Este trabalho recebeu a Menção Honrosa no Prêmio Capes de Teses 2014 / Made available in DSpace on 2014-09-09T12:30:32Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) 16.pdf: 6304996 bytes, checksum: 71c341f48f8e1ace48b22de15c0ccb89 (MD5) Previous issue date: 2013 / Acinetobacter baumannii é um patógeno oportunista com crescente importância em infecções relacionadas a assistência em saúde. No Brasil é particularmente problemático devido à sua alta prevalência e multirresistência, com as carbapenemases tipo OXA representando o principal mecanismo responsável por esta resistência. Esse trabalho teve como objetivo determinar a diversidade genética, caracterizar fenotípica e molecularmente a resistência a antimicrobianos e avaliar fatores de virulência em Acinetobacter baumannii isolados de 10 hospitais públicos e privados no Rio de Janeiro no período de 2005 a 2007. Durante este período foram estudados 141 isolados de A. baumannii coletados de pacientes internados em UTIs ou enfermarias cirúrgicas. A identificação da espécie foi confirmada através da detecção do gene intrínseco blaOXA-51.Os 110 isolados de A. baumannii resistentes ao imipenem apresentaram perfil de multirresistência com taxas superiores a 98,2% para 8 dos 10 antimicrobianos testados e 98(87,3%) produziram a carbapenemase OXA-23. Não houve produto de amplificação para os genes blaOXA-24, blaOXA-58, blaIMP, blaVIM e Int1 pela técnica de PCR. As drogas com atividade in vitro foram a polimixina B e tigeciclina. Observou-se uma diversidade clonal, com a presença de 5 genótipos tipados por PFGE, com prevalência dos genótipos A (71,8%) e B(22,7%), presente em 7 e 5 hospitais, respectivamente. Dentre os 96 isolados produtores de OXA-23, fori selecionada uma cepa representativa de cada genótipo que foram submetidos a métodos de tipagem baseados em sequenciamento... / Acinetobacter baumannii is an opportunistic pathogen with increasing importance in hospital infections. In Brazil, it is particularly problematic because of its high prevalence and multidrug resistance, with the OXA-type carbapenemases representing the main mechanism responsible for such resistance. This study aimed to determine the genetic diversity, as well as phenotypic and molecular characterization of antimicrobial resistance and evaluation of virulence factors in Acinetobacter baumannii isolated from 10 public and private hospitals in Rio de Janeiro from 2005 to 2007. During this period 141 isolates of A. baumannii collected from patients admitted to ICUs or surgical wards have been studied. Species identification has been confirmed by detection of gene intrinsic blaOXA-51. The 110 isolates of A. baumannii resistant to imipenem showed multidrug resistance profile with rates above 98.2% for 8 of the 10 antibiotics tested and 98 (87.3%) produced the carbapenemase OXA-23. There was no amplification product for genes blaOXA-24, blaOXA-58, blaIMP, blaVIM and Int1 by PCR. The drugs with in vitro activity were polymyxin B and tigecycline. There was a clonal diversity, the presence of five genotypes typed by PFGE, with a prevalence of genotypes A (71.8%) and B (22.7%), present in 7 and 5 hospitals, respectively. Among the 96 strains producing OXA-23, one representative for each genotype that were subjected to typing methods based on sequencing was selected. By MLST (related to the database Oxford) four new STs were detected: ST131, ST132, ST133 and ST134 and when using the MLST-IP (developed by Institut Pasteur) the ST79, ST15 and two new allelic profiles were detected. Four SGs (SG1, SG4 and two new profiles) have been identified, allowing the association of 70% of isolates with the European Clone II. Sequencing of the blaOXA-51-like gene revealed the presence of blaOXA-66, blaOXA-95 and blaOXA-132. The blaOXA-23 gene was consistently found associated with the transposon Tn2006 and was chromosomally encoded in all isolates. Of 31 isolates susceptible to imipenem, 5 showed the blaOXA-23 gene and the insertion sequence ISAba1. However, the association of this sequence to the gene blaOXA-23 was detected only in isolates resistant to imipenem used as controls. The ISAba4 insertion sequence was not found in any isolated. These isolates were susceptible to imipenem and meropenem, with MICs ε 4 mg / mL for both antimicrobials. These isolates producing blaOXA-23 have been grouped into four distinct genotypes (B, C, G and I). Most isolates included in this study had plasmid (83.7%), with profiles ranging from 1 to 4. In search of biofilm production by colorimetric assay using crystal violet it was possible to observe the production of biofilm in 96.5% of isolates. Two representative isolates of the prevalent genotypes were evaluated for the degree of association at monolayer of A-549 cells by flow cytometry, and fluorescence optical microscopy. The adhesion was observed in all methodologies, with low rates of association for genotype A (11.9%) and genotype B (9.7%). The search for quorum-sensing carried out with representative isolates of the same prevalent genotypes were negative for the production of AHL inducer using Agrobacterium tumefaciens strain NT1. While the extract of the supernatant of the positive control of P. aeruginosa PAO1 and the reference standard AHL-C8 and AHL -C12 were positive. Data from this study are relevant to public health because they allow the knowledge of the molecular epidemiology of this species, as well as some of the virulence factors, which have been rarely described in Brazil, thus enhancing the monitoring and implementing control measures.

PINHEIRO, C. B. Isolamento de plastídios do endosperma de sementes em desenvolvimento de pinhão manso (Jatropha curcas L.). 2010. 103 f. Dissertação (Mestrado em Bioquímica) - Centro de Ciências, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2010. / Submitted by Francisco Lacerda (lacerda@ufc.br) on 2014-10-31T19:24:09Z No. of bitstreams: 1 2010_dis_cbpinheiro.pdf: 4619196 bytes, checksum: 9c3f62aee9c581ca0c832ec34ef6dab5 (MD5) / Approved for entry into archive by José Jairo Viana de Sousa(jairo@ufc.br) on 2015-01-16T17:02:32Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2010_dis_cbpinheiro.pdf: 4619196 bytes, checksum: 9c3f62aee9c581ca0c832ec34ef6dab5 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-01-16T17:02:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2010_dis_cbpinheiro.pdf: 4619196 bytes, checksum: 9c3f62aee9c581ca0c832ec34ef6dab5 (MD5) Previous issue date: 2010 / Jatropha (Jatropha curcas L.), belonging to the Euphorbiaceae family, is an oilseed plant with great potential for biofuel production because of the richness of lipids in their seeds. It also presents toxicity due to the presence of phorbol esters. In this context, the objective of this study is the isolation of plastids, the site of synthesis of fatty acids and phorbol esters, present in the endosperm of developing seeds of J. curcas. Preliminary experiments by testing morphology, histology and histochemistry was performed to determine the stage of seed development most suitable for the isolation of plastids present in the endosperm. These analyzes revealed that the deposition of lipids and proteins in the endosperm starts around the 30th DAA. The isolation of plastids, the endosperm of the seeds in this stage was performed by gradient centrifugation PBF-Percoll discontinuous (10%, 22%, 35%). The enriched fractions of plastids has been obtained from the band formed in the interface layer of 22-35%. Analysis by scanning electron microscopy and transmission were performed to confirm the efficiency of the protocol employed in the purification of the plastids. Two-dimensional maps have been laid, the "spots" detected in the same will be identified by mass spectrometry, which will allow the identification of the plastid proteins involved in the synthesis of fatty acids and phorbol esters in the endosperm of seeds J. curcas. / O pinhão manso (Jatropha curcas L.), pertencente à família Euphorbiaceae, é uma planta oleaginosa com grande potencial para a produção de biocombustível devido à riqueza de lipídios em suas sementes. Ele também apresenta toxicidade devido à presença de ésteres de forbol. Nesse contexto, o objetivo deste estudo é realizar o isolamento de plastídios, local de síntese de ácidos graxos e de ésteres de forbol, presentes no endosperma de sementes em desenvolvimento de J. curcas. Experimentos preliminares através de análises morfológica, histológica e histoquímica foram realizados para determinação do estágio do desenvolvimento da semente mais adequado para o isolamento de plastídios presentes no endosperma. Estas análises revelaram que a deposição de lipídios e proteínas no endosperma se inicia por volta do 30o DAA. O isolamento de plastídios, do endosperma de sementes nesse estágio foi realizado por centrifugação em gradiente descontínuo de PBF-Percoll (10%, 22%, 35%). A fração enriquecida de plastídios foi obtida a partir da banda formada na interface da camada de 22-35%. Análises por microscopia eletrônica de varredura e de transmissão foram realizadas para confirmar a eficiência do protocolo empregado na purificação dos plastídios. Mapas bidimensionais foram estabelecidos, os “spots” detectados nos mesmos serão identificados por espectrometria de massa, o que possibilitará a identificação das proteínas plastidiais envolvidas na síntese dos ácidos graxos e dos ésteres de forbol no endosperma de sementes de J. curcas.

ABREU, C. E. B. Alteraçãoes fisiológicas e bioquímicas em plântulas de cajueiro anão-precoce submetidas à salinidade em duas condições de cultivo. 2007. 127 f. Dissertação (Mestrado em Bioquímica) - Centro de Ciências, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2007. / Submitted by Francisco Lacerda (lacerda@ufc.br) on 2014-11-04T22:47:14Z No. of bitstreams: 1 2007_dis_cebabreu.pdf: 2486300 bytes, checksum: 3347d9268cf6d1f7b620ed02f952e478 (MD5) / Approved for entry into archive by José Jairo Viana de Sousa(jairo@ufc.br) on 2015-01-19T21:05:40Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2007_dis_cebabreu.pdf: 2486300 bytes, checksum: 3347d9268cf6d1f7b620ed02f952e478 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-01-19T21:05:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2007_dis_cebabreu.pdf: 2486300 bytes, checksum: 3347d9268cf6d1f7b620ed02f952e478 (MD5) Previous issue date: 2007 / Early-dwarf cashew seedlings (Anacardium occidentale L.) were used in order to investigate the physiological and biochemical changes induced by salt stress in two environmental conditions. The seedlings were cultivated in plastics pots containing only nutrient solution (control treatment) or nutrient solution with NaCl at 50, 100, 150 and 200 mM (saline treatment). They were kept in two environmental conditions: greenhouse and growth room. The effects of salinity on the growth, gas exchange, chlorophyll content, osmotic potential and organic (proline, soluble amino-N, soluble carbohydrates) and inorganic (Na+, Cl-, K+) solute contents from both leaves and roots were studied. Salt stress induced changes in gene expression were studied both in leaves and roots comparing 2D electrophoretic pattern. Salinity inhibited the growth of seedlings in both environmental conditions, being the reduction in seedlings growth in the greenhouse more conspicuous than those cultivated in the growth room. This fact was correlated with highest reductions in net photosynthetic rate, in transpiration and stomatal conductance of seedlings grown in the greenhouse when compared with those of growth room. In both cultivation conditions, the root growth was affected by NaCl than shoot growth. The salinity stress not caused great changes in CO2 internal concentration, suggesting that the inhibition of photosynthesis also may be attributed to non-stomatal factors. Leaf chlorophyll a, b and total contents were influenced by salinity and environmental conditions, being observed the highest contents and the lowest reductions of these pigments due to salinity in seedlings under growth room conditions. The readings of portable chlorophyll meter, SPAD-502, were positively correlated to leaf chlorophyll contents, expressed in g.cm-2, both in greenhouse and growth room conditions. In the salt stress conditions, the higher reductions of osmotic potential and higher Na+ and Cl- accumulations in leaves were observed in seedlings grown in the greenhouse. On the other hand, leaves K+ contents did not differ much among the cultivation conditions used. The roots accumulated greater amounts of Na+ and Cl- in their tissues, which were accompanied of great decreases in the K+ contents in both cultivation conditions. Proline content increased with the increase in salt stress especially in leaves, being the greater increases observed in seedlings cultivated in the greenhouse. The soluble carbohydrates contents were increased and decreased, due to salinity, only in leaves of seedlings of growth room and roots of those grown in the greenhouse, respectively. In both cultivation conditions, salinity increased the leaf and root soluble amino-N contents of cashew seedlings. The gene expression patterns both leaves and roots were altered by salt stress, in both environmental conditions. Salinity induced increases and decreases in expression of various proteins, being that some proteins disappeared completely and other were apparently synthesized de novo in the seedlings stressed. The proteins differentially regulated by salt stress were enough different among the environmental conditions used. Future studies should be focused on sequencing and identification of proteins whose rate of synthesis varied as a result of salinity, in order to better characterize their possible roles in the process of acclimation of cashew seedlings to salinity conditions. / O presente trabalho teve por objetivo estudar as respostas fisiológicas e bioquímicas de plântulas de cajueiro anão-precoce (Anacardium occidentale L.) à salinidade em duas condições ambientais de cultivo. Para isso, as plântulas foram cultivadas em vasos de polietileno contendo somente solução nutritiva (tratamento controle) ou solução nutritiva com NaCl a 50, 100, 150 e 200 mM (tratamentos salinos), sendo mantidas em duas condições ambientais: casa de vegetação e sala de germinação. Os efeitos do estresse salino foram avaliados através de medidas de crescimento, trocas gasosas, teores de clorofila, potencial osmótico foliar e teores de solutos orgânicos (prolina, N-aminossolúveis e carboidratos solúveis) e inorgânicos (Na+, Cl- e K+) nas folhas e raízes. Também foram estudadas as alterações na expressão gênica com a salinidade, o que foi feito através da comparação dos padrões eletroforéticos 2D das proteínas de folhas e raízes. A salinidade reduziu o crescimento das plântulas em ambas as condições ambientais de cultivo, sendo que nas plântulas da casa de vegetação, a inibição do crescimento foi mais acentuada do que naquelas da sala de germinação. Este fato correlacionou-se com as maiores reduções na fotossíntese líquida, na transpiração e na condutância estomática das plântulas da casa de vegetação em relação às da sala de germinação. Nas duas condições de cultivo, os efeitos inibitórios do NaCl foram mais conspícuos nas raízes do que na parte aérea. A salinidade não causou grandes mudanças nas concentrações internas de CO2 das plântulas de cajueiro, sugerindo a participação de fatores não-estomáticos na inibição das taxas fotossintéticas. Os teores foliares de clorofila a, b e total foram influenciados pela salinidade e pelas condições de cultivo das plântulas, sendo que as da sala de germinação apresentaram os maiores conteúdos e as menores reduções desses pigmentos devido à salinidade. As leituras feitas com o medidor portátil de clorofila, SPAD-502, correlacionaram-se positivamente com os teores foliares de clorofila, expressos em g.cm-2, tanto nas plântulas da casa de vegetação quanto nas da sala de germinação. As maiores reduções no potencial osmótico e os maiores acúmulos de Na+ e Cl- nas folhas pela salinidade, em relação ao controle, foram observados nas plântulas da casa de vegetação. Por outro lado, os teores de K+ nesse órgão não diferiram muito entre as duas condições de cultivo empregadas. As raízes acumularam grandes quantidades de Na+ e Cl- em seus tecidos, as quais foram acompanhadas de grandes decréscimos nos teores de K+, em ambas as condições de cultivo. Com o aumento da salinidade, os teores de prolina foram aumentados, principalmente nas folhas, sendo os maiores incrementos observados nas plântulas da casa de vegetação. Os teores de carboidratos solúveis foram aumentados e reduzidos, devido à salinidade, somente nas folhas das plântulas da sala de germinação e nas raízes das plântulas da casa de vegetação, respectivamente. Nas duas condições de cultivo, a salinidade aumentou os teores de N-aminossolúveis nas folhas e nas raízes das plântulas de cajueiro. O padrão de expressão gênica das folhas e das raízes foi alterado pelo estresse salino em ambas as condições ambientais. A salinidade causou aumentos e diminuições nas taxas de expressão de várias proteínas, sendo que algumas desapareceram completamente e outras foram aparentemente sintetizadas de novo nas plântulas estressadas. As proteínas diferencialmente reguladas pelo estresse salino foram bastante diferentes nas duas condições ambientais empregadas. Faz-se necessário o seqüenciamento e a identificação dessas proteínas para que se possa especular sobre seus possíveis papéis no processo de aclimatação das plântulas de cajueiro às condições de salinidade.

SOUSA, F. M. L. Estudo das características do aparelho reprodutivo, epitélio seminífero e mapas eletroforéticos bidimensionais do plasma seminal de carneiros Morada Nova. 2010. 91 f. Dissertação (Mestrado em Zootecnia) - Centro de Ciências Agrárias, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2010. / Submitted by Daniel Eduardo Alencar da Silva (dealencar.silva@gmail.com) on 2014-12-10T19:34:09Z No. of bitstreams: 1 2010_dis_fmlsousa.pdf: 576755 bytes, checksum: f5cddfae0f4b87979c19cb614cd3cf53 (MD5) / Approved for entry into archive by José Jairo Viana de Sousa(jairo@ufc.br) on 2016-03-22T15:06:43Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2010_dis_fmlsousa.pdf: 576755 bytes, checksum: f5cddfae0f4b87979c19cb614cd3cf53 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-03-22T15:06:43Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2010_dis_fmlsousa.pdf: 576755 bytes, checksum: f5cddfae0f4b87979c19cb614cd3cf53 (MD5) Previous issue date: 2010 / Information on the reproductive physiological aspects about Morada Nova breed, especially for males, are still few and the lack of knowledge about that becomes a hindrance to implementation best management strategies and reproductive biotechnologies, based on this, this study aimed to describe the biometric characteristics of the reproductive tract in Morada Nova sheep as well as quantitative and qualitative aspects of spermato genesis and correlate them, and to characterize the electrophoretic maps of the seminal plasma of these animals. Semen was collected by electroejaculation in 15 male sheep of the Morada Nova breed, of which only 12 responded. The samples were centrifuged, for separation of seminal plasma , where it was used to determine of total protein concentration and protein profile by denaturing electrophoresis in polyacrylamide gel (SDS - PAGE). Biometric data were obtained from the testicles, epididymis and accessory s ex glands of the group of 15 animals that were slaughtered with an average age of 42 weeks and average weight of 28 kg. Immediately before slaughter, was taken to measure scrotal circumference (SC) of each animal . Then , the testicles, epididymis and access ory sex glands were weighed and measured individually (left and right). Testicles samples were fixed in Bouin's fluid for evaluation of seminiferous tubules. The testicular parenchyma was evaluated for diameter (TD), volume (VT) and length of seminiferous tubules, germinal epithelium height (EA) and a population of Sertoli cells and germinal cells. The proportion of testicular parenchyma occupied by seminiferous tubules was equivalent to 84.8 ± 0.1%. The overall yield of spermatogenesis was 59.8 ± 3.73 cell s. Each Sertoli cell (SC) was able to sustain 7.7 ± 0.51 round spermatids. Were realized analyses using Pearson correlation (p <0.05) between the studied characteristics and the variables were described as means and their respective standard errors using t he statistical program Statview, 5.0 (SAS, 2003). No difference was detected between the left and right values for any of the testicular parameters, epididymal and accessory sex glands. Significant correlations were found between weight and other measures testicle: length (TL), diameter (TD) and volume of parenchyma (VPAR) and other measures of reproductive tract as weight (PEP) and total length of the epididymis (TLE) and of body of the epididymis (LBEp). The testicular weight and diameter, were indicators of the reproductive function of the ram was correlated with all histologic described. For electrophoresis analysis, a total of 103 spots were identified, 45 these being present in all gels, and these spots presents in gel indicate the presence of importan t proteins in the seminal plasma. According to the results, measures of gonads showed correlations with the other structures of the reproductive tract and spermatogenic activity, and electrophoretic maps of seminal fluid were similar to Santa Inês sheep ad ults / Informações sobre aspectos fisiológicos reprodutivos da raça Morada Nova, especialmente para os machos, ainda são escassas e a falta destes conhecimentos torna-se um empecilho para aplicação de melhores estratégias de manejo e biotécnicas reprodutivas. Baseado nisto, este estudo teve como objetivos descrever as características biométricas do aparelho reprodutivo em ovinos Morada Nova e os aspectos quanti-qualitativos da espermatogênese e correlacioná-los, bem como caracterizar os mapas eletroforéticos das proteínas do plasma seminal destes animais. Foi realizada coleta de sêmen, por meio de eletroejaculação em 15 ovinos da raça Morada Nova, dos quais apenas 12 responderam. As amostras de sêmen foram centrifugadas para separação do plasma seminal, onde este foi utilizado na determinação da concentração protéica total e do perfil protéico através de eletroforese desnaturante em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE). Os dados biométricos foram obtidos a partir dos testículos, epidídimos e das glândulas sexuais acessórias do grupo de 15 animais que foram abatidos com idade média de 42 semanas e peso vivo médio de 28 kg. Imediatamente antes do abate, foi tomada a medida de circunferência escrotal (CE) de cada animal. Em seguida, os testículos, epidídimos e glândulas sexuais acessórias foram pesados e mensurados individualmente (direito e esquerdo). Amostras dos testículos foram fixadas em fluido de Bouin para avaliação dos túbulos seminíferos. O parênquima testicular foi avaliado quanto ao diâmetro (DT), volume (VT) e comprimento dos túbulos seminíferos, altura do epitélio germinativo (AE) e população de células de Sertoli e germinativas. A proporção do parênquima testicular ocupado por túbulos seminíferos foi o equivalente a 84,8 ± 0,1%. O rendimento geral da espermatogênese foi de 59,8 ± 3,73 células. Cada célula de Sertoli (CS) foi capaz de sustentar 7,7 ± 0,51 espermátides arredondadas. Foram realizadas análises de correlação de Pearson (p < 0.05) entre as características estudadas e as variáveis foram descritas na forma de médias e respectivos erros-padrão através do programa estatístico StatView, 5.0 (SAS, 2003). Nenhuma diferença foi detectada entre os valores direito e esquerdo para nenhum dos parâmetros testiculares, epididimários ou das glândulas sexuais acessórias. Correlações significativas foram verificadas entre peso e as demais medidas testiculares: comprimento (CT), diâmetro (DT) e volume do parênquima (VPar) e outras medidas do aparelho reprodutor como peso (PEp) e comprimento total (CEp) do epidídimo e comprimento do corpo do epidídimo (CCorpEp). O peso e diâmetro testicular, mostraram-se indicadores da função reprodutiva do carneiro estando correlacionado com todas as variáveis histológicas descritas. Com relação à análise eletroforética bidimensional, um total de 103 spots foram identificados, estando 45 destes presentes em todos os géis, os spots presente indicam a presença de proteínas importantes do plasma seminal. De acordo com os resultados obtidos, as medidas das gônadas apresentaram correlações com as demais estruturas do trato reprodutivo e atividade espermatogênica, e os mapas eletroforéticos do fluido seminal mostraram-se semelhantes aos de ovinos Santa Inês adultos.

NOGUEIRA, F. C. S. Análise Proteômica da Deposição de Proteínas em Sementes em Desenvolvimento e Suspensões Celulares Embriogênicas de Feijão-de-Corda [Vigna unguiculata (L.) Walp.]. 2007. 115 f. Dissertação (Mestrado em Bioquímica) - Centro de Ciências, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2007. / Submitted by Francisco Lacerda (lacerda@ufc.br) on 2015-01-20T17:44:07Z No. of bitstreams: 1 2007_dis_fcsnogueira.pdf: 6829018 bytes, checksum: 30255479dbcd955131fd948802974d2e (MD5) / Approved for entry into archive by José Jairo Viana de Sousa(jairo@ufc.br) on 2015-02-27T19:30:17Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2007_dis_fcsnogueira.pdf: 6829018 bytes, checksum: 30255479dbcd955131fd948802974d2e (MD5) / Made available in DSpace on 2015-02-27T19:30:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2007_dis_fcsnogueira.pdf: 6829018 bytes, checksum: 30255479dbcd955131fd948802974d2e (MD5) Previous issue date: 2007 / Cowpea (Vigna unguiculata) is a leguminous plant highly utilized by low-income earners of Northeastern Brazil. However, proteins found in the crop are highly deficient in sulfur-containing amino acids. In line with this, improvement of nutritional quality of cowpea seeds has been one of the major goals of breeding programs of the crop. A starting point in this respect is a concerted effort to study the basic biochemical and physiological aspects of the development of cowpea seed. Besides determining the protein deposition pattern during the development of zygotic embryos and somatic embryos of the species, we set out to identify genes with specific pattern of expression during the two processes which will be of immense importance in cowpea breeding. Using the technique of two-dimensional electrophoresis (2D-PAGE), we compared the protein deposition pattern of developing cowpea seeds with 10 days after anthesis (DAA) and mature seeds and embryogenic cell suspension (ECS). From each developmental stage and for ECS, we obtained proteomic reference maps that were highly reproducible within the pH of 3-10 and 4-7. Various spots were selected based on quantity or relative volume and rate of expression. About 800 (for seeds development) and 130 (for ECS) proteins spots up- or down-regulated, remained constantly expressed and were specific for each developmental stage. The spots were removed from the 2-D gels, processed, and subjected to mass spectrometry. Some strategies like peptide mass fingerprinting (PMF) and non-processed data search (MS/MS ion search) were employed for protein identification. Over 400 proteins in seeds and over 70 proteins in ECS were identified. A large number of these proteins were found to be primary metabolism proteins, energy, protein destination and storage and defense proteins and others related to stress. / O feijão-de-corda (Vigna unguiculata) é uma leguminosa bastante utilizada na alimentação de famílias de baixa renda da região nordeste do Brasil. Embora suas sementes sejam ricas em proteínas, estas são deficientes em aminoácidos sulfurados na sua composição. Dessa forma, um aumento na qualidade nutricional dessas sementes tem sido um dos principais objetivos dos programas de melhoramento genético para essa espécie. Além de determinar o padrão de deposição de proteínas durante o desenvolvimento de embriões zigóticos e somáticos, nós pretendemos identificar genes com padrões específicos de expressão durante a embriogênese com a finalidade de utilizá-los em programas de melhoramento genético. Utilizando a técnica de eletroforese bidimensional (2D-PAGE) foi comparado o padrão protéico de sementes em desenvolvimento com 10 dias após a antese (DAA), sementes maduras e de suspensões celulares embriogênicas (SCE) obtidas de calos embriogênicos friáveis (CEF) de feijão-de-corda. Para cada estágio de desenvolvimento da semente e para as SCE foram obtidos mapas de referência proteômicos altamente reprodutíveis numa faixa de pH de 3-10 e 4-7. Vários “spots” foram selecionados baseando-se na quantidade ou volume relativo de cada “spot” e na taxa de expressão. Cerca de 800 (para sementes em desenvolvimento) e 130 (para SCE) “spots” protéicos regulados para cima, para baixo, que se mantêm constantes ou que são específicos durante o desenvolvimento foram retirados dos géis 2D para análise por espectrometria de massa. Algumas estratégias foram utilizadas para a identificação das proteínas, como: PMF (peptide mass fingerprinting) e busca através de dados não processados (MS/MS ion search). Dessa forma, cerca de 400 proteínas foram identificadas em sementes e cerca de 70 proteínas foram identificadas para SCE. A maioria das proteínas fram classificadas como proteínas do metabolismo primário, energético, proteínas de destinação/proteínas de reserva e proteínas de defesa ou relacionadas a algum tipo de estresse.

OLIVEIRA, Geórgia Mesquita de. Prospecção de proteínas envolvidas no amadurecimento pós-colheita da graviola (Annona muricata L.), 2011. 83 f. : Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal do Ceará, Centro de Ciências, Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular, Programa de Pós-Graduação em Bioquímica, Fortaleza-CE, 2011. / Submitted by Eric Santiago (erichhcl@gmail.com) on 2016-05-20T12:45:41Z No. of bitstreams: 1 2011_dis_gmoliveira.pdf: 22870177 bytes, checksum: 523d913e6270072f06047beb7e1591f1 (MD5) / Approved for entry into archive by Nádja Goes (nmoraissoares@gmail.com) on 2016-05-20T13:10:48Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2011_dis_gmoliveira.pdf: 22870177 bytes, checksum: 523d913e6270072f06047beb7e1591f1 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-05-20T13:10:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2011_dis_gmoliveira.pdf: 22870177 bytes, checksum: 523d913e6270072f06047beb7e1591f1 (MD5) Previous issue date: 2011 / The soursop (Annona muricata L.) fruit is widely used in food, because it provides vitamins, carbohydrates, proteins, lipids and other molecules for human nutrition. In recent years, soursop (exotic tropical fruit) has had a prominent position in the Brazilian economy, especially for northeastern states such as, Ceara, Alagoas, Bahia and Pernambuco. The high production of soursop fruit is mainly in the Northeast by flowering occurs throughout the year, however it is estimated that the post-harvest losses reach 50% of production, as with other native or exotic fruits. Such post-harvest losses of the product are due to the accelerated rate of development and senescence of the fruit. Although some studies on Graviola, biochemical and molecular understanding of the maturation process is very limited making it important to move forward on this knowledge to develop strategies for increasing the shelf life of fruit. In this study, we sought a better protocol for protein extraction from soursop pulp to generate two-dimensional maps and identification of potential proteins involved in post-harvest ripening of the fruit. The soursop fruit in pre-climacteric stage were collected and allowed to ripen at 25 ° C for up to 8 days. Samples of the fruit pulp were collected at 0, 2, 4, 6 and 8 days post-harvest and used for protein extraction and establishment of two-dimensional gels (2D). Two different protein extraction methods were tested and the best one concerning performance and spots with good resolution in two-dimensional gel was chosen for protein analysis. The two-dimensional gels were analyzed using the Image Master for the identification of specific or differential spots, as well as determination of their isoelectric points (IPs) and their molecular masses (MM). The pI and MM data were used to track homologous proteins in angiosperms through searches on databases UniProtKB / Swiss-Prot and UniProtKB / Tremble featuring more than 16 million deposited information. 2D gels initially produced in the pH range 3 to 10 revealed the protein concentrated in the more acidic pHs. This fact determined the pH range 4-7 was used for better separation of spots in the following analysis. After two-dimensional gel analysis of 21 specific spots and 6 differential spots were selected. The analysis in databases allowed inferences about 26 proteins. Among these proteins, several were related to fruit ripening in other species such as proteins with expression regulated by ethylene, protein related to the establishment of the organoleptic characteristics of the fruit and proteins of energy metabolism. With respect to the metabolism of proteins glycolytic pathway, Krebs cycle and ETC were inferred. Previous studies on the participation of the alternative pathway of electrons in the ripening of climacteric graviola have been strengthened. However, this study also showed that in addition to the alternative oxidase (AOX), other components may participate in the regulation of this pathway. The results reveal possible protein targets for the development of strategies and biochemical and molecular control of postharvest ripening of soursop. / A graviola (Annona muricata L.) é uma fruta bastante utilizada na alimentação, pois fornece vitaminas, carboidratos, proteínas, lipídios, fibras e outras moléculas para nutrição humana. Nos últimos anos a graviola (fruto tropical exótico) tem apresentado uma posição de destaque na economia brasileira, principalmente para Estados do Nordeste como Ceará, Alagoas, Bahia e Pernambuco. A alta produção do fruto de graviola no Nordeste se dá principalmente pela floração ocorrer durante o ano todo, contudo estima-se que a perda pós-colheita chega a 50% da produção, como ocorre com outros frutos nativos ou exóticos. Tal perda pós-colheita do produto se deve à acelerada taxa de desenvolvimento e senescência do fruto. Apesar de haver alguns estudos sobre graviola, o entendimento bioquímico e molecular do processo de amadurecimento é muito limitado tornando-se importante avançar nesses conhecimentos a fim de desenvolver estratégias para o aumento da vida de prateleira desse fruto. No presente trabalho, buscou-se por um melhor protocolo de extração de proteínas da polpa de graviola para gerar mapas bidimensionais e identificação de possíveis proteínas envolvidas no amadurecimento pós-colheita do fruto. Os frutos de graviola no estádio pré-climatérico foram colhidos e deixados amadurecer a temperatura de 25° C por até 8 dias. Amostras da polpa do fruto foram coletadas nos tempos 0, 2, 4, 6 e 8 dias pós-colheita e usadas para a extração de proteínas e estabelecimento de géis bidimensionais (2D). Dois diferentes métodos de extração de proteínas foram testados e o que apresentou melhor rendimento e spots com boa resolução em géis bidimensionais foi escolhido para análise de proteínas. Os géis bidimensionais foram analisados através do programa Image Master para a identificação de spots específicos e ou diferenciais, bem como determinação de seus pontos isoelétricos (pIs) e de respectivas massas moleculares (MM). Os dados de pI e MM foram usados para rastrear proteínas homólogas em angiospermas através de buscas nos bancos de dados UniProtKB/Swiss-Prot e UniProtKB/TrEMBL dispondo de mais de 16 milhões de informações depositadas. Géis 2D inicialmente produzidos na faixa de pH de 3 a 10 revelaram proteínas concentradas na região de pHs mais ácidos. Tal fato determinou que a faixa de pH de 4 a 7 fosse usada para melhor separação dos spots em análises seguintes. Após análise dos géis bidimensionais 21 spots específicos e 6 spots diferenciais foram selecionados. As análises em bancos de dados possibilitaram inferir sobre 26 proteínas. Entre essas proteínas, várias estavam relacionadas com o amadurecimento de frutos em outras espécies tais como: proteínas com expressão regulada pelo etileno, proteínas relacionadas com o estabelecimento das características organolépticas do fruto e proteínas do metabolismo energético. Com relação ao metabolismo enegético proteínas da via glicolítica, ciclo de Krebs e CTE foram inferidas. Estudos prévios sobre a participação da via alternativa de elétrons no amadurecimento climatérico da graviola foram reforçados. Entretanto, nesse trabalho foi observado que além da oxidase alternativa (AOX), outros componentes podem participar da regulação dessa via. Os resultados obtidos revelam possíveis proteínas alvo para o desenvolvimento de estratégias bioquímicas e ou moleculares no controle do amadurecimento pós-colheita da graviola.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Farmácia, Florianópolis, 2013. / Made available in DSpace on 2013-12-05T22:38:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 319247.pdf: 32035397 bytes, checksum: 6df6a033e9092129decad1ea6f038289 (MD5) Previous issue date: 2013 / O gênero Passiflora é o mais importante da família Passifloraceae e suas espécies são conhecidas popularmente no Brasil como 'maracujás'. As folhas de várias espécies de Passiflora são usadas sob a forma de chá, como calmante e suave indutor do sono. O fruto de algumas espécies, além do uso terapêutico popular, é amplamente utilizado pela indústria alimentícia para fabricações de sucos e derivados. Além das espécies de ocorrência no Brasil, a Colômbia também representa o centro de dispersão de muitas espécies de Passiflora, das quais algumas também apresentam elevada importância econômica, etnofarmacológica e terapêutica. Contudo, apesar do grande número de espécies de Passiflora na América Latina, muitas ainda carecem de estudos a respeito de seus constituintes químicos. O presente trabalho teve como objetivo principal investigar a composição química de extratos aquosos das folhas de algumas espécies de Passiflora de ocorrência no Brasil (P. alata) e outras de ocorrência predominante na Colômbia (P. quadrangularis, P. bogotensis, P. tripartita var. mollissima). Foram realizadas análises qualitativas por técnicas cromatográficas (Cromatografia Camada Delgada, Cromatografia Líquida de Alta Eficiência, Cromatografia Líquida de Ultra Eficiência) e eletroforéticas (Eletroforese Capilar) dos perfis de flavonoides, saponinas, alcaloides e aminoácidos nos extratos aquosos das espécies de Passiflora supracitadas. Foi observada a presença de flavonoides e aminoácidos nos extratos das quatro espécies analisadas, com destaque para a grande diversidade de flavonoides glicosilados visualizados para P. tripartita var. mollissima. Saponinas foram observadas somente nos extratos aquosos das espécies P. alata e P. quadrangularis enquanto que a presença de alcaloides do tipo harmano não foi detectada nos extratos aquosos de nenhum das quatro espécies em concentrações superiores a 0,0187 ppm. Também foi utilizada a técnica de Cromatografia Contracorrente de Alta Velocidade em modo de eluição em gradiente para o isolamento de flavonoides glicosilados a partir dos extratos aquosos das folhas de P. quadrangularis e P. bogotensis. Da primeira espécie, foram isolados quatro flavonoides C-glicosídeos, identificados por técnicas espectroscópicas e espectrofotométricas como 2?-O-xilosil-vitexina, 2?-O-glicosil-vitexina, 2?-O-xilosil-orientina e 2?-O-glicosil-orientina. Da segunda espécie, foram isoladas e elucidadas seis flavonoides C-glicosídeos, dois deles ainda não descritos na literatura: 6-C-a-L-ramnopiranosil-(1?2)-(6?-acetil)-ß-D-glicopiranosil-apigenina e 6-C-a-L-ramnopiranosil-(1?2)-(6?-acetil)-ß-D-glicopiranosil-luteolina, além de isovitexina, isoorientina, 2?-O-ramnosil-isovitexina e 2?-O-ramnosil-isoorientina. Por técnicas cromatográficas diversas, foram isoladas três saponinas do extrato aquoso das folhas de P. quadrangularis, para as quais suas estruturas foram elucidadas por técnicas espectroscópicas como 3-O-ß-D-glicopiranosil-9,19-ciclolanost-24Z-en-1a,3ß,21,26-tetraol e 3-O-ß-D-glicopiranosil-9,19-ciclolanost-24Z-en-1ß,3ß,21,26-tetraol, saponinas ainda não descritas na literatura, além do 3-O-ß-D-glicopiranosil-(1?2)-ß-D-glicopiranosídeo do ácido oleanólico. Adicionalmente, uma análise comparativa entre as espécies P. alata e P. quadrangularis, as quais apresentam grande similaridade morfológica, indicou que os flavonoides C-glicosídeos majoritários dos extratos aquosos das folhas de cada espécie (2?-O-ramnosil-vitexina para P. alata e 2?-O-xilosil-vitexina para P. quadrangularis) podem ser utilizados como marcadores químicos na diferenciação dessas duas espécies. <br>

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Agrárias, Programa de Pós-Graduação em Ciência dos Alimentos, Florianópolis, 2016. / Made available in DSpace on 2016-10-18T03:05:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 341958.pdf: 2212678 bytes, checksum: 6c1d80fbabb7329a2f6b28745066a1da (MD5) Previous issue date: 2016 / Análises amplas de perfil podem complementar a avalição de culturas vegetais alimentares. A proteômica comparativa permite observar diferenças entre o perfil de proteínas entre duas culturas equivalentes, que diferem apenas pela expressão de uma característica. Neste contexto, as técnicas de eletrophorese bidimensional (2-DE) seguida de espectrometria de massa (MS) foram utilizadas para avaliar variedades de feijão geneticamente modificado (GM) Embrapa 5.1 e genótipos de milhos mutantes com diferentes teores de flobafenos. No primeiro trabalho, o perfil de proteínas dos grãos de duas variedades de feijão, Pérola e Pontal, derivadas do evento Embrapa 5.1, foram comparadas com suas contrapartes não-GM. Foram detectados 23 spots diferencialmente acumulados entre Pérola GM e Pérola não-GM e 21 spots diferencialmente acumulados entre Pontal GM e Pontal não-GM. Entre os spots detectados como diferencialmente acumulados, oito proteínas foram identificadas em Pérola e quatro proteínas em Pontal. A função das proteínas identificadas nas variedades Pérola e Pontal não foram as mesmas, indicando que a variabilidade observada não está relacionada a transformação genética. Além disso, aplicamos análise de componentes principais (PCA) aos dados obtidos por 2-DE e a variação entre as variedades foi explicada nos dois primeiros componentes. No segundo trabalho, comparou-se os proteomas dos grãos de dois genótipos de milho não comerciais, P1-rr (R) e P1-ww (W) que apresentam alto e baixo conteúdo de flobafenos, respectivamente. A comparação por ANOVA resultou em 55 spots diferencialmente expressos. Após análise de MS, oito proteínas foram identificadas. Aplicou-se PCA a porcentagem de volume de 135 spots combinados em todos os seis géis analisados, e foi observada a separação dos perfis de proteína dos dois genótipos de milho. Os resultados obtidos nos dois estudos demonstram que a técnica 2-DE seguida por MS, acompanhada de PCA, é aplicável para análise de grãos que se diferenciam pela expressão de uma característica, assim como é possível diferenciar cultivares GM e não GM.<br> / Abstract : Profile analyses are complementary for crop food assessment. The comparative proteomics allows observing differences between the protein profiles between two equivalent cultures that differ in a feature. In this context, two-dimensional electrophoresis (2-DE) technique was used followed by mass spectrometry (MS) to evaluate genetically modified (GM) common bean varieties (EMBRAPA 5.1) and maize genotypes with different phlobaphenes contents. In the present work grain proteome profiles of two Embrapa 5.1 common bean varieties, Pérola and Pontal, and their non-GM counterparts were compared by two dimensional gel electrophoresis (2-DE) followed by mass spectrometry (MS). Analyses detected 23 spots differentially accumulated between GM Pérola and non - GM Pérola and 21 spots between GM Pontal and non-GM Pontal. Among them, eight proteins were identified in Perola varieties, and four proteins were identified in Pontal. Although, they were not the same proteins in Perola and Pontal varieties, indicating that the variability observed may not be due the genetic transformation. Moreover, we applied principal component analysis (PCA) on 2-DE data, and variation between varieties was explained in first two principal components. In this study the grain proteomes of the two genotypes of non-commercial maize, P1-rr (R) and P1-ww (W), with high and low flavonoid content, were also compared. ANOVA comparison resulted in 55 spots differentially accumulated. After MS analyses, eight proteins were identified. PCA was applied in the volume percentage of the 135 matched spots in all six gels. The multivariate analysis showed the separation of protein profiles of the two maize genotypes using 2-DE data. The results of both studies show that 2-DE followed by MS, accompanied by PCA, is applicable for profile analysis of grains that differ by one characteristic, and it is possible to differentiate between GM and non-GM varieties.

Made available in DSpace on 2015-07-13T12:10:13Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-12-04. Added 1 bitstream(s) on 2015-07-13T12:25:38Z : No. of bitstreams: 1 000820042_20170105.pdf: 432472 bytes, checksum: 08e4755bdb655578ffb7bb04d02a9c1b (MD5) Bitstreams deleted on 2017-01-06T13:21:19Z: 000820042_20170105.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2017-01-06T13:22:02Z : No. of bitstreams: 1 000820042.pdf: 1098934 bytes, checksum: 899c7c3dd733d16d32b9ed613fb157f1 (MD5) / O uso de novas tecnologias como, por exemplo, peptídeos sintéticos para o desenvolvimento de novas drogas é uma estratégia promissora no campo da biotecnologia. Peptídeos com efeito antimicrobiano derivados de toxinas bacterianas intracelulares, produzidas por sistemas de morte pós-segregacional (PKS) tais como CcdB são exemplos dessa estratégia. Resultados promissores têm sido obtidos em relação à inibição da atividade das enzimas bacterianas topoisomerase IV e DNA girase por derivados peptídicos de toxinas antimicrobianas, isto pode ser visto através de ensaios in vitro, como eletroforese em gel de agarose. Porém, drogas com estrutura peptídica derivadas de toxinas bacterianas apresentam sérios problemas na aplicação terapêutica, pois, têm baixa solubilidade e difícil permeabilidade em membranas bacterianas. Portanto, o objetivo desse estudo consiste no desenvolvimento e aprimoramento de sistemas nanoestruturados (lipossomas) que permita a encapsulação de análogos peptídicos da toxina CcdB e sua consequente translocação no citosol bacteriano, permitindo que os mesmos atinjam seus alvos celulares, que são as enzimas bacterianas DNA girase e Topoisomerase IV. Lipossomas do tipo SUV (Small unilamellar vesicles) de 100 nm de diâmetro, foram preparados pela técnica de extrusão e evaporação variando-se a composição química de suas formulações. Desta forma, foi avaliada a eficiência de encapsulação dos peptídeos através de técnicas de cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) e espectroscopia de UV-Vis e fluorescência. Após testes de eficiência de encapsulação, os lipossomas contendo os análogos peptídicos da toxina CcdB encapsulados, foram submetidos a ensaio de inibição de crescimento em meio líquido para diferentes espécies bacterianas. Os resultados mostraram que os valores de eficiência para o análogo CdBSG-2 ficaram entre 62 e 75% e... / The new technologies, like synthetic peptides, for the development new drugs is a promising in biotechnology. Peptides with antibiotic properties, from Intracellular toxins produced by systems of post-segregational killer (PSK) in bacteria such as CcdB are recent examples of this strategy. Promising results have been obtained with respect to inhibition of the activity of the bacterial enzyme DNA gyrase and topoisomerase IV by toxins antimicrobial peptide derivatives that can be seen through in vitro assays such as electrophoresis in agarose gel. However, drugs formed by peptide structures, based on bacterial toxins, have been shown serious problems in therapeutic application due to their poor solubility and low biological membrane permeabilization. The aim of this study is the development and enhancement of nanostructured systems (liposomes) that allows the encapsulation of analogues peptides based on CcdB toxin and its consequent bacterial translocation in the cytosol, allowing them to reach their cellular targets, which are bacterial enzymes DNA gyrase and topoisomerase IV. Liposomes of the SUV type (Small unilamellar vesicles) of 100 nm diameter were prepared by extrusion and evaporation technique by varying the chemical composition of their formulations.Thus, we evaluated the encapsulation efficiency of the peptides through techniques of high performance liquid chromatography (HPLC) and UV-Vis spectroscopy and fluorescence. After efficiency of encapsulation tests the liposomes containing the peptides have been tested for growth inhibition in a liquid medium to different bacterial species. The results showed that the efficiency values for the analog CdBSG-2 were between 62 and 75% and the CcdBET-2 analogue values were between 52 and 71% Furthermore, the results of bacterial growth inhibition tests showed liposomal system that is effective, to inhibit 82% of gram positive Staphylococcus aureus...

A aplicação de uma diferença de potencial entre os extremos de um capilar de material dielétrico, preenchido com solução aquosa, provoca um fluxo eletroosmótico através deste. As moléculas, de um pequeno volume de uma amostra injetada neste fluxo, se separam umas das outras devido a diferença entre suas mobilidades eletroforéticas. Este método de separação é conhecido como Eletroforese Capilar. Ele tem se mostrado muito eficiente na separação de moléculas orgânicas complexas e é um método complementar à Cromatografia Líquida. Os sistemas de detecção mais comumente utilizados são do tipo eletroquímico ou ópticos, estes últimos podem ser de absorção ou fluorimétricos. Alta sensibilidade tem sido obtida com sistemas de detecção com fluorescência induzida a lazer, como o de Argônio, Hélio-Cádmio e de semicondutor. Neste trabalho testamos o desempenho de um laser ultravioleta pulsado, usando o mini-laser de N2 (337 nm), para induzir a fluorescência em moléculas marcadas com marcadores moleculares fluorogênicos apropriados. Para aminoácidos obtivemos limites de detecção da ordem de alguns attomóis(10-18 mol).Em condições otimizadas a quantidade mínima detectável de melatonina e serotonina, usando o marcador molecular fluorogênico isotiocianato de fluoresceÍna, foi de 150 attomóis, que corresponde a um limite de detecção em concentração de 50 nM. Os peptídeos bradicinina, lisil-bradicinina e metionil-lisil-bradicinina foram separados entre si e detectados no limite de detecção em concentração de 1,2 fmóis quando marcados com fluorescamina e a 90 attomóis quando com orto"ftaldialdeído. Do nosso conhecimento, esta é a primeira vez que um laser pulsado (N2) é usado num sistema de detecção de eletroforese capilar.