[EN] In vitro production (IVP) of embryos has multiple applications, including the development of transgenic / genetically modified animals that are of broad utility in the biomedical field and could reach to be so in agriculture. In this sense, the intracytoplasmic sperm injection (ICSI) with transfected sperm, such as somatic cell nuclear transfer (SCNT) with transfected cells, have proved to be valid strategies to generate animals with stably integrated exogenous DNA, capable of transmitting to their offspring. However, to make it feasible the availability of a large number of IVP embryos it's necessary. Despite the development of IVP systems of pig embryos for these strategies in the last decades, and a high variety of protocols, there are still some critical issues that limit embryonic development and therefore its application on a large scale. The main objective of this thesis has then pursued, optimizing the ICSI and SCNT protocols in order to improve the viability of IVP porcine embryos. The initial approach was to address the study both in vitro maturation (IVM) and oocyte activation within the SCNT frame. To this end, the most efficient electrical activation protocol under our working conditions was selected from among three proposals, and we then studied the effect of serum supplement on IVM medium, noticing that it doesn't increase the development of partenogenetic embryos produced by electrical activation nor of those produced by SCNT. Moreover, and in order to optimize the ICSI technique, different aspects such as Ca2+ concentration in the microinjection medium, sperm pretreatment with Triton X-100 (TX) and the addition of cysteine or caffeine supplements to the in vitro culture (IVC) medium post-ICSI, were studied in order to promote sperm nucleus decondensation and oocyte activation. Noticing that: i) the concentration of Ca2+ did not influence the cleavage rate, or the development of partenogenic embryos from microinjected oocytes without sperm (sham injection); ii) caffeine did not increase either the pronuclear formation neither the subsequent embryo development, in combination with TX sperm pre-treatment it reduced oocyte activation and embryo development rates; iii) the pronuclear formation was not increased by the sperm pre-treatment with TX nor by the cysteine treatment, regardless of the time of the study assessment. / [ES] La producción in vitro (PIV) de embriones goza de múltiples aplicaciones, entre las que cabe destacar la obtención de animales transgénicos/modificados genéticamente que resultan de amplia utilidad en el ámbito biomédico y podrían llegar a resultarlo en el agropecuario. En este sentido, tanto la inyección intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI) con espermatozoides transfectados, como la transferencia nuclear de células somáticas (SCNT) con células transfectadas, han demostrado ser estrategias válidas para generar animales con ADN exógeno integrado de manera estable, capaces de transmitirlo a su descendencia. Sin embargo, para lograrlo es necesario disponer de un gran número de embriones PIV. A pesar del desarrollo durante las últimas décadas de sistemas de PIV de embriones de porcino para estas estrategias, y la disponibilidad de gran variedad de protocolos, persisten aún ciertos puntos críticos que limitan el desarrollo embrionario y por lo tanto su aplicación a gran escala. El objetivo principal de esta tesis ha perseguido por lo tanto, la optimización de los protocolos de ICSI y SCNT con el fin de mejorar la viabilidad de los embriones PIV de porcino. El planteamiento inicial consistió en abordar el estudio tanto de la maduración in vitro (MIV) como de la activación oocitaria en el marco de la SCNT. Para ello se seleccionó de entre tres propuestas de activación artificial, el protocolo de activación eléctrica (que resultó ser el más eficiente bajo nuestras condiciones de trabajo), y se estudió a continuación el efecto del suplemento de suero en el medio de MIV, constatando que no se incrementaba el desarrollo de embriones partenogenotas producidos mediante activación eléctrica ni de aquellos producidos mediante SCNT. Por otra parte, y con el fin de optimizar la técnica de ICSI se abordaron diferentes aspectos como la concentración de Ca2+ en el medio de microinyección, el pre-tratamiento espermático con Triton X-100 (TX), así como la adición de suplementos de cafeína o cisteína al medio de cultivo in vitro (CIV) pos-ICSI, con el fin de favorecer la descondensación del núcleo espermático y la activación oocitaria. Observando que: i) la concentración de Ca2+ no influyó en la tasa de división, ni en la de desarrollo de embriones partenogenotas procedentes de oocitos microinyectados sin espermatozoide (sham injection); ii) la cafeína no incrementó la formación pronuclear ni en el desarrollo embrionario posterior, y en combinación con el pre-tratamiento espermático con TX redujo la activación oocitaria y el desarrollo embrionario; iii) la formación pronuclear no se vio incrementada por el pre-tratamiento espermático con TX ni por el tratamiento con cisteína, independientemente del momento de la evaluación estudiado. / [CAT] La producció in vitro (PIV) d'embrions gaudeix de múltiples aplicacions, entre les quals cap assenyalar l'obtenció d'animals transgènics/modificats genèticament que resulten d'àmplia utilitat en el àmbit biomèdic y podrien arribar a ser-ho en el àmbit agropecuari. En aquest sentit, tant la injecció intracitoplasmàtica d'espermatozoïds (ICSI) amb espermatozoïds transfectats, com la transferència nuclear de cèl.lules somàtiques (SCNT) amb cèl.lules transfectades, han demostrat ser estratègies vàlides per a l'obtenció d'animals amb ADN exogen integrat de manera estable, capaços de transmetrela a la seva descendència. No obstant això, per aconseguir-ho és necessari disposar d'un gran nombre d'embrions PIV. Malgrat el desenvolupament durant les últimes dècades de sistemes de PIV d'embrions de porcí per a aquestes estratègies, i la disponibilitat de gran varietat de protocols, persisteixen encara certs punts crítics que limiten el desenvolupament embrionari i per tant la seva aplicació a gran escala. L'objectiu principal d'aquesta tesi ha perseguit per tant, l'optimització dels protocols d' ICSI i SCNT per tal de millorar la viabilitat dels embrions PIV de porcí. El plantejament inicial va consistir en abordar l'estudi tant de la maduració in vitro (MIV) com de l'activació oocitària en el marc de la SCNT. Per a això es va seleccionar entre tres propostes d'activació artificial, el protocol d'activació elèctrica (que va resultar ser el més eficient sota les nostres condicions de treball), i es va estudiar a continuació l'efecte del suplement de sèrum en el medi de MIV, constatant que no va incrementar el desenvolupament d'embrions partenogenotes produïts mitjançant activació elèctrica ni d'aquells produïts mitjançant SCNT. D'altra banda, i per tal d'optimitzar la tècnica de l'ICSI es van abordar diferents aspectes com la concentració de Ca2 + en el medi de microinjecció, el pretractament espermàtic amb Triton X-100 (TX), així com l'addició de suplements de cafeïna o cisteïna al mitjà de cultiu in vitro (CIV) pos-ICSI, per tal d'afavorir la descondensació del nucli espermàtic i l'activació oocitària. Observant que: i) la concentració de Ca2+ no va influir en la taxa de divisió, ni en la de desenvolupament d'embrions partenogenotes procedents d'oòcits microinjectats sense espermatozoïd (sham injection); ii) la cafeïna no va incrementar la formació pronuclear ni en el desenvolupament embrionari posterior, i en combinació amb el pretractament espermàtic amb TX va reduir l'activació oocitària i el desenvolupament embrionari; iii) la formació pronuclear no es va veure incrementada pel pretractament espermàtic amb TX ni pel tractament amb cisteïna, independentment del moment de l'avaluació estudiat. / García Mengual, ME. (2016). OPTIMIZACIÓN DE LAS ESTRATEGIAS REPRODUCTIVAS DE MICROMANIPULACIÓN PARA LA PRODUCCIÓN IN VITRO DE EMBRIONES PORCINOS [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/61448 / TESIS

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / La mortalidad embrionaria que se ha observado en condiciones de cultivo del pez dorado Seriola lalandi, puede ser mencionada entre los principales obstáculos que han frenado el desarrollo acuícola de esta especie en nuestro país. Esta mortalidad se relaciona a la pérdida de flotabilidad de los huevos y embriones tempranos, la cual se debería a la participación del mecanismo de apoptosis celular. Estudios previos demostraron una mayor expresión de moléculas que participan en la vía intrínseca de este proceso, en huevos y embriones de S. lalandi con bajo nivel de flotabilidad. Por lo tanto, en este trabajo se propuso determinar si en esta pérdida de flotabilidad participan también moléculas de la vía extrínseca, como el sistema Fas/FasL y Caspasa 8. Para esto, se evaluó mediante la técnica de Western Blot la expresión de las proteínas Fas y Fas-L y mediante RT-qPCR la expresión del ARNm de Caspasa 8 en embriones tempranos de S. lalandi clasificados como flotantes y no flotantes. La proteína Fas se expresó como una banda de 50 kDa en todos los estadios en las muestras flotantes. Sin embargo, en los no flotantes este receptor se detectó en tres bandas reactivas de 40, 50 y 65 kDa. FasL (44 kDa) sólo fue detectado en embriones flotantes de 24 horas, mientras que en las muestras no flotantes este ligando se detectó en todos los estadios con un aumento (p<0,05) en su expresión, en la medida que avanzó el desarrollo. Por otro lado, los mayores niveles (p<0,05) de ARNm de Caspasa 8 se observaron en embriones de 24 horas en las muestras flotantes y a partir del estado de gástrula en los no flotantes. Además, la expresión de Caspasa 8 fue mayor (p<0,05) en las muestras no flotantes, en comparación con las flotantes en todos los estadios del desarrollo. Estos resultados, confirman la presencia de moléculas de la vía extrínseca de la apoptosis en huevos y embriones tempranos de S. lalandi, con perfiles de expresión en las muestras no flotantes que representarían un estado pre-apoptótico de estas muestras. Sin embargo, se requieren estudios especie-específicos y complementarios para entender principalmente, la naturaleza del agente inductor de la activación de esta vía. Finalmente, se asume que existió una viabilidad funcional comparable entre las muestras flotantes y no flotantes en todos los estadios del desarrollo analizados, debido a que no se encontraron diferencias (p<0,05) en los valores promedio de Ct, entre estas muestras, de cuatro genes constitutivos (ACTB, 18S, GAPDH y MAP1β). / The embryonic mortality observed under captivity in the yelow-tail kingfish Seriola lalandi could be mentioned among the main obstacles that have avoided its aquaculture development in our country. This mortality has been related to low buoyancy of eggs and early embryos, which would be due to the participation of the apoptosis mechanism. Previous results in S. lalandi have demonstrated greater expression of apoptosis intrinsic pathway molecules in eggs and embryos with low buoyancy level. Therefore, this work aimed in to determine if molecules of the extrinsic pathway such as Fas/FasL system and Caspase 8 are involved in the buoyancy losing. For this, Fas/FasL system and Caspase 8 expression were evaluated in early embryos of S. lalandi previously classified as floating and non-floating, by Western Blot and RT-qPCR, respectively. Fas protein was expressed as a 50 kDa band in all floating developmental stages. However, in non-floating this receptor was detected in three reactive bands of 40, 50 and 65 kDa. FasL (44 kDa) was only detected in 24-hour floating embryos, whereas in the non-floating samples this ligand was detected in all stages with an increase (p<0,05) in its expression as development progressed. By other hand, the highest levels (p<0,05) of Caspase 8 mRNA were observed in 24 hours embryos in floating samples and from gastrula stage in the non-floating ones. In addition, Caspase 8 expression was higher (p<0,05) in non-floating than floating samples, in all developmental stages. These results confirm the presence of apoptosis extrinsic pathway molecules in eggs and early embryos of S. lalandi, which show expression profiles in the non-floating samples that could be interpreted as apoptotic pre-activation. However, species-specific studies are required to understand the nature of the apoptotic pathway trigger. Finally, a comparable viability between floating and non-floating samples used in this study could be assumed since no differences (p<0,05) in Ct value of constitutive genes (ACTB, 18S, GAPDH and MAP1 β) were detected these samples. / Proyecto Fondecyt 11140639.

Tesis para optar al Grado de Magíster en Ciencias Animales y Veterinarias mención Ciencias Animales. / Las células madre mesenquimales (CMM) son células progenitoras multipotentes que poseen potenciales de auto-renovación y diferenciación multilinaje (osteogénico, condrogénico y adipogénico). La capacidad de diferenciación de las CMM se extiende principalmente hacia linajes mesodérmicos como osteogénico, condrogénico y adipogénico; sin embargo, estudios recientes in vitro han demostrado que las CMM poseen capacidad para diferenciarse hacia tejidos ectodérmicos como el neuronal. El objetivo del presente estudio fue determinar la capacidad de diferenciación neurogénica in vitro de CMM bovinas aislada desde medula ósea (MO) fetal. La detección de marcadores mesenquimales CD90, CD105 y CD73, hematopoyéticos CD34 y CD45 y de pluripotencia OCT4 y NANOG fue realizada por medio de PCR-cuantitativo (Q-PCR) y citometría de flujo. El protocolo 1 de diferenciación neurogénica consistió en una pre-inducción neuronal por 24 horas con medio DMEM suplementado con 20% de suero fetal bovino (SFB) y una posterior inducción neuronal con Betamercaptoetanol (BME) durante 6 días. El protocolo 2 de diferenciación neurogénica consistió en medio DMEM suplementado con Fibroblast Growth Factor-basic (bFGF), Epidermal Growth Factor (EGF) durante 24 horas y posteriormente durante 120 horas con medio de cultivo suplementado con hidroxianisol butilado (BHA), cloruro de potasio, ácido valproico, forskolina y suplemento neuronal. Muestras celulares fueron obtenidas a las 0, 24, 96 y 144 horas de cultivo. La expresión de genes fue evaluada por Q-PCR e inmunofluorescencia. Los análisis de Q-PCR en CMM indiferenciadas, detectaron mayores (P<0,05) niveles de mRNA de marcadores mesenquimaticos CD73, CD90 y CD105 en relación a los niveles de CD34 (151.2, 245.1 y 238.1 veces, respectivamente). Mediante citometría de flujo se determinó una alta proporción de CMM positivas para marcadores mesenquimáticos CD29 (76,3%), CD73 (96,8%) y marcadores de pluripotencia Oct4 (94,6%) y Nanog (88,4%). En contraste, una alta proporción de CMM fue negativa para marcadores hematopoyéticos CD34 y CD45 (93,4% y 95,6%, respectivamente). Durante el el protocolo 1 de diferenciación neuronal se detectó una disminución (P<0,05) de los niveles de mRNA de NESTIN a las 24, 96 y 144 horas (3,7; 2 y 1 veces expresión de la hora 0). En comparación, los niveles de mRNA de MAP2 aumentaron (P<0,05) a las 24, 96 y 144 horas (2,4; 18,9 y 16 veces expresión de la hora 0). Los niveles de mRNA de TRKA aumentaron (P<0,05) a las 96 y 144 horas (6,6 y 8 veces expresión de la hora 0). En tanto los niveles de mRNA de NGF y de NANOG no fueron distintos entre el grupo control y diferenciación. Durante el protocolo 2 se detectó una disminución (P<0,05) de los niveles de mRNA de NESTIN a las 24, 96 y 144 horas (3,74; 0,3; 0,1 veces expresión de la hora 0). En comparación, la expresión de MAP2 aumentó (P<0,05) a las 96 y 144 horas (4,1; 22,8 veces expresión de la hora 0). Asimismo, los niveles de TRKA aumentaron (P<0,05) luego de 96 y 144 horas (51,3; 111,7 veces expresión de la hora 0) de diferenciación. Además, NGF presento un menor nivel de expresión en las CMM diferenciadas a las 0, 24, 96 y 144 horas de cultivo (1; 0,8; 16,2 y 17,4 veces la expresión de la hora 0), en comparación con el control (1; 5,8; 47,8 y 25,7 veces la expresión de la hora 0), respectivamente. El perfil de expresión relativa de genes obtenido en el protocolo 2 es concordante con el obtenido en el ensayo de inmunoflorescencia asociada a NESTIN, MAP2, TRKA y PrPC. A pesar de que las CMM expuestas a BME presentan cambios morfológicos similares a un perfil neuronal, los valores de expresión génica no indican la adopción de un fenotipo neurogénico. Como ha sido reportado previamente, estos cambios pueden deberse a efectos citotóxicos del BME más que a inducción neurogénica. Sin embargo, el protocolo 2 utilizado en este estudio indujo cambios morfológicos y un perfil de expresión génica asociado a diferenciación neurogénica. En conclusión, las CMM de origen fetal bovino indiferenciadas poseen mayoritariamente un perfil mesenquimático y bajo condiciones de cultivo in vitro adecuadas poseen un potencial de diferenciación neurogénica. / Mesenchymal stem cells (MSC) are multipotent progenitor cells that possess the potential for self-renewal and multilineage differentiation (osteogenic, chondrogenic and adipogenic). Despite MSC have been isolated from several tissues, the most common source of isolation is the bone marrow (BM), both for clinical and research purposes. The differentiation capacity of MSC extends primarily to mesodermal lineages; however, recent studies have shown that MSC have also the potential to differentiate into ectodermal cell types such as neuronal. The aim of this study was to determine the potential for in vitro neurogenic differentiation of MSC isolated from fetal bovine BM. Detection of mesenchymal markers CD90, CD105 and CD73, hematopoietic markers CD34 and CD45 was performed by Quantitative-PCR (Q-PCR) and flow cytometry. Protocol 1 of neurogenic differentiation consisted in pre-induction for 24 hours with DMEM supplemented with 20% fetal bovine serum (FBS), and induction with beta-mercaptoethanol (BME) for 6 days. Protocol 2 of neurogenic differentiation consisted in culture of MSC in DMEM supplemented with Fibroblast Growth Factor-basic (FGFb) and Epidermal Growth Factor (EGF) for 24 hours, followed by culture in DMEM supplemented with butylated hydroxyanisole, KCl, valproic acid, forskolin, neural supplement for 120 hours. Cell samples were taken at 0, 24, 96 and 144 hours of culture. Analyses indicated that mRNA levels of mesenchymal markers CD73, CD90 and CD105 were higher (151.2, 245.1 and 238.1 fold, respectively; P <0.05) relative to CD34. Moreover, flow cytometry detected a high proportion of MSC positive for mesenchymal markers CD29 (76.3%), CD73 (96.8%), pluripotent markers Oct4 (94.6%) and Nanog (88.4%). In contrast, high proportion of MSC were negative to hematopoietic markers CD34 and CD45 (93.4% and 95.6%, respectively). During protocol 1 of neuronal differentiation, NESTIN mRNA levels decreased (P <0.05) at 24, 96 and 144 hours (3,7; 2 and 1 fold 0 hours). In contrast, levels of mRNA of MAP2 increased (P <0.05) at 24, 96 and 144 hours (2,4; 18,9 and 16 fold 0 hours). Similarly, levels of TRKA mRNA increased (P<0.05) at 96 and 144 hours (6,6 and 8 fold 0 hours). NGF and NANOG mRNA levels were not significantly different between treatments. During protocol 2, NESTIN mRNA levels decreased (P <0.05) at 24, 96 and 144 hours (3.74, 0.3, 0.1 fold 0 hours). In comparison, MAP2 mRNA levels increased (P <0.05) at 96 and 144 hours (4,1; 22,8 fold 0 hours). In addition, NGF mRNA levels were lower (P<0,05) in differentiated MSC at 0, 24, 96 and 144 hours of culture (1; 0.8; 16.2 and 17.4 fold the expression at 0 hours) compared to control (1; 5.8; 47.8 and 25.7 fold 0 hours). The gene relative expression values in differentiated MSC were consistent with immunofluorescence patterns. Although BME induced neuron-like changes in MSC morphology, gene expression profiles showed no indication of the adoption of a neurogenic phenotype. As reported before, BME-induced morphological changes may be due to cytotoxic effects rather than neurogenic induction. However, the second protocol induced morphologic changes and a gene expression pattern associated to neurogenic differentiation. In conclusion, undifferentiated MSC isolated from fetal bovine BM possess a mesenchymal profile and under adequate in vitro culture conditions may be induced into neurogenic differentiation. / Financiamiento: Proyecto Fondecyt 11100205.

El desarrollo de las Técnicas de Reproducción Asistida (TERAS) aplicadas en la reproducción humana acarrea un conflicto ético jurídico que aún no ha sido suficientemente analizado. Una de las TERAS más relevantes al presente es la Fecundación In Vitro (FIV), procedimiento que genera sobreproducción de embriones humanos no implantados mantenidos en crioconservación y que enfrentan un futuro incierto; ello conforma uno de los dilemas bioéticos actuales más significativos que aún no ha sido suficientemente estudiado ni legislado en instancia nacional. Esta investigación tiene por finalidad entender adecuadamente, desde una perspectiva Bioética Personalista, el destino de los embriones crioconservados producidos por las TERAS-FIV; investigación de tipo documental y de carácter exploratorio, debido a que en nuestro país el objeto de estudio es aún novedoso y poco regulado. Se trabajó con el método documental y el analítico-sintético, los resultados se dividieron en tres capítulos, el primero referente a la ciencia, profundizando en el proceso de TERAS-FIV, sus avances científico-tecnológicos y las posibilidades de su futuro; el segundo alusivo a la bioética, parte del origen de la ética personalista, para profundizar en lo formulado por Sgreccia y su planteamiento de Bioética Personalista, así como sus principios, metodologías y posturas respecto a la criopreservación de embriones; en el tercero se enfocó en la regulación normativa de las TERAS-FIV, describe los derechos vinculados a este proceso, las carencias en la legislación actual y la jurisprudencia al respecto. Se concluye recogiendo la clara postura de la Bioética Personalista respecto a las TERAS-FIV y señalando las debilidades de la legislación actual, así como los principales aportes del enfoque personalista para una próxima legislación que contemple el destino de los embriones criopreservados.

La defensa de la dignidad y del valor de la vida humana es la primera condición necesaria para encontrar la justicia y la paz en nuestra herida convivencia ciudadana. Esta investigación de enfoque cuantitativo, tipo descriptiva con propuesta educativa, tuvo como objetivo el diseño de un programa de bioética personalista, haciendo uso del vídeo- fórum, para educar las actitudes sobre la vida del embrión humano, en estudiantes de cuarto a quinto año de secundaria de una institución educativa de Batán Grande 2014. Para ello, se aplicó como instrumento a 213 estudiantes un test con escala tipo Likert donde se consideró las actitudes sobre el aborto. El instrumento ha sido tomado del investigador Cruz García Lirios; de su documento de trabajo social «actitudes hacia el aborto legal asistido»; por lo tanto es un instrumento que se encuentra previamente validado. Después de aplicarse el test se recogió y analizó los resultados de manera estadística, lo cual orientó a la elaboración de un diagnóstico y posteriormente a diseñar un programa con bases en los aportes de la bioética personalista”.

Las técnicas de producción artificial (TRA) generan vida humana desprovista de familia. Nuestro objetivo general fue establecer los criterios bioéticos y biojurídicos para modificar la norma sobre las TRA en el Perú. Nos propusimos tres objetivos específicos: 1) Analizar el contenido y consecuencias de las TRA; 2) Analizar el vigente artículo 7° de la Ley N° 26842 – Ley General de Salud (LGS) y una de sus propuestas modificatorias de la comisión del Ministro de Justicia y Derechos Humanos, y 3) Establecer los criterios bioéticos y biojurídicos para regular las TRA, derogando el artículo 7 de la LGS. Y, proponiendo un proyecto de ley. La investigación de tipo cualitativa mediante el método bibliográfico, para establecer relaciones teórico-doctrinarias, nos permitió conocer en profundidad el artículo 7 de la LGS, e identificar la naturaleza profunda del problema de las TRA. Para el abordaje descriptivo, explicativo e interpretativo, recurrimos a las fichas bibliográficas, textuales y de resumen; para recoger, almacenar, organizar y presentar la información extraída de fuentes provenientes de 51 autores desde: 26 libros, 2 artículos de revistas, 5 tesis, 12 normas legales, 28 linkografías. El procedimiento se destinó a elegir el tema de la investigación. La primera recopilación de datos bibliográficos nos permitió conocer en profundidad las TRA y el contenido del Artículo 7° de la LGS. La bibliografía adicional nos otorgó una sólida base de conocimiento sobre las TRA. El análisis cualitativo y de documentos nos permitió conocer la situación legal y de hecho de las TRA en el Perú. Mediante el abordaje metodológico antropológico y jurídico, analizamos los documentos mediante un enfoque científico-humanista. Los criterios éticos para el tema de fondo se enmarcaron en la interdisciplinariedad de la bioética y la búsqueda de un estatuto jurídico del concebido y los límites éticos que deben regir la ciencia y la tecnología. Los criterios éticos para la investigación formal fueron la verdad del registro y análisis de documentos de la referencia bibliográfica, y el uso de la información con respeto a la propiedad intelectual. Los criterios de rigor científico fueron la claridad para el desarrollo de los objetivos, y la credibilidad y profundidad de las fuentes de información. Los principales resultados apuntan a comprender que el ordenamiento jurídico del Perú es proteccionista del concebido, pero no el artículo 7 de la LGS que autorizó las TRA, las que han escapado del control normativo, por lo que implican riesgos para la vida y la salud de los embriones humanos producidos. Nuestra investigación se centra en determinar los criterios bioéticos y biojurídicos, para que una norma regule las biotecnologías del inicio de la vida prohibiendo las TRA, por respeto al derecho de los embriones humanos, acorde a su estatuto biológico, ontológico y jurídico.

La ICSI porcina es una herramienta con gran potencial aplicativo en diversos campos, entre los que destacan la producción de animales transgénicos, y la recuperación de razas en peligro de extinción. Aunque en la actualidad existen referencias de obtención de descendencia viva, el rendimiento es inferior al de otras especies, posiblemente debido al desconocimiento de las condiciones idóneas, y la dificultad de los cigotos para alcanzar el estadío de blastocisto in vitro. El presente trabajo se llevó a cabo para determinar diferentes factores que podrían afectar al rendimiento de la técnica, estudiando el efecto de 1) la secuencia de cultivo de los zigotos recién inyectados; 2) modificaciones en el sistema de MIV tradicional, y por último 3) la activación exógena del ovocito mediante la inyección de inositol trifosfato con el espermatozoide. El objetivo global de este estudio fue el de incrementar el rendimiento final de la ICSI en la especie porcina. / ICSI in pigs is a tool with an important applicable potential in diverse fields. One of this is the production of transgenic animals, and the conservation of endangered species. Even though there are some cases of living offspring, its output is still quite low comparing to other species, possibly due to unknown factors referring to ideal conditions for the development, and to the difficulty of the zygotes to reach the blastocyst stage in vitro. The goal of this study was to evaluate different factors affecting the ICSI performance. This was done by studying 1) the sequence of culture of the injected oocytes; 2) In vitro maturation (IVM) modifications, through meiotic inhibitors, such as roscovitine, and changes in IVM duration time, and finally 3) the exogenous oocyte activation through inositol triphosphate (InsP3) injection together with the sperm. The main objective of this study was to increase the final performance of ICSI in pigs.

La transgénesis es una potente herramienta biotecnológica para la generación de animales modificados genéticamente con aplicaciones en diversas áreas como veterinaria, biomedicina y agricultura. La técnica de transgénesis mediada por espermatozoides (SMGT) se basa en la habilidad intrínseca de las células espermáticas para unir e interiorizar ADN exógeno y permitir su transferencia al interior de los ovocitos tras la fecundación, e integrarse en el genoma del nuevo embrión. El objetivo global de este estudio fue desarrollar un método eficiente de producción in vitro de embriones porcinos y lechones transgénicos aprovechando la capacidad de transferencia de ADN exógeno que presenta el espermatozoide.La combinación de la técnica de ICSI y SMGT es un método eficiente para la producción de lechones y embriones transgénicos, viéndose incrementada su eficiencia mediante el uso de la recombinasa RecA, obteniendo los primeros lechones nacidos en España mediante ICSI, de los cuales 2 fueron transgénicos. / The transgenesis is a powerful biotechnological tool for the generation of genetically modified animal with applications in different areas such as veterinary medicine, biomedicine and agriculture. The technique of sperm mediated gene transfer (SMGT) is based on the intrinsic ability of the spermatozoa to bind exogenous DNA and to allow its transference to the oocytes after fertilization, and to integrate in the genome of the new embryo. The global objective of this study was to develop an efficient method of in vitro production of transgenic embryos and piglets using the spermatozoa capacity to bind to exogenous DNA.The combination of the ICSI technique and SMGT is an efficient method for the production of transgenic embryos and pigs. The efficiency was increased by the use of recombinase RecA, obtaining the first piglets born in Spain by means of ICSI and two of them were transgenic.

Tesis por compendio / [ES] Para evaluar los efectos del proceso de selección en una línea paterna de conejos, se compararon los rasgos de crecimiento y rendimiento reproductivo de la descendencia actual (generación R36) en similar ambiente con una población control rederivada de embriones de una generación anterior (R18). Para reducir/evitar el efecto del proceso de criopreservación sobre los rasgos fenotípicos se rederivaron embriones de la generación actual (R36) y obtener una 3ra población (R37V). Capítulo 1, se compara la R37V y la descendencia de la R36 nacida por inseminación artificial (R37). Hubo diferencias en rasgos de crecimiento postnatal en las 3 generaciones evaluadas, pero no en el crecimiento fetal, componentes del tamaño de la camada y rasgos reproductivos. Así, los procesos de criopreservación y transferencia de embriones causan cambios en rasgos de crecimiento de poblaciones reconstituidas que influyen en las siguientes generaciones, sin producir cambios en los reproductivos. En los siguientes capítulos, para reducir/evitar los efectos del proceso de rederivación, la deriva genética y factores ambientales sobre los rasgos fenotípicos, se usó sólo poblaciones rederivadas para comparar los rendimientos reproductivos y de crecimiento. Capítulo 2, al ser los machos usados para producir dosis seminales en centros de inseminación y granjas, se evaluó si el programa de selección modificaba los rasgos seminales, el proteoma del plasma seminal y de espermatozoides, y la fertilidad del semen al usarla en inseminación artificial. Se analizó el proteoma del plasma seminal y espermatozoides de machos maduros de c/grupo y se prepararon dosis seminales para inseminación. Sólo el porcentaje de espermatozoides anormales mostró diferencias, presentando los R21 menos espermatozoides anormales que los R39. El análisis discriminante (DA-PLS) mostró efecto de la generación para el proteoma plasmático y espermático. En plasma seminal, se reportaron 64 proteínas diferencialmente expresadas y 56 sobreexpresadas en R39 (87,5%). Del proteoma de espermatozoides 132 diferencialmente abundantes y 89 sobreexpresadas en R39 (67,4%). A pesar de las diferencias en importantes proteínas relacionadas con la capacitación, la motilidad, la inmunoprotección de espermatozoides y la fecundación, no hubo diferencias en fertilidad y prolificidad con las dosis seminales para inseminación. Capítulo 3, se analizó el efecto de la selección por ganancia media diaria de peso (GMD) post-destete después de 37 generaciones. Tras 2 generaciones post rederivación (R21 vs. R39), todos los caracteres evaluados mostraron progreso resultado de la selección, y no afecta a los parámetros estimados de la curva de crecimiento de Gompertz. Los resultados demuestran que el programa de selección mejoró la GMD sin variar el peso corporal adulto, pero tras 37 generaciones de selección, este carácter parece agotado. Capítulo 4, comparamos los parámetros reproductivos de conejas entre las poblaciones rederivadas y control. Los rasgos de desarrollo prenatal y los componentes del tamaño de camada se midieron en la 2da generación post rederivación (R20 y R38). Así la selección por GMD no tiene efectos adversos sobre los componentes del tamaño de la camada, y el área del saco fetal al día 12 de gestación, área de la placenta fetal y la longitud cráneo-rabadilla del feto al 19 de gestación fueron mayores en R38. Resultados muestran que la selección por GMD no afecta negativamente el rendimiento reproductivo. Conclusión, el estudio demuestra que los efectos de la criopreservación sobre los rasgos de crecimiento persisten dos generaciones post rederivación. Además, la línea muestra signos de agotamiento del progreso genético quizás por el bajo rendimiento reproductivo y elevada mortalidad postnatal. La selección por GMD influyó en cambios del crecimiento fetal y del proteoma del eyaculado, sin afectar al rendimiento reproductivo de hembras ni la fertilidad y prolificidad de las dosis seminales de machos. / [CA] Per avaluar els efectes del procés de selección en una línia paterna de conills, es van comparar els trets de creixement i el rendiment reproductiu de la descendència de la generació actual (R36) sota el mateix entorn amb una població control derivada dels embrions emmagatzemats d'una generació anterior (R18). Per reduir/evitar l'efecte del procés de criopreservació embrions de la generació actual (R36) es van criopreservar i transferir (rederivar) per obtenir una 3a població (R37V). Capítol 1, es compara la generació R37V i la descendència de la 36a generació nascuda per inseminació artificial (R37). Hi ha diferències en els trets de creixement postnatal a les tres generacions avaluades. Tot i que el creixement fetal, els components de la mida de la ventrada i els trets reproductius no van mostrar diferències. La rederivació provoquen canvis en els trets de creixement de les poblacions reconstituïdes que influeixen en les generacions següents, sense canvis en els trets reproductius. En els capítols següents, per reduir/evitar els efectes del procés de rederivació, la deriva genètica i els factors ambientals sobre els trets fenotípics, es van utilitzar les poblacions rederivades per comparar els rendiments reproductius i de creixement. Capítol 2, ja que els mascles s'utilitzaven per produir dosis de semen en centres d'inseminació i granges, es va estudiar si un programa de selecció per guany mitja de pes diari pot canviar els trets seminals, el proteoma del plasma i dels espermatozoides i la fertilitat del semen en la inseminació artificial. Només el percentatge d'espermatozoides anormals mostra diferències significatives, R21 presentant menys espermatozoides anormals que R39. L'anàlisi discriminant (DA-PLS) mostra efecte de la generació al proteoma del plasma i dels espermatozoides. En plasma seminal, 64 proteïnes es van expressar de manera diferent, 56 sobre-expressades en R39 (87,5%). El proteoma de l'esperma 132 proteïnes diferencialment abundants, 89 sobre-expressades en R39 (67,4%). Tot i observar diferències en proteïnes importants relacionades amb la capacitat, la motilitat o la immunoprotecció dels espermatozoides i la fecundació, La fertilitat i la prolificitat es van detectar quan es van utilitzar dosis seminals comercials per a la inseminació. Capítol 3, vam avaluar l'efecte d'una selecció a llarg termini per a l'augment de pes mitjà diari (ADG). Després de dues generacions d'ambdues poblacions rederivades (R21 vs. R39), tots els trets avaluats mostra algun progrés. Aquesta resposta no sembla afectar els paràmetres estimats de la corba de creixement de Gompertz. Resultats demostra que el programa de selecció havia millorat l'ADG sense variacions en pes corporal adult, però després de 37 generacions de selecció, aquest tret sembla esgotat. Capítol 4, compara els trets reproductius entre poblacions femenins entre ambdues poblacions (rederivades i control). El desenvolupament fetal i els components de la mida de la ventrada es mesura els trets a la segona generació després de la rederivació (R20 i R38). Resultats suggereix que la selecció per ADG no té cap efecte advers sobre els components de la mida de la ventrada i la zona del sac fetal el dia 12 de gestació i la zona de la placenta fetal i la longitud de la corona-gropa del fetus el dia 19 de gestació eren més grans a la R38. La selecció per ADG no afecta negativament els components de la mida de la ventrada, el creixement fetal i el rendiment reproductiu. Nostre estudi proporciona més proves dels efectes de la criopreservació sobre els trets de creixement que persisteixen dues generacions després de la rederivació. La línia va mostrar signes d'esgotament del progrés genètic per baix rendiment reproductiu i l'alta mortalitat postnatal. La selecció per ADG va influir en els canvis en el creixement fetal i en el proteoma ejaculat, però no va afectar el rendiment reproductiu de les femelles ni la fertilitat i la prolificitat de les dosis seminals dels mascles. / [EN] To evaluate the effects of the selection process in a paternal line of rabbits, growth traits and reproductive performance from the offspring of the current generation (R36) were compared under the same environment with a control population rederived from embryos stored of a previous generation (R18). To reduce or avoid the effect of the cryopreservation process on phenotypic traits embryos of current generation (R36) were cryopreserved and transferred to obtain a third population (R37V). In chapter 1, R37V generation and offspring of 36th generation born by artificial insemination (generation R37) were compared. Differences in postnatal growth traits were observed in the three generations assessed. Although foetal growth, litter size components and reproductive traits did not show significant differences. In conclusion, cryopreservation and embryo transfer processes cause changes in growth traits of reconstituted populations that influence the following generations, without changes in reproductive traits. In the following chapters, to reduce or avoid the effects of the rederivation process, genetic drift and environmental factors on phenotypic traits, only the rederived populations were used to compare reproductive and growth performances. In chapter 2, considering that males were used to produce semen doses at insemination centres and farms, we studied whether a programme of selection by daily gain changed the seminal traits, plasma and sperm proteome and the fertility of semen when used in artificial insemination. Seminal plasma and sperm proteome from mature males of each group were analysed and semen doses were used to inseminate females. Only the percentage of abnormal sperm showed significant differences, R21 presented fewer abnormal sperm than R39. The discriminant analysis (DA-PLS) showed an effect of the generation for plasma and sperm proteome. In seminal plasma, 64 proteins were differentially expressed, 56 were overexpressed in R39 (87.5%). Sperm proteome reported 132 differentially abundant proteins, 89 were overexpressed in R39 (67.4%). Despite differences in important proteins related to capacitation, sperm motility or immunoprotection and to the fertilization process, no differences in fertility and prolificacy were detected when commercial seminal doses were used for insemination. In chapter 3, we evaluated the effect of a long-term selection for post-weaning average daily weight gain (ADG) over 37 generations. After two generations of both rederived populations (R21 vs. R39 generations), all evaluated traits showed some progress as a result of the selection. This response does not seem to affect the estimated Gompertz growth curve parameters. Results demonstrated that the selection programme had improved ADG without variations in adult body weight but, after 37 generations of selection, this trait seems exhausted. In chapter 4, we compared female reproductive traits between both rabbit populations (rederived and control). Foetal growth and litter size traits were measured in the second generation after rederivation (R20 and R38 generations). Our study suggests that selection for growth rate has no adverse effect on litter size components and the foetal sac area at day 12 of gestation, and foetal placenta area and crown-rump length of the foetus at day 19 of gestation were higher in the R38 generation. These results show that selection for growth rate does not adversely affect on reproductive performance. In conclusion, our study provides further evidence of the effects of cryopreservation on growth traits persisting two generations after rederivation. Moreover, the paternal line showed signs of genetic progress exhaustion due to low reproductive performance and high postnatal mortality. Selection by daily weight gain influenced changes in foetal growth and ejaculate proteome, but did not affect the reproductive performance of females or the fertility of seminal doses of males. / This research was supported by AGL2017-85162-C2-1-R research project funded by Ministerio de Economía, Industria y Competitividad (MICINN, Spain). Funding for open access charge: CRUE- Universitat Politècnica de València. / Juárez Moreno, JD. (2022). Embryo cryopreservation and transfer to rederive a paternal rabbit line after 18 generations. Evaluation of growth and reproductive traits [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/185071 / TESIS / Compendio