La levodopa (LD) continúa siendo el fármaco más eficaz en la enfermedad de Parkinson (EP), aunque con respuesta clínica heterogénea, pudiendo incrementar los niveles plasmáticos de homocisteína (Hc). Tanto los niveles elevados de Hc como el alelo E4 de la Apolipoproteína E (ApoE) se han relacionado con deterioro cognitivo. Objetivos: (1) Encontrar una explicación para las variaciones en la respuesta a LD. (2) Confirmar la elevación de Hc en pacientes tratados con LD y su relación con la vitamina B12 (B12) y folato. (3) Influencia de Hc y genotipo de la ApoE en el deterioro cognitivo. Métodos: Se administraron distintas dosis y formulaciones de LD, con y sin entacapona, a 58 pacientes con EP. Se determinaron niveles plasmáticos de LD, catecolaminas, Hc, B12, y folato, y genotipo de la ApoE. Variables clínicas: estadio de la EP, UPDRS, evaluación neuropsicológica. Resultados: Existía una disociación entre la respuesta clínica y los niveles de LD, además de una marcada diferencia interindividual. Añadir entacapona a LD elevaba su nivel plasmático, pero no mejoraba la respuesta. El tratamiento con LD se acompañaba de una elevación significativa del nivel de Hc, dependiente de los niveles de B12 y folato, que no se modificaba con entacapona. Niveles elevados de Hc se asociaron con deterioro cognitivo, por lo que sería razonable añadir suplementos de folato y B12 a la LD. Los portadores de un alelo E4 tenían una evolución más benigna en la sintomatología motora. / Levodopa (LD) being still the best pharmacological treatment for Parkinson's disease (PD), has variable clinical response and may increase homocysteine (Hc) plasmatic levels. Apolipoprotein E4 (Apo E) allele and high levels of Hc were related to cognitive decline. Objectives: (1) To find an explanation for variation in LD response. (2) To confirm high Hc in patients treated with LD and its relation with vitamin B12 (B12) and folic acid (FA). (3) To determine Hc and genotype influence in cognitive decline. Methods: Different LD doses and formulations, with and without entacapone were given to 58 PD patients. LD, catecholamines, Hc, B12 and FA levels and ApoE genotype were determined. Clinical variables were: PD stage, UPDRS and neuropsychological examination. Results: We found dissociation between clinical response and LD levels, and also clear interindividual variations. Entacapone increased LD plasmatic levels, but did not improve its clinical response. LD treatment was associated with increased Hc levels, related to B12 and FA levels; none was modified by entacapone. High Hc levels were related to cognitive decline. Supplements of B12 and FA to LD seem to be reasonable. E4 allele patients had more benign motor evolution.

Las mutaciones en el gen LRRK2, en especial la G2019S, parecen ser una causa relativamente frecuente de enfermedad de Parkinson (EP).Mutaciones en este gen se detectan en el 5-6% de los casos con EP familiar y en el 1-2 % de los casos esporádicos de diferentes poblaciones occidentales. La mutación R1441G del gen LRRK2 también es una causa frecuente de parkinsonismo en el País Vasco. Las hipótesis del presente trabajo son: 1) En Cataluña las mutaciones G2019S y R1441G del gen LRRK2 son causa de parkinsonismo tanto familiar como esporádico, 2) Las manifestaciones clínicas motoras y no motoras del parkinsonismo asociado a mutaciones en el gen LRRK2 son heterogéneas, y 3) El sustrato neuropatológico del parkinsonismo asociado a mutaciones en el gen LRRK2 es heterogéneo y determina el fenotipo clínico. En relación a estas hipótesis, los objetivos son: 1) Determinar la frecuencia de las mutaciones G2019S y R1441G del gen LRRK2 en pacientes con diagnóstico clínico de EP en un hospital terciario de Barcelona, 2) Definir el fenotipo clínico de los pacientes con EP portadores de una mutación en el gen LRRK2, y 3) Determinar la presencia de las mutaciones G2019S y R1441G del gen LRRK2 en cerebros diagnosticados de EP, de parkinsonimo degenerativo, o de degeneración lobar frontotemporal, y estudiar las características clínicas y patológicas de los casos portadores de una mutación en este gen. Los resultados y conclusiones son: 1) La frecuencia de mutaciones en el gen LRRK2 en pacientes con EP que atienden a una consulta especializada en un hospital terciario de Barcelona es del 5,3%, siendo la mutación G2019S la más frecuente (el 4,3% de los pacientes son portadores). La mutación R1441G es más infrecuente (0,7%). 2) Las mutaciones en el gen LRRK2 son más frecuentes en casos familiares de EP (un 9,6% de los casos son portadores) que en casos esporádicos (un 3,4% son portadores). Hasta en un 43,7% de los pacientes con mutaciones en el gen LRRK2 no existen antecedentes familiares de parkinsonismo. 3) Las características clínicas de los síntomas motores y no motores del parkinsonismo asociado a mutaciones en el gen LRRK2 es indistinguible de los observados en la EP clásica. 4) Las alteraciones neuropatológicas del parkinsonismo asociado a la mutación G2019S del gen LRRK2 son heterogéneas. Si bien el sustrato neuropatológico más frecuente es la patología tipo Lewy, describimos un caso que confirma que uno de los fenotipos neuropatológicos asociados a la mutación G2019S es la degeneración nigral inespecífica sin inclusiones distintivas. 5) No hemos detectado mutaciones en el gen LRRK2 en cerebros asociados a otro tipo de enfermedad neurodegenerativa diferente a la EP, como la demencia por cuerpos de Lewy, la parálisis supranuclear progresiva o la atrofia multisistémica. Su existencia habría que considerarla probablemente excepcional o coincidental. / LRRK2 G2019S mutation is a frequent cause of Parkinson’s disease (PD). This mutation is present in 5-6% of familial PD cases and 1-2 % of sporadic PD patients. LRRK2 R1441G is frequent in PD patients from the Basque country. We hypothesize that 1) In Catalonia, the G2019S and R1441G mutations are frequent in patients with familial as well as sporadic parkinsonism. 2) Clinical features in LRRK2-related parkinsonism are heterogeneous 3) The neuropathological substrate of LRRK2-related parkinsonism is pleomorphic and determines the clinical phenotype. We aim to assess 1) The frequency of the G2019S and R1441G mutations in patients with a clinical diagnosis of PD in Barcelona 2) The clinical phenotype of PD patients carrying a LRRK2 mutation, and 3) The presence of LRRK2 G2019S and R1441G mutations in brains diagnosed of PD, other neurodegenerative parkinsonism, as well as frontotemporal lobar degeneration, and assess the clinical and neuropathological features of those cases carrying a LRRK2 mutation. Results and conclusions: 1) LRRK2 mutations are frequent in PD patients from Barcelona (5.3% of them). The G2019S mutation is more frequent (4.3%) than the R1441G mutation (0.7%). 2) LRRK2 mutations are more frequent in familial PD cases (9.6% of them) than in sporadic cases (3.4%). Family history of parkinsonism is absent in up to 43.7% of patients with LRRK2 mutations. 3) Clinical features of motor and non-motor symptoms of LRRK2-related parkinsonism is indistinguishable from those of classical PD. 4) The neuropathological phenotype of LRRK2 G2019S-related parkinsonism is heterogeneous. Although the most frequent neuropathological substrate is Lewy boby type pathology, we describe a patient with non-specific nigral degeneration and the G2019S mutation. 5) We have not been able to identify LRRK2 mutations in brains of a neurodegenerative disease other than PD (e.g Lewy bodies dementia, Progressive supranuclear palsy or Multiple system atrophy). Presence of LRRK2 mutations in these neurodegenerative diseases would be exceptional or coincidental.

La evaluación de los síntomas de la enfermedad de Parkinson tiene un carácter subjetivo ya que se basa en la experiencia y la agudeza visual del médico tratante, quién realiza una puntuación de 0 a 4 según la Escala Unificada para la Evaluación de la Enfermedad de Parkinson Patrocinada por la Sociedad de Trastornos del Movimiento (MDS-UPDRS, por sus siglas en inglés). El presente trabajo de tesis tiene como objetivo evaluar dos algoritmos de flujo óptico y segmentación de imágenes para cuantificar el golpeteo de dedos y movimiento con las manos, basado en la MDS-UPDRS. El punto de partida para cumplir este objetivo fue el diseño de un protocolo de adquisición de videos, el cual se implementó con 30 participantes sanos que realizaron tres secuencias de cada movimiento. Posteriormente, se realizó el procesamiento de datos con los algoritmos propuestos y se obtuvieron las señales de frecuencia y amplitud. Finalmente se hizo el análisis estadístico. Los resultados muestran que los algoritmos fueron codificados con éxito y se apreciaron los cambios de amplitud y frecuencia de los movimientos repetitivos. Finalmente, se discutieron los resultados basándose en mejoras enfocadas en el protocolo de adquisición de datos que permitan su implementación en un ambiente clínico para contribuir al diagnóstico de pacientes que padecen párkinson.

La enfermedad de Parkinson (PD) es un desorden progresivo del movimiento y es la segunda enfermedad relacionada con la edad más común, luego de la enfermedad de Alzheimer. Se la considera como un desorden multifactorial y complejo que involucra tanto factores epidemiológicos como genéticos y toxicológicos, y cuya principal característica es la pérdida progresiva de las neuronas dopaminérgicas. A pesar de los recientes avances que intentan comprender las bases moleculares de esta patología, el mecanismo exacto que desencadena la degeneración de las neuronas dopaminérgicas todavía no se conoce. Numerosos estudios previos destacan dos características comunes de las lesiones de la substancia nigra pars compacta de los cerebros con PD: i) alteraciones en el contenido de los metales de transición y, en consecuencia, aumento del estrés oxidativo (OS) y ii) sobreexpresión y agregación patológica de la proteína α-sinucleína (α-sin). El desbalance en los niveles de los metales de transición ha sido reportado como uno de los principales factores que contribuyen a la degeneración de las neuronas dopaminérgicas en la PD. Específicamente, se ha descripto que la sobrecarga de hierro (Fe) y la desregulación de los niveles de cobre (Cu) estarían involucradas en el daño de las neuronas dopaminérgicas en esta patología. En la primera parte de este trabajo de tesis, nuestro objetivo fue caracterizar los mecanismos de reparación de membrana mediante el estudio de las reacciones de acilación y deacilación y su rol en la injuria oxidativa en la neuronas dopaminérgicas N27 expuestas a sobrecarga de Fe y suplementación con Cu. Las neuronas N27 incubadas en presencia de Fe2+ (1 mM) por 24 hs mostraron elevados niveles de especies reactivas de oxígeno (ROS), peroxidación lipídica y aumentada permeabilidad de membrana plasmática. Por otro lado, en las neuronas que fueron suplementadas con Cu2+ (10,50 μM) no se observaron alteraciones en los marcadores de OS. Se observó un perfil de acilación diferencial en las neuronas N27 premarcadas con [3H]ácido araquidónico (AA) o [3H]ácido oleico (OA). En las neuronas expuestas a Fe2+, la incorporación de AA aumentó en la fracción de triacilglicéridos (TAG), mientras que su incorporación en la fracción de fosfolípidos (PL) se vio disminuida. El contenido de TAG resultó más elevado (40 %) en las neuronas expuestas a Fe2+ que en los controles. Este aumento fue acompañado por la aparición de cuerpos lipídicos Nile Red positivos. En contraposición, la incorporación de OA se vio incrementada en la fracción de PL y no mostró cambios en los TAG. El perfil de acilación lipídica en las neuronas que fueron suplementadas con Cu mostró una mayor acumulación de AA en el PL fosfatidilserina y ningún cambio con respecto a su incorporación en TAG. La inhibición de las reacciones de acilación/deacilación desencadenaron un aumento en los niveles de los marcadores de OS y disfuncionalidad mitocondrial en las neuronas expuestas a sobrecarga de Fe2+. Estos hallazgos brindan evidencia acerca de la participación de los mecanismos de acilación frente a la injuria oxidativa inducida por Fe2+ y postulan que las neuronas dopaminérgicas preservan, inteligentemente, el AA en los TAG en respuesta al OS. Como se mencionó anteriormente, la sobreexpresión patológica de la α-sin está involucrada en la muerte de las neuronas dopaminérgicas en la PD. En la segunda parte de este trabajo, caracterizamos el rol de dos variantes de la α-sin, WT (en su forma nativa) y A53T (una mutación que se encuentra en la PD familiar de aparición temprana), durante el OS inducido por Fe2+ y estudiamos como el metabolismo lipídico estaría involucrado en el destino neuronal. Para ello, utilizamos la línea celular neuronal dopaminérgica N27 sin transfectar (UT) y dos líneas celulares N27 transfectadas de forma estable con WT-α-sin (WT) o A53T-α-sin (A53T). Estas células fueron expuestas a daño inducido por Fe2+ y luego, se analizaron los marcadores de OS y el estado del metabolismo lipídico. Dependiendo del tipo de α-sin expresado, se obtuvieron distintas respuestas neuronales a la sobrecarga de Fe2+. Las células A53T expuestas a injuria inducida por Fe2+ mostraron menores niveles de ROS y menor alteración en la permeabilidad de la membrana plasmática respecto a las neuronas WT. La presencia de A53T-α-sin provocó un aumento en el contenido de TAG, el cual fue aún mayor luego de la exposición de las neuronas a sobrecarga de Fe2+. Por otro lado, las neuronas WT no mostraron alteraciones en el contenido de TAG, respecto a las células UT. Las neuronas A53T también presentaron un aumento en la expresión de la sintasa de ácidos grasos (FAS), junto con una mayor resistencia a la cerulenina, un potente inhibidor de la FAS. El contenido de PL y colesterol (Chol) fue similar en las neuronas UT, WT y A53T. La inhibición farmacológica de la síntesis de novo de los TAG provocó un aumento en la muerte celular de las células A53T durante el daño inducido por Fe2+ mientras que la inhibición de los mecanismos de acilación/deacilación no afectaron ni el contenido de TAG ni la viabilidad celular en la medida en que se afectaron estos parámetros en las células UT. Nuestros resultados brindan nueva evidencia acerca del rol diferencial de las variantes de α-sin en el metabolismo lipídico neuronal, que está relacionado a la respuesta neuronal a la sobrecarga de Fe2+. En conclusión, hemos demostrado que la respuesta neuronal al daño oxidativo y a la sobreexpresión de A53T-α-sin, es dependiente de los mecanismos de acilación/deacilación lipídica e involucra acumulación de TAG. Aunque la inhibición de la síntesis de TAG en las neuronas A53T promueva la muerte celular, nuestros resultados sugieren que la aparición de TAG, algo inusual para el fenotipo neuronal, podría constituir un marcador temprano de daño neuronal. / Parkinson’s disease (PD) is a progressive movement disorder and is the second most common age-related neurodegenerative illness after Alzheimer’s disease. PD is a multifactorial and complex disorder including epidemiological, genetic and toxicological factors whose main characteristic is the progressive loss of dopaminergic neurons. Despite all the effort to understand the molecular basis of this pathology, the exact molecular mechanism that triggers the degeneration of dopaminergic neurons remains still unknown. Cumulative evidence highlights two common facts that occur in the substantia nigra pars compacta lesions in the brain of PD patients: i) alterations in transition metal content and, in consequence, increased oxidative stress (OS) and ii) overexpression and pathological aggregation of the protein α-synuclein (α-syn). Metal-imbalance has been reported as one of the main contributing factor for the degeneration of dopaminergic neurons in PD. Specifically, iron (Fe) overload and copper (Cu) mis-compartmentalization have been reported to be involved in the injury of dopaminergic neurons in this pathology. In the first part of this work, our aim was to characterize the mechanisms of membrane repair by studying lipid acylation and deacylation reactions and their role in oxidative injury in N27 dopaminergic neurons exposed to Fe-overload and Cu-supplementation. N27 dopaminergic neurons incubated with Fe2+ (1 mM) for 24 hs displayed increased levels of reactive oxygen species (ROS), lipid peroxidation and elevated plasma membrane permeability. Cu2+-supplemented neurons (10, 50 μM) showed no evidence of OS markers. A different lipid acylation profile was observed in N27 neurons pre-labeled with [3H]arachidonic acid (AA) or [3H]oleic acid (OA). In Fe-exposed neurons, AA uptake was increased in triacylglycerols (TAG) whereas its incorporation into the phospholipid (PL) fraction was diminished. TAG content was 40 % higher in Feexposed neurons than in controls. This increase was accompanied by the appearance of Nile red positive lipid bodies. Contrariwise, OA incorporation increased in the PL fractions and showed no changes in TAG. Lipid acylation profile in Cu-supplemented neurons showed AA accumulation into phosphatidylserine and no changes in TAG. The inhibition of deacylation/acylation reactions prompted an increase in OS markers and mitochondrial dysfunction in Fe-overloaded neurons. These findings provide evidence about the participation of lipid acylation mechanisms against Fe-induced oxidative injury and postulate that dopaminergic neurons cleverly preserve AA in TAG in response to OS. As previously mentioned, pathological α-syn overexpression is involved in the death of dopaminergic neurons in PD. In the second part of this work, we characterized the role of α-syn variants, Wild Type (WT) and A53T (a dominant mutation found in familial early onset PD) during Fe-induced OS and investigated whether lipid metabolism has implications for neuronal fate. To this end, we used the N27 dopaminergic neuronal cell line non-transfected (UT) and two stably transfected N27 cell lines with WT α-syn (WT) or mutated A53T α-syn (A53T). Cells were exposed to Fe-induced injury and OS markers and the status of lipid metabolism were analyzed. Neuronal response to Fe-induced overload is dependent on the type of α-syn expressed. A53T cells exposed to Fe-induced injury showed lower ROS levels and diminished plasma membrane permeability alteration than WT neurons. The presence of A53T α-syn promoted an increase in TAG content that was enhanced during Fe-induced OS. On the contrary, WT neurons did not display changes in TAG levels with respect to UT cells. A53T neurons also exhibited an increase in fatty acid synthase (FAS) expression, and higher resistance to the potent FAS inhibitor cerulenin. PL and cholesterol (Chol) content were similar in UT, WT and A53T neurons. Pharmacological inhibition of de novo synthesis of TAG increased A53T cell death during Fe-induced injury whereas the blockage of PL and Chol acylation/deacylation affected neither TAG content nor cell viability to the same extent as that observed in UT neurons. Our results bring new evidence about a differential role of α-syn variants on neuronal lipid metabolism that is related to the neuronal response to Fe-overload. In conclusion, we have demonstrated that the neuronal response to OS injury and A53T α-syn overexpression is dependent on lipid acylation and deacylation mechanisms and also involves TAG accumulation. Even though the inhibition of TAG synthesis in A53T neurons promoted cell death, our findings suggest that TAG appearance, rather unusual for the neuronal phenotype, could constitute an early marker of neuronal injury.

La enfermedad de Parkinson es el segundo trastorno neurodegenerativo más común de nuestra sociedad tras el de Alzheimer. Se caracteriza por una disminución de los niveles del neurotransmisor dopamina asociada a la muerte de las neuronas dopaminérgicas en la substantia nigra del mesencéfalo, proceso que sucede de forma análoga en las células dopaminérgicas de la retina, el subtipo de células amacrinas A18. En consecuencia, además de las múltiples deficiencias motoras y cognitivas que conlleva esta enfermedad, también se han observado alteraciones, a nivel morfológico y fisiológico, en la retina de enfermos de Parkinson y animales modelo de esta enfermedad. Dichas alteraciones incluyen deficiencias en la agudeza visual, sensibilidad al contraste, percepción del color y adaptación a la oscuridad, así como en la detección del movimiento. Sin embargo, se hace necesario esclarecer los mecanismos moleculares subyacentes a esta patología en la retina con el fin de facilitar el diagnóstico molecular y la búsqueda de nuevas dianas terapéuticas. En esta Tesis Doctoral se ha analizado la expresión génica y el patrón de distribución en la retina de distintos mamíferos, desde roedores hasta la especie humana, de dos proteínas de elevada relevancia en la enfermedad de Parkinson, denominadas parkina y UCH-L1, dos importantes componentes del sistema ubicuitina-proteasoma, implicado en la homeostasis proteica celular. En este contexto, se han revisado en profundidad los componentes que integran este sistema en la retina, junto a su papel en el desarrollo y función de este tejido en condiciones fisiológicas y sus alteraciones en condiciones patológicas. Por otra parte, se ha estudiado el patrón de procesamiento ('splicing') alternativo del ARNm del gen PARK2, el cual codifica la proteína parkina, en la retina de mamíferos en condiciones fisiológicas, proceso cuya desregulación está implicada en el desarrollo y progresión de diversas patologías que afectan a la retina, incluida la enfermedad de Parkinson. Adicionalmente, se han investigado las alteraciones a nivel proteico en la retina de monos parkinsonianos tratados con el compuesto neurotóxico MPTP, mediante técnicas de proteómica. Finalmente, se han catalogado y cuantificado todos los genes expresados en la retina adulta humana mediante secuenciación masiva del transcriptoma (RNA-Seq), con especial énfasis en aquellos relacionados con enfermedades neurodegenerativas que afectan a la retina. En conclusión, en esta Tesis Doctoral se ha abordado mediante diferentes aproximaciones experimentales en la retina de mamíferos el estudio de la expresión de los genes y proteínas relacionados con enfermedades neurodegenerativas del sistema nervioso central que cursan con alteraciones en la estructura y función de la retina.

Parkinson’s disease (PD) is currently the second most common neurodegenerative disorder after Alzheimer’s disease (AD), affecting 100.000 people in Spain and more than 4 million people worldwide. Being a movement disorder, impairment of motor functions is considered to be the hallmark symptom of PD. However, cognitive dysfunction is now recognized as a common feature, being present since early disease stages and affecting the majority of patients as the disease progresses. In line with this, one of the most common cognitive deficits found in PD patients are verbal semantic and phonemic fluency deficits. Although there are still no established biomarkers for PD, neuroimaging methods offer the possibility of mapping the neurobiological substrates of motor and cognitive impairment in these patients. Amongst the available neuroimaging techniques, structural and functional magnetic resonance imaging (MRI, fMRI) produces images of the brain that provide quantitative values of cerebral atrophy and brain dysfunction, respectively. These techniques are relevant because they shed light into neurodegeneration processes occurring in PD compared to normal aging as well as those pathological processes that specifically underlie cognitive decline in these patients. In addition to neuroimaging, another method that allows studying brain networks and their disruption in PD is transcranial direct current stimulation (tDCS), which, in addition to modulating functional connectivity, provides a tool for cognitive and motor rehabilitation. This thesis comprises three different studies that had two main goals. On one hand, it was aimed at characterizing the brain’s structural and functional correlates of semantic and phonemic fluency cognitive deficits in patients with PD using MRI, fMRI and tDCS methods. On the other hand, given the lack of a comparison of the relative contribution of different existing MRI-based techniques to characterize cortical degeneration in PD, specific changes in different characteristics of the cortical gray matter (GM) layer were assessed to determine whether brain atrophy in PD can be attributed to changes in cortical thickness, cortical folding or GM volume. The first study of this thesis showed that semantic fluency is associated with GM density in cortical frontal and temporal areas in PD patients, suggesting this function relies both on executive functions and semantic memory processes. The second study showed that by stimulating the left dorsolateral prefrontal cortex with tDCS, significant enhancement of functional connectivity occurs in both semantic and phonemic fluency networks in PD, in addition to a significant improvement of phonemic fluency functions. The third and final study showed that amongst the most widely used neuroimaging analysis techniques to assess cortical changes in PD, cortical thickness seems to be the most sensitive, followed by cortical folding and finally GM volume as assessed by voxel-based morphometry. To conclude, the results that were found in this thesis shaded light into previously unstudied issues related to PD, increasing the knowledge on some of the cerebral pathological changes that affect patients with this disorder. In addition they encourage the use of tDCS to explore brain networks in PD and suggest that surface-based techniques such as cortical thickness are useful to assess GM changes occurring in these patients. / Actualmente, la enfermedad de Parkinson (EP) es el segundo trastorno neurodegenerativo más frecuente después de la enfermedad de Alzheimer. Al ser un trastorno del movimiento, el síntoma principal de la EP es el deterioro de las funciones motoras. Sin embargo, la disfunción cognitiva actualmente se reconoce como una característica más de la EP, que está presente desde las fases iniciales de la enfermedad y que afecta a la mayoría de los pacientes a medida que la enfermedad va avanzando. Entre los déficits cognitivos más comunes en la EP se encuentra el deterioro de la fluidez semántica y fonológica que normalmente se atribuye al deterioro de las funciones ejecutivas. Aunque todavía no se han establecido biomarcadores definitivos para la EP, los métodos de neuroimagen como la resonancia magnética estructural y funcional (RM, RMf) y los métodos de estimulación cerebral no invasiva como la estimulación por corriente directa (ECT) ofrecen la posibilidad de estudiar los sustratos neurobiológicos del deterioro cognitivo en estos pacientes. Esta tesis está formada por tres estudios. El primer estudio de esta tesis demostró que la fluidez semántica está asociada con la densidad de sustancia gris en áreas corticales frontales y temporales en los pacientes con EP, lo que sugiere que esta función se basa tanto en las funciones ejecutivas como en la memoria semántica. El segundo estudio mostró que la ECT sobre la corteza prefrontal dorsolateral izquierda, da lugar a un aumento significativo de la conectividad funcional en las redes neuronales de la fluidez semántica y fonológica, además de una mejora significativa de las funciones de fluidez fonológica en la EP. El tercer y último estudio mostró que entre las técnicas de análisis de neuroimagen más utilizadas para evaluar los cambios corticales en la EP, el grosor cortical parece ser el más sensible, seguido por el plegado cortical y el volumen de sustancia gris. Para concluir, los resultados que se encontraron proporcionan información relevante sobre temas que previamente no se habían estudiado en la EP, aumentando el conocimiento sobre algunos de los cambios cerebrales patológicos que afectan a los pacientes con este trastorno

Las enfermedades neurodegenerativas, como la enfermedad de Alzheimer (EA) y la enfermedad de Parkinson (EP), representan un grave problema de salud pública, sobre todo en los países occidentales, donde el envejecimiento creciente de la población augura un incremento sustancial de la prevalencia de estas patologías. A pesar de que ciertos tratamientos proporcionan una disminución de las manifestaciones clínicas, el avance del proceso neurodegenerativo es irreversible. La identificación de los mecanismos, como la interacción entre factores genéticos y medio-ambientales, implicados en la etiología y evolución de estas patologías es de importancia capital. En el presente trabajo de tesis se explora el papel de la metilación del ADN genómico y el mosaicismo genético en enfermedades neurodegenerativas. El análisis del perfil de metilación del ADN se realizó empleando dos arrays de metilación: “HumanMethylation” (27K y 450K, IlIumina), cuyas sondas distribuidas estratégicamente por todo el genoma, permiten detectar cuantitativamente el estado de mutilación de unos 27.000 y 450.000 dinucleótidos CpG, respectivamente. La comparación de un total de 60 individuos (28 con enfermedad de Alzheimer, 3 con enfermedad de Parkinson y 29 controles) ha permitido identificar el perfil de metilación del genoma de distintas áreas del sistema nervioso central (SNC) (corteza, amígdala, hipocampo, hipotálamo, protuberancia, sustancia negra y cerebelo), mostrando la existencia de un patrón diferencial entre hombres y mujeres, asociado a la inactivación del cromosoma X, un patrón independiente para cerebelo, y un patrón de metilación de un conjunto de dianas característico de los estadíos 3 y 4 de Braak de la EA. Asimismo, se observaron diferencias significativas de metilación (1.112 CpGs, p<0,0l) en el cerebelo asociadas a la EA, confirmando su implicación en la enfermedad. El análisis del mosaicismo somático del cerebro se realizó empleando el "SurePrint G3 human CGH array 400K" (Agilent). Tomando como área de referencia el cerebelo se detectaron ganancias o pérdidas de material genómico entre áreas del cerebro de un mismo individuo. Dos muestras de corteza, pertenecientes a dos controles, presentaron una ganancia de material genómico en el gen WWOX, mientras que tan solo una muestra mostró una ganancia de material genómico en el gen ADAM5P3A. La elevada frecuencia de variantes en el número de copia en WWOX y su posible implicación en EA llevó a genotipar un mayor número de individuos, aunque ninguno mostró mosaicismo somático. El análisis del estado de metilación de las sondas ubicadas en WWOX permitió observar una disminución significativa de la metilación entre pacientes y controles en 14 sondas (T-student, p<0,05), sugiriendo que la regulación epigenética de WWOX puede estar alterada en la EA. En conjunto, estos resultados muestran la alteración de los perfiles de mutilación del SNC en relación con la EA tardía (estadíos 3 y 4 de Braak). Principalmente, en una de las regiones cuya afectación patológica en la EA ha sido más controvertida, cerebelo. Es especialmente interesante remarcar que la aparición de las lesiones características de cerebelo tienen lugar en estadíos más avanzados, indicando la posibilidad de que la alteraciones epigenéticas observadas podrían corresponder a un evento prematuro en la progresión de la patología. / Neurodegenerative disorders, such as Alzheimer's disease (AD) and Parkinson's disease (PD), represent a major issue of public health in developing countries where the aging of the population is leading to a progressive increase of its prevalence rates. Currently, several therapeutic strategies help to palliate clinical symptoms, but the neurodegeneration is progressive and irreversible. Identification of underlying mechanisms leading to these disorders is essential to improve patient's life expectancy and quality. In this context, many efforts have been focused on identifying genetics and environment causes of these disorders with little success, highlighting the need to evaluate new mechanisms and factors involved. The present thesis project has explored the implication of new mechanisms, such as DNA methylation and somatic mosaicism in AD and PD. The analysis of DNA methylation was performed with a new methylation array technology: 'HumanMethylation' (27K and 450K, IlIumina), whose probes strategically distributed along the human genome, enables to quantify the methylation state of around 27,000 and 450,000 CpG sites, respectively. The pattern of methylation of 60 subjects (28 AD, 3 PD and 29 unaffected) with four to seven brain regions (cortex, amygdala, hippocampus, hypothalamus, pons, substantia nigra and cerebellum) has been assessed. The study has shown three ma in clusters depending on gender (female/male), brain area (cerebellum vs others) and disease stage (AD3 vs AD4). In addition, a' differential analysis performed in individual CpG sites proved the presence of significant differences associated to AD patient's cerebellum (1112 CpG sites, p<0.01). Somatic mosaicism analysis has been carried out with a 'SurePrint G3 human CGH array 400K' (Agilent) to detect intra-individual genomic gains and losses compared to cerebellum. A total of two cortex samples showed a genomic gain in the WWOX gene, whereas only one sample showed a gain on ADAM5P3A. WWOX has been considered as a potential candidate gene in previous AD studies, and was further analyzed in a larger cohort of human brain samples. Genotyping assays did not confirm the presence of new somatic mosaicism cases, but it was possible to determine the genotype distribution and compared data between samples. A significant hypomethylation of the WWOX promoter region was observed in AD patients compared to controls subjects (T-test, p<0.05) in 14 probes, suggesting a potential regulation of expression by methylation. Overall, these results highlight the implication of epigenetic mechanisms in neurodegenerative disorders, as AD. In particular, it is remarkable the specific pattern of methylation in the cerebellum in intermediate stages of AD, suggesting an overlap with early modifications, which could contribute to unraveling new mechanisms implicated in AD.