Orientador: Paulo César Corrêa Borges / Banca: Edihermes Marques Coelho / Banca: Rui Geraldo Camargo Viana / Resumo: O presente trabalho demonstra as implicações penais que podem surgir do resultado das pesquisas relativas à manipulação genética de embrião humano. Sabe-se que a evolução científica no campo da engenharia genética e técnicas de reprodução humana assistida tem sido responsável por grandes avanços na área da saúde. Entretanto, com o dinamismo em que estão sendo adquiridos tais conhecimentos, surgem necessidade de serem fixados limites e responsabilidades. Neste trabalho, é abordada a temática específica da manipulação genética de embriões humanos, estabelecendo sua correlação com os valores éticos, morais e jurídico-penais. É dada ênfase à necessidade de uma tutela penal acerca do tema, bem como às diversas técnicas de manipulação de embrião humano que podem lesar o patrimônio genético e atentar contra a vida. São desenvolvidas as teorias de maior relevância que tentam definir o momento de inicio da vida, bem como a compatibilização entre os interesses de desenvolvimento tecnológico e a indispensável proteção do ser humano. Na busca da legislação adequada, capaz de incentivar as pesquisas e, ao mesmo tempo, impedir abusos, são analisadas as lacunas existentes no ordenamento jurídico-penal no que tange à proteção do embrião, bem com demonstra-se a urgente necessidade da legislação que seja efetiva na proteção do direito à vida e a intangibilidade e inalterabilidade do patrimônio genético, apontando possíveis caminhos para a devida tipificação e responsabilização jurídico-penal dos desvios / Abstract: This article discusses the criminal implications that may arise from the results of research on the genetic manipulation of the human embryo. It is known that the scientific developments in the field of genetic engineering and assisted reproduction techniques has been responsible for major breakthroughs in healthcare. However, the dynamism that is being acquired such knowledge arise needs to be fixed boundaries and responsibilities. In this paper, we addressed the specific theme of genetic manipulation of human embryos, establishing its correlation with the ethical, moral, legal and criminal. It is intended to emphasize the need for a criminal oversight on the subject as well as the various techniques for manipulating human embryo that can damage the genetic heritage and attacking the living. It will highlight the most relevant theories that attempt to define the moment of the beginning of life as well as the challenge of achieving compatibility between the interests of technological development and the necessary protection of the human being. In search of appropriate legislation, able to encourage research and at the same time prevent abuse, we intend to analyze the gaps in the legal - criminal in regard to the protection of the embryo, as well as demonstrate the urgent need for legislation that is effective in protecting the right to life and to inviolability and inviolability of genetic heritage, pointing possible paths for proper classification and criminal legal accountability of deviations / Mestre

Orientador: Maria Célia Bertolini / Co-orientador: Rodrigo Duarte Gonçalves / Banca: Iran Malavazi / Banca: Márcia Eliana da Silva Ferreira / Resumo: O fungo Neurospora crassa tem sido amplamente utilizado como organismo modelo para o estudo de alguns aspectos da biologia em eucariotos. O sequenciamento de seu genoma permitiu analisar funcionalmente diversos fatores de transcrição e, portanto, atribuir função a proteínas anotadas como hipotéticas. Neste estudo, está sendo investigado o papel funcional do produto de ORF NCU01629, um fator de transcrição que pertence à família zinc-finger sem homólogos funcionais nos bancos de dados de fungos filamentosos. Análises de interação DNA-proteína in vitro foram previamente realizadas por pesquisadores colaboradores, permitindo a identificação do seu motif de ligação ao DNA, bem como os genes provavelmente regulados por este fator de transcrição. A partir destes dados, estes genes foram classificados pelo FunCat. Os resultados revelaram o envolvimento do fator de transcrição em eventos celulares relacionados ao estresse oxidativo, bem como morte celular, entre outros processos celulares. Análises do crescimento radial do fungo foram realizadas em placas de Petri contendo agentes indutores de diferentes tipos de estresse, tais como osmótico, térmico e oxidativo. A linhagem mutante mostrou crescimento semelhante à linhagem selvagem, em condições de estresse osmótico (NaCl 0,1-1,5M e sorbitol 1-1,5M), pH (4,2 e 7,8) e térmico (45ºC). Entretanto, o crescimento da linhagem mutante foi influenciado quando a linhagem foi exposta a diferentes agentes indutores de EROs, como o paraquat (10 μM), menadiona (50 μM), H2O2 (2 mM) e farnesol (10 μM). A linhagem mutante mostrou crescimento radial reduzido, quando comparado à linhagem selvagem no tratamento com diferentes concentrações de paraquat e farnesol e aumento da resistência quando expostos a H2O2 e menadiona. A expressão de genes relacionados a EROs (cat-1, cat-2, cat-3, gst-1, gst-2, sod e nox) e genes apoptóticos... / Abstract: The fungus Neurospora crassa has been widely used as a model organism for the study of some aspects of biology in eukaryotes. The sequencing of its genome has enabled functionally analyze various transcription factors and therefore, assign function to hypothetical proteins. In this study, we investigated the functional role of the ORF NCU01629 product, a transcription factor that belongs to the zinc-finger protein family without functional homologues in fungi database. In vitro analysis of DNA-protein interaction, allowed the identification of its DNA binding motif and, as a consequence, the most likely genes regulated by this transcription factor. The genes were classified by FunCat. The results revealed the involvement of the transcription factor in multiple cellular processes including the response to oxidative stress and cell death. Analyses of radial growth were performed in Petri dishes containing agents that induce different types of stress such as osmotic, thermal and oxidative. The knockout strain showed similar growth to the wild type strain when exposed to osmotic (NaCl 0,1-1,5M and sorbitol 1-1,5M), pH (4.2 and 7.8) and heat (45°C) stresses. However, growth of the knockout strain was influenced when the strain was exposed to different ROS inducing agents, such as paraquat (10 μM), menadione (50 μM), H2O2 (2mM) and farnesol (10 μM). The knockout strain showed reduced radial growth, compared to the wild-type strain, when exposed to different concentrations of paraquat and farnesol and increased resistance to H2O2 and menadione. The expression of genes related to ROS (cat-1, cat-2, cat-3, gst-1, gst-2, sod, and nox) and apoptotic genes (bax, metascaspases, and p53) were analyzed by RT-qPCR. The results showed that the transcription factor is involved in the regulation of the oxidative stress response, controlling the expression of all genes. The gene encoding glutathione-S-transferase... / Mestre

Orientador: Douglas Silva Domingues / Banca: Danilo Centeno / Banca: Monalisa Sampaio Carneiro / Resumo: A aplicação energética dos subprodutos da cana-de-açúcar faz dessa cultura uma das líderes em investimentos do agronegócio internacional. Para suprir a demanda mundial e expandir o setor sucroenergético, estratégias de engenharia genética que possam gerar plantas transgênicas mais tolerantes a estreses bióticos e abióticos podem ser uma alternativa para ganhos de produtividade. Um dos mecanismos mais utilizados em plantas para minimizar os efeitos causados por estresses é o acúmulo de solutos. Entre eles, pode ser destacada a família de oligossacarídeos da rafinose (RFOs). Ela é formada a partir da adição sucessiva de radicais galactosil a uma molécula de sacarose, em reação catalisada pelas enzimas galactinol sintase (GolS), rafinose sintase e estaquiose sintase. A GolS é considerada o passo-chave de regulação da síntese de RFOs em plantas modelo. Embora a compreensão das etapas moleculares da produção de RFOs e sua modulação por estresses abióticos tenham potencial de contribuir na tolerância a estresses em plantas, esta estratégia é pouco compreendida em gramíneas, entre elas a cana-de-açúcar. Neste sentido, o presente trabalho pretende compreender aspectos moleculares relativos à produção de RFOs em cana-de-açúcar e sua relação com estresses abióticos e desenvolvimento. Para tanto, foram avaliados transcricionalmente genes relacionados a síntese de RFOs em cana sob estresse hídrico, bem como obteve-se plantas transgênicas com expressão constitutiva do gene CaGolS2, uma galactinol sintase de cafeeiro. Sob estresse hídrico, gene ScGolS1 teve seu nível transcricional reduzido em folhas e induzido em colmo. ScRFS1 nos dois tecidos tem o padrão transcricional diretamente relacionado ao aumento da severidade do estresse, e o mesmo é observado em ScSTS1. Foram também obtidos 10 eventos transgênicos de cana-de-açúcar com a região codificante do gene CaGolS2 de Coffea arabica, dos quais... / Abstract: Bioenergy application of sugarcane byproducts are making this crop one of the most important in the international agribusiness investments. To meet global demand and expand the sugarcane sector, genetic engineering strategies generating transgenic plants more tolerance to biotic and abiotic stresses is a promising to improve productivity. One of the most relevant mechanism related to stress tolerance in plants involves the accumulation of distinct solutes. The Raffinose Oligosaccharids Family synthesis starts from the successive addition of galactosyl radicals to a sucrose molecule, in a reaction catalyzed by galactinol synthase (GolS), raffinose synthase and stachyose synthase. GolS plays a key role in RFOs production in model plants. Although the stress-responsive action of RFOs may improve abiotic stress tolerance in plants, these mechanisms are almost completely unknown in grasses, like sugarcane. In this context, this study aims to understand molecular aspects of RFOs synthesis and its relation with abiotic stresses. We have evaluated the transcriptional level of genes related RFOs synthesis under water stress and we produced transgenic plants constitutively expressing a coffee galactinol synthase (CaGolS2). Under water stress, ScGolS1 was downregulated in leaves, but upregulated in stems. ScRFS1 and ScSTS1 were upregulated in both tissues, in a direct correlation between transcription level and stress. We produced 10 transgenic events containing the coding region of CaGolS2; in six events, the transgene were transcriptionally active. Transgenic plants presented differences in morphology and carbon assimilation when compared to non-transgenic controls. Overall, we inferred that the stress-responsive pattern of RFO synthesis genes might help carbon relocation during water stress. Raffinose and stachyose seems to have greater impact than galactinol in this process. Furthermore, CaGolS2 transgenic plants have promising traits for... / Mestre

A cana-de-açúcar vem assumindo um papel de destaque na atual conjuntura nacional, impulsionada principalmente pela produção de etanol, que vai de encontro com a crescente preocupação mundial na busca por fontes de energias renováveis e menos impactantes ao ambiente. Por essa razão, é preciso assegurar o contínuo desenvolvimento técnico-científico do setor sucroalcooleiro nacional, mantendo o Brasil na posição de vanguarda na produção de biocombustíveis. Ante a disponibilidade de inúmeras ferramentas biotecnológicas, tornou-se possível avançar com maior celeridade na compreensão dos campos da genética e fisiologia da cana-de-açúcar. Neste trabalho é demonstrado a transformação genética via biobalística da cultivar RB835486. No processo foram usadas duas construções para silenciamento gênico via RNA de interferência (RNAi), com genes quiméricos do tipo shRNA (short harpin RNA) para silenciamento dos genes SspTIP1;1 e SspPIP1;4, em co-tranformação com o gene marcador npt- II. Os dois genes alvo selecionados codificam aquaporinas, proteínas transmembrana responsáveis pelo transporte de água na planta. Estes genes foram identificados anteriormente por seu possível envolvimento no processo de acúmulo de sacarose. A co-integração dos cassetes de silenciamento gênico e do gene marcador ocorreu em 13 plantas, sendo obtidas três linhagens para o gene SspTIP1;1 e 10 linhagens para o gene SspPIP1;4. Dentre elas, duas linhagens SspTIP1;1 e cinco linhagens SspPIP1;4 foram analisadas via RT-PCR, quanto a possíveis modificações nos níveis de expressão dos genes alvos. Nas duas linhagens transgênicas avaliadas para silenciamento do SspTIP1;1, não houve redução em sua expressão em relação ao controle não transformado, possivelmente devido a efeitos de posição. Nas outras cinco linhagens transgênicas avaliadas para silenciamento do SspPIP1;4, houve redução significativa em seus níveis de expressão em três linhagens em relação ao controle não transformado. Nestas plantas serão realizadas as análises fisiológicas a fim de validá-las funcionalmente quanto ao transporte de água e acúmulo de sacarose. / Sugarcane has taken a leading role in the current national economy, mainly boosted by ethanol production, which meet the growing global concern on searching for renewable energy and with low impact on the environment. Therefore, it is necessary to ensure the continuous technical and scientific development of the national sugar and ethanol sector, maintaining the leading position of Brazil in biofuel production. By the availability of numerous biotechnology tools, it became possible to advance more rapidly in understanding the fields of genetics and physiology of sugarcane. This work demonstrated the genetic transformation of the cultivar RB835486 via biolistic assay. In the process it was used two constructs for gene silencing via RNA interference (RNAi) with chimeric genes of the type shRNA (short harpin RNA) for silencing of the genes SspTIP1;1 and SspPIP1;4, co-transformed with the marker gene npt- II. The two selected target genes encode aquaporins, transmembrane proteins which are responsible for water transport in plants. These genes were previously identified for their possible involvement in the process of sucrose accumulation. The co-integration of both, the cassette gene silencing and gene marker was observed in 13 plants, three strains were obtained for the gene SspTIP1;1 and 10 strains for gene SspPIP1;4. Among them, two strains of SspTIP1;1 and five strains of SspPIP1;4 were analyzed by RT-PCR, searching for possible changes in the levels of target gene expression. In the two transgenic lines evaluated for silencing SspTIP1;1, no reduction in expression compared to control non-transformed was obtained, possibly due to effects of position insertion of the gene in the genome. The other five transgenic lines evaluated for silencing of SspPIP1;4, a significant reduction in their expression levels was obtained in three strains when compared to the control untransformed plants. These silenced plants will be physiologically analyzed to validate their function on water transport and sucrose accumulation.

Esta dissertação tem por escopo estudar a interface do Acordo TRIPS com o a Convenção sobre Diversidade Biológica, sob a perspectiva dos países em desenvolvimento. Para tanto, resgata a construção epistemológica Ocidental do conhecimento, direito, propriedade intelectual e desenvolvimento. Esta base teórica constituída é questionada pela CDB, que apresenta direitos relativos ao acesso de recursos genéticos e / ou conhecimento tradicional que subvertem a ordem estabelecida de geração do conhecimento e acumulação econômica. Tal subversão é parte integrante de movimento maior que questiona o próprio modelo de desenvolvimento e a relação Norte e Sul. Esta pesquisa contextualiza a estruturação legal e organizacional do tema e revisa as contribuições de autores que estudam este, sistematizando-as. Com este arcabouço, ela levanta hipóteses e reflete sobre as respostas destas, identificando paradoxos, compatibilidades e desafios. Apresenta (ndo) se, por fim, uma análise da governança institucional deste tema, através de uma nova configuração cognitiva e legal do mesmo. / This MA dissertation aims at studying the interface of the \'TRIPS Agreement\' with the \'Convention on the Biological Diversity\', under the view of the developing countries. As such, it ransoms the epistemologic building of the Ocidental knowledge, as well as the rights, intelectual property and development. This theoretical basis is questioned by \'CDB\', which presents rights related to the access of genetic resourses/ and the traditional knwledge, which subvert the established order of knowledge generation and economic accumulation. Such subvertion is part of a larger movement that questions its own development model and the North/ South relation. This research contextualizes the legal orgazing structuralization of the theme and revises the contributions of authors that study it, systematizing them. With this backbone, it rises hypotheses and thinks of these hypotheses, identifying paradoxes, compatibilities and challenges. It finally presents an analysis of the institutional governing of this theme, via a new cognitive and legal configuration of the same.

É indiscutível os inúmeros benefícios decorrentes do avanço da ciência, principalmente no campo da reprodução artificial, entretanto cada vez mais se mostra necessário impor limites, tanto na área médica quanto na jurídica, devendo-se regulamentar, legal e especificamente a matéria, com o fim de se coibir abusos e proteger direitos. Ademais, o avanço rápido da ciência tem preocupado sobremaneira a sociedade relativamente às conseqüências decorrentes do uso indevido por parte de pesquisadores, médicos e clínicas reprodutivas, das inovações e possibilidades nesta área. Nada justifica que a busca científica desenfreada, por exemplo, de seres humanos geneticamente melhorados, ultrapasse limites éticos, morais e sociais, discriminando-se àqueles que não se enquadram nos padrões sociais previamente estereotipados. Na presente pesquisa, a responsabilidade civil e penal é tratada como forma inibidora de tais atos, mas não se mostra como única solução possível. Sendo assim, questões como o direito dos embriões, o direito a vida, a dignidade humana, a sucessão hereditária, a filiação, entre outros, são objeto primordial da presente obra, de forma que lhe sejam assegurados ampla tutela jurídica nesse sentido. Também questões relativas à gestação de substituição e a autorização daqueles que pretendem implantar um embrião, sejam pais genéticos ou não, na utilização das técnicas de reprodução artificial, aqui se encontram abordadas. Busca-se também proteger o direito de igualdade entre filhos, proibindo-se consequentemente a discriminação entre eles em razão de sua origem. São também esclarecidas as técnicas de reprodução artificial, bem como as teorias relativas ao início da vida para caracterizar-se a personalidade jurídica. Por fim, há ainda, nesta obra, preocupação em esclarecer conceitos, diferenciando-se terminologias e estabelecendo-se definições necessárias tanto na área jurídica quanto médica. / It is undiscuss the numerous benefits resulting from Science advance, especially concerning artificial reproduction, however it is necessary put on limits in medical and legal concernes, having to regulatory, legal rules in order to cohabit abuses and protect rights. Moreover, fast science advance has been worring the society about consequences becomes from the improper use from reserarchers, medical and reproductive clinics concerning innovations and possibilities in this area. Nothing can justifies the fast serch, for example, for humans genetically improveds, it exceeds ethical, moral and social limits, broking down who is not in conform to social standar previously sterotyped. In this research, the civil and penal liability is treated as inhibitory form of such acts, but not appears as the only possible solution. In order, issues concerning embryos rights, such as life rights, human dignity, hereditary succession, among others, are primary subject of this book, performing ensured broad legal protection accordingly. Also issues related to surrogate mother and the authorization of those intending to deploy an embryo, be or not the genetic fathers, in the use of artificial reproduction technical, here related in this work. Also seeks proteting to the rights of equality between sons, in order to forbid discrimination among them because of their origins. The work also clarified the techniques of artificial reproductions, as well as theories concerning the beginning of life to be characterized legal personality. Finally, in this current work, there is worry to clarify the concepts, differing terminologies and definitions needed both in legal and medical fields.

Os impactos ambientais causados pela queima dos combustíveis fósseis e pela sua manipulação, aliados ao crescente preço dos combustíveis, têm fomentado a procura de novos recursos renováveis e o desenvolvimento de novas tecnologias que suportem as necessidades desse mercado. Os biocombustíveis são recursos biodegradáveis e renováveis, que vêm se revelando uma alternativa economicamente viável. No entanto, a atual geração de biocombustíveis possui alguns pontos negativos, tais como: utilização de solos férteis e competição com a indústria de alimentos, uma vez que utiliza culturas como soja, milho e cana-de-açúcar, produtos de extrema importância econômica para seus países produtores. Por estes motivos, há um crescente interesse em explorar outras matérias-primas possíveis, em especial as voltadas exclusivamente para a geração de energia. Neste contexto, as microalgas vêm se mostrando uma opção bastante interessante. Estes organismos apresentam um alto potencial para tal, pois possuem alta taxa de crescimento e capacidade de produzir grande quantidade de óleo. Além disso, a produção do biocombustível por estes organismos pode ser otimizada tanto pela modificação das condições de cultivo (engenharia bioquímica), como através da manipulação genética das linhagens (engenharia genética). Neste trabalho, ambas as estratégias foram utilizadas com o intuito de se aumentar a quantidade de lipídeo produzido pela linhagem CC424 da microalga modelo Chlamydomonas reinhardtii. A via metabólica escolhida para a manipulação genética foi o ciclo do glioxilato, sendo as duas enzimas-chave desse ciclo, isocitrato liase (icl) e malato sintase (ms), os alvos. O plasmídeo pSL18 foi utilizado como vetor da transformação nas microalgas. Seis tipos de linhagens transformantes foram obtidas: duas delas subexpressando os genes icl e ms separadamente, duas subexpressando esses genes e duas contendo duplas transformações, ou seja, uma delas subexpressando ambos os genes ao mesmo tempo e a outra superexpressando os mesmos. Quando se subexpressou ambas as enzimas ao mesmo tempo, houve um aumento significativo na quantidade de lipídeos neutros da célula. Além disso, essa linhagem transgênica foi submetida à escassez de nitrogênio, o que acentuou ainda mais esse resultado. Enquanto em meio normal a diferença entre a quantidade de lipídeos foi de 1,5 vezes, em escassez de nitrogênio essa diferença foi de aproximadamente 3 vezes, corroborada pela diferença nos níveis de expressão gênica, que também foi em torno de 3 vezes. Além disso, a linhagem transgênica também mostrou um aumento em cada um dos ácidos graxos analisados individualmente, revelando uma grande quantidade de todos os tipos de C16 e C18, ácidos graxos importantes para que o biodiesel se adeque ao regulamento da Agência Nacional de Petróleo, Gás Natural e Biocombustíveis. Apesar de maior quantidade de lipídeos em relação à linhagem selvagem, a nova linhagem transgênica Dupla-ICL-MS-anti não mostrou nenhum efeito deletério crítico. Tanto a produção de biomassa, quanto a quantidade de clorofila a, proteínas totais e carboidratos totais se mantiveram estáveis após a introdução da mutação. Esses resultados sugerem que as enzimas do ciclo do glioxilato, sabidamente ligadas ao catabolismo de ácidos graxos, podem ser utilizadas como alvos promissores para a otimização de linhagens já utilizadas comercialmente na produção de biodiesel. / The environmental impacts caused by gases emitted from burning fossil fuels and their manipulation, combined with rising fuel prices, has stimulated demand for new renewable resources and developing new green technologies that support the industry and market needs. Biofuels are biodegradable and renewable resources, which come out to be an economically viable alternative. However, the current generation of biofuels has some disadvantages, such as: use of fertile soils and competition with the food industry, once it uses crops such as soybeans, corn and sugar cane, products of extreme economic importance to the producing countries. For these reasons, there is a growing interest in exploring other possible raw materials, especially those that are geared exclusively for power generation. In this context, microalgae have shown to be a very interesting option. These organisms have a high potential because they have fast growth rate and the ability to produce large amounts of oil. In addition, biofuel production by these organisms can be optimized for both the modification of culture conditions (biochemical engineering), and through the genetic manipulation of microalgae strains (genetic engineering). In this work, the two strategies have been used in order to increase the amount of lipid produced by the strain CC424 from the model organism Chlamydomonas reinhardtii. The metabolic route chosen for genetic manipulation is the glyoxylate cycle, and the two key enzymes of this cycle, isocitrate lyase (icl) and malate synthase (ms), the targets. The plasmid pSL18 was used as a vector of transformation in the microalgae. Six types of transformant strains were obtained, two of them overexpressing the ms and icl genes separately, two underexpressing these genes and two double transformations, one of them overexpressing both genes at the same time the other one underexpressing them. The strain underexpressing both enzymes at the same time, showed a significant increase in the amount of neutral lipids. In this mutant, the shortage of nitrogen led to an even greater increase in these lipids. While in normal media the difference between the amount of lipids was 1.5 times, under nitrogen starvation the difference was approximately 3 times, corroborated by the difference in gene expression levels, which was also about 3 times. Moreover, the mutant strain also showed an increase in each of the individual fatty acids analyzed, revealing a large amount in all kinds of C16 and C18 fatty acids, important for biodiesel that suits the regulation of Agência Nacional de Petróleo, Gás Natural e Biocombustíveis. Although the mutant Dupla-ICL-MS-anti produces higher amounts of lipids compared to the wild type, the strain showed no critical negative effects. Both the production of biomass and the amount of chlorophylla, total protein and total carbohydrates remained stable after the introduction of the mutation. These results suggest that the enzymes of the glyoxylate cycle, which are linked to the catabolism of fatty acids, can be used as promising targets for the optimization of strains already used commercially in the production of biodiesel.

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2017-06-05T14:44:35Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1067093 bytes, checksum: e638533c1c54b6ee80abd013e3fc495c (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-05T14:44:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1067093 bytes, checksum: e638533c1c54b6ee80abd013e3fc495c (MD5) Previous issue date: 2005-02-23 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Antiquitina é uma família de proteínas altamente conservada na evolução que pertence à superfamília de aldeído desidrogenase (ALDH), mas cuja função biológica é desconhecida. Baseado em homologia estrutural e analogia do padrão de expressão, foi isolado um gene da soja, homólogo a antiquitina de humanos, designado GmTP-55, que codifica uma proteína de 55,562 kDa, apresentando um domínio conservado de desidrogenases. A proteína TP-55 apresenta 82% de identidade de seqüência com a proteína 26g de ervilha, induzida por déficit hídrico, e 60% de homologia com a proteína antiquitina de humanos, pertencentes a família ADLH7A1 (conhecida como antiquitina) da superfamília de ALDH. O acúmulo da proteína TP-55 em plantas de soja foi observado na raiz e predominantemente no caule, sob condições de déficit hídrico e estresse salino. Com a finalidade de examinar a função do homólogo da antiquitina in vivo, plantas transgênicas de tabaco (Nicotiana tabacum) e Arabidopsis thaliana expressando constitutivamente o cDNA GmTP-55 foram obtidas e submetidas a diversas condições de estresses abióticos. Enquanto que, em arabidopsis, a expressão do transgene foi confirmada por RT-PCR, em Arabidopsis, a expressão da proteína quimérica TP-55-GFP foi avaliada por microscopia de fluorescência, demonstrando seu acúmulo predominantemente no núcleo e no citoplasma. A expressão ectópica do gene viiGmTP-55 tanto em arabidopsis quanto em tabaco conferiu as plantas transgênicas tolerância a estresse salino durante a germinação e a déficit hídrico durante o desenvolvimento. A eficiência de germinação das sementes transgênicas em concentrações crescentes de NaCl foi muito superior do que a dos controles não transformados. Assim também, em condições de seca progressiva, as plantas transgênicas de tabaco mantiveram a turgidez foliar em altos níveis, contrastando com o aparecimento de murcha foliar das plantas controle. As plantas transgênicas também exibiram uma maior tolerância a estresses oxidativos, que foram induzidos por meio de tratamento com H 2 O 2 e paraquat. Tanto as sementes de arabidopsis quanto as de tabaco expressando GmTP-55 germinaram eficientemente em meio contendo 15 μM de H 2 O 2 , enquanto a germinação das sementes controle foi drasticamente reduzida nas mesmas condições. Similarmente, os discos foliares de tabacos transgênicos tratados com paraquat apresentaram uma redução significativa de lesões necróticas quanto comparadas com as plantas controle. Considerando que o denominador comum resultante dos estresses salino, hídrico e oxidativo seria a produção de ROS e aldeídos tóxicos derivados, estes resultados sugerem que o gene TP-55, homólogo da antiquitina, esteja envolvido em respostas celulares adaptativas relacionadas com detoxificação de aldeídos. / Antiquitin is an evolutionarily conserved protein family of unknown function that belongs to the aldehyde dehydrogenase (ALDH) superfamily. Based on structural homology and expression pattern analogy, we have isolated an antiquitin homolog gene from soybean, designated GmTP-55 that encodes a dehydrogenase motif- containing 55.562 kDa protein. The predicted encoded protein, TP-55, shares 82% sequence identity with the water-stress induced 26g protein from peas and 60% homology with human antiquitin that belongs to the ADLH7A1 (known as antiquitin) family of the ALDH superfamily. Accumulation of TP-55 in soybean was detected in roots and mostly in stems under water deficit and salt stress. To examine the role of antiquitin in vivo, we have obtained transgenics tobacco (Nicotiana tabacum) and Arabidopsis thaliana plants constitutively expressing GmTP-55 and analyzed their response to a variety of abiotic stress conditions. While in tobacco the transgene expression was confirmed by RT-PCR, in Arabidopsis, the expression of the TP-55-GFP chimerical protein was evaluated by fluorescence microscopy that demonstrated its major accumulation in the nucleus and cytoplasm. Ectopic expression of GmTP-55 in both Arabidopsis and tobacco conferred tolerance to salinity during germination and to water stress during plant growth. Under increasing salt concentration the germination efficiency of transgenic seeds were much greater than that of untransformed seeds. ixLikewise, under progressive drought, the transgenic tobacco kept the shoot turgidity to a normal level, which was in contrast to the leaf wilt phenotype of control plants. The transgenic plants also exhibited an enhanced tolerance to oxidative stresses that were induced by H 2 O 2 and paraquat treatments. Both Arabidopsis and tobacco seeds expressing GmTP-55 germinated efficiently in medium supplemented with H 2 O 2 15 μM, whereas the germination of control seeds was drastically reduced under the same condition. Likewise, transgenic tobacco leaf discs treated with paraquat presented a significant reduction in the necrotic lesions as compared to the control leaves. Since the common denominator resulting from salinity, dehydration and oxidative stress is the production of ROS and derived toxic aldehydes, our results suggested that the antiquitin homolog gene might be involved in adaptive responses related to aldehyde detoxification.

Made available in DSpace on 2016-06-02T20:21:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 4058.pdf: 1157673 bytes, checksum: 2346bf567a5ddfbb9217c250df00ce8e (MD5) Previous issue date: 2011-09-09 / Universidade Federal de Sao Carlos / Saccharomyces cerevisiae is the most important microorganism used in alcoholic fermentation process. A strain of Saccharomyces cerevisiae widely used to produce alcohol in Brazil is the PE-2, due to its high fermentation capacity. The goal of this study was to develop an expression system for recombinant proteins using the industrial strain of Saccharomyces cerevisiae, PE-2. The protein chosen to be used as a model for this system was the Cane-CPI-1, an inhibitor of cysteine protease. Initially the construction of plasmids containing CaneCPI-1 gene was performed and yeast cells were transformed with pYADE4-CaneCPI-1 construction. The transformed strain was submitted to expression analyses during batch fermentative process with cell recycle. The recombinant protein was expressed in yeast cells and it was possible to purify the recombinant protein by affinity chromatography on nickel column. This purified protein was immunodetected using a polyclonal anti-CaneCPI-1antibody and monoclonal anti His-Tag antibody, which were also able to detect the CaneCPI-1 in a crude extract from Saccharomyces cerevisiae cells. Assays of inhibitory activity performed with the purified CaneCPI-1 revealed its ability to inhibit the catalytic activity of a cysteine proteinase. This study showed that the use of transformed strain did not affect the fermentation process and that the PE-2 industrial strain of S. cerevisiae can be a viable expression system for recombinant protein production and open perspectives for production of any protein of biotechnological applications during fermentation alcoholic process. / Saccharomyces cerevisiae é o microrganismo mais importante usado no processo de fermentação alcoólica. Uma linhagem de S. cerevisiae amplamente utilizado para produzir álcool no Brasil é a PE-2, devido à sua alta capacidade de fermentação e persistência no sistema. Neste trabalho utilizou-se esta linhagem industrial de levedura como um sistema de expressão de proteínas de interesse biotecnológico. A proteína escolhida como modelo para este sistema foi a CaneCPI-1, uma cistatina de cana-de-açúcar que possui ação inseticida. Inicialmente, foi realizada a construção de um plasmídeo contendo o gene que codifica para a proteína CaneCPI-1 e este foi utilizado para transformar células da levedura S.cerevisiae linhagem PE-2. Posteriormente foram realizados sucessivos ciclos de fermentação (5 ciclos) com esta levedura transformada e as células fermentadas foram submetidas a análises de expressão da proteína CaneCPI-1. Foi possível purificar a proteína recombinante por cromatografia de afinidade em coluna de níquel. Anticorpo policlonal anti-CaneCPI-1 e anticorpo monoclonal anti-His-Tag foram capazes de imunodetectar a proteína purificada e no extrato proteico bruto do último ciclo fermentativo. Ensaios da atividade inibitória mostraram que a CaneCPI-1 purificada foi capaz de inibir a atividade hidrolítica da papaína. A utilização da linhagem transformada não afetou a eficiência do processo fermentativo durante os quatro primeiros reciclos. A produção da CaneCPI-1 em uma linhagem industrial de S. cerevisiae ao longo do processo fermentativo se mostrou viável, abrindo-se novas perspectivas para a produção de qualquer proteína de aplicações biotecnológicas durante o processo de fermentação alcoólica.

Os impactos ambientais causados pela queima dos combustíveis fósseis e pela sua manipulação, aliados ao crescente preço dos combustíveis, têm fomentado a procura de novos recursos renováveis e o desenvolvimento de novas tecnologias que suportem as necessidades desse mercado. Os biocombustíveis são recursos biodegradáveis e renováveis, que vêm se revelando uma alternativa economicamente viável. No entanto, a atual geração de biocombustíveis possui alguns pontos negativos, tais como: utilização de solos férteis e competição com a indústria de alimentos, uma vez que utiliza culturas como soja, milho e cana-de-açúcar, produtos de extrema importância econômica para seus países produtores. Por estes motivos, há um crescente interesse em explorar outras matérias-primas possíveis, em especial as voltadas exclusivamente para a geração de energia. Neste contexto, as microalgas vêm se mostrando uma opção bastante interessante. Estes organismos apresentam um alto potencial para tal, pois possuem alta taxa de crescimento e capacidade de produzir grande quantidade de óleo. Além disso, a produção do biocombustível por estes organismos pode ser otimizada tanto pela modificação das condições de cultivo (engenharia bioquímica), como através da manipulação genética das linhagens (engenharia genética). Neste trabalho, ambas as estratégias foram utilizadas com o intuito de se aumentar a quantidade de lipídeo produzido pela linhagem CC424 da microalga modelo Chlamydomonas reinhardtii. A via metabólica escolhida para a manipulação genética foi o ciclo do glioxilato, sendo as duas enzimas-chave desse ciclo, isocitrato liase (icl) e malato sintase (ms), os alvos. O plasmídeo pSL18 foi utilizado como vetor da transformação nas microalgas. Seis tipos de linhagens transformantes foram obtidas: duas delas subexpressando os genes icl e ms separadamente, duas subexpressando esses genes e duas contendo duplas transformações, ou seja, uma delas subexpressando ambos os genes ao mesmo tempo e a outra superexpressando os mesmos. Quando se subexpressou ambas as enzimas ao mesmo tempo, houve um aumento significativo na quantidade de lipídeos neutros da célula. Além disso, essa linhagem transgênica foi submetida à escassez de nitrogênio, o que acentuou ainda mais esse resultado. Enquanto em meio normal a diferença entre a quantidade de lipídeos foi de 1,5 vezes, em escassez de nitrogênio essa diferença foi de aproximadamente 3 vezes, corroborada pela diferença nos níveis de expressão gênica, que também foi em torno de 3 vezes. Além disso, a linhagem transgênica também mostrou um aumento em cada um dos ácidos graxos analisados individualmente, revelando uma grande quantidade de todos os tipos de C16 e C18, ácidos graxos importantes para que o biodiesel se adeque ao regulamento da Agência Nacional de Petróleo, Gás Natural e Biocombustíveis. Apesar de maior quantidade de lipídeos em relação à linhagem selvagem, a nova linhagem transgênica Dupla-ICL-MS-anti não mostrou nenhum efeito deletério crítico. Tanto a produção de biomassa, quanto a quantidade de clorofila a, proteínas totais e carboidratos totais se mantiveram estáveis após a introdução da mutação. Esses resultados sugerem que as enzimas do ciclo do glioxilato, sabidamente ligadas ao catabolismo de ácidos graxos, podem ser utilizadas como alvos promissores para a otimização de linhagens já utilizadas comercialmente na produção de biodiesel. / The environmental impacts caused by gases emitted from burning fossil fuels and their manipulation, combined with rising fuel prices, has stimulated demand for new renewable resources and developing new green technologies that support the industry and market needs. Biofuels are biodegradable and renewable resources, which come out to be an economically viable alternative. However, the current generation of biofuels has some disadvantages, such as: use of fertile soils and competition with the food industry, once it uses crops such as soybeans, corn and sugar cane, products of extreme economic importance to the producing countries. For these reasons, there is a growing interest in exploring other possible raw materials, especially those that are geared exclusively for power generation. In this context, microalgae have shown to be a very interesting option. These organisms have a high potential because they have fast growth rate and the ability to produce large amounts of oil. In addition, biofuel production by these organisms can be optimized for both the modification of culture conditions (biochemical engineering), and through the genetic manipulation of microalgae strains (genetic engineering). In this work, the two strategies have been used in order to increase the amount of lipid produced by the strain CC424 from the model organism Chlamydomonas reinhardtii. The metabolic route chosen for genetic manipulation is the glyoxylate cycle, and the two key enzymes of this cycle, isocitrate lyase (icl) and malate synthase (ms), the targets. The plasmid pSL18 was used as a vector of transformation in the microalgae. Six types of transformant strains were obtained, two of them overexpressing the ms and icl genes separately, two underexpressing these genes and two double transformations, one of them overexpressing both genes at the same time the other one underexpressing them. The strain underexpressing both enzymes at the same time, showed a significant increase in the amount of neutral lipids. In this mutant, the shortage of nitrogen led to an even greater increase in these lipids. While in normal media the difference between the amount of lipids was 1.5 times, under nitrogen starvation the difference was approximately 3 times, corroborated by the difference in gene expression levels, which was also about 3 times. Moreover, the mutant strain also showed an increase in each of the individual fatty acids analyzed, revealing a large amount in all kinds of C16 and C18 fatty acids, important for biodiesel that suits the regulation of Agência Nacional de Petróleo, Gás Natural e Biocombustíveis. Although the mutant Dupla-ICL-MS-anti produces higher amounts of lipids compared to the wild type, the strain showed no critical negative effects. Both the production of biomass and the amount of chlorophylla, total protein and total carbohydrates remained stable after the introduction of the mutation. These results suggest that the enzymes of the glyoxylate cycle, which are linked to the catabolism of fatty acids, can be used as promising targets for the optimization of strains already used commercially in the production of biodiesel.