La producción in vitro (PIV) de embriones caprinos mediante técnicas de maduración, fecundación y cultivo embrionario in vitro (MIV-FIV-CIV) proporciona un elevado número de embriones utilizables a nivel científico y/o comercial. El objetivo del este estudio ha sido seleccionar ovocitos de cabra prepuber y sistemas de maduración in vitro para mejorar la producción in vitro de embriones. Los ovocitos se maduraron en medio TCM199 + piruvato sódico + L-glutamina + gentamicina + 10% suero bovino de macho castrado (SS) + 10 mg/ml LH + 10 mg/ml o-FSH + 1 mg/ml 17b-estradiol. Tras 27 h de MIV, los ovocitos se inseminaron con semen fresco (3.5x106 espermatozoides/ml) en medio TALP suplementado con 1 mg/ml de hipotaurina. A las 24 h post-inseminación, se cultivaron en medio SOFm y se mantuvieron 7 días en cultivo. En el Estudio 1, se evaluó la utilidad del test de Azul de Cresol Brillante (BCB) para seleccionar los ovocitos de cabras prepúberes. Los ovocitos BCB+ (ovocitos con citoplasma coloreado de azul, crecimiento finalizado) presentaron un mayor diámetro (136.6 ¡À 6.3 mm; P<0.001) y mayores tasas de maduración nuclear (81.4%; P<0.05), fecundación normal (23.5%; P<0.0001) y desarrollo más allá del estadio de 8 células (41.3%; P<0.001) y de mórulas más blastocistos (12.0%; P<0.05) que los ovocitos no coloreados de azul.En el Estudio 2, se utilizó el Factor de Crecimiento Epid¨¦rmico (EGF), para la maduración in vitro. Para ello, se comparó un medio suplementado con hormonas (LH, FSH y 17b-estradiol) y suero (SS o FCS) con un medio suplementado con 10 ng de EGF en ausencia de suero y hormonas. El porcentaje de ovocitos fecundados de forma normal fue inferior (P<0.05) cuando se empleó EGF (17.3%) que SS (SS: 27.2%; FCS: 29.0%). Las tasas de embriones totales (71.5%) y de embriones que superaron el estadio de 8 células (26.2%) fueron superiores (P<0.05) al emplear SS y hormonas en el medio de maduración.En el Estudio 3, se analizó el efecto de la adición de compuestos tiol (100 ¦ÌM de cisteamina, 100 ¦ÌM de b-mercaptoetanol, 0.57 mM de cisteína y 0.57 mM de cistina) al medio de MIV. Los ovocitos madurados en presencia de cisteamina y b-mercaptoetanol mostraron mayor capacidad (P<0.01) para formar el pronúcleo masculino tras la penetración espermítica (88.0% y 97.1%) y para ser fecundados (P<0.01) de forma normal (72.0% y 77.1%) comparados con el grupo control (62.2% y 37.8%, respectivamente). Asimismo, la adición de cisteamina al medio de MIV mejoró (P<0.05) el porcentaje de embriones que alcanzaron los estadios de mórula y blastocisto (22.2%) y la tasa de blastocistos expandidos (13.0%) respecto al grupo control (6.4% y 2.6%, respectivamente). La concentración de GSH intracelular (pmol/ovocito) fue superior en los ovocitos MIV que en los ovocitos inmaduros.En el Estudio 4 se evaluó el efecto de la adición de cisteamina al medio de maduración de ovocitos de cabra prepúber seleccionados mediante el test de Azul de Cresol Brillante (BCB) sobre la maduración nuclear, fecundación y desarrollo embrionario in vitro. En presencia de cisteamina, el porcentaje de ovocitos BCB+ y madirados con cisteamina mejoraron la maduración nuclear, los fecundados normales, la formación del pronucleo masculino y el porcentage de embriones a las 8 celulas, comparados con el control y BCB-. En presencia de cisteamina, la formación de mórulas y blastocistos fue superior (P<0.001) en los ovocitos BCB+ (23.8%). En conclusión, la selección ovocitaria mediante el test de BCB y la MIV en presencia de cisteamina permiten una mayor capacidad de desarrollo tras MIV-FIV-CIV. Sin embargo, a pesar de obtener resultados aceptables en los parámetros de maduración nuclear y de fecundación in vitro, el desarrollo embrionario continúa siendo reducido. / In vitro production (IVP) of caprine embryos using techniques of in vitro maturation, fertilization and embryo culture (IVM-IVF-IVC) provide a high number of embryos.The aim of the present studies has been the establishment of a system of selection and in vitro maturation of oocytes adequate for competence to develop until blastocyst after in vitro fertilization and embryo culture. For this, oocytes were matured in TCM199 + sodium pyruvate + L-glutamine + gentamicine + 10% steer serum (SS) + 10 mg/ml LH + 10 mg/ml o-FSH + 1 mg/ml 17b-estradiol. After 27 h of IVM, the oocytes were inseminated with fresh sperm (3.5x106 sperm/ml) in TALP medium supplemented with 1 mg/ml hypotaurine. A t 24 h post-insemination, the presuntive zygotes were cultued in SOFm medium and were maintained 7 days in culture. In Study 1, the utility of the Brilliant Cresyl Blue (BCB) test was evaluated . The BCB+ oocytes (oocytes with blue coloured cytoplasm, fully-grown oocytes) presented a bigger diameter(136.6 ¡À 6.3 mm; P<0.001) and higher rates of nuclear maturation (81.4%; P<0.05), normal fertilization (23.5%; P<0.0001), development beyond the 8-cell stage (41.3%; P<0.001) and morulae plus blastocyts (12.0%; P<0.05) .In Study 2, the use of an chemically defined medium, based in Epidermal Growth Factor (EGF) for the in vitro maturation of prepubertal goat oocytes was investigated. A medium supplemented with hormones and serum (SS or FCS) was compared with a medium with 10 ng EGF. The percentage of normally fertilized oocytes was lower when EGF (17.3%) was employed (SS: 27.2%; FCS: 29.0%). The rate of total embryos (71.5%) and embryos that developed beyond the 8-cell stage (26.2%) were higher (P<0.05) when SS and hormones was used. In Study 3, the effect of the addition of thiol compounds (100 ¦ÌM cysteamine, 100 ¦ÌM b-mercaptoethanol, 0.57 mM cysteine and 0.57 mM cystine) to the IVM medium was analyzed. The oocytes matured in the presence of cysteamine and b-mercaptoethanol showed a better ability to form the MPN and to be normally fertilized (P<0.01; 72.0% y 77.1%) compared to the control group. The addition of cysteamine to the IVM medium improved the percentage of embryos that reached the m¨®rula plus blastocyst stage (22.2%) and the expanded blastocyst formation rate (13.0%) related to the control group. The intracellular GSH concentration (pmol/oocyte), was higher in the oocytes tIVM than immature oocytes. In Study 4, the addition of cysteamine to the IVM medium of oocytes selected by the Brilliant Cresyl Blue (BCB) was studied. The control group oocytes, no exposed to the BCB test, were matured in the same medium, but without cysteamine. In the presence of cyteamine, the percentage of oocytes that matured nuclearly was of BCB+ oocytes (89.5%)., while this rate was higher in the presence of cysteamine (77.8%). 97.0% of the penetrated oocytes exhibited ability to form MPN and a 69.7% were able to develop the 2 pronuclei, being these percentages significantly higher. The exposed oocytes to the BCB with cysteamine showed a lower percentage of non-decondensed heads (3.0%) than the control group (25.6%). Embryos developed beyond the 8-cell stage was higher in the BCB+ (68.3%). Likewise, in the presence of cysteamine, the morule plus blastocysts formation rate was higher (P<0.001) in the BCB+ oocytes (23.8%) related to the BCB- oocytes (5.1%). In conclusion, oocytes selection using the BCB test and the IVM in the presence of cysteamine allow a better development ability after IVM-IVF-IVC. In the present studies, we have been able to confirm an improvement in the oocytes development in relation with the initial IVM system, acting on growing and final maturation phases.

Se evaluó la capacidad regenerativa de blastómeros de Oncorhynchus mykiss de 60 horas de desarrollo utilizando vitamina A, insulina, suero 2% (v/v) de “Trucha arco iris” en estadíos previos y posteriores al desove y medio Leibovitz L-15. Primero se obtuvo la sangre de trucha anestesiando a los peces en un baño de clorobutanol (600 mg/ml). A partir de ello, la relación encontrada entre el peso del animal, el tiempo de sedación y el tiempo de recuperación fue directa y en promedio la inducción se realizó en un tiempo menor que el reportado para el anestésico. Luego, el suero de trucha obtenido fue tratado con varias temperaturas por separado, obteniéndose la inactivación de las proteínas del complemento sólo con el suero tratado a 30°C. A continuación, las concentraciones más adecuadas de vitamina A e insulina para obtener regeneración de blastómeros fueron 0.6 UI/ml de vitamina A y 0.7 UI/ml de insulina. Utilizando otros tipos de sueros, como los de mujeres grávidas y no grávidas, se estableció que ninguno de ellos son útiles para este tipo de cultivo por tanto la utilidad del suero de “Trucha arco iris” es específica en la concentración probada (2%v/v). Finalmente, cada uno de los elementos componentes del medio regeneratriz – vitamina A, insulina, suero de trucha, medio Leibovitz L-15- desempeñan diferentes roles en el proceso. En ausencia de vitamina A e insulina de manera simultánea, de vitamina A, de suero, y en presencia sólo de medio Leibovitz la capacidad regenerativa de los embriones fue casi nula a diferencia de los cultivos sin insulina. La vitamina A fue de mayor importancia debido a su rol morfógeno y la insulina jugó un papel permisivo en el proceso regenerativo. Los resultados de la ausencia del suero demostraron que este elemento es clave para mantener la adherencia entre los blastómeros del embrión de trucha mientras que el medio Leibovitz no tuvo ninguna participación en el proceso regenerativo. Se establecieron las necesidades del proceso de regeneración de blastómeros de “Trucha arco iris”, basado en la importancia de cada uno de los factores que contribuyeron en el proceso regenerativo, con concentraciones adecuadas de vitamina A e insulina necesarias para desencadenar dicho fenómeno. Su aplicación futura es de suma relevancia tanto en acuicultura, medicina veterinaria y medicina humana. / The regenerative capacity of the 60 hours development Oncorhynchus mykiss blastomeres was evaluated utilizing vitamin A, insulin, pre or post-spawning rainbow trout serum 2%(v/v) and medium Leibovitz L-15. First, trout blood was obtained when the fishes were anesthetized with a bath of clorobutanol at 600 mg/ml. The relationship among animal weight, sedation time and recovery time was proportionally direct and the induction is realized in a less time than the reported for the anesthetic. Then, the trout serum obtained was treated with several temperatures, the proteins complement inactivation was optimal on treated serum at 30°C. Next, the more adequate concentrations of vitamin A and insulin for blastomeres regeneration were 0.6 IU/ml vitamin A and 0.7 IU/ml insulin. Using another kind of sera such as from pregnant and non-pregnant women, it is found out that no one was useful for the culture, so the usefulness of rainbow trout serum is specific in the proven concentration (2% v/v). Finally, each regenerating medium components – vitamin A, insulin, trout serum, medium Leibovitz– have different roles into the process. Without vitamin A and insulin of simultaneous manner, without vitamin A, serum and only utilizing medium Leibovitz the embryos regenerative capacity was almost null. The vitamin A was the more important factor to its morphogenic role and the insulin played a permissive paper in the regenerative process. The results from free-serum culture showed that element is key to maintain the adherence between blastomeres of trout embryo while medium Leibovitz had no participation into regenerative process. It is established the necessities for regeneration process in rainbow trout blastomeres, based on the importance of each factors that contributed for regeneration with adequate concentrations of vitamin A and insulin to trigger this phenomenon. Its application is relevant in aquaculture, veterinary and human medicine.

Tesis para optar al Grado de Magíster en Ciencias Animales y Veterinarias. / Las células madres mesenquimáticas (MSC) se han caracterizado inicialmente por su potencial de autorenovación y diferenciación in vitro hacia linajes celulares mesodérmicos. Sin embargo; el potencial terapéutico de las MSC se basa principalmente en sus capacidades de migración y angiogénesis importantes para la regeneración tisular. El objetivo del presente estudio fue determinar los potenciales de migración y angiogénesis de las MSC derivadas de médula ósea (MSC-MO) y de tejido adiposo (MSC-TA) fetales bovinas. El ensayo de migración scratch se utilizó para determinar la capacidad migratoria de las MSC, utilizando fibroblastos (FB) fetales como controles biológicos. Para este ensayo se cultivaron 44 x 103 células/cm2 hasta alcanzar 80% de confluencia. Luego de 24 horas, se realizó el scratch en la monocapa de cada línea celular y el área de migración fue cuantificada en el tiempo 0 y luego de 24 horas mediante el software ImageJ. El análisis de migración transwell, se utilizó para determinar el potencial de migración celular en respuesta al quimiotáctico factor derivado de células estromales-1 (SDF-1). Para este análisis se cultivaron 25x103 células/mL por 24 horas, en respuesta a SDF-1 ulilizando 5% suero fetal bovino (SFB) y medio DMEM como controles. Las células que migraron hacia el lado inferior de la membrana transwell fueron observadas y cuantificadas mediante el software ImageJ. Para el análisis del potencial angiogénico de MSC, se realizó el ensayo de formación de túbulos. Células endoteliales de aorta bovina fetal fueron aisladas y resuspendidas en medios condicionados de MSC-MO, MSC-TA y FB. Luego de 6 horas de incubación a 38°C en 5% CO2 se observó y cuantificó la formación de estructuras tubulares utilizando el software ImageJ. La expresión de genes de migración, SDF-1, su receptor CXCR4 y la quimiocina secretada y expresada por linfocitos T normales regulada por activación (RANTES) y de genes de angiogénesis, factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) y angiopoyetina 1 (ANGPT1) fue cuantificada mediante PCR cuantitativo (Q-PCR). Los datos obtenidos fueron analizados estadísticamente por ANOVA de una vía y para las diferencias entre los promedios se utilizó el post test de tuckey, utilizando el software InfoStat. Mediante ensayo scratch se determinó un mayor (p<0,05) porcentaje de migración in vitro en cultivos de MSC-MO comparado con FB. Sin embargo; los porcentajes de migración no fueron distintos (p>0,05) entre MSC-MO y MSC-TA. El ensayo transwell permitió determinar un mayor (p<0,05) número de células migrantes en cultivos tratados con DMEM suplementado con 5% de SFB. Sin embargo; no se detectaron diferencias significativas entre líneas celulares. Se determinó que los niveles de mRNA de SDF-1 fueron mayores (p<0,05) en MSC-TA comparado con MSC-MO y FB. Los niveles de mRNA de RANTES fueron mayores (p<0,05) en MSC-TA comparado con FB. Sin embargo; los niveles de mRNA de CXCR4 no fueron distintos (p>0,05) entre las líneas celulares en estudio. El medio condicionado concentrado de MSC-TA indujo mayor (p<0,05) formación de túbulos, comparado con MSC-MO, FB y sus controles DMEM con 5% de SFB y DMEM. Además, se cuantificó una mayor (P<0,05) expresión de VEGF en MSC-TA comparado con las otras líneas celulares. En comparación, la expresion de ANGPT1 fue mayor (p<0,05) en MSC-MO y FB comparado con MSC-TA. En conclusión, el potencial de migración entre MSC-MO y MSC-TA es similar, lo cual puede estar determinado por niveles de expresión similares del receptor CXCR4. A su vez, una mayor expresión de VEGF en MSC-TA puede determinar que estas células presenten una mayor capacidad angiogénica comparado con MSC-MO. / Mesenchymal stem cells (MSCs) were initially characterized by their potential for self-renewal and in vitro differentiation into mesodermal cell lines. However, the therapeutic potential of MSCs is primarily based on their migration and angiogenic capacities, which are important for tissue regeneration. The objective of the present study was to determine the migration and angiogenic potentials of MSCs derived from bone marrow (MSC-MO) and adipose fetal bovine tissue (MSC-TA). The scratch migration assay was used to determine the migratory capacity of MSC, using fetal fibroblasts (FB) as biological controls. For this, 44 x 103 cells/cm2 were cultured until 80% confluence. After 24 hours, the scratch was performed in the monolayer of each cell line culture and the migration area was quantified at time 0 and after 24 hours using ImageJ software. The transwell migration analysis was used to determine cell migration capacity in response to the chemokine stromal differentiation factor-1 (SDF-1). For this assay, 25x103 cells/mL were grown for 24 hours in response to SDF-1, using as SFB 5% and DMEM as controls. Cells that migrated to the underside of the transwell membrane were observed and quantified using the ImageJ software. In order to determine the angiogenic potential of MSC, the tubule formation test was performed. Endothelial cells of bovine aorta were isolated and resuspended in conditioned media of each cell line. After 6 hours of incubation, the number of tubular structures was quantified and analyzed using ImageJ software. The relative expression levels of migration genes SDF-1, its receptor CXR4, regulated upon activation normal T-cell expressed and secreted (RANTES) and angiogenic genes vascular endothelial growth factor (VEGF) and angiopoietin (ANGPT1) were analyzed using quantitative-PCR (Q-PCR). The data obtained were statistically analyzed by one-way ANOVA and the tuckey post test was used to determine differences between means, using InfoStat software.The scratch test allowed to determine a higher (p<0.05) percentage of migration in MSC-MO cultures compared to FB. However, migration rates were not different (p>0.05) between MSC-MO and MSC-TA. The highest (p <0.05) number of migrant cells in the transwell test was detected in cultures treated with DMEM supplemented with 5% FBS. However, no significant differences were detected between cell lines. SDF-1 mRNA levels were higher (p <0.05) in MSC-TA compared to MSC-MO and FB. Similarly, RANTES mRNA levels were higher (p <0.05) in MSC -TA compared to FB. CXCR4 mRNA levels were not different (p> 0.05) between cell lines. Concentrated conditioned (CC) media of MSC-TA induced greater (p <0.05) tubule formation, compared to CC of MSC-MO, FB and its controls. Moreover, the highest (P <0.05) expression of VEGF was observed in MSC-TA, compared to the other cell lines. In the case of the expression of ANGPT1 the expression was higher in MSC-MO and FB compared to MSC-TA. In conclusión, a similar migration potential between MSC-MO and MSC-TA may be associated to similar expression of the CXCR4 receptor. Moreover, higher expression of VEGF in MSC-TA may explain the greater angiogenic capacity of these cells compared to MSC-MO. / Financiamiento: Proyecto Fondef ID 15I10129.

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / A nivel mundial, la tendencia en producción de leche es a un aumento importante en la producción lechera por vaca, pero acompañado de un descenso continuo en la fertilidad. Esta disminución provoca importantes repercusiones económicas negativas para los planteles lecheros. Un aspecto relevante en la fertilidad de una vaca es el alto porcentaje de pérdidas gestacionales, en especial las ocurridas en el período embrionario y fetal temprano. El objetivo de este estudio fue determinar los porcentajes de pérdida embrionaria-fetal entre los 30 y los 60 días de preñez, tanto en vacas como en vaquillas lecheras de la zona central de Chile, y a su vez determinar la relación de ésta con posibles factores de riesgo. El estudio se realizó en dos lecherías de alta producción de la zona central de Chile, en la Región de Valparaíso. Se analizó la información proveniente de 3.422 gestaciones; 2.231 en vacas y 1.191 en vaquillas, iniciadas en un período de un año y medio. La gestación se determinó por ultrasonografía transrectal 30 a 36 días después de la inseminación artificial (IA) y se realizó un segundo diagnóstico de la gestación por palpación transrectal para determinar la pérdida de la preñez a los 60 a 66 días posteriores a la IA. Para cada preñez, se registró información de posibles factores de riesgo como: el predio de origen, la condición corporal (CC) al parto, la CC a la concepción, el cambio de CC desde el parto al posparto (aproximadamente 40 días posparto), la producción de leche, el tipo de inseminación artificial (inseminación artificial a tiempo fijo (IATF) o a celo detectado), los días en leche a la concepción, el número ordinal del parto (NOP) y la presencia de mastitis clínica dentro del periodo en estudio. La asociación de estos posibles factores de riesgo con la pérdida embrionaria-fetal entre los 30 y los 60 días posteriores a la concepción, se analizó a través de un modelo de regresión logística, utilizando el programa estadístico InfoStat®. Se obtuvieron las razones de riesgo (odd ratios, OR) con sus intervalos de confianza al 95% (IC 95%). Se observó un 11% de pérdida embrionaria-fetal en vacas, mientras que en vaquillas la pérdida fue de un 3,2%. El primer análisis (regresión logística binaria univariada), mostró que las vacas tuvieron 3,74 veces la probabilidad de perder su gestación en comparación con las vaquillas (IC 95%: 2,64 - 5,31; p < 0,0001). Dentro de las vacas, los factores predio de origen, cambio de CC desde el parto al posparto, estación del año a la concepción y tipo de inseminación se relacionaron significativamente con la pérdida gestacional (p < 0,05). Por otro lado, factores como NOP, CC al parto, CC a la concepción, producción de leche el día de la concepción, producción de leche acumulada hasta los 100 días de lactancia, días en leche a la concepción y mastitis clínica no mostraron un efecto significativo sobre la pérdida de la gestación. El modelo estadístico final incluyó los factores que fueron significativos en el primer análisis, y mostró una tendencia a una mayor probabilidad de pérdida gestacional en las vacas del predio 2 en comparación a las del predio 1 (IC 95%: 0,94 - 2,49; p = 0,09). También mostró que las vacas que perdieron 1 punto o más de CC al posparto tuvieron 2,02 veces la probabilidad de perder la gestación, en comparación con aquellas que bajaron 0,25 puntos o menos de CC en el mismo periodo (IC 95%: 1,02 - 4,00; p = 0,04). En relación a la estación del año, las vacas que comenzaron su gestación en invierno o verano tuvieron 2,03 (IC 95%: 1,12 - 3,7; p = 0,02) y 1,84 (IC 95%: 1,03 - 3,3; p = 0,04) veces, respectivamente, la probabilidad de perder la gestación, con respecto a aquellas que iniciaron su gestación en primavera. En cuanto al tipo de inseminación, se observó una tendencia a una mayor pérdida gestacional en las vacas inseminadas bajo protocolos de IATF, en comparación con las inseminadas a celo natural (IC 95%: 0,93 - 1,95; p = 0,12). En vaquillas, el modelo sólo incluyó los factores predio de origen y estación del año al inicio de la gestación. Se observó una fuerte tendencia a una mayor probabilidad de pérdida embrionaria-fetal en las vaquillas del predio 2, en comparación con las del predio 1 (IC 95%: 0,94 - 3,73; p = 0,08) y no se determinó una asociación estadísticamente significativa entre la estación del año a la concepción y pérdida gestacional. Los resultados de este estudio muestran una pérdida embrionaria-fetal notoriamente mayor en vacas que en vaquillas. Dentro de las vacas, la pérdida excesiva de CC al posparto y la estación del año a la concepción (invierno o verano), fueron factores de riesgo de pérdida de la gestación entre los 30 a 60 días de preñez. El efecto de la estación del año a la concepción fue menos evidente y no fue significativo en vaquillas. Por lo tanto, en vacas sería recomendable poner énfasis en el mejoramiento de los factores de riesgo identificados en este estudio, tales como manejando adecuadamente la alimentación en el periodo de posparto, y haciendo diseños y manejos de las instalaciones que mejoren el confort de los animales y que limiten los efectos adversos del invierno y el verano. Este tipo de manejos podría contribuir a aumentar la fertilidad y, por ende, la rentabilidad de las lecherías de la zona central de Chile

Se evaluó la capacidad regenerativa de blastómeros de Oncorhynchus mykiss de 60 horas de desarrollo utilizando vitamina A, insulina, suero 2% (v/v) de “Trucha arco iris” en estadíos previos y posteriores al desove y medio Leibovitz L-15. Primero se obtuvo la sangre de trucha anestesiando a los peces en un baño de clorobutanol (600 mg/ml). A partir de ello, la relación encontrada entre el peso del animal, el tiempo de sedación y el tiempo de recuperación fue directa y en promedio la inducción se realizó en un tiempo menor que el reportado para el anestésico. Luego, el suero de trucha obtenido fue tratado con varias temperaturas por separado, obteniéndose la inactivación de las proteínas del complemento sólo con el suero tratado a 30°C. A continuación, las concentraciones más adecuadas de vitamina A e insulina para obtener regeneración de blastómeros fueron 0.6 UI/ml de vitamina A y 0.7 UI/ml de insulina. Utilizando otros tipos de sueros, como los de mujeres grávidas y no grávidas, se estableció que ninguno de ellos son útiles para este tipo de cultivo por tanto la utilidad del suero de “Trucha arco iris” es específica en la concentración probada (2%v/v). Finalmente, cada uno de los elementos componentes del medio regeneratriz – vitamina A, insulina, suero de trucha, medio Leibovitz L-15- desempeñan diferentes roles en el proceso. En ausencia de vitamina A e insulina de manera simultánea, de vitamina A, de suero, y en presencia sólo de medio Leibovitz la capacidad regenerativa de los embriones fue casi nula a diferencia de los cultivos sin insulina. La vitamina A fue de mayor importancia debido a su rol morfógeno y la insulina jugó un papel permisivo en el proceso regenerativo. Los resultados de la ausencia del suero demostraron que este elemento es clave para mantener la adherencia entre los blastómeros del embrión de trucha mientras que el medio Leibovitz no tuvo ninguna participación en el proceso regenerativo. Se establecieron las necesidades del proceso de regeneración de blastómeros de “Trucha arco iris”, basado en la importancia de cada uno de los factores que contribuyeron en el proceso regenerativo, con concentraciones adecuadas de vitamina A e insulina necesarias para desencadenar dicho fenómeno. Su aplicación futura es de suma relevancia tanto en acuicultura, medicina veterinaria y medicina humana. / --- The regenerative capacity of the 60 hours development Oncorhynchus mykiss blastomeres was evaluated utilizing vitamin A, insulin, pre or post-spawning rainbow trout serum 2%(v/v) and medium Leibovitz L-15. First, trout blood was obtained when the fishes were anesthetized with a bath of clorobutanol at 600 mg/ml. The relationship among animal weight, sedation time and recovery time was proportionally direct and the induction is realized in a less time than the reported for the anesthetic. Then, the trout serum obtained was treated with several temperatures, the proteins complement inactivation was optimal on treated serum at 30°C. Next, the more adequate concentrations of vitamin A and insulin for blastomeres regeneration were 0.6 IU/ml vitamin A and 0.7 IU/ml insulin. Using another kind of sera such as from pregnant and non-pregnant women, it is found out that no one was useful for the culture, so the usefulness of rainbow trout serum is specific in the proven concentration (2% v/v). Finally, each regenerating medium components – vitamin A, insulin, trout serum, medium Leibovitz– have different roles into the process. Without vitamin A and insulin of simultaneous manner, without vitamin A, serum and only utilizing medium Leibovitz the embryos regenerative capacity was almost null. The vitamin A was the more important factor to its morphogenic role and the insulin played a permissive paper in the regenerative process. The results from free-serum culture showed that element is key to maintain the adherence between blastomeres of trout embryo while medium Leibovitz had no participation into regenerative process. It is established the necessities for regeneration process in rainbow trout blastomeres, based on the importance of each factors that contributed for regeneration with adequate concentrations of vitamin A and insulin to trigger this phenomenon. Its application is relevant in aquaculture, veterinary and human medicine. / Tesis

Tesis para optar al Grado de Magíster en Ciencias Animales y Veterinarias. / Las células madre mesenquimáticas (del inglés Mesenchymal Stem Cells, MSC), son células adultas indiferenciadas, que poseen propiedades de autorenovación, inmunomodulación y cuentan con una baja inmunogenicidad. Debido a ello son actualmente consideradas como potenciales agentes terapéuticos celulares para el tratamiento de variadas patologías. En el presente estudio se comparó el potencial de proliferación, inmunomodulación e inmunogenicidad in vitro de MSC derivadas de médula ósea (MO) y tejido adiposo (TA) fetal bovino. Las MSC fueron asiladas en base a su capacidad de adherencia al plástico y a su morfología fibroblastoide. El potencial de proliferación se determinó en dos concentraciones celulares (5000 y 8500 células/cm2) durante 10 y 15 días de cultivo, respectivamente. La expresión de genes de inmunomodulación indolamina 2,3 dioxigenasa (IDO), interleuquina 6 (IL-6), factor de crecimiento de transformante β1 (TGFβ1), prostaglandina E2 (PGE2) e interleuquina 10 (IL-10) fue cuantificada mediante PCR cuantitativo (Q-PCR) en MSC-MO y MSC-TA estimuladas con interferón γ (IFNγ). Adicionalmente, se cuantificaron los niveles de expresión de genes de inmunogenicidad complejo principal de histocompatibilidad I y II (MHC-I y II) y moléculas coestimuladoras de linfocitos T (CD80 y CD86). Además, se evaluó el efecto de medio condicionado de ambas líneas celulares estimuladas con IFNγ sobre la proliferación de linfocitos de sangre periférica (PBL) bovina activadas con aloantígenos. La población de MSC provenientes de MO y TA adherentes al plástico expresaron mayores (P<0,05) niveles de mRNA de marcadores mesenquimales (CD105, CD90 y CD73) en comparación a marcadores hematopoyéticos (CD45 y CD34). Las MSC-MO doblaron su población en menor (P<0,01) tiempo en comparación a MSC-TA (2,9 vs 4,4 días, respectivamente). La exposición de MSC-MO y MSC-TA a IFNγ activó la expresión de mRNA de IDO y aumentó (P<0,05) la concentración del metabolito de IDO, quinurenina en el medio condicionado de MSC. Además, ambas líneas celulares expresaron niveles de mRNA de IL-6, PGE2, TGFβ1 e IL-10 con o sin tratamiento de IFNγ. Las MSC-MO expresan mayores (P<0,05) niveles de mRNA de MHC-II en comparación con MSC-TA. El medio condicionado de ambas líneas celulares suprime la proliferación de PBL bovino. En conclusión, los potenciales de proliferación e inmunogenicidad de MSC son dependientes de la fuente de origen tisular, debido a que las MSC-MO poseen alto potencial de proliferación e inmunogenicidad en comparación a MSC-TA. Sin embargo, ambas líneas de MSC poseen similares potenciales de inmunomodulación. / Mesenchymal stem cells (MSC) are undifferentiated adult cells that possess self-renewal, immunomodulating and low immunogenicity properties. Hence, they are currently considered as potential therapeutic agents for the treatment of various pathologies. In the present study, proliferation, immunomodulation and immunogenicity in vitro potentials were compared between MSCs derived from bone marrow (BM) and adipose fetal bovine tissue (AT). MSC were isolated based on their ability to adhere to plastic and fibroblastoid morphology. The proliferation potential was determined at two cell concentrations (5000 and 8500 cells / cm2) during 10- and 15-days culture periods, respectively. Relative expression of indoleamine 2,3 dioxygenase (IDO), interleukin-6 (IL-6), transforming growth factor β1 (TGFβ1), prostaglandin E2 (PGE2) and interleukin-10 (IL-10) were quantified using quantitative PCR (Q PCR) in MSC-BM and MSC-AT stimulated with IFNγ. Additionally, the mRNA levels of immunogenicity genes, major histocompatibility complex I and II (MHC-I and II) and T-cell costimulatory molecules (CD80 and CD86) were determined. In addition, the effect of conditioned medium from IFNγ-stimulated MSC was estimated on the proliferation of alloantigen-activated bovine peripheral blood lymphocytes (PBL). The plastic-adherent population of MSC derived from BM and AT expressed higher (P <0.05) mRNA levels of mesenchymal markers (CD105, CD90 and CD73) compared to hematopoietic markers (CD45 and CD34). MSC-MO doubled population in a shorter (P <0.01) time period compared to MSC-AT (2.9 vs. 4.4 days, respectively). Exposure of MSC-BM and MSC-AT to IFNγ activated the expression of IDO mRNA and increased (P <0.05) IDO-metabolite kinurenine concentration in conditioned medium of MSC. Both MSC lines expressed levels of IL-6, PGE2, TGFβ1 and IL-10 mRNA with or without IFNγ treatment. MSC-BM expresses higher (P <0.05) mRNA levels of MHC-II mRNA in comparison to MSC-AT. Conditioned medium of MSC cell lines suppress the proliferation of bovine PBL. In conclusion, the potential for proliferation and immunogenicity are tissue-source dependent, since MSC-MO has a high potential for proliferation and immunogenicity compared to MSC-TA. However, both MSC lines display similar potential for immunomodulation. / Financiamiento: Proyecto Fondef Idea ID15I10129 y PRONABEC y Beca Presidente de la República del Perú.

No description available.

Existen muchos factores que influyen en el éxito de la técnica de producción de embriones in vitro (PIV), muchos de los cuales aun son desconocidos o bien su efecto no ha sido totalmente esclarecido. El método de colección a elegir en condiciones de laboratorio y la óptima tensión de oxígeno para lograr un mejor desarrollo de los embriones siguen siendo materia de discusión entre los investigadores. Los métodos más usados para obtener ovocitos cultivables son la aspiración de folículos y la disección de la corteza ovárica, mientras que para el oxígeno las tensiones de 5% y 20% son las que se usan comúnmente en la producción de embriones. El objetivo de este estudio fue evaluar la influencia del método de colección y la tensión de oxígeno sobre los parámetros de PIV (porcentaje de divisiones a las 72 horas y porcentaje de blastocistos a los 7 y 9 días post fecundación). En el experimento 1, el efecto de dos métodos de colección, aspiración y disección, sobre la tasa de divisiones y desarrollo embrionario fue comparado. El porcentaje de divisiones a las 72 horas post inseminación obtenido con el método de aspiración (71.39%) fue significativamente mayor respecto al porcentaje obtenido con el método de disección (60.98%); en tanto que la tasa de blastocistos al día 7 y 9 post fecundación para el método de aspiración (17.63% y 11.4%, respectivamente) no mostró diferencia estadística con los resultados obtenidos con el método de disección (22.9% y 12.09%, respectivamente). Adicionalmente se observó que el número de ovocitos recuperados por ovario fue significativamente mayor con el método de disección. En el experimento 2 se compararon dos tensiones de oxígeno en la etapa de cultivo, 5% y 20 % de oxígeno, y se obtuvo mayor tasa de divisiones y mayor tasa de blastocistos al día 7 post fecundación con una tensión de oxígeno del 5% (69.71% y 29.79%, respectivamente) comparado con una tensión de oxígeno del 20% (59.69% y 19.26%, respectivamente), no se registró diferencia en cuanto a los blastocistos obtenidos al día 9 post fecundación. Los resultados obtenidos sugieren que el método de aspiración folicular y el cultivo con una tensión de oxígeno del 5% deberían ser considerados como factores adecuados para lograr las condiciones óptimas en el proceso de producción de embriones in vitro. Palabras clave: embrión, oxígeno, colección, bovino, PIV / --- There are many factors that influence the success of the technique of in vitro embryo production (IVP), many of which are still poorly understood or the influence mechanism has not yet been clarified. The collection method to choose in laboratory conditions and the optimal oxygen tension for better embryo development are still a matter of debate among researchers. The methods used to obtain cultivable oocytes are follicle aspiration and cortex dissection from the ovary, whereas two oxygen tension, 5% and 20%, are commonly used in the embryo production. The objective of this study was to evaluate the influence of the collection method and oxygen tension on PIV parameters (cleavage rate and blastocyst rate). In Experiment 1, the effect of two collection methods, aspiration and dissection, on embryonic development was compared. The highest percentage of cleavage at 48 hours post insemination was obtained with the aspiration method (71.39%), but no difference was observed in the percentage of blastocysts at 7 and 9 days post insemination, additionally it was noted that the number of oocytes recovered per ovary was significantly higher with the dissection method. In Experiment 2, it was compared two oxygen tensions in the culture stage, 5% and 20% oxygen, and it was obtained higher cleavage and blastocyst rate at day 7 post insemination with an 5% oxygen tension. Then, according to these results it can be concluded that follicular aspiration method and a 5% oxygen tension are included within the optimal conditions for the PIV. Keywords: embryo, oxygen, collection, bovine, IVP

Busca realizar una adecuada selección del número de embriones, así como del día y estadío de desarrollo embrionario que permitirá escoger embriones de alta calidad con la finalidad de conseguir una mayor incidencia de embarazos exitosos en pacientes con problemas de infertilidad y simultáneamente reducir la incidencia de embarazos multiples los cuales tienen mayores riesgos obstétricos y neonatales. Presenta un estudio observacional, descriptivo, retrospectivo y comparativo en el cual se revisaron 555 historias clínicas de pacientes a las que se les realizó la transferencia de un embrión único y que recibieron tratamiento por problemas de infertilidad en el Servicio de Ginecología de la Unidad de Fertilidad del Hospital de la Universidad de Hirosaki, Aomori, Japón; en el periodo comprendido desde enero de 1995 hasta Enero del 2006. Determina la incidencia de embarazos y recién nacidos vivos después de realizar la transferencia de un embrión en estadío de blastocisto el día 5 de desarrollo embrionario. Determina la frecuencia de embarazos y recién nacidos vivos después de realizar la tranferencia de un embrión único el día 3 y el día 4 de desarrollo embrionario. Evalúa que estadio de desarrollo embrionario proporciona la mayor incidencia de embarazos y recièn nacidos vivos. Se obtiene que el 14.3% de embarazos cuando se realizó la transferencia de un embrión el día 3 ( 4-16 blastómeras), 23.4 % de embarazos cuando se realizó la transferencia de un embrión el día 4 (estadío de Morula) y 45% de embarazos cuando se realizó la transferencia de un embrión el día 5 (estadío de blastocisto). El porcentaje de recién nacidos vivos fue de un 42.9% el día 3( 4-16 blastómeras), 42.3 % el día 4 (estadío de Morula) y 77.8% el día 5 (estadío de blastocisto). En cuanto a la paridad principalmene las pacientes fueron nulíparas: 75% (día 3), 69.2% (día 4) y 55.6% (día 5). Encuentra que el grupo etáreo más frecuente estuvo comprendido entre los 36 a 40 años con un 46.4% el día 3( 4-16 blastómeras), un 42.3% el día 4 (estadío de Morula) un 44.4% el día 5 (estadío de blastocisto). La técnica de reproduccion asistida más utilizada fue la fecundacion in vitro: 75% (día 3), 80.8% (día 4) y 77.8% (día 5). El factor de tubárico y masculino fueron los más frecuentes: 42.85% (día 3), 42.3% (día 4) y 66.6% (día 5). Concluye que realizar la transferencia de un embrión en el dia 5 y durante el estadío de blastocisto de desarrollo embrionario permite obtener un mayor número de embarazos y nacimientos vivos, asì como el menor nùmero de complicaciones obstètricas en las parejas con problemas de infertilidad. / Trabajo de investigación

Las técnicas de producción artificial (TRA) generan vida humana desprovista de familia. Nuestro objetivo general fue establecer los criterios bioéticos y biojurídicos para modificar la norma sobre las TRA en el Perú. Nos propusimos tres objetivos específicos: 1) Analizar el contenido y consecuencias de las TRA; 2) Analizar el vigente artículo 7° de la Ley N° 26842 – Ley General de Salud (LGS) y una de sus propuestas modificatorias de la comisión del Ministro de Justicia y Derechos Humanos, y 3) Establecer los criterios bioéticos y biojurídicos para regular las TRA, derogando el artículo 7 de la LGS. Y, proponiendo un proyecto de ley. La investigación de tipo cualitativa mediante el método bibliográfico, para establecer relaciones teórico-doctrinarias, nos permitió conocer en profundidad el artículo 7 de la LGS, e identificar la naturaleza profunda del problema de las TRA. Para el abordaje descriptivo, explicativo e interpretativo, recurrimos a las fichas bibliográficas, textuales y de resumen; para recoger, almacenar, organizar y presentar la información extraída de fuentes provenientes de 51 autores desde: 26 libros, 2 artículos de revistas, 5 tesis, 12 normas legales, 28 linkografías. El procedimiento se destinó a elegir el tema de la investigación. La primera recopilación de datos bibliográficos nos permitió conocer en profundidad las TRA y el contenido del Artículo 7° de la LGS. La bibliografía adicional nos otorgó una sólida base de conocimiento sobre las TRA. El análisis cualitativo y de documentos nos permitió conocer la situación legal y de hecho de las TRA en el Perú. Mediante el abordaje metodológico antropológico y jurídico, analizamos los documentos mediante un enfoque científico-humanista. Los criterios éticos para el tema de fondo se enmarcaron en la interdisciplinariedad de la bioética y la búsqueda de un estatuto jurídico del concebido y los límites éticos que deben regir la ciencia y la tecnología. Los criterios éticos para la investigación formal fueron la verdad del registro y análisis de documentos de la referencia bibliográfica, y el uso de la información con respeto a la propiedad intelectual. Los criterios de rigor científico fueron la claridad para el desarrollo de los objetivos, y la credibilidad y profundidad de las fuentes de información. Los principales resultados apuntan a comprender que el ordenamiento jurídico del Perú es proteccionista del concebido, pero no el artículo 7 de la LGS que autorizó las TRA, las que han escapado del control normativo, por lo que implican riesgos para la vida y la salud de los embriones humanos producidos. Nuestra investigación se centra en determinar los criterios bioéticos y biojurídicos, para que una norma regule las biotecnologías del inicio de la vida prohibiendo las TRA, por respeto al derecho de los embriones humanos, acorde a su estatuto biológico, ontológico y jurídico. / Tesis