A obtenção de plantas geneticamente modificadas tornou-se uma ferramenta biotecnológica de grande valor, contribuindo nos programas de melhoramento. Plantas transgênicas contendo genes de peptídeos antibacterianos são uma boa alternativa nos programas visando resistência às bactérias. A cecropina é um peptídeo isolado de inseto que apresenta ação antibacteriana contra diversas bactérias, entre elas, a Xylella fastidiosa causadora da clorose variegada dos citros (CVC). Com isso, este trabalho teve dois objetivos: 1) obter plantas transgênicas dos cultivares copa de laranja 'Hamlin' e laranja 'Pêra' (Citrus sinensis L. Osbeck) com o gene cecropin MB39 dirigido pelos promotores do gene da fenilalanina amônia-liase (PAL) clonado de citros (CsPP) e de Arabidopsis thaliana (AtPP), que conferem expressão gênica nos vasos do xilema. Obter plantas transgênicas de laranja 'Hamlin' e laranja 'Valência' com o gene GUS dirigido pelo promotor AtPP. 2) avaliar plantas de laranja 'Valência' transformadas com o gene cecropin MB39 inoculadas com Xylella fastidiosa. As transformações genéticas foram realizadas através do co-cultivo de explantes, coletados de plantas cultivadas in vitro (segmentos de epicótilo) ou em casa de vegetação (segmentos internodais), com Agrobacterium tumefaciens. Para isso, utilizou-se a estirpe EHA-105 de A. tumefaciens contendo os vetores binários CsPPCEC/2201, AtPPCEC/2201 ou AtPP-GUS/2201. A seleção das gemas transformadas foi feita em meio de cultura contendo o antibiótico canamicina, e para confirmação da transformação foram realizados teste histoquímico GUS e análises moleculares de PCR e 'Southern blot'. As gemas regeneradas foram microenxertadas em citrange 'Carrizo' ou laranja 'Hamlin' não transgênicos. Foi possível a obtenção de gemas transformadas para todos os cultivares, porém a regeneração de plantas ocorreu para laranja 'Hamlin' transformada com os vetores CsPPCEC/2201, AtPPCEC/2201 e AtPP-GUS/2201. Para a avaliação da resistência de plantas transgênicas a Xylella fastidiosa foram selecionadas nove plantas de laranja 'Valência' transformadas com o gene cecropin MB39, sendo que em quatros plantas o gene está sendo dirigido pelo promotor CsPP e nas outras cinco plantas pelo promotor CaMV 35S. Essas plantas foram multiplicadas por borbulhia e inoculadas mecanicamente com Xylella fastidiosa. Foram realizados isolamentos primários e quantificações bacterianas aos quatro e dez meses após a inoculação da bactéria para verificar a eficiência da inoculação e movimentação sistêmica da bactéria. Avaliações sintomáticas foliares também foram feitas aos oito meses após a inoculação. Os resultados dos isolamentos aos quatro meses mostraram que a inoculação da bactéria foi eficiente, já que houve crescimento bacteriano na maioria das placas com meio de cultura. A movimentação sistêmica da bactéria pôde ser detectada no isolamento aos dez meses. Das nove plantas avaliadas, uma planta transgênica apresentou crescimento populacional menor do que a da planta controle, indicando uma resistência ao patógeno. Nas avaliações sintomáticas foliares, as plantas transgênicas não diferiram do controle. / The production of genetically modified plants has become an important biotechnological tool, contributing with breeding programs. Transgenic plants expressing antibacterial peptides genes are a good alternative for breeding programs aiming to obtain bacterial resistance. Cecropin is a peptide isolated from an insect, which presents antibacterial effect against several bacteria including the citrus variegated chlorosis in which the causal agent is Xylella fastidiosa. This work had two objectives: 1) genetically transform 'Hamlin' and 'Pêra' sweet oranges scions with the cecropin MB39 gene under the control of the phenylalanine ammonia-lyase (PAL) gene promoter, cloned from citrus (CsPP) and from Arabidopsis thaliana (AtPP). This promoter confers gene expression within the xylem vessels. Obtain transgenic plants of 'Hamlin' and 'Valência' sweet oranges with the GUS gene under the control of the AtPP promoter. 2) Evaluate the resistance to Xylella fastidiosa of 'Valência' sweet orange plants transformed with the cecropin MB39 gene. Co-culture of explants with Agrobacterium tumefaciens was used to genetically transform in vitro plants (epicotyl segments) and greenhouse plants (internodal segments). A. tumefaciens strain EHA-105 containing the CsPPCEC/2201, AtPPCEC/2201 or AtPP-GUS/2201 binary vectors were used for transformation. Culture medium containing the antibiotic kanamycin was used for selection of transformed buds. Confirmation of transgenesis was carried out by GUS assays, PCR and Southern blot analysis. Regenerated buds were in vitro grafted on non-transgenic 'Carrizo' citrange or 'Hamlin' sweet orange rootstocks. Transformed buds were obtained for all cultivars, however plant regeneration was only obtained for 'Hamlin' sweet orange transformed with vectors CsPPCEC/2201, AtPPCEC/2201 and AtPP-GUS/2201. Nine 'Valência' sweet orange plants transformed with the cecropin MB39 gene were selected for the Xylella fastidiosa resistance experiment. Four transgenic lines were controlled by the CsPP promoter and the other five lines were controlled by the CaMV 35S promoter. These transgenic lines were graft propagated and mechanically inoculated with Xylella fastidiosa. Primary isolations and bacterial quantifications were conducted on the fourth and tenth month after inoculation in order to detect inoculation efficiency and bacterial systemic movement. Leaf symptom evaluations were executed eight months after inoculations. The bacterial isolation results from the fourth month indicated that inoculations were successful, since bacterial growth could be detected in the majority of culture mediums. Systemic movement of bacteria within the plants was detected after ten months. From the nine transgenic lines tested, one presented reduced pathogen growth when compared to controls indicating resistance. Transgenic lines did not differ from controls regarding leaf symptoms.

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:32:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1444636 bytes, checksum: 6eeadcc5d1f7aefe015645aed7d241f2 (MD5) Previous issue date: 2014-02-27 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Until then, how to increase the gain by selection has been pointed out by different strategies recommended in breeding methods, or by using the basic principles of experimentation, or even use biometric models that seek to parameterize both genotypic and environmental influences. Thus, as regards the methods of genetics and statistics used for selection of superior genotypes, highlight the methods derived from the theory of direct selection, indirect selection and index selection, combined selection method and REML-BLUP method among others. Despite several methodologies available for the selection of superior genotypes is still common and necessary practice selection of individuals in relation to features with low reliability of predicting genotype value from a phenotypic value given by the corrected or adjusted by the aggregate average phenotypic information from relatives of correlated traits or practices to reduce the environmental effect. In the end, we consider this phenotypic average adjusted as the most appropriate measure to indicate genetic superiority and predict genetic gain. However, such models or procedures do not include a multitude of other statistical information of great relevance, different phenotypic average which is usually adopted, but which provide important information about the reported genotype and who have been sidelined studies involving genetic improvement and selection criteria. In this context, artificial neural networks are a new paradigm that has been employed, albeit tenuously, in animal and plant breeding programs. This approach, unlike the stochastic modeling used so far, is based on principles of learning and computational intelligence on a wide range of performance information of genotype involving averages, maximum, minimum, variance and all sorts of information can be directly or indirectly measured. Thus, unlike the statistical methods that summarize the information or perform the structural simplification of data, neural networks, like the human brain, capture all available information to generate a criterion for decision making. This work was carried out with the intention of using neural networks to improve the accuracy of the predicted values and genetic gains, through a discussion of its theoretical foundations and use simulated data with the same characteristics in terms of average heritability and coefficient of variation of actual data by providing an alternative method for identification of superior genotypes. / Até então, as formas de aumentar o ganho por seleção tem sido apontadas pelas diferentes estratégias preconizadas nos métodos de melhoramento, ou pela utilização dos princípios básicos da experimentação, ou ainda recorrer a modelos biométricos que buscam parametrizar as influências tanto genotípicas quanto ambientais. Assim, no que se refere aos métodos de genética e estatística utilizados para seleção de genótipos superiores, destacam-se os métodos derivados da teoria de seleção direta, seleção indireta e por índice de seleção, o método de seleção combinada e o método REML-BLUP, dentre outros. Apesar das diversas metodologias disponíveis para a seleção de genótipos superiores, ainda é comum e necessário praticar seleção de indivíduos em relação a características com baixa confiabilidade de predição do valor genotípico a partir de um valor fenotípico dado pela média fenotípica corrigida ou ajustada em função da agregação de informações de parentes, de caracteres correlacionados ou de práticas de redução do efeito ambiental. No final, considera-se esta média fenotípica ajustada como a medida mais apropriada para indicar a superioridade genética e predizer o ganho genético. No entanto, tais modelos ou procedimentos não contemplam uma infinidade de outras informações estatísticas de grande relevância, diferentes da média fenotípica que é usualmente adotada, mas que agregam informações importantes acerca do genótipo avaliado e que têm sido deixadas à margem dos estudos envolvendo melhoramento genético e critérios de seleção. Neste contexto, as redes neurais artificiais constituem novo paradigma que tem sido empregado, ainda que de forma tênue, nos programas de melhoramento genético animal e vegetal. Essa abordagem, diferentemente das modelagens estocásticas utilizadas até então, é baseada nos princípios de aprendizado e de inteligência computacional de um conjunto amplo de informação do desempenho do genótipo envolvendo médias, máximos, mínimos, variância e toda ordem de informação possível de ser direta ou indiretamente mensurada. Assim, ao contrário dos métodos estatísticos que resumem as informações ou realizam a simplificação estrutural dos dados, as redes neurais, à semelhança do cérebro humano, captam toda informação disponível para gerar um critério de tomada de decisão. Assim, este trabalho foi realizado com o intuito de utilizar as redes neurais para melhorar a acurácia na predição de valores e ganhos genéticos, através de uma discussão de seus fundamentos teóricos e utilização de dados simulados, com mesma caracterização em termos de média, herdabilidade e coeficiente de variação dos dados reais, fornecendo um método alternativo para identificação de genótipos superiores.

Made available in DSpace on 2016-12-08T16:24:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 PGCV06MA014.pdf: 2536288 bytes, checksum: 2ced4e5eb18884533f8a66a86da4f665 (MD5) Previous issue date: 2006-07-04 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Aujeszky s disease (AD) is an infect-contagious illness that causes serious economical damages to the producer and the swine industry. Aiming to develop mechanisms and to improve technologies that are faster, more sensitive and more specific for diagnosis and for use in free areas or in AD s eradication programs, the sequence codifier of the glycoprotein E (gE) of Aujeszky s disease virus (ADV) was amplified, cloned and expressed. Through genetic engineering the sequence of the gE gene was propagated in an host organism. The gE was amplified by the technique of polimerase chain reaction (PCR), cloned in the vector pGem®-T Easy and transformed in competent cells of Escherichia coli, DH-5a . The clone obtained was sub-cloned in the expression plasmid pFastBac 1, which contains the promoter gene of the polyhedrin. The obtained subclone was analyzed inside for certification of its correct plasmid orientation with the restriction endonucleases BamH I and EcoR I. The sub-clone with the correct orientation had its DNA extracted and used for transposition inside the bacmid (recombinant baculovirus and helper plasmid with competent DH10Bac cell). Colonies with inserted gE were selected by the phenotype of the colony, which expresses white color when cloned. White recombinant colonies had their DNA extracted and used for cotransfection in insect cells Trichoplusia ni (BTI-Tn5B1-4). The recombinant-gE baculovirus was inoculated in cultured cells and expressed the recombinant gE by PCR and Western blotting . The recombinant-gE baculovirus containing only the gE gene of the VDA will be used for antigen and monoclonal antibodies production, which will aid in the development of a more sensitive, specific and safer for the use in VDA free regions / A doença de Aujeszky (DA) é uma enfermidade infecto-contagiosa que causa graves prejuízos econômicos ao produtor e à agroindústria suinícola. Com o objetivo de desenvolver insumos e aprimorar tecnologias que sejam mais rápidas, sensíveis e específicas de diagnóstico para uso em regiões livres ou em erradicação da DA, a seqüência codificadora da glicoproteína E (gE) do vírus da doença de Aujeszky (VDA) foi amplificada, clonada e expressada. Através da engenharia genética a seqüência do gene da gE foi propagada em um organismo hospedeiro. A gE foi amplificada pela técnica da reação em cadeia da polimerase (PCR) , clonada no vetor pGem®-T Easy e transformada em células competentes de Escherichia coli, DH-5a . O clone obtido foi subclonado no plasmídeo de expressão pFastBac 1, o qual possui o sítio promotor do gene da poliedrina. O subclone obtido foi analisado para certificação de sua orientação correta dentro do plasmídeo com as endonucleases de restrição BamH I e EcoR I. O subclone com a orientação correta teve seu DNA extraído e usado para a transposição dentro do bacmid (baculovírus recombinante e plasmídeo helper em célula competente DH10Bac ). As colônias com inserto gE foram selecionadas pelo fenótipo da colônia, a qual expressa cor branca quando clonada. As colônias brancas recombinantes tiveram seu DNA extraído e usado para a co-transfecção em células do inseto Trichoplusia ni (BTITn5B1- 4). O baculovírus gE-recombinante ao ser inoculado em cultivo celular, expressou a gE recombinante, comprovada pela técnica de PCR e Western blotting . O baculovírus gE-recombinante contendo apenas o gene da gE do VDA será utilizado para produção de antígeno e de anticorpos monoclonais, o que auxiliará no desenvolvimento de um teste de diagnóstico mais sensível, específico e mais seguro para uso em áreas livres do VDA

Submitted by Geandra Rodrigues (geandrar@gmail.com) on 2018-01-08T14:33:50Z No. of bitstreams: 1 gustavotorresdesouza.pdf: 5085443 bytes, checksum: eada917698a8738ea1947743e940692c (MD5) / Approved for entry into archive by Adriana Oliveira (adriana.oliveira@ufjf.edu.br) on 2018-01-23T11:05:29Z (GMT) No. of bitstreams: 1 gustavotorresdesouza.pdf: 5085443 bytes, checksum: eada917698a8738ea1947743e940692c (MD5) / Made available in DSpace on 2018-01-23T11:05:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 gustavotorresdesouza.pdf: 5085443 bytes, checksum: eada917698a8738ea1947743e940692c (MD5) Previous issue date: 2017-08-08 / CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / O advento sistema CRISPR/Cas9 tornou o processo de edição gênica consideravelmente mais fácil e direto, uma vez que retirou empecilhos técnicos relacionados aos sistemas já disponíveis. Desta forma, foram permitidos diversos avanços no entendimento da função de elementos genômicos, assim como a produção de embriões geneticamente modificados com diversas finalidades. O atual trabalho objetivou a edição gênica no gene da beta-lactoglobulina em células somáticas bovinas objetivando a produção futura de embriões da espécie geneticamente modificados. Considerando-se que a hipersensibilidade a essa proteína responde pela maior parte das alergias ao leite bovino, a produção de animais cujo leite não contenha essa molécula é de grande interesse para a indústria de laticínios. Durante os experimentos, foi possível obter uma linhagem de células bovinas MDBK expressando a enzima Cas9 (MDBK-Cas). Usando células MDBK e as células MBDK-Cas foi possível se obter com sucesso edições gênicas no locus beta-lactoglobulina utilizando-se os componentes do sistema CRISPR/Cas9 na forma de mRNA da proteína Cas9 e sgRNAs. Conclui-se que o sistema CRISPR/Cas9 pode ser usado com os sgRNA desenhados neste estudo para editar o gene da betalactoglobulina em células MDBK. Assim, células MDBK podem ser utilizadas como alvo o locus em estudo. Modelos de estudos para edição do genoma bovino. Em vista da escassa literatura constando de trabalhos em que tenha sido feita a edição gênica em embriões bovinos, os dados gerados por esse trabalho colaborarão para o avanço do estado da arte no que diz respeito a engenharia gênica de bovinos e no conhecimento do funcionamento do sistema CRISPR/Cas9. / The advent of the CRISPR / Cas9 system made the process of gene editing considerably easier and more straightforward, since it removed technical impediments related to the systems already available. In this way, several advances were made in the understanding of the function of genomic elements, as well as the production of genetically modified embryos for various purposes. The present work aimed at the genetic editing of the beta-lactoglobulin gene in bovine somatic cells aiming at the future production of genetically modified embryos of the species. Considering that hypersensitivity to this protein accounts for most of the allergies to bovine milk, the production of animals whose milk does not contain this molecule is of great interest to the dairy industry. During the experiments, it was possible to obtain a lineage of bovine MDBK cells expressing the Cas9 enzyme (MDBK-Cas). Using MDBK cells and MBDKCas cells it was possible to successfully obtain gene editions at the beta-lactoglobulin locus using the components of the CRISPR / Cas9 system as mRNA of the Cas9 protein and sgRNAs. It is concluded that the CRISPR / Cas9 system can be used with the sgRNAs designed in this study to edit the beta-lactoglobulin gene in MDBK cells. Thus, MDBK cells can be targeted as the locus under study. Models of studies for editing the bovine genome. In view of the scarce literature consisting of studies in which bovine embryos have been genetically engineered, the data generated by this work will contribute to the advancement of the state of the art regarding the genetic engineering of cattle and the knowledge of the functioning of the system CRISPR / Cas9.

Plantas transgênicas constituem interessantes alternativas para a produção de compostos com elevado valor agregado como polímeros industriais, proteínas farmacológicas e lipídios nutracêuticos. Como candidata à biofábrica, a cana-de-açúcar (Saccharum spp.) apresenta características agronômicas favoráveis, além de versatilidade de matéria-prima, que é empregada em fins tradicionais, como produção de álcool e açúcar, e até mesmo para geração de energia ou como forragem para alimentação de gado. Em nutrição animal, uma molécula bastante estudada é o ácido linoleico conjugado (CLA), que tem atividades anticarcinogênica, antidiabética, antiaterosclerose e moduladora do sistema imune e metabolismo de lipídios. O isômero t10,c12- CLA tem sido particularmente promissor na agropecuária por conta de inibição da síntese de gordura do leite e na melhoria do desempenho reprodutivo de vacas. Com o objetivo de avaliar a cana-de-açúcar como sistema biotecnológico para produção de CLA, o gene da isomerase do ácido linoleico de Propionibacterium acnes (pai) foi isolado e clonado, previamente caracterizado em Escherichia coli e, em seguida, utilizado na biolística de calos embriogênicos para regeneração de plantas transgênicas. No sistema procariótico, foi induzida a expressão de pai e a proteína heteróloga foi verificada como uma banda de 50 kDa, porém não houve alteração evidente do perfil de ácidos graxos da bactéria. Na cotransformação de cana-de-açúcar, o vetor pHA9, que contém o gene de seleção da neomicina fosfotransferase (nptII), foi bombardeado com uma das duas construções desenvolvidas com o promotor da poliubiquitina 1 de milho (pUbi1) dirigindo a expressão de pai adicionado ou não de sequência sinal da proteína de reparo de DNA recA para direcionamento para cloroplasto. Das cultivares CTC2 e IACSP9303046, foram obtidas eficiências de transformações de 2,2% e 1,7-7,1%, respectivamente. Um total de 156 plântulas foram regeneradas após regime de seleção com geneticina. Em seguida, 115 plântulas transgênicas foram identificadas por PCR para nptII e, entre essas, 29 e 48 foram PCRpositivas para pai e rec-pai, respectivamente. De 50 plantas aclimatizadas, 12 foram analisadas por Southern blot para nptII e 4 para pai, confirmando-se a transformação genética. Para comprovar a expressão de mRNA de pai, 27 plantas foram averiguadas por RT-PCR e RT-qPCR e indicaram produção de transcritos estudados. A análise de expressão das proteínas de folha por Western blot em 21 plantas selecionadas não produziu resultados conclusivos quanto à detecção de PAI. Essas mesmas foram analisadas por Cromatografia Gasosa, mas não foi detectado acúmulo de CLA. Embora seja possível a introdução e expressão do gene pai em cana-de-açúcar, é necessário avaliar em maior detalhe os fatores que possam afetar positivamente a produção de CLA, como tipo de tecido, compartimentos subcelulares para direcionamento proteico ou coexpressão de fosfolipases. / Transgenic plants are attractive alternatives for the production of high value compounds as industrial polymers, pharmacological proteins and nutraceutical lipids. As a candidate for biofactory, sugarcane presents favorable agronomic characteristics and versatility of raw material which is used for traditional purposes such as ethanol and sugar production and even for power generation or as forage feeding of cattle. In animal nutrition, a widely studied molecule is the conjugated linoleic acid (CLA), which has anticarcinogenic, antidiabetic, antiatherosclerosis and immune system and metabolism of lipids modulator activities. The isomer t10,c12-CLA has been particularly promising in agriculture because of inhibition of milk fat synthesis and improvement of the reproductive performance of cows. Aiming to evaluate the sugarcane as a system for biotechnological production of CLA, the linoleic acid isomerase gene from Propionibacterium acnes (pai) was isolated and cloned, previously characterized in Escherichia coli and then used for biolistic of embryogenic calli for regenerating transgenic plants. In the prokaryotic system, the expression of pai was induced and the heterologous protein was verified as a band of 50 kDa, but there was no obvious change in fatty acid profile of the bacterium. In cotransformation of sugarcane, pHA9 vector containing the selection gene neomycin phosphotransferase (nptII) was bombarded with one of the two constructions developed with the promoter of maize polyubiquitin 1 (pUbi1) driving the expression of pai, either added or not with the signal sequence of DNA repair protein recA for targeting to chloroplast. Cultivars CTC2 and IACSP93-3046 were obtained with transformation efficiencies of 2.2% and 1.7 a 7.1%, respectively. A total of 156 plantlets were regenerated after selection with geneticin regimen. After that, 115 transgenic plantlets were identified by PCR for nptII and among then, 29 and 48 were PCR-positive for pai and rec-pai, respectively. Of 50 acclimatized plants, 12 were analyzed by Southern blot for nptII and 4 for pai, confirming the genetic transformation. In order to prove the expression of pai mRNA, 27 plants were verified by RT-PCR and RT-qPCR and indicated the production of the studied transcripts. Expression analysis of leaf proteins by Western blot in 21 plants selected produced no conclusive results regarding the detection of PAI. Those were analyzed by gas chromatography and no accumulation of CLA was detected. Although it was possible to introduce and express the pai gene in sugarcane, it is necessary to evaluate in more detail the factors that may positively affect the production of CLA, as tissue type, subcellular compartments for protein targeting or coexpression of phospholipases.

A indústria dos citros é de grande importância econômica e social para o Brasil, que é considerado o maior produtor e exportador de suco concentrado de laranja do mundo. Porém, sérios problemas relacionados a doenças têm afetado a produção e qualidade dos citros. Com o desenvolvimento da engenharia genética e a clonagem de genes relacionados à resistência a doenças em plantas, a transformação genética têm se mostrado uma ferramenta auxiliar a programas de melhoramento genético de citros. O objetivo deste trabalho foi a obtenção de plantas transgênicas de laranja doce das variedades ‘Hamlin’, ‘Valência, ‘Natal’ e ‘Pêra’ expressando o gene hrpN, sob o controle do promotor Pgst1, induzível pelo patógeno. A avaliação da resposta de plantas transgênicas da variedade ‘Hamlin’ contra o agente causal do cancro cítrico, a bactéria Xanthomonas axonopodis pv. citri, também foi realizada. Segmentos de epicótilo foram transformados via Agrobacterium tumefaciens, e selecionados em meio de cultura suplementado com canamicina ou gentamicina. A transformação genética foi confirmada por PCR e Southern blot. A transcrição do gene foi avaliada por RT-PCR e a produção da proteína harpina foi analisada por western blot. A eficiência de transformação variou de 2,7 e 6,2% de acordo com a variedade de laranja. Algumas linhagens de plantas transgênicas apresentaram desenvolvimento anormal, não permitindo a realização da análise por Southern blot nem a multiplicação por enxertia. Plantas de laranja ‘Hamlin’ foram propagadas por enxertia e avaliadas para resistência a Xanthomonas axonopodis pv. citri. Todas as linhagens apresentaram redução na severidade dos sintomas causados pela bactéria X. axonopodis pv. citri, avaliados 30 dias após a inoculação. / The citrus industry has a great economic and social importance for Brazil, which is considered largest producer and orange juice exporter in the world. However, serious problems related to pathogens have affected citrus production and quality. With the development of genetic engineering and the characterization of genes related with plant disease resistance, the genetic transformation became an important tool in citrus breeding programs. The objective of this work was the production of transgenic plants of four sweet orange cultivars ‘Hamlin’, ‘Valencia’, ‘Natal’ and ‘Pera’ expressing hrpN gene under the control of Pgst1 inducible promoter. The evaluation of ‘Hamlin’ sweet orange transgenic plants infected with the causal agent of citrus canker, Xanthomonas axonopodis pv. citri was carry out. Epicotyl segments were inoculated with Agrobacterium tumefaciens, and selected in a culture medium supplemented with kanamycin or gentamycin. The genetic transformation was confirmed by PCR and Southern blot analysis. The gene transcription was evaluated by RT-PCR and the production of harpin protein was detected by western blot. The genetic transformation efficiency varied from 2,7% to 6,2% depending on the cultivar. Some transgenic lines had abnormal development, not allowing performing Southern blot analysis or multiplication by grafting. Plants of ‘Hamlin&#146 sweet orange were propagated by grafting and evaluated for Xanthomonas axonopodis pv. citri resistance. All tested plants presented reduction in the severity of the symptoms caused by bacterium X. axonopodis pv. citri 30 days after the inoculation.

A produção vegetal é dependente do processo fotossintético. As técnicas de biologia molecular e transformação genética de plantas trouxeram boas perspectivas para a alteração do metabolismo fotossintético. Plantas transgênicas de tabaco (Nicotiana tabacum, L.) que superexpressam o gene quimérico Lhcb1*2 de ervilha têm sido estudadas por apresentarem uma série de alterações no desenvolvimento e no metabolismo fotossintético, em relação à linhagem selvagem. Vários autores observaram mudanças morfológicas, fisiológicas, bioquímicas e adaptativas que favorecem essas plantas em diversas condições de cultivo. O objetivo desse trabalho foi o de avaliar o impacto da superexpressão desse gene na formação plastidial de plântulas de tabaco germinadas e mantidas no escuro por sete dias e depois transferidas à luz, com coletas periódicas de 0, 6, 18 e 120 horas pós-iluminação. O desenvolvimento plastidial, avaliado por microscopia de luz, mostra um provável adiantamento na formação dos cloroplastos dos materiais vegetais transgênicos (TR1 e TR2) em relação à selvagem (WT). A análise de ultraestrutura dos plastídios por microscopia eletrônica de transmissão, demostrou um real adiantamento na formação dos cloroplastos maduros nas duas linhagens transgênicas A análise de Western blot confimou a presença de proteínas específicas do fotossistema II (Lhcb 1-2 e D1). Este fato implica que a montagem do aparato fotossintético é antecipada nos transgênicos, assim como o desenvolvimento morfológico e estrutural observado nos plastídios. / The vegetal production is strictly dependent on the photosynthetic process. Techniques of molecular biology and genetic transformation of plants brought good perspectives for the alteration of the photosynthetic metabolism. Transgenic tobacco plants (Nicotiana tabacum, L.) which express the chimeric pea Lhcb1*2 gene were pbtained and presenta series of alterations on development and photosynthetic metabolism in relation to the wild type. Previous analysis have demonstrated morphological, physiological, biochemical and adaptative changes that favour these transgenic lines in various conditions of culture. The aim of this work was to evaluate the impact of the expression of this gene in the plastid formation, of tobacco seedlings. Seeds were germinated and kept in darknes for seven days, and transferred to light. The seedlings were then collected after 0, 6, 18 and 120 hours of exposure to continuous ilumination. The plastidial development evaluated by light microscopy, showed an advanced chloroplast formation of the transgenic lines (TR1 and TR2) in relation to the wild type (WTSR1). The ultrastructural analysis of the plastids by electronic microscopy showed, indeed on advanced formation of mature chloroplasts in the transgenic lines. The Western blot analysis confirmed the presence of two specific proteins (CAB and D1), of the photosystem II. This fact implies that the assembly of the photosynthetic apparatus might occurs earlier in the transgenic lines, as well as the morphological and structural development of the plastids.

Orientador: Gonçalo Amarante Guimarães Pereira / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-24T00:00:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Prause_AndreRichard_D.pdf: 4277553 bytes, checksum: d91469a30bbec7480bb60a683266a0af (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: Com o aumento da busca por novas fontes renováveis para a substituição do petróleo fóssil como substrato de derivados petroquímicos, as indústrias de plásticos, atualmente um dos ramos mais dependentes da acessibilidade do petróleo, já alcançaram um nível alto de sustentabilidade em linhas de polímeros verdes. Porém, rotas verdes para a obtenção do produto final ainda não foram implantadas industrialmente, sendo que somente precursores dos monômeros desejados são produzidos. A partir desses precursores, o processo é continuado convencionalmente através de operações químicas até a obtenção do monômero. O desenvolvimento de uma rota enzimática para esses monômeros pode ser uma alternativa para os processos praticados na indústria. Enzimas são amplamente utilizadas para a bio-conversão industrial de compostos químicos e a busca por enzimas capazes de catalisar novas reações tem se intensificado, criando uma demanda maior por processos automatizados com aplicação de protocolos de rastreamento de alto desempenho. Para a realização da produção enzimática de alcenos de cadeia curta, uma enzima nativa, apresentando um mecanismo catalítico similar à reação desejada, foi modificada pela aplicação do conceito de "desenho de proteínas", que reúne técnicas de diversificação, recombinação, clonagem, expressão heteróloga e rastreamento, utilizando a "enzima molde" como ponto de partida. A enzima P450BS?, selecionada por apresentar os melhores pré-requisitos para modificações estruturais, foi submetida ao "desenho de proteínas", gerando 5.271 versões mutantes. O rastreamento de alto desempenho automatizado dessas proteínas alteradas, utilizando uma plataforma robótica, possibilitou a obtenção de uma enzima que apresenta a nova ação catalítica da conversão de 100 ?M de ácido octanóico para 2,6 ?M de 1-hepteno. Essa nova enzima abre o caminho para a produção industrial de "bio-alcenos" em micro-organismos, criando um sistema de fermentação que poderia sustentar uma rota verde para os monômeros necessários para a produção de plásticos. / Abstract: With the increased search for renewable resources for substituting fossil petroleum as the raw material for petrochemical products, the plastics industry, currently being one of the branches with the highest dependency on petroleum availability, already reached a high level of sustainability in their green polymer lines. Still, green routes producing the final product have not been implemented industrially and only precursors of the desired are being produced. Using these precursors, the process is continued conventionally, using chemical operations for the production of the monomers. The development of an enzymatic route toward these monomers could be an alternative for current industrial processes. Enzymes are widely used in industrial bioconversion of chemicals and the search for enzymes with the potential of catalyzing new reactions has intensified, creating a higher demand for automatized processes for the application of high-throughput screening protocols. In order to realize the enzymatic production of short-chained alkenes, a native enzyme, presenting a catalytic mechanism similar to the target reaction, was modified, applying the concept of "protein design", which unites diversification, recombination, cloning, heterologous expression and screening techniques, utilizing the "template enzyme" as a starting point. The enzyme P450BS?, selected for possessing the best prerequisites for structural modifications, was submitted to "protein design", creating 5,271 mutant versions. Automatized high-throughput screening of these altered proteins, utilizing a liquid handling platform, enabled the discovery of an enzyme, which presents a new catalytic action: the conversion of 100 ?M butyric acid to 2.6 ?M 1-heptene. This new enzyme opens the way for the industrial production of "bio-alkenes" in microorganisms, creating a fermentation system, which would be able to sustain a green route toward the necessary monomers for the production of plastics. / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Recentes estudos genômicos têm mostrado que vários fungos e bactérias possuem um potencial biossintético superior à quantidade de me tabólitos secundários já isolados desses micro-organismos. A descoberta de produtos naturais inéditos e bioativos é limitada pela impossibilidade dos micro-organismos expressarem to das as suas rotas biossintéticas em laboratório. Assim, estratégias alternativas para i nduzir a produção de produtos naturais microbianos são necessárias. A utilização de cultur as mistas de micro-organismos é uma estratégia que vem sendo recentemente utilizada, na tentativa de mimetizar condições mais naturais de crescimento. Além disso, a adição de mo duladores químicos e epigenéticos às culturas microbianas também pode potencialmente est imular a produção de compostos de interesse, seja por ativar mecanismos celulares em resposta à condição de estresse, ou por alterar a taxa de transcrição de certos genes, em f unção de mudanças no grau de enovelamento da cromatina. Alternativamente, a indu ção de certos genes, e até mesmo a diversificação do metabolismo secundário, podem ser conseguidos através de engenharia genética, pela manipulação direta de genes de inter esse. A linhagem endofítica Alternaria tenuissima SS77, selecionada para os experimentos de modulaçã o química e epigenética, teve seu metabolismo secundário alterado após o tra tamento com diferentes moduladores. Provavelmente, o efeito observado ocorreu em função de uma eliciação inespecífica dos diferentes moduladores. Além disso, o cultivo misto desse fungo com o fungo endofítico Nigrospora sphaerica SS67 , isolada da mesma planta hospedeira ( Smallanthus sonchifolius ), levou ao isolamento de dois novos policetídeos, da classe das perilenequinonas, juntamente com um já relatado na literatura científica. Para r ealizar os cultivos microbianos mistos, envolvendo uma linhagem bacteriana e uma fúngica, t rês linhagens de actinobactérias e cinco de fungos, todos endofíticos da planta Lychnophora ericoides , foram selecionadas. Alterações no perfil metabólico da cultura mista de Phomopsis sp FLe6 com Streptomyces albospinus RLe7 foram as mais evidentes e por isso a maioria das investigações foram focadas nessa cultura mista. Várias condições de cu ltivo foram testadas e diferentes resultados foram obtidos. Em alguns casos, o desenv olvimento da linhagem fúngica foi inibido pela bacteriana, e em outros, foi observado o inverso. Da mesma forma, houve acentuada inibição da produção de alguns metabólito s secundários na presença da linhagem desafiadora, mas também foi verificada a eliciação de outros. Os extratos das culturas simples desses micro-organismos também apresentaram relativas alterações nos perfis metabólicos em função das condições de cultivo. Os metabólitos produzidos pelo fungo Phomopsis sp FLe6 e pela actinobactéria Streptomyces albospinus RLe7 foram isolados e caracterizados. Os resultados mostram que as intera ções entre os micro-organismos endofíticos são bastante complexas, estando sujeita s a ação de diversos fatores externos que muitas vezes não podem ser pré-determinados. Po r isso, estabelecer um cultivo misto adequado, do ponto de vista da eliciação da produçã o de metabólitos secundários, pode requerer uma série de tentativas. Ainda assim, os r esultados almejados podem ser conseguidos utilizando essa estratégia. Diferenteme nte das linhagens endofíticas, manipuladas quimicamente através de diferentes estr atégias, a linhagem sequenciada de Fusarium heterosporum ATCC 74349, foi manipulada geneticamente para a co nstrução de um gene biossintético híbrido pks-nrps , contendo a porção nrps do gene híbrido da equisetina e um pks críptico de Aspergillus fumigatus . Era esperado que a linhagem hibridizada fosse capaz de produzir o metabólito se cundário geneticamente planejado, entretanto, após seu cultivo, esse produto não foi detectado nos extratos, e as possíveis razões são discutidas. Ainda que os resultados espe rados não tenham sido obtidos, estudos que contribuam para a ampliação do entendimento das megassintases fúngicas são de extrema valia. / Recently, genetic studies have shown that several b acteria and fungi hold a greater biosynthetic potential than the amount of secondary metabolites isolated from these microorganisms. The discovery of novel bioactive na tural products is limited by the inability of microorganisms to express all their biosynthetic pa thways in laboratory conditions. Therefore, alternative strategies to induce the production of microbial natural products are required. Mixed cultures of microorganisms are a strategy tha t has been used to mimic more natural conditions of growth. Furthermore, the addition of chemical and epigenetic modulators to the microbial cultures can also stimulate the productio n of compounds by activating cellular mechanisms in response to stress conditions or by c hanging the transcription rate of certain genes, due to changes in the chromatin folding. Alt ernatively, the induction of some genes, and even the diversification of secondary metabolis m, can be achieved by genetic engineering, by manipulating genes of interest. The endophytic strain Alternaria tenuissima SS77, which was selected for the experiments of che mical and epigenetic modulation, had changed its secondary metabolism after treatment wi th different modulators. Probably, the observed effect was due to a nonspecific elicitatio n of those modulators. Moreover, the mixed cultures of this fungus with the endophytic fungus Nigrospora sphaerica SS67, isolated from the same host plant ( Smallanthus sonchifolius ), led to the isolation of two new polyketides, belonging to perylene quinone class, along with ano ther one already reported in the scientific literature. Three strains of actinobacteria and fiv e fungi, all endophytes of Lychnophora ericoides , were selected to grow in microbial mixed cultures comprising one bacteria and one fungus. Changes in the metabolic profile of the mix ed culture of Phomopsis sp. FLe6 with Streptomyces albospinus RLe7 were the most obvious, and then further studi es were focused on this mixed culture. Many culture conditions were analyzed and different results were obtained. In some cases, the development of the fun gal strain was inhibited by bacteria, and in other cases was observed the opposite. Similarly , there was a remarkable inhibition of the production of certain secondary metabolites in the presence of the challenging strain, but the eliciting of others was also observed. The extracts of the single cultures of these microorganisms also showed changes in metabolic pro files due to culture conditions. The metabolites produced by the fungus Phomopsis sp. FLe6 and the actinobacteria S. albospinus RLe7 were isolated and characterized. The results show that interactions between endophytic microorganisms are quite complex and are influenced by various external factors that often can not be previously determined. Theref ore, establishing a suitable mixed culture to elicit the production of secondary metabolites m ay require some attempts. Still, the expected results can be achieved using this strateg y. Unlike the endophytic strains, that was chemically manipulated by different strategies, the sequenced strain Fusarium heterosporum ATCC 74349 was genetically manipulated to construct a hybrid PKS-NRPS biosynthetic gene containing the NRPS portion of the hybrid gene of e quisetin and a cryptic PKS gene of Aspergillus fumigatus . It was expected that hybridized strain could be a ble to produce the secondary metabolite genetically planned, however, after its cultivation, this product was not detected in any extracts, and some possible reasons are discussed. Although the expected results have not been obtained, studies that contri bute to increasing the understanding of fungal megasynthases are extremely valuable

Made available in DSpace on 2016-04-26T20:25:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Fernanda Garcia Escane.pdf: 10577423 bytes, checksum: d657a52e1d8f512f4aea237929afa9c6 (MD5) Previous issue date: 2007-05-08 / This study intends to analyze the biosafety law allowing genetic engineering with human biological material, more precisely human embryos generated in laboratories. Chapter I discusses the concepto of life according to science, law and ethics in view of the understanding prevailing in science and law. Chapter II approaches the right to life as seen by the Brazilian Federal Constitution and the principles on which it lies. There is no other right more valuable or important than that to life, all the more so because without it any other fails to deserve protection or even to stand by itself, dependent as they are on the right to life. In chapter III the definition of embryo and unborn child are introduced and a lengthy discussion about personality rights is tackled. Focus is laid on the protection due to the life of embryos and the menace represented by the continuous manipulation of scientists. Chapter IV analyses the biosafety law authorizing embryos to become object of research and therapy and the disregard of scientific parameters determining the inception of life at the exact moment of conception. Finally, chapter V considers the civil liability of those dealing with embryos, given that law must protect life to the fullest, whichever stage it might be, clear from any sort of prejudice may look, because life is not relative: it either exists or does not / Este trabalho tem por objetivo analisar a Lei de Biossegurança que permite a engenharia genética com material biológico humano, mais precisamente, com os embriões humanos, criados em laboratório. No capítulo I, o objetivo é delinear o conceito de vida, pautado pela ciência, pelo direito e pela ética, considerando o entendimento que prevalece na ciência e no direito. No capítulo II, define-se o direito à vida em face da Constituição Federal e o os princípios que o norteiam, dado que não existe nenhum outro bem mais valioso ou importante do que o direito à vida. Sem ela, por força de lógica, desaparece o respaldo a qualquer outro, visto que nenhum deles sobrevive sem a vida, existindo tão-somente por decorrência dela. No capítulo III, definem-se embrião e nascituro e abordam-se os direitos da personalidade, destacando o direito à vida, que deve ser protegida em sua amplitude, independentemente da maneira pela qual se origina, haja vista a possibilidade atual de manipulação do homem. No capítulo IV, analisa-se a Lei de Biossegurança, que autoriza sejam os embriões objeto de pesquisa e terapia, desconsiderando os parâmetros científicos que demonstram iniciar-se a vida no exato momento da concepção. Por fim, o capítulo V destina-se a observar a responsabilidade civil de todos os que lidam com o embrião, já que compete ao direito proteger integralmente a vida, qualquer seja seu estágio, desvinculando-se de todo preconceito, ainda que insignificante na aparência. A vida não é relativa: ou existe ou não