Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Agrárias, Programa de Pós-Graduação em Ciências dos Alimentos, Florianópolis, 2012 / Made available in DSpace on 2013-06-25T21:29:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 313711.pdf: 2121587 bytes, checksum: 5ed51db2daa3e69003797dd78eaff5d8 (MD5) / O presente estudo propõe o desenvolvimento de uma metodologia para determinação de ácidos carboxílicos alifáticos de baixo peso molecular (ACAlBPM) indicadores de qualidade e de processamento em amostras de cachaças produzidas e comercializadas no estado de Santa Catarina. O desenvolvimento do método por eletroforese capilar de zona foi realizado com o auxílio do software PeakMaster que avalia o comportamento dos analitos quanto aos parâmetros de mobilidade efetiva e dispersão por eletromigração; e SIMULSC, que constrói curvas de mobilidade dos compostos em função do pH. As condições experimentais foram: eletrólito de corrida, -alanina 21 mmol L-1 e ácido 3,5 dinitrobenzóico 10 mmol L-1, pH 3,6, injeção hidrodinâmica, 50 mbar/3 s, tensão de 30 kV, polaridade negativa, capilar 73,5 cm (Ltot), 64,5 cm (Ldet), 75 µm (DI), revestido com quitosana quaternizada, modo de detecção indireto em 254 nm. Os ACAlBPM: maleico, malônico, tartárico, fórmico, cítrico, málico, glicólico, lático, succínico e acético foram separados em menos dez minutos, com padrão interno ácido aspártico. A validação intralaboratorial foi realizada para verificação dos parâmetros: linearidade e faixa de trabalho, efeito de matriz, seletividade, repetibilidade, reprodutibilidade parcial, recuperação, limites de detecção e quantificação e robustez. O método se mostrou linear por avaliação visual e R2 na faixa de 6,97 a 27,8, 6,24 a 24,9; 9,01 a 36,0; 2,76 a 11,04; 11,5 a 46,1; 8,05 a 32,1; 4,57 a 18,2; 8,11 a 32,4; 7,09 a 28,3; 36 a 144 mg L-1 para os ácidos maleico, malônico, tartárico, fórmico, cítrico, málico. glicólico, lático, succícnico e acético, respectivamente,. Os limites de detecção variaram de 0,69 a 5,76 mg L-1 com DPR de 4,9 a 9,4%; os limites de quantificação variaram de 2,76 a 11,5 mg L-1 com DPR de 3.8 a 8,6%; o método mostrou-se robusto para os parâmetros tensão, temperatura, pressão, comprimento de onda, tempo de lavagem e tempo de injeção; a recuperação foi avaliada em sete níveis para estes ácidos, e estes apresentaram valores de recuperação de 89,6 % a 145%. Os valores de DPR para reprodutibilidade parcial e repetibilidade foram satisfatórios, menores que 9,81 e 12,9%, respectivamente. A metodologia foi aplicada na análise de duas amostras de cachaça não envelhecidas e dez envelhecidas; com preparo de amostra por simples diluição. A concentrações encontradas variaram de 0,19 a 2,99 mg L-1 para o ácido fórmico; 1,02 a 16,5 mg L-1 para o ácido lático; e 5,39 a 106,4 mg L-1 para ácido acético. A acidez titulável total foi avaliada pelo método titulométrico e as concentrações encontradas apresentaram diferença significativa para a = 0,05, demonstrando a potencialidade da técnica para discriminação individual destes ácidos presentes em amostras de cachaça e sua importância no controle de qualidade da bebida, uma vez que estes ácidos podem fornecer informações sobre controles de processo e higiene que venham a afetar a qualidade e rendimento do álcool produzido.<br> / Abstract : This study proposes the development of a methodology to determine the aliphatic carboxylic acids of low molecular weight (ACAlBPM) indicators of quality and processing in sugarcane spirit samples produced and marketed in Santa Catarina. The method was developed using capillary zone electrophoresis with the aid of Peakmaster®, software that assesses the behavior of analytes for the parameters of effective mobility and electromigration dispersion, and SIMULSC, which builds the compound's mobility curves as a function of pH. The experimental conditions were: background electrolyte; 21 mmol L-1 ?-alanine and 10 mmol L-1 3,5-dinitrobenzoic acid; pH 3,6, hydrodynamic injection; 50 mbar/3 s; 30 kV voltage; negative polarity; capillary 73.5 cm (Ltot), 64,5 cm (Ldet), 75 ?m (ID) and coated with chitosan quaternized, indirect detection mode at 254 nm. The ACAlBPM (maleic, malonic, tartaric, formic, citric, malic, glycolic, lactic, succinic and acetic acids) were separated in less than ten minutes using the aspartic acid internal standard. An in-house validation was performed to check the parameters: linearity and working range, matrix effect, selectivity, repeatability, partial reproducibility, recovery, limits of detection and quantification and robustness. The method showed linearity by visual evaluation and R2 in the range of 6,97 a 27,8, 6,24 a 24,9; 9,01 a 36,0; 2,76 a 11,04; 11,5 a 46,1; 8,05 a 32,1; 4,57 a 18,2; 8,11 a 32,4; 7,09 a 28,3; 36 a 144 mg L-1 for maleic, malonic, tartaric, formic, citric, malic. glicolic, lactic, succicnic and acetic acids, respectively. The detection limits were from 0.69 to 5.76 mg L-1 with RSD from 4.9 to 9.4 percent, the quantification limits were from 2.76 to 11.5 mg L-1 with RSD 3.8 to 8.6 percent, the method was robust for voltage, temperature, pressure, wavelength, washing time and injection time parameters; recovery was evaluated in seven levels for these acids that showed values from 89.6 to 145 percent. The values of RSD for partial reproducibility and repeatability were satisfactory, less than 9.81 and 12.9 percent, respectively. The methodology was applied in the analyses of two sugarcane spirit samples not aged and ten aged sugarcane spirit samples, with sample preparation by simple dilution. The concentrations found were from 0.19 to 2.99 mg L-1 for formic acid, from 1.02 to 16.5 mg L-1 for lactic acid and from 5.39 to 106.4 mg L-1 for acetic acid. The total titratable acidity was measured with the titrimetric method, and the concentrations found showed significant differences for a = 0.05. This shows the potential of this technique for individual discrimination of these acids in sugarcane spirit samples and its importance in controlling beverage quality, since these acids can provide information about process controls and hygiene that may affect the quality and yield of alcohol produced.

Orientador: Maria Luiza Moretti / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-05T09:55:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Bratfich_OrlandoJose_D.pdf: 1128343 bytes, checksum: 5a4d981849f245636703326e9af0c8ad (MD5) Previous issue date: 2005 / Resumo: Isolados clínicos de Staphylococcus epidermidis provenientes de infecções de corrente sangüínea do hospital de clínicas HC ¿ UNICAMP, Campinas foram analisados. Os isolados foram caracterizados por análises fenotípicas e genotípicas. Os testes de susceptibilidade aos antimicrobianos foram realizados para comparar os métodos de disco difusão, concentração inibitória mínima e diluição em Agar, para determinar a relevância clínica da resistência aos antimicrobianos. Foram analisados a presença do gene mecA por PCR, produção de biofilme, genotipagem por PFGE com enzima SmaI. Dados epidemiológicos dos pacientes foram analisados para detectar a importância clínica dessas cepas. Para oxacilina 82 isolados foram resistentes, sendo que 78 (95,12%) apresentaram reação de PCR positiva para o gene mecA, dois isolados apresentaram-se como hiperprodutores de ß-lactamases. Para teicoplanina os testes de CIM apresentaram 52 isolados sensíveis, 35 isolados intermediários e 13 isolados resistentes e, quando comparado com os testes de disco difusão foram observadas discordâncias em 43% dos isolados, onde o teste de disco difusão não foi capaz de identificar isolados intermediários e resistentes (P < 0,001). Para vancomicina um único isolado apresentou resultado intermediário com CIM de 8,0 µg/mL. Isolados vancomicina resistentes não foram observados. Analises dos dados epidemiológicos, através de regressão logística, as variáveis estatisticamente significantes foram neutropenia (P = 0,002) e quimioterapia (P = 0,015). As análises genotípicas por PFGE demonstraram a disseminação clonal de S. epidermidis no ambiente hospitalar e verificou-se que testes dilucionais são necessários quando se estudam glicopeptideos. A análise filogenética demonstrou grande estabilidade e adaptabilidade genética do gene mecA responsável pela resistência a oxacilina / Abstract: Clinical strains of Staphylococcus epidermidis taken from bloodstream infection from UNICAMP (teaching hospital in Campinas São Paulo State, Brazil) were analyzed. The strains were characterized by phenotypic and genotypic analysis. The antimicrobial susceptibility tests were made to compare the disk diffusion tests, MIC, and agar-salt screening-test to determine the relevant clinical antimicrobial resistance. There were also made PCR assays for mecA detection, biofilm production, genotypic by SmaI-digested and pulsed-field gel electrophoresis. Patients epidemiological data were employed to determine the major clinical importance of these strains. For oxacillin 82 strains were resistant, and 78 (95.12%) had positive PCR assay for mecA gene, and two strains presented characteristics of ß-lactamases hyperproduction. In the MIC tests for teicoplanin, 52 strains were susceptible; 35 strains intermediate and 13 strains were resistant, and when compared to the results obtained by disk diffusion tests, MIC, were observed discordant results in 43% of the strains where the disk diffusion test was not able to identify strains intermediate and resistant (P < 0.001). MIC test had only one intermediate of 8.0 µg/mL for vancomycin. Strains vancomycin-resistant were not observed. The variable data statistically significant in the logistic regression analysis related to the treatment of the BSI by S. epidermidis were: neutropenia (P = 0.002) and chemotherapy (P = 0.015). The genotyping analysis of isolates demonstrated a clonal distribution of S. epidermidis in the hospital environment and it was checked that dilution tests are necessary when glycopeptides are being studied.. The phylogenetic analysis showed great genetic stability and adaptability of the mecA gene responsible for the oxacillin resistance / Doutorado / Ciencias Basicas / Doutor em Clínica Médica

Este trabalho descreve a construção e avaliação de um detector condutométrico sem contato (oscilométrico) para sua aplicação em eletroforese capilar de zona e cromatografia micelar eletrocinética (MEKC). A construção do detector contou com a avaliação de diversos materiais e métodos para a confecção dos eletrodos, tão bem como o aperfeiçoamento do seu circuito eletrônico. O seu comportamento e desempenho foram verificados através do estudo dos diversos parâmetros que influenciam sua resposta, como freqüência e amplitude do sinal aplicado, temperatura e condutividade do meio. Além disso, a simulação do circuito equivalente da cela de detecção auxiliou no entendimento das propriedades do detector frente a alterações na condutividade do meio, na freqüência de operação e nas dimensões da cela. A otimização dos parâmetros operacionais foi racionalizada pela formulação de equações analíticas que descrevem o fator de resposta do detector a partir de parâmetros obtidos experimentalmente. Para o desenvolvimento do sistema de detecção, dois equipamentos completos de eletroforese capilar foram construídos. Sistemas de injeção de amostra por pressão, por gravidade, e eletrocinética foram desenvolvidos. Um dos equipamentos permite que a injeção da amostra seja feita do lado aterrado da fonte de alta tensão. Conseqüentemente, o detector é posicionado próximo do ponto de aplicação da alta tensão. Este é, de que se tem notícia, o primeiro sistema de detecção eletroquímico para eletroforese capilar com essa característica. A termostatização dos capilares foi efetuada por convecção forçada de ar. De maneira a aumentar o grau de automação e facilitar o seu manuseio, os dois equipamentos foram interfaceados a microcomputador. Os equipamentos de eletroforese com detecção oscilométrica construídos permitiram a análise de diversas substâncias em matrizes variadas, como por exemplo íons orgânicos e inorgânicos em água de chuva e material particulado, ácidos graxos de cadeia linear em gordura de coco, formaldeído na fase gasosa da atmosfera, e, pela primeira vez, espécies neutras, como álcoois alifáticos, separadas por MEKC. / This work describes the construction and evaluation of a contactless conductometric (or oscillometric) detector, for its application in capillary zone electrophoresis and micellar electrokinetic chromatography (MEKC). The materials and methods used for the construction of the electrodes, as well as the improvements on the electronic circuit, were evaluated. The behavior and performance of the detector were studied by changing the parameters that affect its response, e. g., the frequency and amplitude of the input signal, temperature and solution conductivity. The simulation of the cell equivalent electric circuit helped to understand the detector properties related to the variations in the solution conductivity, frequency, and cell dimensions. The optimization of the parameters was conducted by the formulation of analytical equations that describe the response factor using experimental data. For the detection development, two complete capillary electrophoresis equipments were constructed. Pressure, gravity, and electrokinetic sample injection systems were developed. One of the equipments allows the sample injection on the grounded side of the capillary. Consequently, the detector is placed near the high voltage application point. This is the first electrochemical detector described for capillary electrophoresis with this characteristic. The capillary thermostating was made by passing a forced air stream. Both equipments were interfaced to microcomputers. The capillary electrophoresis equipments with oscillometric detection were applied to the analysis of many types of compounds in different matrices, such as organic and inorganic ions in rainwater and particulate material, fatty acids in cocoa oil, formaldehyde in the atmosphere and, for the first time, neutral species, like aliphatic alcohols, separated by MEKC.

Nos últimos anos a eletroforese capilar tem substituído a eletroforese em gel e está sendo usada para uma ampla variedade de aplicações forenses, incluindo tipagem de DNA. A fim de superar as desvantagens com relação à análise simultânea de amostras que a eletroforese em gel oferece, equipamentos com arranjos de capilares foram idealizados, assim como a possibilidade de análises multiplexadas em um único capilar por meio da utilização de corantes intercaladores. Neste trabalho foi otimizada a metodologia para amplificação de DNA pela reação em cadeia da polimerase para sete primers correspondentes a sete regiões padronizadas e legalmente aceitas para testes de paternidade. Três casos foram avaliados por eletroforese em microchip, indicando que um método mais reprodutível e de maior resolução deveria ser utilizado, fato que levou ao desenvolvimento de um método para separação de um padrão de tamanho de DNA de 25 pares de base por eletroforese capilar em soluções poliméricas em um equipamento comercial. Este método foi aplicado à separação do mesmo padrão intercalado a um corante dimérico em um equipamento de eletroforese capilar lab-made miniaturizado, com detecção espectrofotométrica na região visível, sugerindo a possibilidade de o equipamento desenvolvido ser utilizado para análises genéticas multiplexadas com custo e tempo minimizados. / In recent years capillary electrophoresis has substituted slab gel electrophoresis and has been used in a variety of forensic applications, such as DNA typing. In order to overcome the disavantages regarding the simultaneous samples analysis that slab gel offers, equipments with capillary arrays were developed, as well as the possibility of multiplex analysis in a single capillary by using intercalating dyes. In this work the metodology to amplify DNA by polimerase chain reaction was studied to seven primers corresponding to seven standardized and legaly accepted regions in paternity tests. Three cases were evaluated by microchip electrophoresis, indicating the need for a more reproductive and with better resolution method has to be used. This fact lead to the development of a method to separate a 25 base pairs DNA ladder by gel capillary electrophoresis in a comercial equipment. In the sequence, this method was apllied to the separation of the same ladder intercalated to a dimeric dye in a lab-made miniaturized capillary electrophoresis system with spectrophotometric detection at visible region, suggesting that the developed equipment can be used for multiplexed genetic analysis with reduced cost and time.

O hiperadrenocorticismo é uma das endocrinopatias mais frequentes em cães. As manifestações clínicas e as lesões associadas com o hiperadrenocorticismo resultam primariamente da hipercortisolemia crônica. Várias são as alterações clínicas observadas em diversos sistemas orgânicos, como também as laboratoriais que ocorrem como consequência dos efeitos gliconeogênico, lipolítico, catabólico, protéico e anti-inflamatório dos glicocorticóides. No que concerne aos rins, a hipercortisolemia crônica pode causar lesão do glomérulo, como também esta estrutura pode sér comprometida secundariamente pela hipertensão arterial sistêmica e, assim, evoluir para doença renal crônica. Neste estudo foram avaliados 10 cães normotensos com hiperadrenocorticismo hipófise dependente, antes e após a terapia com trilostano, com o intuito de verificar a existência ou não de proteinúria patológica pelos métodos quantitativos (razão proteína-creatinina urinária) e qualitativos (eletroforese de proteínas urinárias), como também de acompanhar a intensidade da mesma ao longo da evolução da doença e do curso da terapia. A principal lesão renal detectada nos cães com HAC foi no segmento tubular, constatada pelo predomínio de bandas de proteínas urinárias de baixo peso molecular, indicando o comprometimento na absorção dessas proteínas no segmento proximal do néfron, sendo que a presença dessas bandas perduraram ao longo da terapia, mesmo quando as concentrações séricas de cortisol diminuíram gradativamente após a terapia com trilostano. Ainda, o bom controle do hiperadrenocorticismo pela terapia e a pressão arterial sistêmcia dentro dos valores de normalidade podem ter contribuído para a prevenção do desenvolvimento de lesão glomerular. / Hyperadrenocorticism is one of the most common endocrine disorders in dogs. Clinical sings and organs lesions associated with hyperadrenocorticism result primarily from chronic hypercortisolemia. There are several clinical changes observed in different organ systems, as well as laboratory alterations that occur as a result of the effects of gluconeogenic, lipolytic, catabolic, protein and anti-inflammatory glucocorticoids. Regarding to the kidneys, chronic hypercortisolemia can cause damage to the glomerulus, but also that structure may be compromised by secondary hypertension and, thus, evolve into chronic kidney disease. This study evaluated 10 normotensive dogs with pituitary dependent hyperadrenocorticism, before and after therapy with trilostane, in order to verify the existence of pathological proteinuria by quantitative (urinary protein-to-creatipine) and qualitative (urinary protein electrophoresis) methods, and also to monitor its intensity over the course of the disease and therapy. The main renal lesion detected in dogs with hyperadrenocorticism was in the tubular segment, evidenced by the prevalence of urinary protein bands of lower molecular weight, indicating the lack absorption of these proteins in the proximal segment of the nephron. Low molecular weight proteins persisted throughout therapy, even when serum cortisol concentrations gradually decreased after treatment with trilostane. Moreover, good control of hyperadrenocorticism and blood pressure within the normal range may have contributed to the prevention ofthe development of glomerular injury.

Resumo: Inibidores voláteis de corrosão (IVC) são amplamente utilizados para conferir proteção temporária aos metais ferrosos. Estes inibidores são substâncias que possuem a propriedade de volatilizar a temperatura ambiente, formando uma atmosfera de alta concentração que posteriormente irá se condensar na superfície do metal deixando-o menos suscetível a corrosão. No entanto, estes produtos são comercializados sem que haja padronização e avaliação de qualidade. Atualmente longos ensaios eletroquímicos são utilizados ou somente a quantidade de IVC presente nos suportes é analisada. Pouco estudo tem sido realizado a cerca da quantidade de IVC presente na atmosfera formada. Aminas como monoetanolamina (MEA), monociclohexilamina (MCHA) e diciclohexilamina (DCHA) apresentam propriedades desejáveis de IVC, sendo comumente empregadas. Neste trabalho é desenvolvido um método analítico para avaliar atmosferas modificadas por inibidores voláteis de corrosão. Para coleta e amostragem da atmosfera de interesse otimizouse um método utilizando micro gotas suspensas. Como técnica de separação e determinação utilizou-se a eletroforese capilar (EC) com detecção indireta a 214 nm. Além de eficiente, EC faz uso de micro volumes tornando-a conveniente para o presente estudo. Alternativamente, otimizou-se um método espectrofotométrico a partir da derivação das aminas com o reagente cromóforo p-cloranil, esta técnica foi escolhida visto sua simplicidade e baixo custo. Através dos métodos desenvolvidos foi possível avaliar adequadamente a composição de atmosferas contendo MEA, MCHA e DCHA. Testes colorimétricos em filtros de papel também foram realizados e se mostrou uma alternativa interessante para maiores estudos posteriores. As atmosferas provenientes de amostras plásticas comerciais apresentaram DCHA como principal amina inibidora, apresentando quantidades... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Volatile Corrosion Inhibitors (VCIs) are widely used to provide ferrous metals temporary protection. These substances have the vaporing property at room temperature, making a high concentration atmospheric, which subsequently will condense on the metallic surface, making it less susceptible to corrosion. Therefore, these products are commercialized without proper standardization and quality evaluation. Currently lengthy electrochemical tests are applied or only the amount of VCI on support is analyzed. Little study has been done about the amount of VCI in the atmosphere formed. Amines such as monoethanolamine (MEA), monocyclohexylamine (MCHA) and dicyclohexylamine (DCHA) have desirable properties of VCI and this why are commonly used as one. An analytical method to evaluate modified atmospheres by volatile corrosion inhibitors was developed. Hangdrops were used as collector and sampler of atmosphere, several papers have been published about its versatility and efficiency. Such as separation and determination technique the capillary electrophoresis (CE) with indirect detection to 214 nm was used. In addition other advantage is the use the small volumes by CE. Alternatively, spectrophotometric method was enhanced, amines derivatization by chromophore p-chloranil reagent was used, this technique has been chosen due its simplicity and low cost. By these developed methods is possible to determine rightly the atmosphere composition with MEA, MCHA and DCHA contained. Colorimetric tests were made on filter paper and the results were promising. Results show commercial plastic samples atmosphere have DCHA as the main inhibitor and it was less quantity on support than atmosphere, although DCHA quantities on support after 8 months was kept. Degradation of MEA under salt form was evaluated and results shown beginner solution modification after few days. / Orientador: Arnaldo Alves Cardoso / Coorientador: Elisabete Alves Pereira / Banca: Antonio José Felix de Carvalho / Banca: Wagner Luiz Polito / Mestre

Resumo: Nesse trabalho, foram desenvolvidos métodos analíticos para determinação de três classes de conservantes e contaminantes em alimentos e bebidas utilizando como técnica analítica a Eletroforese Capilar. No primeiro subgrupo, foram investigados os ânions nitrito e nitrato, utilizados como conservantes em alimentos curados. A separação foi efetuada utilizando os seguintes parâmetros instrumentais: eletrólito de corrida: 60 mmol.L-1 de borato de sódio contendo 0,2 mmol.L-1 de CTAB, pH 9,30; tensão: -10 kV, temperatura: 29º C, injeção: 8 s x 30 mbar, Capilar: 48,5 cm (sendo 40,0 cm até o detector) e detecção direta em 210 nm. Os parâmetros de validação foram investigados revelando boa precisão no tempo de migração (RSD < 0,73%). A linearidade foi estudada na faixa de 50 - 250 mg.Kg-1 para nitrito e 100 - 1000 mg.Kg-1 para nitrato, com r > 0,99. Os limites de quantificação foram de 14,8 mg.Kg-1 para nitrito e 16,9 mg.kg-1 para nitrato. A recuperação foi maior que 98% para os ânions. O método foi aplicado a amostras de alimentos encontradas no comércio local e os resultados estão abaixo dos valores permitidos pela legislação para nitrito (150 mg.kg-1 ) e nitrato (300 mg.kg-1 ). O segundo subgrupo avaliado foram os ânions benzoato, sorbato, metil e propilparabeno, que são utilizados como conservantes em diversos alimentos, dentre eles em sucos, bebidas gaseificadas, condimentos e adoçantes. As condições de separação otimizadas foram: Eletrólito de corrida: 20 mmol.L-1 de borato de sódio, tensão: 20 kV; temperatura: 29ºC, injeção: 8 s x 30 mbar; Capilar: 48,5 cm (sendo 40,0 cm até o detector) e detecção direta em 220 nm. O método foi validado, com bons resultados de precisão analítica para tempo de migração (RSD < 1,89 %), a linearidade estudada foi na faixa de 75 - 500 mg.Kg-1 , com r > 0,99 para todos os ânions. Os ... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: In this work were developed analytical methods for determination of three groups of preservatives and contaminants in foods and beverages using Capillary Electrophoresis. In the first group, it was investigated the nitrite and nitrate anions, used as preservatives in cured meats. The separation was achieved according to the following instrumental parameters: Running buffer: 60 mmol.L-1 sodium tetraborate containing 0.2 mmol.L-1 CTAB; voltage: -10 kV, temperature: 29ºC; injection: 8 s x 30 mbar, Capillary lenght: 48.5 cm (40.0 cm effective length) and wavelength: 210 nm. The validation parameters were investigated, revealing a good precision on the migration time (RSD < 0,73%). The linearity was evaluated in the range of 50 - 250 mg.Kg-1 to nitrite and 100 - 1000 mg.Kg-1 to nitrate (r>0.99). Limit of quantification was 14.8 mg.Kg-1 to nitrite and 16.9 mg.Kg-1 to nitrate and the recovery rate higher than 98% to these anions. The method was applied to commercial samples of meats and the obtained results were below the acceptable levels according to the Brazilian legislation (150 mg.Kg-1 to nitrite and 300 mg.Kg-1 to nitrate). The second group evaluated was the anions benzoate, sorbate, methyl and propylparaben, used as preservatives in several foods, including juices, sauces, soda and sweeteners. The analytical parameters were: running buffer: 20 mmol.L-1 sodium borate; voltage: 20 kV; temperature: 29ºC; injection: 8 s x 30 mbar; capillary: 48.5 cm (40.0 effective length), wavelength: 220 nm. The method was validated revealing a good precision (RSD > 1.89 %) and linearity in range of 75 - 500 mg.L-1 (r>0.99). Limits of detection were 27.0; 47.5; 27.0; 40.5 mg.Kg-1 ; to methylparaben, propylparaben, benzoate and sorbate, respectively. The recovery range found was from 98.81 - 104.87%. The method was applied in different commercial sodas, sweeteners, sauces and juices ... (Complete abstract click electronic access below) / Orientador: Arnaldo Alves Cardoso / Coorientador: Elisabete Alves Pereira / Banca: Emanuel Carrilho / Banca: Ana Valéria Colnaghi Simionato / Mestre

A criptococose é infecção fúngica oportunista causada pelo Cryptococcus neoformans com alta incidência em indivíduos imunodebilitados, principalmente entre pacientes com Aids, sendo o número de casos registrados da doença no Brasil, 474.279, de 1980 a junho de 2007. Para melhor compreensão do agente etiológico, da criptococose e dos fatores associados à virulência são necessários estudos adicionais sobre a patogênese deste microrganismo. Dentre os fatores relacionados à virulência, a melanina é um dos principais e sua síntese ocorre por ação da lacase. Assim sendo, foram realizados estudos para avaliar a produção do pigmento entre amostras clínicas e ambientais de C. neoformans sob diferentes condições de pH (5, 6 e 7) e temperatura (25 °C, 30 °C e 35°C). A relação do pigmento com o perfil de sensibilidade aos antifúngicos fluconazol e anfotericina B também foi avaliada. Os resultados mostraram que não houve comportamento uniforme de melanização entre as amostras. As maiores alterações de pigmentação e crescimento das leveduras foram observadas nos meios de cultura com pH 7 incubados a 35 °C. A técnica de eletroforese em gel PAGE nãodesnaturante mostrou-se uma ferramenta útil na análise da lacase produzida pelas amostras de C. neoformans com posterior quantificação de melanina por densitometria das bandas após reação com o substrato L-dopa. As amostras ambientais apresentaram os maiores valores de intensidade de melanina e ampla faixa de variação. Mais da metade das amostras clínicas (56,2 %) apresentaram as menores intensidades de melanina. A amostra clínica ICB 88 revelou duas bandas de melanina no gel indicando a presença de duas isoformas da lacase. Os testes de sensibilidade aos antifúngicos fluconazol e anfotericina B, através das metodologias de difusão em agar por disco e fita (E-test®), mostraram que a leitura após 72 h de incubação pode levar a erro na classificação quanto ao perfil de sensibilidade, tanto nos testes com ou sem adição de melanina. Adição de melanina pareceu não interferir nos resultados frente ao fluconazol nas metodologias de difusão em agar a partir de disco e fita (E-test®). Para anfotericina B houve aumento de CIMs para 90,9 % das amostras, sendo 45,4 % superior a 2 diluições com adição de melanina nos testes de sensibilidade na metodologia de difusão em agar a partir de fita (E-test®). / Cryptococcosis is an opportunistic fungal infection caused by Cryptococcus neoformans that has presented increased incidence with the great number of immunocompromised patients, mainly AIDS ones, being 474.273, the number of cases registered in Brazil since 1980 to june 2007. Additional studies about microorganism’s pathogenesis is necessary for better comprehension about the aethyological agent, criptococosis and associated factors to virulence. Among virulence’s factors, melanin is one of the mainly and its synthesis occurs by laccases action. So, some studies were performed to evaluate the melanin pigment’s production between clinical and environmental strains of C. neoformans under different conditions of pH (5, 6 and 7) and temperatures (25 °C, 30 °C and 35 °C). The pigment and susceptibility to fluconazole and amphotericin B relation’s was also evaluated. The results showed that there wasn’t comparable behaviour of melanization among the strains. The higher alterations on yeast’s pigmentation and growth were noted under pH 7 and at 35 °C. The electrophoresis technique on non-denaturant PAGE gel showed to be an useful tool to the analysis of laccase produced by C. neoformans strains and posterior quantification of melanin by spot’s densitometry after reaction with L-dopa substrate. The environmental strains showed the higher values of melanin intensities and large variation range. Over than a half of clinical strains (56.2 %) showed the lower melanin’s intensities. The clinical strain, ICB 88 revealed two melanin spots on gel indicating the presence of two laccase isoforms. The susceptibility antifungal tests with fluconazole and amphotericin B through disk diffusion and E-test® methods showed that reading after 72 hours can induce to mistakes on the susceptibility profile of strains, either in presence or absence of melanin. Addition of melanin on medium surface appears not change the results of susceptibility to fluconazole in disk diffusion and E-test®, but to amphotericin B was observed increase of MICs to 90.9 % of strains, been 45.4 % upper to 2 dilutions after addition of melanin in Etest ® methodology.

Neste trabalho foram desenvolvidas tecnologias e novos processos de fabricação de microdispositivos analíticos visando o acoplamento desta plataforma microfluídica com a detecção condutométrica sem contato (C4D). Uma segunda etapa do trabalho concentrou esforços em melhorar os níveis de detectabilidade da C4D. Para tanto foi proposto um processo rápido e robusto para selagem de canais de vidro para produção de microdispositivos analíticos para eletroforese. Os canais de vidro foram fabricados por processo fotolitográfico e corrosão química em via úmida. Os microcanais obtidos foram selados contra outra lâmina de vidro previamente recoberta por uma membrana polimérica (PDMS) de 50 &micro;m de espessura. Esta mesma membrana, além de promover a junção das placas de vidro, promoveu também o isolamento elétrico entre a solução no interior do canal microfluídico (de uma lâmina de vidro) e os eletrodos metálicos presentes no substrato de vidro oposto. Assim, foi possível acoplar a detecção condutométrica sem contato (C4D) com a plataforma eletroforética proposta. O desempenho analítico desta foi avaliado usando detecção por fluorescência induzida a laser (LIF) e C4D. Eficiência de aproximadamente 47000 pratos/m foi alcançada com boa repetibilidade chip-a-chip. Fluxo eletrosmótico (EOF) estável foi observado apesar da presença do material polimérico compondo parte da parede interna do canal. Com a metodologia proposta, um chip pode ser fabricado em menos de 120 min, já incluindo as etapas de gravação por fotolitografia, corrosão e selagem. Quando comparada à selagem térmica, além do ganho de tempo e facilidade no manuseio dos substratos, o método proposto não necessita de altas temperaturas e os dispositivos obtidos apresentam repetibilidade satisfatória para análises em diferentes dias e em diferentes microchips. A plataforma analítica desenvolvida foi utilizada em um estudo cinético no qual foi possível determinar os parâmetros cinéticos (Vmax = 12,64 mmol L-1 min-1 e KM = 23,8 mmol L-1) da reação de decomposição de ureia catalisada pela enzima urease. Na segunda etapa do trabalho, foi proposta a alteração de um parâmetro físico, a constante dielétrica, da membrana de PDMS usada como isolante de modo a obter um acoplamento capacitivo mais eficiente e como conseqüência uma melhor resposta no detector. Uma discussão teórica fez-se necessária a respeito do princípio de funcionamento da C4D. Os resultados obtidos com experimentos, nos quais a membrana de PDMS foi dopada com dióxido de titânio (TiO2), mostraram que a discussão sobre o funcionamento deste detector está de acordo com as considerações teóricas apresentadas neste trabalho, onde o sinal analítico é proporcional à capacitância e esta é proporcional à constante dielétrica na cela de detecção. Com esta alternativa foi possível reduzir os limites de detecção em experimentos de análise em fluxo de 385,5 para 14,7 &micro;mol L-1 após adição de 50% em massa de TiO2 na membrana de PDMS. / In this thesis were presented technologies developed aiming new manufacturing processes for analytical microdevices by coupling of this microfluidic platform with capacitively coupled contactless conductivity detection (C4D). In a second stage of the work, we focused on improving the levels of detectability of C4D. We proposed a fast and robust process for sealing glass channels to produce analytical microdevices for electrophoresis. The glass channels were fabricated by photolithographic process and chemical wet etching. The obtained microchannels were sealed against another glass plate, which was previously coated with a 50-&micro;m-thick membrane of poly(dimethylsiloxane) (PDMS). The purpose of this membrane, besides promoting the bonding of the two glass plates, was to act as an electrical insulator between the solution within the microfluidic channel on the top glass plate and the metal electrode present on the bottom glass chip. Thus it was possible to couple the contactless conductivity detection (C4D) with the electrophoretic platform proposed. The analytical performance was evaluated using both laser induced fluorescence (LIF) detection and C4D. Efficiency of about 47,000 plates/m was achieved with good chip-to-chip repeatability. Electroosmotic flow (EOF) was observed and stable despite the presence of polymer composing part of the inner wall of the channel. With the proposed methodology, a chip can be manufactured at less than 120 min, including the patterning step by photolithography, chemical etching, and sealing (bonding) step. When compared to the heat sealing procedure, in addition to time savings, and ease of handling of the substrates, the method does not require high temperatures, and the devices obtained show satisfactory repeatability analysis on different days and different microchips. The proposed analytical platform was used in a kinetic study in which it was possible to determine the kinetic parameters (Vmax = 12.64 mmol L-1 min-1 and KM = 23.8 mmol L-1) for the decomposition of urea catalyzed by the enzyme urease. In the second part of this thesis, it was proposed to change a physical parameter, the dielectric constant of the PDMS membrane used as an insulator, to achieve a more efficient capacitive coupling and consequently a better response in the detector. A theoretical discussion was required regarding the operating principle of C4D. The results obtained from experiments in which the PDMS membrane was doped with titanium dioxide (TiO2) showed that the discussion on the functioning of this detector is in agreement with the theoretical considerations presented in this work. The analytical signal was proportional to the capacitance and this was proportional to the dielectric constant in the detection cell. With this alternative we could reduce the detection limits in flow analysis system experiments from 385.5 to 14.7 &micro;mol L-1 after addition of 50% wt of TiO2 in the PDMS membrane.

Este trabalho descreve o desenvolvimento de microchips para eletroforese a partir dos processos de impressão direta e fotolitográfico. A estrutura dos microcanais fabricados pelo processo de impressão direta são definidos por filmes de poliéster (base e tampa) e por uma camada de toner (paredes). A caracterização da superfície e da composição do toner foram necessárias para um melhor entendimento da composição química da estrutura dos microcanais e para este propósito foram utilizadas diferentes técnicas como análise elementar de CHN-O, AFM, EDX e MEV. Além da química do toner as dimensões limites para os canais, como largura e altura, também foram estudadas. A aplicação de um efeito de cinza nos microcanais foi avaliado de modo a desenvolver um dispositivo de pré-concentração usando as partículas de toner como obstáculos para o fluxo. Os microdispositivos fabricados em poliéster-toner foram integrados com detecção amperométrica no final do canal de separação usando eletrodos produzidos a partir da combinação das tecnologias da produção de máscaras de toner e CDs, como fonte de ouro. O desempenho destes microchips foi avaliado com detecção amperométrica da separação eletroforética de iodeto e ascorbato. Os limites de detecção obtidos foram de 500 nmol L-1 (135 amol) e 1,2 mmol L-1 (486 amol) para o iodeto e ascorbato, respectivamente. Além do processo de impressão direta, o processo fotolitográfico também foi utilizado para a mesma finalidade. Neste processo foi utilizado o fotorresiste negativo SU-8 e microdispositivos com área de 1 cm2 foram fabricados usando diferentes substratos como vidro, silício e alumina. A alumina apresentou muitas irregularidades para os microdispositivos fabricados. Problemas com a absorção e dispersão da radiação ultravioleta foram observados. No entanto, a alumina foi um excelente material para as etapas de produção de dois moldes metálicos para a rápida produção de dispositivos poliméricos. Um molde com uma geometria complexa foi obtido para estudar um novo sistema de injeção e um segundo molde foi preparado para avaliar o uso de uma borracha de silicone como material moldante. Além disso, este trabalho também apresenta o desenvolvimento de um dispositivo microfabricado com eletrodos completamente integrados para separação e detecção eletroquímica. Eletrodos de ouro ou de titânio/platina foram obtidos através da técnica lift-off. As máscaras para a fabricação de moldes metálicos e dos dispositivos integrados foram preparadas em fotolito de alta resolução. / This work describes the development of electrophoresis microchip fabricated by direct-printing and photolithographic processes. The channel structures of the devices fabricated by direct-printing process are defined by polyester films (base and cover) and by a toner layer (walls). The characterization of toner surface and composition were necessary for a better understanding of the chemistry composition and for this purpose we have used different techniques such as CHN-O elemental analysis, AFM, EDX and SEM. Besides the chemistry of toner, the possible dimensions for the channels as the depth and the width were also studied. The application of a gray-scale effect in the channels was evaluated in order to create a preconcentration device using the toner particles as obstacles for the flow. The polyester-toner microdevices were coupled with end-channel amperometric detection using electrodes produced by combination of the toner masks laser-printing and compact discs as a gold source. The performance of this electrophoresis microchip was evaluated by amperometric detection of iodide and ascorbate. The detection limits found were 500 nmol L-1 (135 amol) and 1.2 mmol L-1 (486 amol) for iodide and ascorbate, respectively. Besides the direct-printing process, the photolithographic process was also used for this purpose. In this process it was used the SU-8 negative photoresist and microdevices with 1-cm2 area were fabricated using different substrates such as glass, silicon and alumina. The alumina presented several irregularities for the microdevices fabricated. Problems with the absorption and dispersion of ultraviolet radiation were observed. However, the alumina was an excellent material for the steps in the production of two metallic molds for fast production of PDMS devices. One mold with complex geometry was obtained in order to study a new injection system and a second mold was prepared to evaluate the use of silicon rubber as molding material. Furthermore, in this work it was also reported the development of a microfabricated device with fully integrated electrodes for separation and electrochemical detection. The gold or titanium/platinum electrodes were obtained by lift-off technique. The masks for fabrication of the metallic molds and of the integrated microdevices were prepared in transparency films with high resolution.