O endométrio é a mucosa que reveste o útero. A receptividade uterina é definida como um estado em que o endométrio se encontra receptivo à implantação do blastocisto. E, a preparação do endométrio para a implantação não é somente uma questão de estimulação hormonal adequada, depende da interação entre o blastocisto e o endométrio. Esta interação envolve uma complexa sequência de eventos de sinalização e uma variedade de moléculas. As concentrações de interleucina-8 (IL-8) e interleucina-1β (IL-1β) estão correlacionadas com o processo de implantação. Em humanos, a taxa de insucesso desse processo é alta e ocasionada por diversos fatores. A síndrome dos ovários policísticos (SOP) é um distúrbio endócrino-ginecológico que afeta de 6 a 8 % das mulheres em idade reprodutiva, e se caracteriza, principalmente, por anovulação crônica e hiperandrogenismo, estando diretamente relacionada à infertilidade feminina. Apesar da incerteza sobre a causa primária da SOP, há relatos sobre a importância da hiperinsulinemia na sua promoção. O objetivo deste trabalho foi estabelecer um modelo de hiperinsulinemia e hiperandrogenismo em células estromais endometriais in vitro, simulando características de SOP; identificar o melhor gene normalizador para estudos de expressão gênica em amostras das células em cultivo; avaliar o efeito da metformina sobre a proliferação celular e expressão gênica da IL-8 e IL-1β no modelo proposto. O tecido endometrial foi obtido de pacientes submetidas a histerectomia. A cultura primária das células estromais foi padronizada e as células foram divididas em sete grupos de tratamento: estradiol (G1); estradiol e progesterona (G2); estradiol, progesterona e insulina (G3); estradiol, progesterona e diidrotestosterona (G4); estradiol, progesterona e metformina (G5); estradiol, progesterona, insulina e diidrotestosterona (G6); estradiol, progesterona, insulina, diidrotestosterona e metformina (G7). Foi realizada análise de imunocitoquímica para vimentina para confirmação do cultivo com células estromais. Para avaliar a viabilidade e proliferação celular ao longo do tempo foi utilizado o ensaio de MTT em dois tempos diferentes de cultivo. As extrações de RNA foram realizadas e o cDNA obtido das amostras foi utilizado para a amplificação do mRNA de cinco genes candidatos a normalizadores e para avaliar a expressão dos genes da IL-8 e IL-1β através de PCR em tempo real.O estabelecimento da cultura de células estromais foi confirmado através da coloração positiva para a proteína vimentina. As células mantiveram-se viáveis durante todo o período de cultivo, apresentando aumento significativo na proliferação celular no tempo 8 em relação ao tempo 4 em todos os grupos. O grupo G7 (tratado durante 48 horas com metformina) apresentou uma menor taxa de proliferação em relação aos grupos G2, G3 e G6. Para análise de expressão gênica nestas células, o gene que mostrou os melhores parâmetros de estabilidade de expressão no modelo celular proposto foi o gene HPRT1. Observamos uma maior expressão do gene da IL-8 no grupo G5 tratado durante 48 horas em relação ao mesmo grupo tratado durante o período de 24 horas. Verificou-se maior expressão do gene da IL-1β no grupo G5 quando comparado a todos os outros grupos no período de 48 horas de tratamento com metformina. Entretanto, o grupo G7, também tratado com metformina, não apresentou diferença estatística em relação ao tempo de tratamento em nenhum dos genes estudados. Esses resultados demonstram que o modelo de hiperinsulinemia e hiperandrogenismo em cultura de células estromais endometriais é viável. Neste modelo, em que foram testados cinco genes em relação à sua estabilidade de expressão, o gene HPRT1 apresentou uma boa estabilidade, ao contrário de outros genes frequentemente utilizados como genes de referência. O tratamento com metformina apresentou um efeito antiproliferativo nas células do grupo hiperinsulinêmico e hiperandrogênico. No período de 48 horas aumentou a expressão do gene da IL-1β no grupo tratado somente com o medicamento. Sugerindo uma ação inibitória da insulina sobre a expressão dos genes da IL-8 e IL-1β no grupo hiperinsulinêmico e hiperandrogênico. Mais estudos são necessários para melhor entendimento do efeito da metformina nos fatores envolvidos durante a implantação. / The endometrium is the mucosa lining the uterus. The uterine receptivity is defined as a condition in which the endometrium is receptive to implantation of the blastocyst. The preparation of the endometrium for implantation is not only a matter of proper hormonal stimulation, it depends on the interaction between the blastocyst and the endometrium. This interaction involves a complex sequence of events and a variety of signaling molecules. The concentrations of interleukin-8 (IL-8) and interleukin-1β (IL-1β) are correlated to the implantation process. In humans, the failure rate of this process is high and caused by several factors. The polycystic ovary syndrome (PCOS) is an endocrine-gynecological disorder that affects from 6 to 8 % of women of reproductive age. It is characterized mainly by chronic anovulation and hyperandrogenism and directly related to female infertility. Despite the uncertainty about the primary cause of PCOS, there are reports about the importance of hyperinsulinemia in promoting it. The aim of this study was to establish a model of hyperinsulinemia and hyperandrogenism in endometrial stromal cells in vitro, simulating features of PCOS; to identify the best housekeeping gene for gene expression studies in the cultured cells; to evaluate the effects of metformin on cell proliferation, as well as IL-8 and IL-1β gene expression in the proposed culture model. The human endometrial tissue was obtained from patients undergoing hysterectomy. The primary culture of stromal cells was standardized and divided into seven treatment groups: estradiol (G1); estradiol and progesterone (G2); estradiol, progesterone and insulin (G3); estradiol, progesterone and dihydrotestosterone (G4); estradiol, progesterone and metformin (G5); estradiol, progesterone, insulin and dihydrotestosterone (G6); estradiol, progesterone, insulin, dihydrotestosterone and metformin (G7). Immunocytochemistry analysis for vimentin were performed. Cell viability and proliferation were evaluated by MTT assay at two days in different times of cultivation. RNA extractions were performed and the cDNA obtained from primary culture was used to amplify five candidates to housekeeping genes mRNA and to evaluate IL-8 and IL1β expression by real time PCR. The stromal culture cell establishment was confirmed by positive staining for vimentin. The cells remained viable throughout the cultivation period, with significant cell proliferation increase at day 8 compared to day 4 in all groups. The G7 group (metformin treated for 48 hours) showed lower proliferation rate than G2, G3 and G6 groups. For gene expression analysis in these cells, the gene showing the best parameters of stability of expression was HPRT1. Increased gene expression of IL-8 was observed in G5 group treated for 48 hours compared to the same group during 24 hours. Similarly, the G5 group showed higher IL-1β gene expression when compared to all other groups treated with metformin for 48 hours. However, the G7 group, also metformin treated, did not show statistically significant difference in treatment time of any studied genes. These results suggest that model of hyperinsulinemia and hyperandrogenism in endometrial stromal cells is viable and provides a good cell sampling to molecular analysis under different experimental conditions. In this model, several genes were tested for expression stability. HPRT1 presented the best values, unlike others classical housekeeping genes. The metformin treatment showed an antiproliferative effect on cells in hyperinsulinemic and hyperandrogenic group and at 48 hours increased IL-1β gene expression in the treated group with the drug alone. It suggests an inhibitory action of insulin on these genes expression in the hyperinsulinemic and hyperandrogenic group. More studies are needed to better understand the effect of metformin on the factors involved during implantation.

A corticoterapia tem sido utilizada frequentemente nas éguas suscetíveis. O uso de isuflupredona melhora a taxa de prenhez e altera o perfil proteico do líquido endometrial em relação a éguas não tratadas. A utilização de dexametasona diminui o acúmulo de líquido pós-cobertura, reduz o edema do útero, porém, desconhecem-se seus efeitos no perfil proteico do líquido endometrial. O objetivo do presente estudo foi analisar o efeito da dexametasona em éguas suscetíveis à endometrite persistente póscobertura sobre perfil proteico do líquido endometrial na presença ou ausência de infecção. Nove éguas suscetíveis foram utilizados, com idade entre 7 a 30 anos. Após a verificação dos sinais de estro as éguas foram submetidas a quatro tratamentos: (C) éguas não receberam nenhum tipo de tratamento e serviram como controle; (D) éguas receberam 40mg de dexametasona (IV), no momento da cobertura, com coleta da amostras após 6 horas, (I-6 e I-24) infusão intra-uterina de 1 x 109 de S. zooepidemicus/mL, com coleta da amostra após 6 e 24 horas; (I/D-6 e I/D-24) infusão intra-uterina de 1 x 109 S. zooepidemicus/mL e administração de 40mg de dexametasona (IV), com coleta da amostra após 6 e 24 horas. Todas as éguas foram submetidas a todos os tratamentos. As amostras foram coletadas e submetidas à eletroforese bidimensional para separação proteica e espectrometria de massa para a identificação das bandas proteicas relevantes. A corticoterapia provocou alteração na proteômica do líquido endometrial de éguas suscetíveis, caracterizada pelo aumento (TTR) e/ou diminuição (ApoA1) na densidade óptica de proteínas da fase aguda da inflamação. Conclui-se que a utilização da dexametasona em éguas com e sem presença de infecção altera a proteômica do fluido endometrial de éguas suscetíveis. Sugere-se que a dosagem ou a frequência de aplicação da dexametasona deva ser aumentada. / Corticotherapy has often been used in susceptible mares. The use of isuflupredona improves pregnancy rate and alters the protein profile of the endometrial fluid in relation to untreated mares. The use of dexamethasone decreases the post breeding fluid accumulation, reduces the uterine edema, however is unaware of its effects on the protein profile of endometrial fluid. The aim of the present study was analyze the effect of dexamethasone in mares susceptible to post-breeding persistent endometritis on the protein profile of endometrial fluid in the presence or absence of infection. Nine susceptible mares were used, aged 7-30 years old. After checking the signs of estrus, mares were subjected to four treatments: (C) mares received no treatment and served as controls; (D) mares received 40 mg of dexamethasone at breeding time, with collection of samples after 6 hours; (I-6 and I-24) intrauterine infusion of 1 x 109 S. zooepidemicus/ml and the sample was collected after 6 and 24 hours; (I/D-6 and I/D-24) intrauterine infusion of 1 x 109 S. zooepidemicus/ml and 40 mg of dexamethasone administration, collecting the sample after 6 and 24 hours. All of the mares were subjected to all treatments. Samples were collected and subjected to two-dimensional electrophoresis for protein separation and mass spectrometry for the identification of relevant protein bands. Corticotherapy resulted in alteration of the protein profile of the endometrial fluid of susceptible mares, characterized by an increase (TTR) and/or decrease (ApoA1) in optical density of the acute phase of proteins of inflammation. We conclude that the use of dexamethasone in mares with and without the presence of infection alters the protein profile of endometrial fluid of susceptible mares. It is suggested that the dosage or frequency of application of dexamethasone should be increased.

Introdução: o carcinoma de endométrio é uma das neoplasias ginecológicas mais comuns nos países industrializados. O tratamento desta doença é primariamente cirúrgico. Segundo a normatização da Federação Internacional de Ginecologia e Obstetrícia (FIGO), a cirurgia ideal consiste na realização de histerectomia total, anexectomia bilateral, linfadenectomia retroperitonial e coleta de citologia peritoneal. No entanto, a realização sistemática da linfadenectomia tem sido contestada. Alguns centros de referência acreditam que deva ser realizada apenas em um grupo de pacientes com alto risco para disseminação linfática da doença. O desafio é encontrar marcadores pré-operatórios que possam ser preditivos da presença de doença linfonodal e, assim , virem a ser utilizados para a definição da necessidade da linfadenectomia. Objetivos: verificar se a expressão imuno-histoquímica (IMH) positiva da p53 na amostra endometrial diagnóstica e, se o valor sérico do CA 125 obtido no tempo pré-operatório, podem ser efetivos para prever a presença de doença linfonodal. Métodos: um estudo transversal restrospectivo foi realizado. Foram incluídas 111 pacientes com carcinoma de endométrio submetidas a histerectomia com anexectomia bilateral e linfadenectomia com ou sem citologia peritoneal. Noventa pacientes apresentavam CA 125 pré-operatório e 73, a avaliação da p53. Cinquenta e quatro pacientes apresentavam as duas variáveis em combinação. Foram estabelecidas as associações entre o valor de CA 125 e da expressão IMH da p53 com o envolvimento linfonodal. Uma curva ROC foi construída para identificar o valor de CA 125 com melhor Sensibilidade (S) e Especificidade (E) para doença linfonodal. / Introduction: endometrial carcinoma is one of the most common gynecological malignancies in industrialized countries. The treatment of this disease is primarily surgical. According to the International Federation of Gynecology and Obstetrics surgery ideal consists in performing total hysterectomy, bilateral adnexectomy, retroperitoneal lymphadenectomy and peritoneal cytology. However, the systematic lymphadenectomy has been disputed, and should only be performed in a group of patients at high risk of lymphatic spread of the disease. The challenge is to find preoperative markers that may be predictive of the presence of lymph node disease and thus come to be used to determine the necessity of lymphadenectomy. Objectives: to determine whether the positive immunohistochemical expression (IMH) of p53 in diagnostic endometrial sample and, if the value of serum CA 125, obtained during pre-operative, can be effective to predict the presence of lymph node disease. Methods: a cross-sectional study was conducted. The final sample consisted of 111 patients with endometrial carcinoma undergoing hysterectomy with bilateral adnexectomy and lymphadenectomy with or without peritoneal cytology. Ninety two patients had preoperative CA 125 and 73, evaluation of p53. Fifty four patients had both variables in combination. Associations have been established between the value of CA 125 and IMH expression of p53 with lymph node involvement. A ROC curve was constructed to identify the value of CA 125 with better sensitivity (S) and specificity (E) for lymph node disease.

Base teórica: O processo de implantação do embrião no ser humano é extremamente complexo e, ao mesmo tempo, essencial para que a mulher possa engravidar. Neste processo, em que o endométrio precisa sofrer uma série de mudanças para tornar-se receptivo, a adequada expressão de MFG-E8 (milk fat globule epidermal growth factor 8), seu receptor a integrina αvβ3 e LIF (leukemia inhibitory factor) parecem ter um papel importante. Além do mais, mulheres com infertilidade e endometriose podem apresentar a falha de implantação como uma grande barreira para obter seu sucesso terapêutico. Objetivos: Avaliar o papel de MFG-E8 e do seu receptor integrina αvβ3 em um modelo de implantação in vitro com uma linhagem celular trofoblástica e outra de epitélio endometrial. Comparar a expressão de MFG-E8, de integrina αvβ3 e de LIF no endométrio de pacientes férteis e inférteis com endometriose durante a janela de implantação. Métodos: No primeiro ensaio, utilizando-se uma linhagem celular bem diferenciada de adenocarcinoma de endométrio (células Ishikawa) e uma linhagem de coriocarcinoma de trofoblasto, o modelo in vitro de implantação humana foi estabelecido. Para investigação do impacto do bloqueio de MFG-E8 e integrina αvβ3, ambas linhagens celulares foram pré-tratadas com anticorpos contra estas proteínas em diferente concentrações antes do ensaio de adesão. No ensaio subsequente, para comparar a expressão de MFG-E8, de integrina αvβ3 e de LIF no endométrio humano, foram realizadas biópsias no período da janela de implantação (LH+7 a LH+10) com cateter de Pipelle. As amostras foram submetidas a imunohistoquímica, e analisadas através do HSCORE. Resultados: Na avaliação in vitro observamos que as células Ishikawa pré-tratadas com anticorpo anti-MFG-E8 causaram diminuição da adesão das esferas Jar dose-dependente. Por outro lado, o pré-tratamento das esferas Jar não resultou em diminuição significativa da adesão. Pré-tratamento com anticorpos anti-integrina αvβ3, tanto de células Ishikawa como de esferas Jar, causaram inibição significativa, dose-dependente, da adesão das esferas. A análise imunohistoquímica das biópsias realizadas durante a janela de implantação mostrou uma expressão aumentada de MFG-E8 em pacientes com endometriose e infertilidade. Além do mais, houve expressão diminuída de LIF no grupo em estudo. Contudo, não houve diferença estatisticamente significativa na expressão de integrina αvβ3 entre os grupos em estudo. Conclusão: Este estudo demonstrou que, quando se bloqueia MFG-E8 ou seu receptor integrina αvβ3 em células Ishikawa em um modelo in vitro, ocorre uma diminuição de adesão das células Jar. Além do mais, bloqueando-se a integrina αvβ3 nas esferas Jar, também ocorre uma diminuição da adesão destas nas células Ishikawa. No entanto, quando estudamos o endométrio in vivo de pacientes com endometriose e infertilidade, encontramos a expressão aumentada de MFG-E8 e diminuída de LIF durante a janela de implantação no endométrio. / Background: The human implantation process is very complex and, at the same time, it is essential for women to achieve pregnancy. In this process, where the human endometrium must go through a lot of changes in order to become receptive, an adequate expression of MFG-E8 (milk fat globule epidermal growth factor 8), integrin αvβ3 and LIF (leukemia inhibitory factor) appear to play an important role. Furthermore, women with endometriosis and infertility may have in their implantation process the key to achieve pregnancy. Objectives: To investigate the role of MFG-E8 and its receptor integrin αvβ3 in the attachment of trophoblast cells to the endometrial epithelium, in an in vitro model. To compare endometrial expression of MFG-E8, integrin αvβ3 and LIF between fertile patients and patients with endometriosis and infertility during the window of implantation. Methods: In our first assay, by using a well-differentiated endometrial adenocarcinoma cell line (Ishikawa cells) and choriocarcinoma human trophoblast cells (Jar cells), an in vitro model mimicking human implantation was established. To investigate the impact of blocking MFG-E8 and integrin αvβ3, the cell lines were pretreated with antibodies against those proteins at different concentrations before the attachment assay. Moreover, to compare endometrial expression of MFG-E8, integrin αvβ3 and LIF, endometrial biopsies were performed during the window of implantation (LH+7 to LH+10) with the Pipelle catheter. The samples were submitted immunochemistry, and analyzed with HSCORE. Results: Pretreatment of Ishikawa cells with anti-MFG-E8 antibody caused a dosedependent and significant inhibition of attachment is our in vitro assay. On the other hand, pretreatment of Jar spheroids did not result in a significant effect on the attachment rate. Pretreatment of Ishikawa cells as well as Jar spheroids with anti-integrin avb3 antibodies resulted in a dose-dependent, significant inhibition of attachment. The immunochemistry analysis of the endometrial biopsies performed during the window of implantation showed increased MFG-E8 expression in patients with endometriosis and infertility. Moreover, there was lower LIF expression in the study group. Conclusion: This study showed that blocking MFG-E8 and its receptor integrin αvβ3 in Ishikawa cells diminishes Jar spheroid attachment in an in vitro model. Moreover, blocking integrin αvβ3 in the trophoblastic cells also diminished their attachment to the Ishikawa monolayer. Nevertheless, when we studied the endometrium of patients with endometriosis and infertility, we saw an increased expression of MFG-E8 and decreased expression of LIF during the window of implantation.

Orientador: Aureo Tatsumi Yamada / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-13T00:51:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Aires_MarluciaBastos_D.pdf: 2189429 bytes, checksum: 72ea45d01e8d2f7c191ae7c71d82c5f8 (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: A implantação embrionária implica em alterações profundas do ambiente uterino, cujos eventos devem obedecer uma sincronia temporal e espacial com o estágio do desenvolvimento embrionário. Qualquer desequilíbrio nesta sincronia resulta em interrupção da gestação e o desconhecimento dos mecanismos que atuam nas interações materno-fetais inviabilizam as possíveis intervenções buscando controlar as causas que levam às perdas iniciais da gestação. Visando contribuir para a melhor compreensão da biologia da resposta uterina de bovinos, o presente trabalho utilizou úteros de bovinos (Bos spp) não gestantes (NG) e gestantes nos períodos correspondentes à implantação embrionária para a coleta de fragmentos das regiões carunculares (CAR) e intercarunculares (IC). Esses fragmentos foram processadas para embebição em parafina destinadas às análises histológicas e obtenção de RNA total para realização de RT-PCR semi-quantitativo dos morfógenos Bmp2, Wnt2, Wnt5a, Wnt7a, e de seus antagonistas Sostdc1, Noggin, Dkk1 e Sfrp2. Pela análise histológica do desenvolvimento da mucosa uterina da região CAR foram estabelecidos os critérios morfológicos das seqüências de alterações da histoarquitetura endometrial em resposta à implantação embrionária constituindo quatro grupos (P1-P4) definindo os períodos gestacionais correspondentes, quais sejam: P1 (20-26 dg) - adesão das células trofoblásticas na superfície apical das células epiteliais e/ou entremeadas no revestimento epitelial, P2 (28-33 dg) - presença de projeções digitiformes na superfície da região CAR e tecido epitelial uterino constantemente rompido em ambas as regiões CAR e IC, P3 (35-40 dg) - expansão das projeções da região CAR formando uma rede anastomosada, entremeada pelo córion e P4 (50-60dg) - consolidação do placentônio. A ruptura das células epiteliais observada em P2 demonstra a fragilidade da interação epitélio-córion neste período que pode estar diretamente relacionada com a alta freqüência de perdas gestacionais em bovinos particularmente durante a implantação embrionária. A reação imunocitoquímica para anti-PCNA demonstrou uma marcação crescente no epitélio (E) e estrato subepitelial (ES), particularmente nas projeções da CAR de P1 a P4 e em menor proporção no E e estrato compacto (EC) da IC, confirmando a intensa atividade proliferativa associada com a hipertrofia endometrial. As análises da expressão genica através de RT-PCR, demonstraram a presença dos transcritos de Bmp2, Sostdc1, Noggin, Wnt2, Wnt5a, Wnt7a, Sfrp2 e Dkk1, e pela hibridização in situ, confirmaram-se as expressões localizadas dos genes Bmp2, Wnt5a, Wnt7a, Dkk1, Sfrp2, além dos receptores Bmpr1a e Bmpr2 no E+ES da CAR e E+EC da IC no útero NG e gestantes de P1 a P4. A expressào de Bmp2 foi maior na CAR em relação a IC em P1 e P2 o que sugere uma participação importante na ativação da resposta da região CAR relacionada com a implantação embrionária, enquanto o Wnt5a parece não atuar neste período. A redução da expressão de Wnt2 em P1, indica uma regulação negativa na CAR e IC no inicio da implantação, enquanto que a menor expressão de Wnt7a na CAR em relação a IC sugere que este gene não está relacionado com as principais alterações observadas nessa região. A maior expressão de Dkk1 e Sfrp2 na CAR em relação à IC, sugere a participação na atividade celular da região CAR, porém não apresenta relação direta com a expressão dos genes Wnt analisados, assim como a ausência de Sostdc1 no endométrio e a menor expressão de Noggin demonstram não serem estes os antagonistas principais de BMP que atuam no endométrio bovino. A expressão de Wnt e Bmp em conjunto com seus antagonistas simultaneamente nas regiões CAR e IC atesta a dependência da ação múltipla e sinérgica/antagônica de vários fatores na modulação da resposta da mucosa uterina na implantação embrionária e durante o desenvolvimento da placentação sinepitéliocorial. / Abstract: The embryo implantation implies in deep changes of the uterine environment which events must be topologically and chronologically synchronized with embryo development stage. Any imbalance in this synchronization results in disruption of the gestation and the lack of knowledge regarding the mechanisms of maternal-fetal interaction make difficult any potential action intending to control the causes which induce early gestational loss. Aiming to contribute to a better understanding of the biology of bovine uterine response, the present work evaluated the caruncle (CAR) and intercaruncle (IC) regions collected from non-pregnant (NG) and pregnant bovine uteri (Bos spp) and processed for paraffin embedding and submitted to histological analysis, RNA isolation for RT-PCR of Bmp2, Wnt2, Wnt5a and Wnt7a morphogen genes and their antagonists Sostdc1, Noggin, Dkk1 and Sfrp2 gene expression. By histological analysis of CAR uterine mucosa development, the morphological criteria of the endometrial histoarchitecture changes sequences were established and adopted to compose four groups (P1- P4) with corresponding gestational stages: P1 (20-26 gd) - adhesion of throphoblast cells on the apical surface of epithelium cells and/or between them, P2 (28-33 gd) - villous-like projections on the CAR surface and areas of disrupted or absence of epithelial cells on both CAR and IC regions, P3 (35-40 gd) - expansion of villous-like projections resulting in an anastomosis mesh where chorion villi intrude, P4 (50-60 gd) - placentome consolidation. The constant disruption of epithelial cells seen in P2 evidenced the fragility of epithelium-chorion interaction that may be related to the high incidence of bovine pregnancy loss particularly during embryo implantation. The immunocytochemistry for PCNA demonstrated reactivity in epithelium (E) and subepithelium stratum (SS), particularly on CAR villous-like projections from P1-P4 and in a less frequent proportion in the epithelium (E) and compactum stratum (CS) from IC, demonstrating the intense proliferative activity associated with endometrial hypertrophy. The gene expression analysis by RT-PCR (Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction) confirmed the transcripts for Bmp2, Sostdc1, Noggin, Wnt2, Wnt5a, Wnt7a, Sfrp2 and Dkk1, and by In situ hybridization the localized expression of Bmp2, Wnt5a, Wnt7a, Dkk1, Sfrp2, and also Bmpr1a and Bmpr2 receptors in E+SS and E+CS in NG and P1-P4 uteri. The Bmp2 expression was higher on CAR when compared to IC in P1 and P2 which suggest an important involvement on CAR response activation related to embryo implantation, whereas Wnt5a does not seem to participate at this period. The decreased expression of Wnt2 in P1 point out a negative regulation on CAR and IC in the beginning of implantation, while the lower expression of Wnt7a in CAR when compared to IC suggest that this is not the main gene related to changes of CAR in pregnancy. The highest expression of Dkk1 and Sfrp2 on CAR when compared to IC indicate their participation on the cellular activity on the CAR region, but it is not involved directly with the expression of Wnt genes analyzed, as well as the absence of Sostdc1 on the endometrium and the lowest expression of Noggin demonstrated that they are not the main BMP antagonists acting on bovine endometrium. The expression of Wnt and Bmp together with their antagonists simultaneously on CAR and IC regions attest the multiple and synergic/antagonic action of several factors on the modulation of uterine mucosa response during the embryo implantation and development of synepitheliochorial placentation. / Doutorado / Histologia / Doutor em Biologia Celular e Estrutural

Introdução: A endometriose, condição inflamatória prevalente, associa-se a alterações da reposta imune na cavidade peritoneal e no útero. Evidências sugerem participação de mediadores inflamatórios, como as células Natural Killer e T-reguladoras na patogênese desta doença. A resposta destas células pode ser controlada pela atividade de algumas quimiocinas. O objetivo deste estudo foi avaliar a expressão gênica das quimiocinas reguladoras das células Natural Killer e T-reguladoras em endométrio tópico em lesões endometrióticas de pacientes com endometriose. Pacientes e Métodos: A expressão gênica das quimiocinas reguladoras da atividade das células Natural Killer (CXCL9, 10, 11, CXCL12, XCL1 e CX3CL1) e T reguladoras (CCL17 e CCL21) foi avaliada por meio de RTPCR no endométrio tópico e lesão endometriótica de 22 pacientes com endometriose de retossigmóide; 10 pacientes com endometriose retrocervical e no endométrio tópico de 32 mulheres sem endometriose comprovada por laparoscopia para laqueadura tubária. Resultados: Dentre as quimiocinas relacionadas às células Natural Killer, encontramos diferença estatística significativa na CX3CL1 e CXCL12, as quais foram mais expressas no foco de endometriose intestinal e retrocervical, quando comparadas ao endométrio tópico das pacientes e controles (p < 0,05). Das relacionadas às células T-reguladoras, a CCL17 foi mais expressa no endométrio tópico de pacientes com lesão em retossigmóide quando comparada aos demais grupos (p < 0,05). Conclusões: As quimiocinas CX3CL1 e CXCL12 foram mais expressas nos focos de endometriose intestinal e a CCL17 foi mais expressa no endométrio tópico de pacientes com lesão de retossigmóide. Estes resultados sugerem que as quimiocinas CX3CL1, CXCL12 e CXCL17 participam da resposta inflamatória que ocorre na endometriose pélvica / Objective: Endometriosis is a highly prevalent inflammatory condition associated with an altered immune response in the peritoneal cavity and uterus. Evidence suggests a participation of inflammatory mediators such as natural killer (NK) and T-regulatory (T-reg) cells in the pathogenesis of this disease while the response of these cells may be controlled by the activity of some chemokines. Patients and Methods: Gene expressions of the chemokines that regulate the activity of NK (CXCL9, CXCL10, CXCL11, CXCL12, XCL1 and CX3CL1) and T-reg cells (CCL17 and CCL21) were evaluated using real time polymerase chain reaction (PCR) in the eutopic and ectopic endometrium of 22 patients with bowel endometriosis, 10 patients with retrocervical endometriosis and 32 controls. Results: Of the chemokines associated with NK cells, the expression of CX3CL1 and CXCL12 was significantly greater in the foci of endometriosis (p < 0.05). Of those associated with T-reg cells, significant differences between groups were found in CCL17. In addition, CCL17 was expressed to a higher degree in the eutopic endometrium of the patients with rectosigmoid lesions when compared to the other groups (p < 0.05). Conclusions: Chemokines CX3CL1 and CXCL12 were more expressed in intestinal endometriosis and CCL17 expression was higher in eutopic endometrium of the patients with rectosigmoid lesions. These results suggest that those chemokines participate in the inflammatory response that occurs in pelvic endometriosis

Introdução: o carcinoma de endométrio é uma das neoplasias ginecológicas mais comuns nos países industrializados. O tratamento desta doença é primariamente cirúrgico. Segundo a normatização da Federação Internacional de Ginecologia e Obstetrícia (FIGO), a cirurgia ideal consiste na realização de histerectomia total, anexectomia bilateral, linfadenectomia retroperitonial e coleta de citologia peritoneal. No entanto, a realização sistemática da linfadenectomia tem sido contestada. Alguns centros de referência acreditam que deva ser realizada apenas em um grupo de pacientes com alto risco para disseminação linfática da doença. O desafio é encontrar marcadores pré-operatórios que possam ser preditivos da presença de doença linfonodal e, assim , virem a ser utilizados para a definição da necessidade da linfadenectomia. Objetivos: verificar se a expressão imuno-histoquímica (IMH) positiva da p53 na amostra endometrial diagnóstica e, se o valor sérico do CA 125 obtido no tempo pré-operatório, podem ser efetivos para prever a presença de doença linfonodal. Métodos: um estudo transversal restrospectivo foi realizado. Foram incluídas 111 pacientes com carcinoma de endométrio submetidas a histerectomia com anexectomia bilateral e linfadenectomia com ou sem citologia peritoneal. Noventa pacientes apresentavam CA 125 pré-operatório e 73, a avaliação da p53. Cinquenta e quatro pacientes apresentavam as duas variáveis em combinação. Foram estabelecidas as associações entre o valor de CA 125 e da expressão IMH da p53 com o envolvimento linfonodal. Uma curva ROC foi construída para identificar o valor de CA 125 com melhor Sensibilidade (S) e Especificidade (E) para doença linfonodal. / Introduction: endometrial carcinoma is one of the most common gynecological malignancies in industrialized countries. The treatment of this disease is primarily surgical. According to the International Federation of Gynecology and Obstetrics surgery ideal consists in performing total hysterectomy, bilateral adnexectomy, retroperitoneal lymphadenectomy and peritoneal cytology. However, the systematic lymphadenectomy has been disputed, and should only be performed in a group of patients at high risk of lymphatic spread of the disease. The challenge is to find preoperative markers that may be predictive of the presence of lymph node disease and thus come to be used to determine the necessity of lymphadenectomy. Objectives: to determine whether the positive immunohistochemical expression (IMH) of p53 in diagnostic endometrial sample and, if the value of serum CA 125, obtained during pre-operative, can be effective to predict the presence of lymph node disease. Methods: a cross-sectional study was conducted. The final sample consisted of 111 patients with endometrial carcinoma undergoing hysterectomy with bilateral adnexectomy and lymphadenectomy with or without peritoneal cytology. Ninety two patients had preoperative CA 125 and 73, evaluation of p53. Fifty four patients had both variables in combination. Associations have been established between the value of CA 125 and IMH expression of p53 with lymph node involvement. A ROC curve was constructed to identify the value of CA 125 with better sensitivity (S) and specificity (E) for lymph node disease.

Esta investigação experimental teve como finalidade de avaliar os efeitos do ultra-som pulsado de baixa intensidade sobre a regeneração do miométrio e do endométrio de ratas submetidas à uterotomia. Foram utilizadas neste experimento 20 ratas adultas da raça Wistar, submetidas a uma uterotomia mediante incisão longitudinal de 1,5 cm total de uma das paredes do corno uterino. As ratas foram divididas em 2 grupos de 10 animais cada, sendo que um grupo foi submetido à estimulação ultra-sônica por 10 dias durante 15 minutos diários e outro grupo, chamado controle, foi submetido à estimulação fictícia pelo mesmo tempo e período. Seis horas antes do sacrifício, os animais receberam via intramuscular 0,10 mg de colchicina para cada 100 g de peso corporal com a finalidade de bloquear as mitoses em metáfase. A avaliação dos tecidos baseou-se na análise comparativa entre a contagem de células em mitose do endométrio e do miométrio de animais estimulados com o de animais controle. Os achados morfológicos foram analisados estatisticamente e são sugestivos de que o U.S.P. estimula a regeneração do miométrio bem como do endométrio de ratas. / This experimental investigation had the purpose to evaluate the low-intensity pulsed ultrasound effects under the regeneration of the myometrium and the endometrium of the rats that were submitted to uterotomia. It was used, in this experiment, twenty adult rats of the Wistar race, submitted to uterotomia beyond the longitudinal incision of total 1, 5 cm of one of the uterine horn walls. The rats were divided in two groups of ten animals each, the first group went trough fifteen daily minutes ultra-sound stimulation during ten days, and the second group, called control, went through fictional stimulation by the same time and period of the first group. Six hours before the sacrifice, the animals received, by intra muscular, 0, 10 mg of colchicine for each 100 g of body weight, with the intention to block the mitosis in metaphase. The evaluation of the tissue was based on the comparative analysis between the mitosis cell count of the stimulated animals\' endometric tissue and the control animals\' one. The morphologic findings were statistically analyzed.

INTRODUÇÃO: O câncer de endométrio é a sexta neoplasia maligna mais frequente nas mulheres no mundo. Com o crescimento mundial da obesidade, fator associado ao desenvolvimento do câncer de endométrio, estima-se que haja avanço no número de casos da doença. O tratamento cirúrgico do câncer de endométrio inclui a linfadenectomia pélvica e para-aórtica para o conhecimento do status linfonodal utilizado para determinação do tratamento adjuvante segundo a FIGO. Este é um procedimento que requer profissionais com treinamento cirúrgico avançado e não é isento de complicações. Algumas pacientes não se beneficiam da realização sistemática da linfadenectomia. O estudo das características clínicas, laboratoriais, radiológicas e anatomopatológicas das pacientes com câncer de endométrio em nossa população é fundamental para entendermos quais pacientes poderiam prescindir da linfadenectomia. MÉTODOS: Foram avaliadas 408 pacientes atendidas no Instituto do câncer do Estado de São Paulo entre janeiro de 2009 a março de 2015 com diagnóstico de carcinoma de endométrio submetidas ao tratamento cirúrgico. Foram avaliados parâmetros clínicos, laboratoriais, radiológicos e anatomopatológicos e sua capacidade de predizer metástases linfonodais. Foram construídas curvas Kaplan Meyer de sobrevivência. Além disso, as complicações relacionadas à realização da linfadenectomia também foram avaliadas. RESULTADOS: Das 405 pacientes elegíveis para o estudo 236(58,3%) foram submetidas à linfadenectomia pélvica e para-aórtica e não foi obtida amostra linfonadal em 73(18%). Os parâmetros significativos predição de acometimento linfonodal obtido através de regressão logística foram infiltração miometrial > 50%, presença de invasão linfovascular, presença de acometimento linfonodal pélvico por exame de imagem e CA125 > 21,5U/mL. A ausência dos quatro parâmetros implica em um risco de acometimento linfonodal de 2,7% enquanto que na presença de todos os quatro parâmetros o risco é de 82,3%. Nas curvas de sobrevida global (p=0,0001) e livre de doença (p=0,0004), a realização da linfadenectomia teve impacto positivo nas pacientes submetidas à linfadenectomia quando comparadas as não submetidas a este procedimento. CONCLUSÕES: A avaliação do risco de metástases linfonodais em pacientes com carcinoma do endométrio, baseadas em parâmetros clínicos, laboratoriais, radiológicos e anatomopatológicos foi capaz de identificar quatro variáveis com significativo valor preditivo de acometimento linfonodal que foram: linfonodos pélvicos pela imagem, CA125 com valor de corte 21,5U/mL, infiltração miometrial e invasão linfovascular. Na presença desses quatro parâmetros a probabilidade de acometimento linfonodal é de 82,3% / BACKGROUND: Endometrial cancer is the sixth most common malignancy in women worldwide. Obesity is a factor associated with this type of cancer development. Thus, the increase of obesity among women leads to a higher number of endometrial cancer cases. The surgical treatment of endometrial cancer includes pelvic lymphadenectomy and para-aortic to the knowledge of lymph node status used for determining the adjuvant treatment according to FIGO. This procedure requires professionals with advanced surgical training and is associated to complication. Moreover, some patients do not benefit from systematic lymphadenectomy. The study of clinical, laboratory, radiological and pathological data of patients with endometrial cancer in our population is critical to understand which patients could dispense lymphadenectomy. METHODS: This study analyzed 408 patients with the diagnosis of endometrial carcinoma undergoing surgical treatment at the Sao Paulo Cancer Institute between January 2009 and March 2015. Clinical, laboratory, radiologic and pathologic parameters were used to test the ability to predict lymph node metastasis. In addition, Kaplan Meyer survival curves were constructed. Complications related to lymphadenectomy were also evaluated. RESULTS: Out of 405 patients eligible for the study, 236 (58.3%) underwent pelvic and para-aortic lymphadenectomy and 73 (18%) had no lymph node samples. Significant parameters prediction of lymph node involvement obtained through logistic regression were myometrium infiltration > 50%, lymphovascular space invasion, pelvic lymph node involvement by imaging and CA125 > 21,5U/mL. The absence of the four parameters implies a risk of lymph node metastasis of 2.7%, whereas in the presence of all four parameters the risk is 82.3%. The overall survival curves (p = 0.0001) and the disease-free survival curves (p = 0.0004), had a positive impact on patients undergoing lymphadenectomy compared to the subject without lymphadenectomy. CONCLUSIONS: The assessment of lymph node metastasis in patients with carcinoma of the endometrial, based on clinical, laboratorial, radiologic and pathologic parameters was able to identify four variables with significant predictive value of lymph node metastasis. Those were pelvic lymph nodes by the image, CA125 > 21,5U/ml, myometrium infiltration > 50% and lymphovascular space invasion. In the presence of these four parameters, the probability of lymph node involvement is 82.3%

INTRODUÇÃO: O Sangramento Uterino Disfuncional (SUD) é uma das causas mais prevalentes de sangramento uterino, estando relacionado a variações hormonais, independente de causas orgânicas. A ablação endometrial é uma das opções terapêuticas, porém está associada à necessidade de treinamento específico e apresenta alto custo. Este estudo tem como objetivo desenvolver modelo de ablação endometrial em ratas adultas. Além disso, avaliar os efeitos histológicos e histomorfométricos causados pelo ácido tricloroacético no útero desses animais, bem como a regeneração endometrial e o retorno do ciclo estral. MÉTODOS: 30 ratas fêmeas adultas foram divididas em dois grupos. Todos os animais foram submetidos à injeção intra-uterina de SF 0,9% em um corno uterino e de ácido tricloroacético (ATA) no corno contralateral. O primeiro grupo, constituído de 15 ratas, foi sacrificado após 1 dia da injeção e tiveram os úteros removidos (Grupo 1). O segundo grupo, constituído de 15 ratas, foi sacrificado após voltar a apresentar um ciclo estral normal, quando foram submetidos à coleta de esfregaços vaginais e eutanasiados em fase de diestro, o que ocorreu cerca de 20 a 30 dias após o procedimento (Grupo 2). As espessuras do epitélio superficial e do estroma endometrial, o número de glândulas endometriais por campo e a espessura miometrial foram comparadas entre os cornos uterinos de cada animal do Grupo 1. As mesmas comparações foram realizadas entre os cornos dos animais do Grupo 2. Por fim, foi avaliada a regeneração endometrial nos Grupos 1 e 2. RESULTADOS: Todos os animais apresentaram recuperação satisfatória do procedimento, não havendo sinais de toxicidade aguda associada ao uso de ATA. No grupo 1, as medianas da espessura do epitélio superficial do endométrio (ATA 0mm vs. Controle 0,05mm,p=0,0001), da espessura do estroma endometrial (ATA 0,325mm vs. Controle 0,525mm, p=0,0006), do número de glândulas (ATA 4,5 vs. Controle 6,5, p=0,0012) e da espessura miometrial (ATA 0,25mm vs. Controle 0,35mm, p=0,009) foram significativamente inferior no corno que recebeu a injeção de ATA. No Grupo 2, quatro animais (27%) morreram na segunda semana após o procedimento e, em seis animais (40%), o material obtido não pode ser avaliado devido à intensa destruição tecidual. Nos cinco animais restantes (33%) a mediana da espessura do epitélio superficial do endométrio (ATA 0,0mm vs. Controle 0,05mm, p<0,004), da espessura do estroma endometrial (ATA 0,325mm vs. Controle 0,725mm, p=0,011), do número de glândulas (ATA 3 vs. Controle 6,5, p=0,011) e da espessura miometrial (ATA 0,35mm vs. Controle 0,5mm, p=0,024), foram significativamente inferior no corno submetido à injeção de ATA. Quanto à mediana da espessura do epitélio superficial do endométrio (Grupo 1 0mm vs. Grupo 2 0mm, p=1) e à mediana da espessura do estroma endometrial (Grupo 1 0,325mm vs. Grupo 2 0,325mm, p=0,857), não houve diferenças significantes entre os cornos uterinos submetidos à injeção de ATA. A mediana do número de glândulas após a injeção de ATA foi superior no Grupo 1 em comparação ao Grupo 2 (p=0,003). CONCLUSÃO: O estudo permitiu o desenvolvimento de um modelo experimental viável de ablação de endométrio em ratas adultas. As alterações histológicas e histomorfométricas encontradas nos cornos uterinos mostraram que o ácido tricloroacético é um potente agente na destruição química endometrial. Não houve regeneração endometrial após retorno ao ciclo estral. / INTRODUCTION: Dysfunctional uterine bleeding is one of the most prevalent causes of uterine bleeding and it is related to hormonal variations without organic causes. Endometrial ablation is a therapeutic option but the methods are frequently expensive and dependent of high cost technologies. The objective of the present study is to develop an animal model of endometrial ablation in adults female rats. In addition, to evaluated the histological and histomorphometric effects after trichloroacetic acid (TCA) exposure into uterine cavity. METHODS: A total of thirty female adult rats were divided in two groups of 15 rats each. All animals were submitted to injection of 0,3 ml of TCA 90% in one uterine horn and the same amount of saline solution 0,9% (control) in the other. Group 1 was sacrificed in the following day of the procedure, whereas group 2 was sacrificed in phase of diestrous after recovery of normal estral cycle identified by vaginal smears, approximately 20 to 30 days after the procedure. Superficial epithelia of the endometrium, estromal thickness, number of endometrial glands as well as of myometrium thickness were assessed and compared between the uterine horns of the same rats of group 1. The same evaluation was performed in group 2. Also, endometrial regeneration was evaluated comparing histological alterations in the uterine horn that was injected with TCA in group 1 and 2. RESULTS: All animals recovered satisfactorily from the procedure. In group 1, superficial epithelia of the endometrium (TCA 0,0mm vs 0,05 mm control, p=0,0001), estromal thickness (TCA 0,325mm vs 0,525 mm Control, p=0,009), number of endometrial glands (TCA 4,5mm vs 6,5 mm control, p=0,001) and mean myometrial thickness (TCA 0,25mm vs 0,35 mm Control, p=0,0006) presented a significant difference between the horns showing endometrial destruction on TCA uterine horn. In group 2, four rats (27%) died in the second week after the initial procedure and six rats (40%) had no viable material to be analyzed due to extent tissue destruction. The rest of the group (33%) showed a mean superficial epithelia of the endometrium (TCA 0,0mm vs 0.05 mm control, p<0,004), mean estromal thickness (TCA 0,325mm vs 0,725 mm Control, p=0,011), mean number of endometrial glands (TCA 3 vs 6,5 control, p=0,011) and mean myometrial thickness (TCA 0,35mm vs 0.5 mm Control, p=0,024) significant different between horns showing endometrial destruction on TCA uterine horn. There was no significant difference in the mean superficial epithelia of the endometrium (group 1 0mm vs. group 2 0mm, p=1) and mean estromal thickness (group 1 0,325mm vs. group 2 0,325mm, p=0,857) between TCA uterine horn from both groups. However, number of endometrial glands (4,5mm in group 1 vs 3 mm in group 2, p=0,003) was higher in group 1. CONCLUSION: The study developed a valid model for endometrial ablation in adult females rats. The histological and histomorphometric effects observed in the uterine horns showed that the trichloroacetic acid is a potent agent for endometrial ablation in rat model. In the current model no endometrial regeneration was observed after recovery of normal estral cycle.