treadmill running, 15 m/min, 60 min, 5 days/week, during 6 weeks. Plasma lipids and glucose were determined by enzymatic techniques and glycosometer, respectively. Cholesterol in aortic arch and oxysterols were measured by gas chromatography/mass spectrometer. The expression of genes involved in lipid metabolism was determined by RT-qPCR. Results (mean ± SD) were compared by one-way ANOVA with Newman-Keuls posttest or Student\'s t-test. Body weight and plasma total cholesterol, TG, HDL-c, glucose, and oxysterols were similar among groups. The exercise training enhanced 7beta-hydroxycholesterol (70%) and reduced cholesterol (32%) in the aortic arch. In addition, exercise increased Cyp27a1 (54%), Cd36 (75%), cat (70%), Prkaa1 (AMPKalpha1) (40%) and Prkaa2 (AMPKalpha2) (51%) mRNA. No changes were observed in the expression of Abca1, Nr1h3 (LXRalpha) and Nr1h2 (LXRbeta). In macrophages, the activation of AMPK by AICAR, reduced 7beta-hydroxycholesterol level after stimulation by HDL2. Treatment with AICAR increased Abca1 (52%) and Cd36 (220%), decreased Prkaa1 (19%) e Cyp27a1 (47%), and did not change Abcg1, Nr1h3 e Nr1h2. In conclusion, in dyslipidemic mice aerobic exercise training increases the nonenzymatic-driven oxysterol, 7beta-hydroxycholesterol, which is related to the enhanced expression of Cd36. The rapid diffusion of oxysterols, as a complementary pathway for the reverse cholesterol transport, may also be favored by the increase and reduction of Cyp27a1 and Cyp7b1 expressions, respectively, which in turns favors 27-OH C desorption from cells. Together with its direct role in improving reverse cholesterol transport as previously reported, aerobic exercise training diminishes cholesterol accumulation in the arterial wall preventing atherosclerosis. Based on in vitro assays, the AMPK activation does not seem to contribute to the effect of exercise in increasing oxysterols

Os óxidos de colesterol modulam o desenvolvimento da aterosclerose por mediarem a síntese, captação e exportação de colesterol, além de inflamação e citotoxicidade na parede arterial. O exercício físico regular previne e regride a lesão aterosclerótica, por melhorar o perfil lipídico, transporte reverso de colesterol e defesas antioxidantes. A proteína cinase ativada por AMP (AMPK) é um importante mediador dos efeitos metabólicos do exercício físico. Em macrófagos, sua ativação vincula-se ao aumento no efluxo de colesterol e diminuição na captação de LDL. Entretanto, não está claro se o treinamento físico modula as concentrações de óxidos de colesterol, refletindo seu benefício sobre a prevenção da aterosclerose, e se esses efeitos podem ser mediados pela AMPK. O objetivo do presente estudo foi avaliar, em camundongos dislipidêmicos, o papel de 6 semanas de treinamento físico aeróbio sobre: o infiltrado de colesterol arterial e a distribuição de óxidos de colesterol no arco aórtico e no plasma; a expressão gênica de proteínas envolvidas na metabolização de óxidos de colesterol na parede arterial; e o efeito da ativação da AMPK em macrófagos, in vitro, sobre a concentração dos óxidos de colesterol e expressão de genes envolvidos na metabolização de óxidos de colesterol. Para tanto, camundongos machos knockout para apolipoproteína E, com 16 semanas de idade, alimentados com dieta padrão, foram incluídos no estudo. O treinamento físico foi realizado em esteira, 15 m/min, por 60 min, 5 dias/semana, durante 6 semanas. Lípides plasmáticos e glicose foram determinados por ensaio enzimático e glicosímetro, respectivamente, antes e após o treinamento físico. Colesterol arterial e óxidos de colesterol foram avaliados por cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massa. A expressão de genes envolvidos no metabolismo de lípides foi avaliada RT-qPCR. Os resultados foram comparados por ANOVA de um fator com pós-teste de Newman-Keuls ou teste t de Student. Peso corporal, colesterol total, TG, HDL-c, glicose e óxidos de colesterol no plasma foram semelhantes entre os grupos. O treinamento físico aumentou a concentração de 7alfa-OH C (70%) e reduziu a de colesterol (32%) na aorta. Além disso, o exercício físico aumentou a expressão gênica da Cyp27a1 (54%), Cd36 (75%), Cat (70%), Prkaa1 (AMPKalfa1) (40%) e Prkaa2 (AMPKalfa2) (51%) e reduziu Abcg1 (31%), Olr1 (LOX-1) (65%), Cyp7b1 (35%) e Ch25h (48%). Nenhuma alteração foi observada na expressão de Abca1, Nr1h3 (LXRalfa) e Nr1h2 (LXRbeta). Nos macrófagos, a ativação da AMPK por AICAR, reduziu o conteúdo de 7alfa-OH C após estimulo com HDL2. O tratamento com AICAR aumentou a expressão gênica de Abca1 (52%) e Cd36 (220%) e diminuiu Prkaa1 (19%) e Cyp27a1 (47%), e não alterou Abcg1, Nr1h3 e Nr1h2. Em conclusão, em camundongos dislipidêmicos, o treinamento físico aeróbio, por 6 semanas, aumentou a concentração de 7 beta -OH C, o que se vincula à maior expressão de Cd36 no arco aórtico. A rápida difusão de óxidos de colesterol, como via complementar ao transporte reverso de colesterol, pode também ser favorecida pelo aumento e redução, respectivamente, na expressão de Cyp27a1 e Cyp7b1, favorecendo maior liberação de 27-OH C das células. Juntamente com suas ações diretas que beneficiam o transporte reverso de colesterol, previamente descritas o treinamento físico diminui a concentração de colesterol na parede arterial, prevenindo a aterosclerose. Baseado nos ensaios in vitro a ativação da AMPK não parece contribuir para o aumento das concentrações de óxidos de colesterol após treinamento físico / Oxysterols modulate the development of atherosclerosis by mediating cholesterol synthesis, uptake and exportation as well as inflammation and cytotoxicity in the arterial wall. Regular physical exercise prevents and regresses atherosclerosis by improving lipid metabolism, reverse cholesterol transport and antioxidant defenses. AMP-activated protein kinase (AMPK) plays an important role in the beneficial metabolic adaptations of physical exercise. In macrophages, its activation is related to the enhancement in cholesterol efflux and reduction in LDL uptake. However, it is not clear whether exercise training benefits in atherosclerosis is mediated by its action in oxysterols concentrations, and whether this can be modulated by AMPK. The aim of this study was to evaluate the role of a 6-week aerobic exercise training program in dyslipidemic mice in the arterial and plasma accumulation of cholesterol and oxysterols subspecies; expression of genes related to oxysterols metabolisms in the aortic arch, and the effect of AMPK activation in macrophage on the concentration of oxysterols and expression of genes linked to oxysterols metabolism. Sixteen-week-old male apoE knockout mice fed a chow diet were included in the protocol. Animals were trained in a treadmill running, 15 m/min, 60 min, 5 days/week, during 6 weeks. Plasma lipids and glucose were determined by enzymatic techniques and glycosometer, respectively. Cholesterol in aortic arch and oxysterols were measured by gas chromatography/mass spectrometer. The expression of genes involved in lipid metabolism was determined by RT-qPCR. Results (mean ± SD) were compared by one-way ANOVA with Newman-Keuls posttest or Student\'s t-test. Body weight and plasma total cholesterol, TG, HDL-c, glucose, and oxysterols were similar among groups. The exercise training enhanced 7beta-hydroxycholesterol (70%) and reduced cholesterol (32%) in the aortic arch. In addition, exercise increased Cyp27a1 (54%), Cd36 (75%), cat (70%), Prkaa1 (AMPKalpha1) (40%) and Prkaa2 (AMPKalpha2) (51%) mRNA. No changes were observed in the expression of Abca1, Nr1h3 (LXRalpha) and Nr1h2 (LXRbeta). In macrophages, the activation of AMPK by AICAR, reduced 7beta-hydroxycholesterol level after stimulation by HDL2. Treatment with AICAR increased Abca1 (52%) and Cd36 (220%), decreased Prkaa1 (19%) e Cyp27a1 (47%), and did not change Abcg1, Nr1h3 e Nr1h2. In conclusion, in dyslipidemic mice aerobic exercise training increases the nonenzymatic-driven oxysterol, 7beta-hydroxycholesterol, which is related to the enhanced expression of Cd36. The rapid diffusion of oxysterols, as a complementary pathway for the reverse cholesterol transport, may also be favored by the increase and reduction of Cyp27a1 and Cyp7b1 expressions, respectively, which in turns favors 27-OH C desorption from cells. Together with its direct role in improving reverse cholesterol transport as previously reported, aerobic exercise training diminishes cholesterol accumulation in the arterial wall preventing atherosclerosis. Based on in vitro assays, the AMPK activation does not seem to contribute to the effect of exercise in increasing oxysterols

Submitted by Renata Lopes (renatasil82@gmail.com) on 2016-05-04T14:54:05Z No. of bitstreams: 1 vanessacordeirodias.pdf: 2034556 bytes, checksum: 89059620f1b31c4177f6ae487a15c672 (MD5) / Approved for entry into archive by Adriana Oliveira (adriana.oliveira@ufjf.edu.br) on 2016-06-07T15:33:46Z (GMT) No. of bitstreams: 1 vanessacordeirodias.pdf: 2034556 bytes, checksum: 89059620f1b31c4177f6ae487a15c672 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-06-07T15:33:46Z (GMT). No. of bitstreams: 1 vanessacordeirodias.pdf: 2034556 bytes, checksum: 89059620f1b31c4177f6ae487a15c672 (MD5) Previous issue date: 2015-12-18 / FAPEMIG - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais / As bactérias Gram-negativas não fermentadoras, como Pseudomonas aeruginosa e Acinetobacter baumannii, estão amplamente disseminadas no ambiente e estão cada vez mais associados a infecções nosocomiais graves. O uso extensivo e indiscriminado de antibióticos tem contribuído para um aumento do número de infecções causadas por A. baumannii e P. aeruginosa resistentes a uma grande variedade de agentes antimicrobianos, incluindo β-lactâmicos. O objetivo deste trabalho foi avaliar características fisiológicas e moleculares da resistência aos carbapenêmicos em P. aeruginosa e A. baumannii isolados em um hospital terciário. A partir de estudos com amostras clínicas de pacientes admitidos num hospital terciário foram isolados, em 2012, A. baumannii (n=44) e P. aeruginosa (n=28) resistentes aos carbapenêmicos e em 2013, P. aeruginosa (n=19) e A. baumannii (n=44) com igual fenótipo. As amostras bacterianas recuperadas em 2012 foram submetidas a testes de susceptibilidade aos antimicrobianos. Marcadores genéticos relacionados com a síntese de β-lactamases blaOXA-23, blaOXA-24, blaOXA-51, blaOXA-58 e blaOXA-143 foram testados por PCR. A partir das linhagens isoladas no estudo de 2013, testes fisiológicos foram realizados para avaliar a atividade hemolítica, estresse oxidativo, tolerância aos biocidas, formação de biofilme e determinação da resistência aos antimicrobianos. Marcadores genéticos relacionados com a síntese de β-lactamases (ampC, blaKPC, blaSIM, blaIMP, blaSPM-1, blaVIM, blaGIM, blaOXA e blaNDM-1), sistemas de efluxo (adeB, mexB, mexD, mexF e mexY) e perda de porina (oprD) foram pesquisados por PCR. Foram analisados dados epidemiológicos de todos os pacientes avaliados. No estudo de 2012, a polimixina B foi a única droga eficaz para todos os isolados. Os marcadores genéticos foram observados apenas em isolados de Acinetobacter. O genótipo mais frequente observado foi blaOXA-23+/blaOXA-51+ (45,5%), seguido por blaOXA-51+/blaOXA-143+ (41%). Os genes blaOXA-24 e blaOXA-58 não foram detectados. Uma elevada taxa de mortalidade foi observada (> 70%) entre os pacientes. No estudo de 2013, idade avançada, predomínio de indivíduos internados em UTI, uso de dispositivos médicos invasivos, como cateter venoso, tratamento anterior com fluoroquinolonas ou ß-lactâmicos em combinação com um inibidor da β-lactamase e estadia prolongada no hospital foram fatores predisponentes para infecção por estes microrganismos. Colistina demonstrou atividade, in vitro, contra todas as amostras bacterianas avaliadas. Tigeciclina foi também efetiva para linhagens de A. baumannii. P. aeruginosa resistente aos carbapenêmicos não foi capaz de produzir hemolisinas. Essas linhagens foram menos tolerantes ao estresse oxidativo e alguns biocidas, mas mostraram um aumento da capacidade de formação de biofilme em relação aos isolados sensíveis. Os principais mecanismos de resistência presentes em linhagens de A. baumannii resistentes aos carbapenêmicos foi síntese de oxacilinases (OXA-23, OXA-51 e OXA-143), ausência de oprD e presença de bomba de efluxo (AdeABC). Em P. aeruginosa foram encontrados genes para bombas de efluxo (MexAB-OprM, MexCD-OprJ, MexEF-OprN, MexXY-OprM), blaSPM-1, além de ausência de oprD. Estes resultados confirmam a dificuldade de manejo terapêutico de pacientes com infecções associadas a microrganismos multirresistentes, com impacto direto na mortalidade e controle epidemiológico dessas linhagens nos centros de saúde. / The non-fermenting Gram-negative bacteria, such as Pseudomonas aeruginosa and Acinetobacter baumannii are widespread in the environment and are increasingly associated with severe nosocomial infections. Extensive and indiscriminate use of antibiotics has contributed to an increased number of infections caused by A. baumannii and P. aeruginosa that are resistant to a wide variety of antimicrobials, including β-lactams. This study aimed to evaluate physiological and molecular characteristics of carbapenem resistance in P. aeruginosa and A. baumannii. From studies with clinical samples from patients admitted to a tertiary hospital, were isolated in 2012 A. baumannii (n=44) and P. aeruginosa (n=28) resistant to carbapenems and in 2013, P. aeruginosa (n=19) and A. baumannii (n=44) with similar phenotype. The bacterial samples recovered in 2012 were submitted to antibiotic susceptibility testing. Genetic markers related to β-lactamases synthesis blaOXA-23, blaOXA-24, blaOXA-51, blaOXA-58 and blaOXA-143 were screened by PCR. From strains recovered in the 2013 study, physiological tests were performed to evaluate hemolytic activity, oxidative stress, biocides tolerance and biofilm formation, besides determination of antimicrobial resistance patterns. Genetic markers related to β-lactamases synthesis (ampC, blaKPC, blaSIM, blaIMP, blaSPM-1, blaVIM, blaGIM, blaOXA and blaNDM-1), efflux systems (adeB, mexB, mexD, mexF and mexY) and loss of porin (oprD) were screened by PCR. Epidemiological data about all of these patients were analyzed. In the 2012 study, polymyxin B was the only effective drug for all isolates. Genetic markers were observed only in Acinetobacter isolates. The most frequent genotype observed was blaOXA-23+/blaOXA-51+ (45,5%), followed by blaOXA-51+/blaOXA-143+ (41%). The genes blaOXA-24 and blaOXA-58 were not detected. High mortality rate (> 70%) between the pacients was observed. In a prospective study, advanced age, predominance of individuals hospitalized in ICU, use of invasive medical devices, such as venous catheter, previous treatment with fluoroquinolones or β-lactams in combination with β-lactamase inhibitor and prolonged stay in hospital were predisposing factors for infection by these microorganisms. Colistin has shown activity, in vitro, against all assessed bacterial samples. Tigecycline was also effective for strains of A. baumannii. Carbapenem-resistant P. aeruginosa was not able to produce hemolysin. These strains were less tolerant to oxidative stress and some biocides, but they showed increased ability of biofilm formation in relation to susceptible isolates. The major mechanisms of carbapenems resistance present in A. baumannii strains was oxacilinases synthesis (OXA-23, OXA-51 and OXA-143), oprD absence and efflux pump presence (AdeABC). In P. aeruginosa was found genes encoding efflux pumps (MexAB-OprM, MexCD-OprJ, MexEF-OprN, MexXY-OprM) and blaSPM-1; besides oprD absence. These results confirm the difficulty of therapeutic management of patients with infections associated with multidrug resistant microorganisms, with direct impact on mortality and epidemiological control of multidrug-resistant strains in health centers.

P. aeruginosa e espécies de Acinetobacter são causas comuns de diversas infecções em pacientes hospitalizados, principalmente nos internados em centros de tratamento intensivo. Além disso, esses microrganismos se destacam por apresentarem resistência, intrínseca e adquirida, a várias classes de antibióticos, conferindo à bactéria fenótipos de multirresistência e panresistência. O objetivo deste estudo foi avaliar a participação de integrons (elementos genéticos que carreiam genes de resistência), de genes codificadores de metalo--lactamases, da perda de porinas (canais protéicos da membrana externa), e da atividade de efluxo aumentada, como determinantes do fenótipo de multirresistência e panresistência. Foram estudadas 147 P. aeruginosa e 57 Acinetobacter spp. isolados de pacientes hospitalizados no Hospital Universitário da Universidade Federal de Juiz de Fora, no período de 2003 a 2006. O perfil de sensibilidade destes isolados foi determinado por disco de difusão e utilizado para classificá-las como multirresistentes (MDR) e não multirresistentes (n-MDR). A variabilidade clonal dos isolados foi investigada por PFGE. Os isolados pertencentes aos grupos MDR e n-MDR foram investigados quanto a presença de integrons de classe 1, 2 e 3, por PCR e análise de RFLP. Os cassetes gênicos contidos nestes integrons, assim como genes codificadores de carbapenemases (ex. IMP, VIM e SPM), foram detectados por PCR e identificados por seqüenciamento. Avaliação da expressão gênica de bombas de efluxo (mexB, mexY, mexD e adeB) e de porina (OprD) foi conduzida por real-time RT-PCR. Os dados apresentados para os isolados do grupo MDR foram comparados àqueles do grupo n-MDR e a associação entre os determinantes de resistência e o fenótipo MDR foi calculada estatisticamente. Fenótipo de multiresistência foi observado em 42,2% e 84,2% das P. aeruginosa e Acinetobacter spp. estudadas. Nenhum isolado bacteriano apresentou fenótipo panresistente. Em 65 (44,2%) dos isolados de P. aeruginosa, foram detectados integrons de classe 1. Esses elementos apresentaram relação estatisticamente significativa com fenótipos MDR em P. aeruginosa. Entretanto, a maioria desses integrons não carreava nenhum cassete gênico (43/65) ou continham apenas cassetes gênicos de resistência a aminoglicosídeos (19/65). Entre os isolados de Acinetobacter spp., 11 (17,5%) apresentaram integrons de classe 1 e 30 (47,6%) integrons de classe 2. Apenas os últimos foram estatisticamente associados com fenótipos MDR. A pesquisa de metalo--lactamase (MBL) revelou a produção de enzimas SPM em 24 isolados de P. aeruginosa. Os estudos de expresão gênica demonstraram que, entre os sistemas de efluxo mais relatados para P. aeruginosa, MexXY-OprM foi o que mostrou maior diferença entre o nível de expressão dos grupos MDR e n-MDR, sugerindo que este sistema de efluxo desempenha importante papel no fenótipo MDR. Diminuição, em média de 66,4%, da produçãode OprD também foi um padrão encontrado nos isolados MDRem relação aos n-MDR. Dois grupos clonais de P. aeruginosa e dois de Acinetobacter spp. foram predominantes e tiveram relação com presença de integrons, produção de SPM-1 e com fenótipo MDR. Portanto, esse fenótipo pode ser consequência de acúmulo de determinantes de resistência em clones específicos. / The non-fermenting pathogenic bacteria Pseudomonas aeruginosa and Acinetobacter spp. are important causes of nosocomial infections. Theses species are often associated with a multidrug resistance (MDR) phenotype, due to intrinsic and acquired resistance genes. Some determinants of resistance, such as integrons, carbapenemases, overexpression of efflux systems and porins loss may be associated with the MDR phenotype. The aim of this study was to evaluate the association of non-MDR and MDR phenotypes in P. aeruginosa and Acinetobacter spp. to the presence of integrons and carbapenemases encoding genes, the overexpression of mexY, mexB, mexD and adeB genes and loss of the outer membrane protein, OprD. These resistance determinants were evaluated in 147 P. aeruginosa and 57 Acinetobacter spp., isolated from in-patients of University Hospital of UFJF. Isolates with different PFGE and non-susceptibility profiles were grouped according to MDR or non-MDR phenotypes. PCR and real-time RT-PCR were used to investigate the presence of class 1, 2 and 3 integrons and carbapenemase encoding genes and the expression of mexY, mexB, mexD and adeB efflux pumps and OprD porin, respectively. Class 1 integrons were one of the most common genetic elements present in MDR P. aeruginosa (44,2%), but the phenotype could not be attributed to these elements, since they showed empty (43/65) or only aminoglycoside gene cassettes (19/65). Class 2 integrons were the most common genetic elements in MDR Acinetobacter spp., and this association was statistically significant. SPM encoding gene was the only carbapenemase gene found in P. aeruginosa and, predominantly, in the PFGE cluster A. Expression of MexXY-OprM determined by real-time RT-PCR was the highest variable between MDR and non-MDR P. aeruginosa isolates (almost 10-fold). Reduction of 66.4% in OprD expression was observed in MDR P. aeruginosa, in comparison with non-MDR ones. It is concluded that the most important genetic determinants in the MDR phenotype of P. aeruginosa were SPM-1 production, followed by MexXY-OprM over expression and diminished production of OprD, while class 2 integrons was the most important genetic determinant of MDR phenotype in A. baumannii.

A resistência aos antibióticos é um problema de saúde pública global com sérias consequências para o tratamento de várias infecções bacterianas. Os fatores de transcrição da família MarR têm sido descritos controlando resistência a antibióticos e vários outros processos em bactérias. Neste trabalho, estudamos mecanismos de resistência a antibióticos em Chromobacterium violaceum, uma bactéria Gram-negativa ambiental que pode atuar como um patógeno oportunista em humanos. A estratégia envolveu a varredura de um painel de treze linhagens mutantes de fatores de transcrição da família MarR de C. violaceum disponíveis, por testes de susceptibilidade a 24 antibióticos. Estes ensaios revelaram que apenas o mutante ?emrR apresentou resistência aumentada ao antibiótico ácido nalidíxico em relação à linhagem selvagem. Esta resistência aumentada do mutante ?emrR ao ácido nalidíxico foi revertida em uma linhagem complementada deste mutante, conforme verificado por ensaios de viabilidade, ensaios de difusão em disco e concentração inibitória mínima (MIC). O fenótipo de diminuída produção de violaceína deste mutante, observado em meio líquido, também foi complementado. Além disso, foi realizado o isolamento de mutantes espontâneos de C. violaceum resistentes a ácido nalidíxico com mutação pontual em emrR. Os ensaios de microarranjo de DNA mostraram que EmrR reprime algumas dezenas de genes, incluindo o operon emrCAB, o qual codifica a bomba de efluxo EmrCAB. Os ensaios de Northern blot confirmaram que o EmrR reprime o operon emrCAB, e que a expressão desta bomba é induzida por salicilato, mas não outros compostos, como ácido nalidíxico ou brometo de etídeo. Os ensaios de alteração de mobilidade eletroforética (EMSA) mostraram que a proteína EmrR purificada se liga diretamente às 8 regiões promotoras de emrR, emrCAB e vários outros genes do regulon EmrR, para exercer uma regulação negativa direta sobre esses genes. Um mutante nulo ?emrCAB foi obtido, mas a ausência desta bomba de efluxo não tornou C. violaceum mais susceptível ao ácido nalidíxico, sugerindo que ela é importante somente em condições nas quais é induzida. Estas condições indutoras talvez incluam estresse oxidativo, uma vez que enzimas antioxidantes são parte do regulon de EmrR e a proteína EmrR formou dímeros covalentes na presença de agentes oxidantes in vitro. Portanto, nossos dados revelam que mutações pontuais ou moléculas como salicilato abolem a atividade repressora do fator de transcrição EmrR sobre o operon emrCAB, levando a superexpressão da bomba de efluxo EmrCAB e aumentando a resistência ao ácido nalidíxico em C. violaceum. / Antibiotic resistance is a global public health problem with serious consequences for the treatment of various bacterial infections. MarR family transcription factors have been described controlling antibiotic resistance and several other processes in bacteria. In this work, we studied mechanisms of antibiotic resistance in Chromobacterium violaceum, an environmental Gramnegative bacterium that can act as a human opportunistic pathogen. The strategy involved a screening of an available collection of thirteen C. violaceum mutant strains of MarR family transcription factors, by susceptibility testing for 24 antibiotics. These assays revealed that only the ?emrR mutant showed increased resistance to the antibiotic nalidixic acid in relation to the wild-type strain. This increased resistance of the ?emrR mutant to nalidixic acid was reversed in a complemented strain of this mutant, as verified by viability, disk diffusion, and minimal inhibitory concentration (MIC) assays. The phenotype of decreased violacein production of this mutant, observed in a liquid medium, was also complemented. In addition, it was performed the isolation of spontaneous mutants of C. violaceum resistant to nalidixic acid with a point mutation in emrR. DNA microarray assays showed that EmrR represses a few dozen of genes, including the emrCAB operon, which encodes the EmrCAB efflux pump. Northern blot assays confirmed that EmrR represses the emrCAB operon and that the expression of this pump is induced by salicylate, but not other compounds, such as nalidixic acid or ethidium bromide. Electrophoretic mobility shift assays (EMSA) showed that the purified EmrR protein binds directly to the promoter regions of emrR, emrCAB and several other genes of the EmrR regulon, to exert a direct negative regulation of these genes. A ?emrCAB null mutant strain was obtained, but the absence of this efflux pump did not make C. violaceum more susceptible to nalidixic acid, suggesting that it is important only under conditions in which it is induced. These inducing conditions may include 10 oxidative stress since antioxidant enzymes are part of the EmrR regulon and the EmrR protein has formed covalent dimers in the presence of oxidizing agents in vitro. Therefore, our data reveal that point mutations or molecules such as salicylate abolish the repressive activity of the EmrR transcription factor on the emrCAB operon, causing overexpression of the EmrCAB efflux pump and increasing the resistance to nalidixic acid in C. violaceum.

Introdução: Isolados clínicos de Pseudomonas aeruginosa multirresistentes estão associados a elevadas taxas de mortalidade. A resistência ao imipenem é uma urgência global, uma vez que é considerado o tratamento de escolha para infecções associadas a bactérias Gram negativas multirresistentes. Assim, elucidar os mecanismos de resistência é de vital importância para realizar um controle epidemiológico efetivo da disseminação deste tipo de isolado. Objetivos: Caracterizar os principais mecanismos de resistência ao imipenem em 76 isolados clínicos brasileiros de Pseudomonas aeruginosa, recuperados em 2004/2007, de 4 centros hospitalares do Estado de São Paulo. Material e métodos: Foram investigados: i) o perfil de resistência com determinação da CIM do imipenem; ii) a detecção de metalo-betalactamases (MBL) através de métodos fenotípicos e genotípicos; iii) a sensibilidade e especificidade do método de dupla difusão do disco na detecção de MBL; iv) a presença de genes codificadores de metilases 16S RNAr e sua associação com fenótipos aminoglicosídeo resistentes; v) alterações da permeabilidade por perda da porina OprD; vi) a presença ou ausência do gene oprD por PCR; vii) triagem fenotípica para expressão de bombas de efluxo através da determinação da CIM de quinolonas, cefalosporinas e carbapenêmicos na presença/ausência de inibidores específicos, realizando uma análise comparativa com o método de disco combinado; viii) os genes associados às bombas de efluxo mexA e mexE, através de PCR; ix) caracterizar a expressão das bombas de efluxo MexAB-OprM e MexEF-OprN, x) a clonalidade dos isolados por tipagem genotípica, através de ERIC-PCR, avaliando a relação genética (dendrograma) e sua associação com o predomínio de um determinado mecanismo de resistência. Resultados: Dentre os isolados de P. aeruginosa resistentes ao imipenem estudados (n=76, CIM50 e CIM90 = 32 µg/mL e > 512 µg/mL, respectivamente) 82% apresentaram um fenótipo de multirresistência. O principal mecanismo de resistência ao imipenem foi a produção de MBL, detectada em 74% dos isolados, e destes, 62% carregavam o gene blaSPM-1 e 12% carregavam o gene blaVIM-like. O método de dupla difusão do disco identificou a produção de MBL em 61% dos isolados. A combinação CAZ/MAA apresentou maior sensibilidade na detecção de MBL associada à SPM-1 (89%), mostrando uma especificidade de 86%. A presença do gene rmtD foi confirmada em 66% das amostras resistentes aos aminoglicosídeos, sendo que a presença concomitante do gene rmtD e do gene blaSPM-1 foi confirmada em 61% dos isolados. A deleção da porina OprD foi observada em 71% dos isolados. Dentre os isolados MBL positivos, 66% apresentaram ausência desta porina e, dentre as amostras MBL negativas, 85% não apresentaram OprD. Assim, para a resistência ao imipenem foi confirmada a contribuição de dois mecanismos, mediados pela presença de MBL e ausência de porina OprD. Em 13% (10/76) isolados, a deleção da porina OprD esteve associada à presença de seqüências de inserção (SI) em uma região anterior ao gene oprD. Por outro lado, a ausência de amplificação da região 736/1394 do gene oprD, em 11% (9/76) dos isolados, sugeriu a presença de polimorfismos. O gene mexA esteve presente em 92% dos isolados, enquanto que o gene mexE esteve presente em 82% dos isolados. A triagem de bombas de efluxo por disco combinado e análise da CIM na presença de reserpina, CCCP e PAβN, utilizando levofloxacina, meropenem, aztreonam, imipenem ou levofloxacina, não teve correlação com a superexpressão dos sistemas MexAB-OprM e MexEF-OprN. Ambos os métodos careceram de especificidade e sensibilidade quando comparados ao PCR em tempo real. A superexpressão dos sistemas mexA e mexE foi confirmada em 35% (7/20) isolados MBL negativos, enquanto que 11% (6/56) isolados MBL positivos apresentaram superexpressão do gene mexA ou mexE, sendo que 7% (4/56) isolados MBL positivos superexpressaram ambos os genes. A superexpressão dos sistemas MexAB-OprM e MexEFOprN como único mecanismo de resistência ao meropenem e imipenem foi confirmada em 10% (2/20) dos isolados MBL negativos. Nos 76 isolados, a tipagem genotípica por ERIC-PCR, identificou a presença de 24 clusters (considerando 90% de similaridade na análise do dendrograma). Conclusão: A convergência de múltiplos mecanismos de resistência em P. aeruginosa parece ser um evento favorável para a seleção de clones endêmicos multirresistentes disseminados na região Sudeste do Brasil. / Introduction: Clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa are associated with high mortality rates. Resistance to imipenem is a global concern, since it is a drug of choice for the treatment of infections produced by multidrug-resistant Gram-negative bacteria. Thus, research on resistance mechanisms is crucial to carry out an effective program for infection control and epidemiology of imipenem-resistant strains. Objective: to characterize the major mechanisms of imipenem resistance in 76 clinical isolates of P. aeruginosa recovered from clinical samples collected, from 2004 to 2007, in four hospitals in the State of São Paulo, Brazil. Material and methods: Isolates were screened for: i) resistance profile to antibacterial agents, determining the MIC of imipenem; ii) the detection of metallo-beta-lactamase (MBL) by phenotypic and genotypic methods, iii) MBL detection by using a double-disk diffusion test (D-test), determining the sensitivity and specificity of the assay; iv) the presence of genes encoding 16S rRNA methylases and their association with aminoglycoside-resistant phenotypes, v) changes in the bacterial permeability due to porin (OprD) loss; vi) the presence or absence of the oprD gene by using PCR; vii) phenotypic expression of efflux pumps by determining the MIC of quinolones, cephalosporins and carbapenems in the presence/absence of specific inhibitors, performing a comparative analysis with a combined-disk method, viii) genes encoding efflux pumps proteins (mexC and mexX) by PCR; ix) MexAB-OprM and MexEF efflux pumps expression; x) clonal relatedness, by ERIC-PCR genotyping, regarding the predominance of major resistance genotypes. Results: Among imipenem-resistant P. aeruginosa strains (n=76, MIC50 e MIC90 = 32 µg/mL e > 512 µg/mL, respectively) 82% showed a multidrug-resistant phenotype. The main mechanism of imipenem resistance was the MBL production detected in 74% strains, of which 62% harbored the blaSPM-1 gene, and 12% harbored the blaVIM-like gene. The D-test identified MBL production in 61% strains. In this regard, CAZ/MAA was the most sensitive combination for MBL detection associated to SPM-1 enzyme (89%), exhibiting 86% specificity. The presence of the rmtD 16S rRNA methylase gene was confirmed in 66% aminoglycoside-resistant strains. Moreover, presence of both rmtD and blaSPM-1 genes was identified in 61% strains. Loss of OprD porins was observed in 71% strains. In this regard, 66% MBL positive strains and 85% MBL negative strains showed OprD loss. Thus, MBL production and OprD loss contributed to imipenem resistance in P. aeruginosa. Most likely, in 13% (10/76) strains the porin loss was associated to insertion sequences (SI) inserted upstream of the oprD gene. On the other hand, in 11% (9/76) strains the absence of a PCR product targeting the 736/1394 region of the oprD gene, suggested the presence of polymorphisms. The mexA gene was identified in 92% strains, whereas the mexE gene was identified in 82% strains. Results obtained from efflux pump screening by using a combined-disk assay and MIC determination in the presence of reserpine, CCCP e PABN (using levofloxacin, meropenem, aztreonam or imipenem) was not correlated with results obtained from MexAB-OprM and MexEF-OprN overexpression analysis by RT-PCR. In this regard, both combined-disk and MIC assay showed lack of specificity and sensitivity in comparison to RT-PCR. Overexpression of mexA and mexE genes was confirmed in 35% (7/20) MBL-negative and 11% (6/56) MBL-positive strains, respectively, being 7% (4/56) MBL-positive strains overexpressed both genes. The overexpression of MexAB-OprM and MexEF-OprN efflux pumps, as only mechanism of resistance to meropenem and imipenem was observed in 10% (2/20) MBL-negative strains. ERICPCR typing revealed the presence of 24 clusters among 76 imipenem-resistant P. aeruginosa strains (≥ 90% similarity). Conclusion: The convergence of multiple mechanisms of resistance in Pseudomonas aeruginosa seems to be a favorable event for the selection of multiresistant clones endemic in the southeastern region of Brazil.

Introdução: Isolados clínicos de Pseudomonas aeruginosa multirresistentes estão associados a elevadas taxas de mortalidade. A resistência ao imipenem é uma urgência global, uma vez que é considerado o tratamento de escolha para infecções associadas a bactérias Gram negativas multirresistentes. Assim, elucidar os mecanismos de resistência é de vital importância para realizar um controle epidemiológico efetivo da disseminação deste tipo de isolado. Objetivos: Caracterizar os principais mecanismos de resistência ao imipenem em 76 isolados clínicos brasileiros de Pseudomonas aeruginosa, recuperados em 2004/2007, de 4 centros hospitalares do Estado de São Paulo. Material e métodos: Foram investigados: i) o perfil de resistência com determinação da CIM do imipenem; ii) a detecção de metalo-betalactamases (MBL) através de métodos fenotípicos e genotípicos; iii) a sensibilidade e especificidade do método de dupla difusão do disco na detecção de MBL; iv) a presença de genes codificadores de metilases 16S RNAr e sua associação com fenótipos aminoglicosídeo resistentes; v) alterações da permeabilidade por perda da porina OprD; vi) a presença ou ausência do gene oprD por PCR; vii) triagem fenotípica para expressão de bombas de efluxo através da determinação da CIM de quinolonas, cefalosporinas e carbapenêmicos na presença/ausência de inibidores específicos, realizando uma análise comparativa com o método de disco combinado; viii) os genes associados às bombas de efluxo mexA e mexE, através de PCR; ix) caracterizar a expressão das bombas de efluxo MexAB-OprM e MexEF-OprN, x) a clonalidade dos isolados por tipagem genotípica, através de ERIC-PCR, avaliando a relação genética (dendrograma) e sua associação com o predomínio de um determinado mecanismo de resistência. Resultados: Dentre os isolados de P. aeruginosa resistentes ao imipenem estudados (n=76, CIM50 e CIM90 = 32 µg/mL e > 512 µg/mL, respectivamente) 82% apresentaram um fenótipo de multirresistência. O principal mecanismo de resistência ao imipenem foi a produção de MBL, detectada em 74% dos isolados, e destes, 62% carregavam o gene blaSPM-1 e 12% carregavam o gene blaVIM-like. O método de dupla difusão do disco identificou a produção de MBL em 61% dos isolados. A combinação CAZ/MAA apresentou maior sensibilidade na detecção de MBL associada à SPM-1 (89%), mostrando uma especificidade de 86%. A presença do gene rmtD foi confirmada em 66% das amostras resistentes aos aminoglicosídeos, sendo que a presença concomitante do gene rmtD e do gene blaSPM-1 foi confirmada em 61% dos isolados. A deleção da porina OprD foi observada em 71% dos isolados. Dentre os isolados MBL positivos, 66% apresentaram ausência desta porina e, dentre as amostras MBL negativas, 85% não apresentaram OprD. Assim, para a resistência ao imipenem foi confirmada a contribuição de dois mecanismos, mediados pela presença de MBL e ausência de porina OprD. Em 13% (10/76) isolados, a deleção da porina OprD esteve associada à presença de seqüências de inserção (SI) em uma região anterior ao gene oprD. Por outro lado, a ausência de amplificação da região 736/1394 do gene oprD, em 11% (9/76) dos isolados, sugeriu a presença de polimorfismos. O gene mexA esteve presente em 92% dos isolados, enquanto que o gene mexE esteve presente em 82% dos isolados. A triagem de bombas de efluxo por disco combinado e análise da CIM na presença de reserpina, CCCP e PAβN, utilizando levofloxacina, meropenem, aztreonam, imipenem ou levofloxacina, não teve correlação com a superexpressão dos sistemas MexAB-OprM e MexEF-OprN. Ambos os métodos careceram de especificidade e sensibilidade quando comparados ao PCR em tempo real. A superexpressão dos sistemas mexA e mexE foi confirmada em 35% (7/20) isolados MBL negativos, enquanto que 11% (6/56) isolados MBL positivos apresentaram superexpressão do gene mexA ou mexE, sendo que 7% (4/56) isolados MBL positivos superexpressaram ambos os genes. A superexpressão dos sistemas MexAB-OprM e MexEFOprN como único mecanismo de resistência ao meropenem e imipenem foi confirmada em 10% (2/20) dos isolados MBL negativos. Nos 76 isolados, a tipagem genotípica por ERIC-PCR, identificou a presença de 24 clusters (considerando 90% de similaridade na análise do dendrograma). Conclusão: A convergência de múltiplos mecanismos de resistência em P. aeruginosa parece ser um evento favorável para a seleção de clones endêmicos multirresistentes disseminados na região Sudeste do Brasil. / Introduction: Clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa are associated with high mortality rates. Resistance to imipenem is a global concern, since it is a drug of choice for the treatment of infections produced by multidrug-resistant Gram-negative bacteria. Thus, research on resistance mechanisms is crucial to carry out an effective program for infection control and epidemiology of imipenem-resistant strains. Objective: to characterize the major mechanisms of imipenem resistance in 76 clinical isolates of P. aeruginosa recovered from clinical samples collected, from 2004 to 2007, in four hospitals in the State of São Paulo, Brazil. Material and methods: Isolates were screened for: i) resistance profile to antibacterial agents, determining the MIC of imipenem; ii) the detection of metallo-beta-lactamase (MBL) by phenotypic and genotypic methods, iii) MBL detection by using a double-disk diffusion test (D-test), determining the sensitivity and specificity of the assay; iv) the presence of genes encoding 16S rRNA methylases and their association with aminoglycoside-resistant phenotypes, v) changes in the bacterial permeability due to porin (OprD) loss; vi) the presence or absence of the oprD gene by using PCR; vii) phenotypic expression of efflux pumps by determining the MIC of quinolones, cephalosporins and carbapenems in the presence/absence of specific inhibitors, performing a comparative analysis with a combined-disk method, viii) genes encoding efflux pumps proteins (mexC and mexX) by PCR; ix) MexAB-OprM and MexEF efflux pumps expression; x) clonal relatedness, by ERIC-PCR genotyping, regarding the predominance of major resistance genotypes. Results: Among imipenem-resistant P. aeruginosa strains (n=76, MIC50 e MIC90 = 32 µg/mL e > 512 µg/mL, respectively) 82% showed a multidrug-resistant phenotype. The main mechanism of imipenem resistance was the MBL production detected in 74% strains, of which 62% harbored the blaSPM-1 gene, and 12% harbored the blaVIM-like gene. The D-test identified MBL production in 61% strains. In this regard, CAZ/MAA was the most sensitive combination for MBL detection associated to SPM-1 enzyme (89%), exhibiting 86% specificity. The presence of the rmtD 16S rRNA methylase gene was confirmed in 66% aminoglycoside-resistant strains. Moreover, presence of both rmtD and blaSPM-1 genes was identified in 61% strains. Loss of OprD porins was observed in 71% strains. In this regard, 66% MBL positive strains and 85% MBL negative strains showed OprD loss. Thus, MBL production and OprD loss contributed to imipenem resistance in P. aeruginosa. Most likely, in 13% (10/76) strains the porin loss was associated to insertion sequences (SI) inserted upstream of the oprD gene. On the other hand, in 11% (9/76) strains the absence of a PCR product targeting the 736/1394 region of the oprD gene, suggested the presence of polymorphisms. The mexA gene was identified in 92% strains, whereas the mexE gene was identified in 82% strains. Results obtained from efflux pump screening by using a combined-disk assay and MIC determination in the presence of reserpine, CCCP e PABN (using levofloxacin, meropenem, aztreonam or imipenem) was not correlated with results obtained from MexAB-OprM and MexEF-OprN overexpression analysis by RT-PCR. In this regard, both combined-disk and MIC assay showed lack of specificity and sensitivity in comparison to RT-PCR. Overexpression of mexA and mexE genes was confirmed in 35% (7/20) MBL-negative and 11% (6/56) MBL-positive strains, respectively, being 7% (4/56) MBL-positive strains overexpressed both genes. The overexpression of MexAB-OprM and MexEF-OprN efflux pumps, as only mechanism of resistance to meropenem and imipenem was observed in 10% (2/20) MBL-negative strains. ERICPCR typing revealed the presence of 24 clusters among 76 imipenem-resistant P. aeruginosa strains (≥ 90% similarity). Conclusion: The convergence of multiple mechanisms of resistance in Pseudomonas aeruginosa seems to be a favorable event for the selection of multiresistant clones endemic in the southeastern region of Brazil.