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Contexte: La néovascularisation pathologique oculaire entraîne plusieurs troubles de la cécité, y compris la dégénérescence maculaire néovasculaire liée à l'âge (nDMLA) et la rétinopathie de la prématurité (ROP). La nDMLA est la principale cause de cécité dans le monde industrialisé avec un impact socio-économique considérable (1-6). Les thérapies palliatives actuelles reposent sur la suppression du facteur de croissance de l'endothélium vasculaire (VEGF), prouvé sûr et efficace (7-19). Cependant, certains patients résistent aux injections intravitréennes mensuelles répétées d'anti-VEGF, et les conséquences à long terme comprennent une perte de vision supplémentaire et une atrophie géographique (10, 14, 17, 18, 20-27). Cliniquement, il existe un besoin de nouvelles cibles combinatoires ou alternatives dans les cliniques, permettant de réduire les doses d'anti-VEGF, de traiter et d'étendre un intervalle approprié personnalisé à chaque patient non répondeur, et de minimiser la charge des injections répétées (24, 25, 28, 29). La famille TGF-β et sa sous-famille BMP sont cruciales dans l'angiogenèse oculaire physiologique dans un modèle de ROP, et pourraient être des cibles thérapeutiques potentielles chez les patients souffrant d’une nDMLA (30-66). Hypothèse: COCO, un membre de la famille DAN, un modulateur connu des voies BMP et TGF-β, agit comme un facteur neurotrophique sur les progéniteurs de photorécepteurs humains en culture. Nous émettons l'hypothèse que les effets neurotrophiques et anti-angiogéniques de COCO pourraient être des approches thérapeutiques bénéfiques pour empêcher la néovascularisation dans la nDMLA ou la ROP. Objectifs: Objectif 1: Pour évaluer le rôle du COCO sur les maladies oculaires néovasculaires, nous proposons d'étudier ses effets sur la néovascularisation rétinienne et choroïdienne dans le développement et des modèles pathologiques de la DMLA et de la ROP lors d'injections intravitréennes. Objectif 2: Pour comprendre le rôle physiologique et le mécanisme d'action du COCO, nous évaluerons les effets de COCO endogène au cours de l'angiogenèse et du développement vasculaire oculaire. Conclusions: Nous avons découvert un nouvel inhibiteur de l'angiogenèse, COCO, un membre de la famille des protéines DAN. COCO abroge la migration et la prolifération des cellules endothéliales de la veine ombilicale humaine, en partie grâce à sa régulation des voies TGF-β et BMP et à une modification du métabolisme cellulaire et des gènes mitochondriaux. Les injections intravitréennes de COCO suppriment la vascularisation rétinienne en cours du développement et dans un modèle expérimental de ROP. COCO inhibe de la même manière la néovascularisation choroïdienne dans un modèle de DMLA. De plus, COCO empêche l'angiogenèse rétinienne développementale sans affecter le système vasculaire mature. L'examen des souris Dand5 (COCO) KO a également montré un phénotype de développement rétinien léger à P12 ainsi qu'une exacerbation des touffes néovasculaires dans un modèle de rétinopathie induite par l'oxygène. Impact: Nos données montrent que COCO inhibe la néovascularisation rétinienne et choroïdienne et pourrait être une nouvelle thérapie possible pour des maladies oculaires. Nos études fournissent des données sur les impacts de COCO sur le développement vasculaire rétinien, établissent ses caractéristiques moléculaires et déterminent son importance biologique. / Background: Ocular pathological neovascularization leads to several blinding disorders, including neovascular age‐related macular degeneration (nAMD) and retinopathy of prematurity (ROP). nAMD, for instance, is the primary cause of blindness in the industrialized world with a tremendous socioeconomic impact (1-6). Current palliative therapies rely on suppressing vascular endothelial growth factor (VEGF), proven safe and effective (7-19). However, some patients are resistant to monthly repeated intravitreal injections of anti-VEGF, and long-term consequences comprise further vision loss and geographic atrophy (10, 14, 17, 18, 20-27). Clinically, there is a necessity for novel combinatory or synergistic therapeutic targets to reduce anti-VEGF treatment adherence. Novel personalized therapies to each non-responder patient may increase efficiency while minimizing the burden of repeated injections (24, 25, 28, 29). The TGF-β family, specifically the BMPs subfamily of proteins, is crucial in pathological ocular angiogenesis in a model of pre-retinal neovascularization. These alternative pathways could be potential therapeutic targets in nAMD patients as well (30-66). Hypothesis: COCO, a member of the DAN family, is a known modulator of BMP and TGF-β pathways and acts as a neurotrophic factor on cultured human photoreceptor progenitors. We hypothesize that COCO’s neurotrophic and anti-angiogenic effects could exert therapeutic benefits to preclude neovascularization in nAMD or ROP. Objectives: Aim 1: To assess the role of COCO on neovascular ocular diseases, we propose investigating its effects on retinal and choroidal neovascularization in the development and pathological models of AMD and ROP upon intravitreal injections. Aim 2: To understand COCO's physiological role and mechanism of action, we evaluate the exogenous and endogenous effects of COCO during angiogenesis and ocular vascular development. Conclusions: We discovered a novel inhibitor of angiogenesis, COCO, a DAN protein family member. COCO abrogated sprouting migration and cellular proliferation of human umbilical vein endothelial cells, partly through its regulation of TGF-β and BMP pathways and cellular metabolism. Intravitreal injections of COCO suppress retinal vascularization in development and an experimental model of ROP. COCO similarly inhibits choroidal neovascularization in an nAMD model. COCO prevents developmental retinal angiogenesis without affecting the mature vasculature. Examination of Dand5 (COCO) KO mice also shows a mild retinal developmental phenotype at P12 as well as an exacerbation of neovascular tufts in a model of oxygen-induced retinopathy. Impact: Our data show that COCO inhibits retinal and choroidal neovascularization and could be of potential therapeutic use in treating neovascular ocular diseases. Our studies set grounds for understanding the role of COCO during retinal vascular development, characterizing its molecular features, and determining its biologic significance.

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Dans le circuit de la greffe de cornée, l'endothélium de chaque greffon est observé en microscopie optique conventionnelle afin de vérifier que sa densité cellulaire est suffisante pour maintenir une bonne transparence après l'opération. Les greffons étant conservés dans un milieu spécifique, ils sont imprégnés de liquide et présentent donc des plis qui perturbent l'observation et le comptage des cellules. Ce problème pratique est à l'origine d’une étude théorique sur les concepts de profondeur de champ étendue et de shape-from-focus. A partir d'une séquence d'images acquise par sectionnement optique, les informations les plus nettes permettent d'une part d'accéder à la topographie de la surface observée et d'autre part de restaurer l'image de sa texture. Une reconstruction surfacique 3-D est alors obtenue en projetant la texture sur la topographie. Cette thèse considère essentiellement l’étape fondamentale de mesure de netteté du processus de reconstruction. Des nouvelles mesures génériques offrant une haute sensibilité à la netteté sont introduites. De par une stratégie 3-D originale au travers de la séquence d'images, une autre mesure très robuste au bruit est proposée. Toutes ces mesures sont testées sur des données simulées puis diverses acquisitions réelles en microscopie optique conventionnelle et comparées aux méthodes de la littérature. Par ailleurs, la mesure 3-D améliore nettement les reconstructions d'endothéliums cornéens à partir de leurs acquisitions particulièrement perturbées (inversions de contraste). Un processus itératif complet de reconstruction 3-D d’endothéliums cornéens est finalement décrit, aboutissant à des résultats solides et exploitables. / In the cornea transplant process, each graft endothelium is observed by conventional optical microscopy to check that its cell density is sufficient to maintain a proper transparency after the transplantation. The grafts are stored in a specific preservation medium, they are thus impregnated with fluid and therefore exhibit folds which make cell observation and counting difficult. This practical issue led to the following theoretical study about the so-called concepts: extended-depth-of-field and shape-from-focus. Throughout a sequence of images acquired by optical sectioning, the in-focus information allows on the one hand to recover the topography of the observed surface and on the other hand to restore the image of its texture. A 3-D reconstruction is then obtained by mapping the texture onto the topography. This thesis basically considers the fundamental step of the reconstruction process that is the focus measurement. New generic focus measurements exhibiting high sharpness sensitivity are introduced. Another one offering high noise robustness is proposed, due to an original 3-D strategy through the image sequence, unlike traditional methods that operate in 2-D. All of them are tested on simulated data and various real acquisitions, and compared to the state-of-the-art methods. Furthermore, the aforementioned 3-D focus measurement clearly improves the 3-D surface reconstructions of the corneal endotheliums from their particularly disturbed acquisitions (contrast reversals). A complete iterative process of 3-D reconstruction of the corneal endothelial surfaces is finally described, resulting in solid results that can already be transferred to cornea banks.

La dysfonction de l’endothélium vasculaire, associée à une diminution de ses propriétés vasorelaxantes et anti-thrombogéniques, survient avec le vieillissement mais également chez de plus jeunes patients athérosclérotiques présentant plusieurs facteurs de risque cardiovasculaire. Au niveau cellulaire, le vieillissement des cellules endothéliales (CE) mène à un état irréversible de non division cellulaire appelé sénescence. Ces cellules sénescentes présentent des changements spécifiques au niveau de leur morphologie et de l’expression génique, menant à leur dysfonction. La sénescence dite réplicative est déclenchée par le raccourcissement des télomères survenant à chaque division cellulaire, mais peut également être induite prématurément par le stress oxydant (SIPS). L’objectif principal de cette étude est de caractériser la sénescence de CE vasculaires isolées à partir de patients athérosclérotiques, et d’observer l’impact des facteurs de risque sur cette sénescence. Afin de confirmer la contribution des deux principales voies de la sénescence, nous avons par la suite étudié conjointement ou séparément, l’impact d’un traitement chronique avec un antioxydant sur la sénescence de CE, et d’une surexpression de la sous-unité catalytique de la télomérase (hTERT), une enzyme responsable de l’allongement des télomères. Nous avons isolé et cultivé des CE provenant d’artères mammaires internes prélevées lors de pontages coronariens. Selon les études, les cellules ont été infectées ou non avec un lentivirus surexprimant la hTERT, et cultivées in vitro jusqu’à sénescence, en présence ou en absence de l’antioxydant N-acétyl-L-cystéine (NAC). Différents marqueurs des deux principales voies de la sénescence (réplicative ou SIPS) ont été quantifiés. La sénescence cellulaire se développe exponentiellement avec le temps et est associée à une réduction de la viabilité et de la prolifération cellulaires. Chez les patients athérosclérotiques, le vieillissement des CE passe par les deux principales voies de la sénescence : des télomères courts initialement en culture et la durée d’exposition in vivo aux facteurs de risque cardiovasculaire prédisent une apparition prématurée de la sénescence. Toutefois, chez les fumeurs, la sénescence est exclusivement du type SIPS. Ces facteurs de risque cardiovasculaire et principalement l’hypertension, semblent accélèrer le vieillissement biologique et favoriser la dysfonction des CE. Lorsque traitées chroniquement avec le NAC, les CE présentant initialement de moindres dommages cellulaires et moléculaires ainsi qu’une meilleure défense antioxydante développent une sénescence retardée. Lorsque le NAC est combiné à une surexpression de la hTERT, les deux voies de la sénescence sont bloquées et une immortalisation cellulaire est observée. À l’inverse, dans les CE les plus endommagées par les ROS in vivo, le NAC n’a aucun effet sur le développement de la sénescence, la hTERT, seule ou en combinaison avec le NAC, retarde légèrement la sénescence mais aucune immortalisation n’est observée lorsque ces traitements sont combinés. En conclusion, nos études démontrent que l’exposition chronique au stress oxydant associé aux facteurs de risque cardiovasculaire accélère le développement de la sénescence de CE vasculaires, contribuant potentiellement à l’athérogénèse. Dans les cellules de patients athérosclérotiques, il semble exister un seuil de dommages cellulaires et moléculaires subis in vivo au-delà duquel, aucun traitement (antioxydant ou hTERT) ne peut être bénéfique. / Vascular aging is associated with a decrease in endothelial dilatory and antithrombotic functions. This typical endothelial dysfunction, however, is also present in younger patients with cardiovascular diseases (CVD). At the cellular level, aging of healthy vascular endothelial cells (EC) leads to senescence, a state of permanent growth arrest. Senescence is characterized by specific changes in cell morphology and gene expression, which reduce EC function and thus are proposed to be pro-atherogenic. Age-associated telomere shortening leads to replicative senescence of human endothelial cells, but senescence can also be induced prematurely by oxidative stress (SIPS). Our aim was to characterize senescence of EC isolated from atherosclerotic patients and look at the influence of risk factors for CVD on the onset of senescence. To confirm the contribution of each of the two mains pathways triggering senescence, we then looked at the impact on senescence of a chronic treatment with an antioxidant combined or not with an overexpression of the catalytic subunit of telomerase (hTERT), a reverse transcriptase involved in telomere elongation. We used EC isolated from internal mammary arteries discarded during coronary bypass graft surgery. Depending on the study, EC were infected or not with a lentivirus overexpressing hTERT, and cells were cultured in vitro until senescence, in the presence or the absence of the antioxidant N-acetyl-L-cysteine (NAC). Different markers of the two main pathways of senescence (replicative ou SIS) were quantified. Senescence develops exponentially with time in culture and is associated with a decrease in cell viability and proliferation. In atherosclerotic patients, cellular aging displays an overlap between replicative and stress-induced senescence: short initial telomere length in vitro and a long exposure to risk factors for CVD in vivo predict the onset of a premature senescence. However, in smoking patients, premature senescence is exclusively induced by oxidative stress. Risk factors for CVD seem to accelerate the biological aging leading to EC dysfunction. When treated chronically with NAC, EC presenting initially lower levels of damage and a better endogenous antioxidant capacity develop a delayed senescence, probably due to a slight hTERT activation. When NAC is combined with an overexpression of hTERT, both pathways triggerring senescence are blocked and cellular immortalization is observed. In contrast, in EC presenting higher levels of damage undergone in vivo, NAC has no effect by itself on the onset of senescence, hTERT delays the onset of senescence in combination or not with NAC, but no cellular immortalization was observed in NAC-hTERT cells. In conclusion, our studies show that a chronic in vivo exposition to oxidative stress associated with risk factors for CVD accelerates the onset of vascular endothelial cells senescence that could potentially contribute to atherogenesis. EC having strong antioxidant defense capacity and DNA repair mechanisms may be rescued from replicative and stress-induced senescence unless EC have undergone an insurmountable cellular and molecular damage possibly due to uncontrolled free radical production associated with risk factors for CVD.

Thèse numérisée par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

La dysfonction de l’endothélium vasculaire, associée à une diminution de ses propriétés vasorelaxantes et anti-thrombogéniques, survient avec le vieillissement mais également chez de plus jeunes patients athérosclérotiques présentant plusieurs facteurs de risque cardiovasculaire. Au niveau cellulaire, le vieillissement des cellules endothéliales (CE) mène à un état irréversible de non division cellulaire appelé sénescence. Ces cellules sénescentes présentent des changements spécifiques au niveau de leur morphologie et de l’expression génique, menant à leur dysfonction. La sénescence dite réplicative est déclenchée par le raccourcissement des télomères survenant à chaque division cellulaire, mais peut également être induite prématurément par le stress oxydant (SIPS). L’objectif principal de cette étude est de caractériser la sénescence de CE vasculaires isolées à partir de patients athérosclérotiques, et d’observer l’impact des facteurs de risque sur cette sénescence. Afin de confirmer la contribution des deux principales voies de la sénescence, nous avons par la suite étudié conjointement ou séparément, l’impact d’un traitement chronique avec un antioxydant sur la sénescence de CE, et d’une surexpression de la sous-unité catalytique de la télomérase (hTERT), une enzyme responsable de l’allongement des télomères. Nous avons isolé et cultivé des CE provenant d’artères mammaires internes prélevées lors de pontages coronariens. Selon les études, les cellules ont été infectées ou non avec un lentivirus surexprimant la hTERT, et cultivées in vitro jusqu’à sénescence, en présence ou en absence de l’antioxydant N-acétyl-L-cystéine (NAC). Différents marqueurs des deux principales voies de la sénescence (réplicative ou SIPS) ont été quantifiés. La sénescence cellulaire se développe exponentiellement avec le temps et est associée à une réduction de la viabilité et de la prolifération cellulaires. Chez les patients athérosclérotiques, le vieillissement des CE passe par les deux principales voies de la sénescence : des télomères courts initialement en culture et la durée d’exposition in vivo aux facteurs de risque cardiovasculaire prédisent une apparition prématurée de la sénescence. Toutefois, chez les fumeurs, la sénescence est exclusivement du type SIPS. Ces facteurs de risque cardiovasculaire et principalement l’hypertension, semblent accélèrer le vieillissement biologique et favoriser la dysfonction des CE. Lorsque traitées chroniquement avec le NAC, les CE présentant initialement de moindres dommages cellulaires et moléculaires ainsi qu’une meilleure défense antioxydante développent une sénescence retardée. Lorsque le NAC est combiné à une surexpression de la hTERT, les deux voies de la sénescence sont bloquées et une immortalisation cellulaire est observée. À l’inverse, dans les CE les plus endommagées par les ROS in vivo, le NAC n’a aucun effet sur le développement de la sénescence, la hTERT, seule ou en combinaison avec le NAC, retarde légèrement la sénescence mais aucune immortalisation n’est observée lorsque ces traitements sont combinés. En conclusion, nos études démontrent que l’exposition chronique au stress oxydant associé aux facteurs de risque cardiovasculaire accélère le développement de la sénescence de CE vasculaires, contribuant potentiellement à l’athérogénèse. Dans les cellules de patients athérosclérotiques, il semble exister un seuil de dommages cellulaires et moléculaires subis in vivo au-delà duquel, aucun traitement (antioxydant ou hTERT) ne peut être bénéfique. / Vascular aging is associated with a decrease in endothelial dilatory and antithrombotic functions. This typical endothelial dysfunction, however, is also present in younger patients with cardiovascular diseases (CVD). At the cellular level, aging of healthy vascular endothelial cells (EC) leads to senescence, a state of permanent growth arrest. Senescence is characterized by specific changes in cell morphology and gene expression, which reduce EC function and thus are proposed to be pro-atherogenic. Age-associated telomere shortening leads to replicative senescence of human endothelial cells, but senescence can also be induced prematurely by oxidative stress (SIPS). Our aim was to characterize senescence of EC isolated from atherosclerotic patients and look at the influence of risk factors for CVD on the onset of senescence. To confirm the contribution of each of the two mains pathways triggering senescence, we then looked at the impact on senescence of a chronic treatment with an antioxidant combined or not with an overexpression of the catalytic subunit of telomerase (hTERT), a reverse transcriptase involved in telomere elongation. We used EC isolated from internal mammary arteries discarded during coronary bypass graft surgery. Depending on the study, EC were infected or not with a lentivirus overexpressing hTERT, and cells were cultured in vitro until senescence, in the presence or the absence of the antioxidant N-acetyl-L-cysteine (NAC). Different markers of the two main pathways of senescence (replicative ou SIS) were quantified. Senescence develops exponentially with time in culture and is associated with a decrease in cell viability and proliferation. In atherosclerotic patients, cellular aging displays an overlap between replicative and stress-induced senescence: short initial telomere length in vitro and a long exposure to risk factors for CVD in vivo predict the onset of a premature senescence. However, in smoking patients, premature senescence is exclusively induced by oxidative stress. Risk factors for CVD seem to accelerate the biological aging leading to EC dysfunction. When treated chronically with NAC, EC presenting initially lower levels of damage and a better endogenous antioxidant capacity develop a delayed senescence, probably due to a slight hTERT activation. When NAC is combined with an overexpression of hTERT, both pathways triggerring senescence are blocked and cellular immortalization is observed. In contrast, in EC presenting higher levels of damage undergone in vivo, NAC has no effect by itself on the onset of senescence, hTERT delays the onset of senescence in combination or not with NAC, but no cellular immortalization was observed in NAC-hTERT cells. In conclusion, our studies show that a chronic in vivo exposition to oxidative stress associated with risk factors for CVD accelerates the onset of vascular endothelial cells senescence that could potentially contribute to atherogenesis. EC having strong antioxidant defense capacity and DNA repair mechanisms may be rescued from replicative and stress-induced senescence unless EC have undergone an insurmountable cellular and molecular damage possibly due to uncontrolled free radical production associated with risk factors for CVD.

Thèse numérisée par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

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La prévention des maladies cardiovasculaires constitue actuellement une approche capitale dans la diminution de la mortalité au sein de nos pays industrialisés. Tous les facteurs de risques étant associés à une dysfonction endothéliale, nous nous sommes intéressés à deux classes de médicaments dont l’action bénéfique se situe, du moins en partie, au niveau de l’endothélium vasculaire :les inhibiteurs de l’enzyme de conversion de l’angiotensine (IECA) et les inhibiteurs de l’hydroxy-3-méthyl-3-glutaryl-Coenzyme A (HMG-CoA) réductase (statines).<p> Le présent travail contribue à l’étude in vitro des effets protecteurs vasculaires de l’administration chronique, chez le rat, de deux statines (la pravastatine et l’atorvastatine) vis-à-vis de la toxicité aiguë des LDL humaines oxydées et vis-à-vis de la tolérance à la nitroglycérine. Une comparaison est menée par rapport au ramipril dans ces deux modèles expérimentaux.<p>Les effets de ces médicaments se manifestent au niveau vasculaire par une amélioration de la disponibilité du NO. Toutefois, dans nos modèles, des mécanismes singulièrement différents ont été identifiés entre les agents étudiés :alors que le ramipril engendre une augmentation de l’expression de la eNOS, enzyme synthétisant le NO, les statines permettent une meilleure disponibilité de ce radical par un mécanisme post-traductionnel. Outre cette action, elles semblent agir directement sur des enzymes oxydatives comme les NAD(P)H oxydases.<p>Une action antioxydante des statines pourrait expliquer tous les effets observés, ce qui n’est pas le cas pour le ramipril. Vu que le stress oxydatif intervient dans tous les facteurs de risques cardiovasculaires, diverses perspectives cliniques sont envisagées afin d’améliorer l’approche thérapeutique de la maladie athéroscléreuse.<p> / Doctorat en sciences pharmaceutiques / info:eu-repo/semantics/nonPublished