Made available in DSpace on 2016-05-16T12:53:22Z (GMT). No. of bitstreams: 2 eliame_confort_ipec_dout_2009.pdf: 1662597 bytes, checksum: 2845404a7d2a515a0ca6f5220b3ccd21 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2009 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Nacional de Infectologia Evandro Chagas. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Avaliou-se o ensaio imunoenzimático indireto (ELISA) com antígeno de Leishmania (V.) braziliensis para a investigação diagnóstica da leishmaniose tegumentar americana (LTA) em suas modalidades cutânea (LC) e cutâneomucosa (LCM) e avaliação da resposta terapêutica a partir de amostras de soro de pacientes atendidos no Instituto de Pesquisa Clínica Evandro Chagas (IPEC). O grupo I, LTA (n=153) foi formado com amostras de soros de pacientes com pelo menos um resultado positivo nos exames parasitológicos ou na reação em cadeia da polimerase (PCR), e o grupo II, controle (n=103), com amostras de indivíduos representativos da população do estudo, com suspeita inicial de LTA, mas com outro diagnóstico confirmado. As seguintes informações foram obtidas dos prontuários: avaliação clínica, dermatológica otorrinolaringológica; intradermorreação de Montenegro IDRM; pesquisa de Leishmania por exame direto e histopatológico, isolamento em meio de cultura, PCR e exames diretos com colorações especiais, inoculação em meios de cultura para fungos e micobactérias. As amostras foram obtidas nas fases de investigação diagnóstica e pós-tratamento em períodos definidos até dois anos. Comparou-se a sensibilidade do ELISA com a de cada um dos métodos parasitológicos, PCR e com a IDRM. Para avaliação da resposta terapêutica, amostras de 75 pacientes que se mantiveram com as lesões cicatrizadas durante o período do estudo constituíram o subgrupo cura terapêutica (ICT) e aquelas de 31 pacientes com recidivas constituíram o subgrupo recidiva pósterapêutica (IRT). A confiabilidade do teste avaliado pelo coeficiente de correlação intraclasse foi de 0,953 (IC 95%) Encontrou-se sensibilidade de 94,7%, especificidade de 95,1% e valores preditivos, positivo e negativo de 96,6% e 92,4% respectivamente. Não houve diferença com significância estatística entre as sensibilidades encontradas no ELISA, na PCR e na IDRM (CI= 95%, qui-quadrado pvalor= 0,140 e p-valor=0,498). O mesmo não ocorreu com os demais métodos parasitológicos (p-valor<0,001). A análise da resposta humoral à terapia demonstrou haver redução da resposta de anticorpos nos pacientes do subgrupo ICT significativamente menor aos seis meses após o tratamento (Wilcoxon; pvalor= 0,016) com 51,8% de pacientes não reatores ao final de dois anos após a terapia. Os demais se encontravam fracamente reatores. Ao contrário, no subgrupo IRT, houve pequena redução seguida de elevação dos valores de densidade otica atingindo patamares mais elevados na ocasião da recidiva. Comparando-se estes subgrupos (ICT e IRT) quanto à intensidade das reações e frequencia de reatores, em cada ponto do acompanhamento, encontraram-se diferenças a partir do sexto mês após a terapia e a cura clínica (Mann-Whitney; p-valor=0,046 e p-valor 0,009). Os resultados demonstram um bom desempenho do ELISA no diagnóstico diferencial de LTA e na avaliação da resposta terapêutica / Indirect Enzyme Immunoassay (EL ISA) was evaluated with Leishmania (V.) braziliensis antigen to the diagnostic workup of American Tegumentary Leishmaniasis (American Tegumentary Leishmaniasis - ATL ) in their cutaneous (CL) and mucocutaneous (MCL) modalities, and about the therapeutic res ponse from samples of serum from patients at the Instituto de Pesquisa Clínica Evandro Chagas (IPEC). Group I , ACL (n = 153) was formed with sera samples of patients with at least one positive result in parasitological examinations or in polymerase chain r eaction (PCR), and group II , control (n = 103), with samples of individuals representative of the study population, with initial suspicion of ACL, but with other confirmed diagnosis. The following information was obtained from medical records: clinical, de rmatological, and otorrinolaringology evaluation; measure in mm of Montenegro intradermoreaction (IDRM); search for Leishmania by direct examination and histopathology, isolation in culture media, PCR and direct examination with special staining and inocul ation in culture media for fungi and mycobacteria. Samples were obtained during the diagnostic workup and after treatment, in periods defined as up to two years. We compared the sensitivity of the ELISA with each of the individual parasitological methods, the PCR, and the IDRM. To evaluate the therapeutic response, samples of 75 patients who remained with the lesions healed during the study period were the therapeutic healing subgroup ( ICT ) and those 31 patients with recurrences were the post - therapy relaps e subgroup ( IRT ). The reliability of the test assessed by the intraclass correlation coefficient was 0.953 (95% CI). We found a sensitivity of 94.7% and 95.1% specificity, and positive and negative predictive values of 96.6% and 92.4%, respectively. There was no statistically significant difference between the sensitivities found in ELISA, PCR and IDRM (95% CI, Chi - square p - value = 0.140 and p - value = 0.498). The same did not happen with the remainder parasitological methods ( p - value <0.001). The analysis o f the humoral response to therapy have demonstrated a decrease of the antibody response in patients of subgroup ICT , significantly lower at six months after treatment (Wilcoxon; p - value = 0.016), with 51.8% of patients non reactors at the end of two years after the therapy. The others remained mild reactors. Contrarily, in subgroup IRT, a small reduction of the intensity of the reactions, was followed by the increase in the values of optical density that reached higher levels during recidive. Analyzed toget her, the results of samples from the IRT subgroup were significantly higher than those from the ICT subgroup (Mann - Whitney; p - value <0.0001). The intensity of reactions and the frequency of reactors there were reduce from the six months after the therapia sustaining this thendency afther the clinical cure. When comparing the intensity of reactions and frequency of reactors in each point of follow - up there were differences from the sixth month of therapy and clinical cure (Mann - Whitney; p - value = 0.046 and p - value 0.009). The results show a good performance of the ELISA in the differential diagnosis of ACL and the assessment of therapeutic response.

Made available in DSpace on 2015-10-06T13:02:46Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-07-17. Added 1 bitstream(s) on 2015-10-06T13:19:32Z : No. of bitstreams: 1 000849010.pdf: 646917 bytes, checksum: 6ff31432c39a9bdc92b648de138b7639 (MD5) / Visceral leishmaniasis (VL) control strategies in Brazil are based on the early detection and treatment of the patients, vector control by insecticide and the serological screening and euthanasia of positive dogs. Thus, canine visceral leishmaniasis (CVL) diagnosis must accurately identify canine reservoir hosts to ensure the efficiency of screening. Considering that the humoral immune response of dogs to natural Leishmania spp. infection is dependent on parasite load, our aim was to evaluate if outcomes of the diagnostic kits currently used in canine seroepidemiological surveys in Brazil (DPP-BioManguinhos™ rapid test and EIA-ELISA Indirect ELISA BioManguinhos™) could be related to the blood parasite loads in dogs. Six hundred and 10 dogs from the VL endemic region of Northwest São Paulo State were sampled for this evaluation. Positivity varied from 15.9 to 68.4% between diagnostic techniques, due to differences in test sensitivity and specificity. Overall, positive dogs had higher mean parasite loads than negative dogs. Nevertheless, the potential of transmission of the negative dogs shall be investigated

Submitted by CAMILA SAID MOREIRA (camilasaid@gmail.com) on 2016-04-12T00:00:59Z No. of bitstreams: 1 Tese Camila.pdf: 1710523 bytes, checksum: 5cf66492ca8a4b6f0378282d6a6c38cd (MD5) / Approved for entry into archive by Felipe Augusto Arakaki (arakaki@reitoria.unesp.br) on 2016-04-13T13:26:27Z (GMT) No. of bitstreams: 1 saidmoreira_c_dr_sjc.pdf: 1710523 bytes, checksum: 5cf66492ca8a4b6f0378282d6a6c38cd (MD5) / Made available in DSpace on 2016-04-13T13:26:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 saidmoreira_c_dr_sjc.pdf: 1710523 bytes, checksum: 5cf66492ca8a4b6f0378282d6a6c38cd (MD5) Previous issue date: 2016-02-17 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / O reimplante tardio de dentes avulsionados é uma realidade dentro dos consultórios odontológicos. Na tentativa de se restabelecer a arquitetura e a função do ligamento periodontal, além de se evitar a anquilose, evitando ou modulando a reabsorção por substituição, a superfície radicular dos dentes avulsionados pode ser tratada com diversas substâncias, dentre elas o EDTA (ácido etilenodiamino tetra-acético) a 17%, sempre visando uma menor chance de ocorrer reabsorção inflamatória e por substituição. Sendo assim, o objetivo deste estudo foi avaliar a eficácia do tratamento de discos da superfície vestibular de raízes de dentes bovinos, com EDTA 17%, com Emdogain® , com ácido hialurônico e com colágeno, através de testes de viabilidade celular, quantificação das citocinas IL-1ß, IL-6, IL-8, IL-10 e TNF-α por ensaio ELISA, além da ilustração por microscopia eletrônica de varredura da adesão dos fibroblastos sobre os discos de dentina. Foram cortados 155 discos de dentina, com 4,5 mm de diâmetro, da face vestibular da superfície radicular de dentes bovinos, previamente raspados ou não com cureta periodontal. Os discos foram regularizados, limpos e autoclavados. Os espécimes foram tratados com as substâncias preconizadas e colocados em placas de 96 poços onde foram semeadas células de culturas primárias de fibroblastos humanos de ligamento periodontal, que ficaram em contato com os discos por 48 horas. A sobrevivência e a viabilidade celular na superfície dos discos foram avaliadas através do ensaio de XTT. A microscopia eletrônica de varredura foi utilizada para verificar a adesão de fibroblastos à superfície dos discos. A detecção e quantificação das citocinas foram realizadas pelo teste ELISA. Os dados foram submetidos à análise estatística pelo teste ANOVA e Tukey (p < 0,05). Os resultados obtidos mostraram que o uso de EDTA 17% por 5 minutos sem agitação foi mais eficaz que os outros protocolos (p < 0,05) e aliado ao ácido hialurônico, foi menos citotóxico promovendo melhor viabilidade celular. Não foi possível assegurar a visualização dos fibroblastos em microscopia eletrônica de varredura. Quanto ao ensaio de ELISA, houve expressão das citocinas IL-1β, IL-6 e IL-8 (citocinas pró-inflamatórias), porém houve diferença estatisticamente significante entre a IL-6 e a IL-8. Sendo assim, podemos concluir que o EDTA 17% por 5 minutos sem agitação e o ácido hialurônico apresentaram menor índice de citotoxicidade aos fibroblastos do ligamento periodontal, porém houve resposta inflamatória pela expressão de IL-6 e IL-8. / The delayed reimplantation of avulsed teeth is a reality in dental offices. In an attempt to restore architecture and function of the periodontal ligament, avoiding ankylosis, preventing or modulating the replacement resorption, avulsed teeth root surface may be treated with various substances including EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) to 17%, always seeking a lower chance of occurring inflammatory or replacement resorption. Thus, the aim of this study was to evaluate the effectiveness of the treatment of discs cutted of the vestibular surface of bovine teeth roots with EDTA 17% with Emdogain® with hyaluronic acid and collagen through cell viability tests, quantification of cytokines IL -1ß, IL-6, IL-8, IL-10 and TNF-α by ELISA assay and, in addition, it was taken Illustrations by scanning electron microscopy of the accession of fibroblasts on the dentin disks. 155 dentin discs with 4,5 mm in diameter will be cut from the vestibular surface of the root surface of bovine teeth, previously scraped or not with periodontal curette. The discs were regularized, cleaned and autoclaved. The specimens were treated with the substances advocated and placed in 96 well plates are seeded in which primary cell cultures of human periodontal ligament fibroblasts that were in contact with the discs for 48 hours. The survival and cell viability on the surface of the disks are evaluated by XTT assay. The scanning electron microscopy was used to verify adherence of fibroblasts to the surface of the discs. Detection and quantification of cytokines were done by ELISA assay. The data were statistically analyzed by ANOVA and Tukey (p < 0.05). The results showed that the use of 17% EDTA for 5 minutes without stirring was more effective than the other protocols (p <0.05) and combined with hyaluronic acid was less cytotoxic promoting better cell viability. It was not possible to ensure the fibroblasts display in scanning electron microscopy. As for the ELISA assay, there was expression of IL- 1β, IL -6 and IL -8 (pro- inflammatory cytokines), but there was just statistically significant difference between IL -6 and IL -8. Thus, we can conclude that 17% EDTA for 5 minutes without stirring and hyaluronic acid showed less cytotoxicity index fibroblasts of the periodontal ligament, but there was inflammatory response by IL -6 and IL-8 expression .

Made available in DSpace on 2015-04-09T12:28:12Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013-01-08Bitstream added on 2015-04-09T12:48:01Z : No. of bitstreams: 1 000814210.pdf: 741951 bytes, checksum: f3cd07eaf72ae06779a4848293410751 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / presente estudo teve por objetivo pesquisar a ocorrência de infecção por Leishmania spp. em 491 cães domiciliados no município de Florianópolis, Santa Catarina, região até então considerada indene para leishmaniose visceral, mas que apresenta notificação de casos autóctones da doença canina no ano de 2011. A soroprevalência na população avaliada foi de 0,4% (2/491) por ELISA indireto e 4,09% (24/491) por RIFI. A concordância entre as técnicas sorológicas foi fraca (k=0,069). Somente um cão apresentou sororeatividade em ambos os métodos sorológicos. No mesmo animal foi amplificado o DNA de Leishmania sp. no sangue total, por PCR convencional e PCR em Tempo Real. Não foi possível realizar o sequenciamento do material amplificado e, deste modo, determinar a espécie de Leishmania envolvida. Os resultados do presente estudo salientam a necessidade de uma investigação epidemiológica minuciosa no município / The aim of the present study was to investigate the occurrence of Leishmania infantum chagasi infection in 491 dogs living in Florianópolis, Santa Catarina, a region considered non-endemic for visceral leishmaniasis, but with notification of autochthonous of canine cases in 2011. The seroprevalence in this population was 0.4% (2/491) by ELISA and 4.09% (24/491) by IFAT. There was a poor agreement between the serological techniques (k = 0.069). Only one dog presented seroreactivity in both serological methods. In the same animal Leishmania sp. DNA was amplified from whole a blood sample by conventional PCR and Real- Time PCR. It was not possible to sequence the amplicons and, thereby, to determine the Leishmania specie involved. The results of this study highlight the necessity of epidemiological investigation in the county / FAPESP: 2010/17168-3

Made available in DSpace on 2015-07-13T12:10:16Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-10-07. Added 1 bitstream(s) on 2015-07-13T12:25:31Z : No. of bitstreams: 1 000836107.pdf: 635760 bytes, checksum: ec2d485fda10942342f695f3a95c00d4 (MD5) / A leishmaniose visceral (LV) é causada por parasitas intracelulares do gênero Leishmania que afeta humanos e várias espécies de animais. Os cães são um dos principais reservatórios urbanos da Leishmania Infantum e desempenham um papel central no ciclo de transmissão para os seres humanos utilizando flebotomíneos. A apoptose de linfócitos está envolvida na regulação da resposta imune da LV, podendo contribuir para uma resposta imune ineficaz porque o mecanismo efetor não reduz a multiplicação do patógeno. Um importante regulador da apoptose é a proteína FAS (Cluster de diferenciação 95 CD95) e proteína ligante FAS-FASL (Cluster de diferenciação 178-CD178), sistema envolvido na baixa regulação de reações imunes mediadas por células T citotóxicas. A proteína FAS é um membro de receptor da superfamília fator de necrose tumoral (TNF) que pode ser expresso na forma transmembrana ou solúvel. Os níveis das proteínas solúvel FAS (sFAS), solúvel FASL (sFASL), e caspase 3 ativa, essa última relacionada a cascata apoptótica, foram determinados por ensaio de ELISA de captura nos extratos do baço de 19 cães sintomáticos apresentando LV moderada e em 6 cães saudáveis. A carga parasitária esplênica foi determinada por PCR em tempo real com amplificação do segmento intergênico espaçador transcrito interno 1 (ITS1) do gene de rRNA do parasita. Foi realizada a correlação entre os níveis de sFAS e sFAS-L com a carga parasitária explênica. Os cães com leishmaniose apresentaram menores níveis de sFAS (p<0,05) e elevados níveis de sFASL e caspase 3 ativa (p<0,05) no baço que os cães saudáveis. Além disso, foi observada correlação negativa entre a carga parasitária e os níveis de sFASL nos cães infectados. Conclui-se que o aumento do sFASL pode estar relacionado com o mecanismo envolvido na eliminação do parasita / Visceral Leishmaniosis (VL) is caused by intracellular parasites of the genus Leishmania that affect humans and several animal species. Dogs are one of the main urban reservoirs of Leishmania infantum and play a central role in the transmission cycle to humans via sandflies. CD3+ cells apoptosis is involved in the immune response in VL. Dysregulation of apoptosis has been implicated in various disease states. An important regulator of apoptosis is the FAS-FAS-associated death domain protein (cluster of differentiation 95-CD95) and FASL-FAS ligand protein (cluster of differentiation 178-CD178) system involved in the down-regulation of immune reactions and in T cell-mediated cytotoxicity. FAS is a member of the tumor necrosis factor (TNF) receptor super family, which can be expressed in transmembrane or soluble forms. The soluble levels of FAS (sFAS), FASL (sFASL) and active Caspase-3, this last related to apoptotic cascade, were investigated in the spleen of 19 symptomatic dogs presenting moderate VL and 6 healthy dogs, determined by ELISA assay. The splenic parasite load was determined by real-time PCR monitoring of amplification of the intergenicinternal transcribed spacer (ITS1) gene of parasite rRNA. sFAS levels were lower (p <0.05) sFASL and active Caspase-3 levels were higher (p<0.05) in dogs with VL compared with controls. Negative correlation was observed between parasite burden and sFASL levels. The increase in sFASL could be related to the mechanism involved in the elimination of the parasite.

Made available in DSpace on 2014-11-10T11:09:53Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-05-08Bitstream added on 2014-11-10T11:57:46Z : No. of bitstreams: 1 000791056.pdf: 1521345 bytes, checksum: 03c061fa4f15b07c0492cc0bf73a460a (MD5) / Os objetivos deste trabalho foram comparar os métodos de diagnóstico por ensaio imunoenzimático (ELISA) de captura e reação em cadeia da polimerase (nested-PCR) à análise morfológica utilizando a técnica de centrífugo-flutuação em água-éter seguida de coloração de Kinyoun modificada (microscopia) para estimar a taxa de eliminação de oocistos de Cryptosporidium spp. na população de gatos domiciliados na zona urbana do Município de Araçatuba, São Paulo. O potencial zoonótico do coccídio isolado em fezes deste hospedeiro foi investigado por meio de caracterização molecular. Um total de 138 amostras fecais foi colhido de forma aleatória simples e proporcional à população de gatos de cada uma das sete áreas censitárias pertencentes à zona urbana do município. Não houve discordância entre ELISA de captura e microscopia (p = 1,0000) nem entre nested-PCR e microscopia (p = 0,1094); entretanto, o grau de concordância variou de substancial (Kappa = 0,7948) a moderado (Kappa = 0,4647), respectivamente, entre estes métodos. Especificidade da nested-PCR e do ELISA de captura foi semelhante; entretanto, a nested-PCR apresentou menor sensibilidade, justificada pela associação entre a intensidade da densidade óptica e a amplificação da subunidade 18S do rRNA. Detectamos oocistos de Cryptosporidium spp. em 9,4% das amostras por pelo menos dois métodos diagnósticos. Com intervalo de 95% de confiança, estimamos que a taxa de eliminação de oocistos desse protozoário na população felina do município variou de 4,5% a 14,3%. Todos os isolados sequenciados apresentaram 100% de similaridade com Cryptosporidium felis. Concluímos que gatos domiciliados possam contribuir para a contaminação ambiental de um município, ainda que C. felis não seja o principal agente etiológico da criptosporidiose em seres humanos / The aim of this work was to compare the diagnostic methods by capture enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and polymerase chain reaction (nested-PCR) to morphological analysis using the technique of flotation in water-ether followed by modified Kinyoun staining (microscopy) to estimate the shedding rate of Cryptosporidium spp. in stool samples of cats domiciled in urban area of municipality of Araçatuba, São Paulo State. Zoonotic potential of coccidian isolated in feces was investigated by molecular characterization. A total of 138 stool samples were collected random and proportionally from to cat population in each of the seven census areas belonging to the urban area. There was no disagreement between capture ELISA and microscopy (p = 1.0000) or between nested-PCR and microscopy (p = 0.1094); however, the degree of agreement varied from substantial (Kappa = 0.7948) to moderate (Kappa = 0.4647), respectively, in these diagnostic methods. Specificity of nested-PCR and ELISA capture were similar; however, the nested-PCR showed lower sensitivity, justified by the association between the intensity of the optical density and amplification of 18S rRNA subunit. We detected Cryptosporidium spp. in 9.4% of the samples by at least two diagnostic methods. With the 95% confidence, we estimate that shedding rate of Cryptosporidium oocysts ranged from 4.5% to 14.3% in the feline population of Araçatuba. All isolates sequenced showed 100% similarity with Cryptosporidium felis. We conclude that cats domiciled can contribute to environmental contamination of a municipality, although C. felis is not the primary etiologic agent of cryptosporidiosis in humans

Made available in DSpace on 2016-06-07T17:12:08Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2015-02-26. Added 1 bitstream(s) on 2016-06-07T17:16:41Z : No. of bitstreams: 1 000860294.pdf: 1568094 bytes, checksum: 044319797056c4a704a1822a33bee13d (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)

Orientador: João Pessoa Araújo Junior / Banca: Luciane Alarcão Dias Melício / Banca: Marcelo de Souza Zanutto / Resumo: O Coronavírus felino (FCoV) é um membro da ordem Nidovirales, família Coronaviridae, gênero Alphacoronavírus, que é responsável por causar a peritonite infecciosa felina (PIF). Dentre os testes sorológicos utilizados no auxílio ao diagnóstico da doença, o método mais sensível e recomendado é o ELISA. O FCoV apresenta características que dificultam seu cultivo celular, sendo necessário o uso de antígenos recombinantes no ELISA. A proteína de nucleocapsídeo (N) do FCoV apresenta vantagens no seu uso como antígeno recombinante em testes sorológicos, por ser conservada, altamente imunogênica, e ser uma das mais produzidas durante a infecção viral. O objetivo deste trabalho foi padronizar e aplicar o ELISA indireto com uso de proteína N recombinante para detectar anticorpos anti-FCoV em soros de gatos naturalmente infectados. Um fragmento de rim de um felino que veio a óbito com PIF foi utilizado para extração de RNA viral, amplificação pela RT-PCR e sequenciamento da proteína N. A sequência da proteína N foi sintetizada com códons otimizados para expressão em Escherichia coli e inserida no plasmídeo pGS21a. Após sua produção, a proteína foi purificada. Foi realizado o Western blott com soro de gato naturalmente infectado para a confirmação da reatividade da proteína. Na padronização do ELISA indireto foi determinada o tipo de bloqueio, concentração de antígeno e diluição dos soros. Trezentos e oitenta e duas amostras de soros felinos foram testadas. Os resultados obtidos mostraram que a proteína produzida apresentou ótima reatividade no ELISA indireto. Foram encontradas diferenças de A450 entre os soros testados, onde se demonstrou uma alta capacidade de discriminação com A450 de 0,1 a 1,8, mostrando que o teste é quantitativo. O ELISA indireto padronizado para detecção de anticorpos anti-FCoV utilizando a proteína N recombinante é um método eficiente e pode ser aplicado em amostras de campo / Abstract: The Feline Coronavírus (FCoV) is a member of the Nidovirales order, Coronaviridae family, Alphacoronavírus genus, which is responsible for causing Feline Infectious Peritonitis (FIP). Among the serological tests used in the disease diagnosis, ELISA is the most sensitive and recommended assay. FCoV has characteristics that difficult their cell culture growing, requiring the use of recombinant antigens in the ELISA. The FCoV nucleocapsid protein (N) is conserved, highly immunogenic and is the most protein produced during viral infection, being a great recombinant antigen in serological tests. The aim of this study was to standardize and apply the indirect ELISA using recombinant N protein to detect anti-FCoV antibodies in sera from naturally infected cats. A kidney fragment of died feline FIP positive was used for extraction of viral RNA, amplification by RT-PCR and sequencing of the protein N. The N protein sequence was synthesized with optimized codons for expression in Escherichia coli and inserted into pGS21a plasmid. The protein was produced, purified and the Western blotting was performed with sera from naturally infected cat to confirm the reactivity of the protein. To indirect ELISA standardization, the antigen concentration, serum dilution and the blocking reagent were determined. Three hundred eighty-two cat's sera were tested. The obtained results showed that the protein presented good reactivity in indirect ELISA. The A450 differences from 0.1 to 1.8 showed the quantitative feature of the assay. The standardized indirect ELISA for detection of anti-FCoV using recombinant N protein is efficient and can be applied in field samples / Mestre

Orientador: Paulo Inácio da Costa / Banca: Miriane da Costa Gileno / Banca: Vanderlei Rodrigues / Banca: Daniele Cardoso Geraldo Maia / Banca: Elisabeth Loshchagin Pizzolitto / Resumo: O vírus da hepatite C (VHC) é um vírus envelopado com cerca de 50 a 70 nm de diâmetro, fita positiva de RNA e pertence ao gênero do Hepacivirus e à família Flaviridae. A detecção e quantificação do antígeno do core, proteína do nucleocapsídeo do VHC tem obtido sucesso em muitos ensaios, sendo considerado um marcador da replicação viral, por apresentar uma sequencia de aminoácidos altamente conservada, o que lhe confere alta sensibilidade e especificidade. A proteína E2 é uma glicoproteína de envelope do VHC com 11 sítios de glicosilação e a maioria deles estão bem conservados, tornando-a um alvo antigênico. O objetivo deste estudo foi o de desenvolver métodos diagnósticos para o VHC de alta sensibilidade, baixo custo e que pudessem ser utilizados na triagem sorológica. As regiões genômicas que codificam as proteínas core (parcial 136 aa) e E2 do VHC foram expressas em E. coli da linhagem Rosetta e clonadas no vetor de expressão pET-42a e induzidas por IPTG 0,4mM, produzindo proteínas recombinantes fusionadas a proteína GST (glutationa S-transferase), que foram então purificadas por cromatografia de afinidade. A imunorreatividade foi avaliada por Western Blot, Slot Blot e os métodos diagnósticos (ensaio imunoenzimático (ELISA) de captura, indireto, imunoblotting e imunocromatográfico) desenvolvidos e aprimorados. Os métodos desenvolvidos foram mais sensíveis e específicos utilizando a mistura das proteínas recombinantes fusionadas a GST (core + E2) / Abstract: The hepatitis C virus (HCV) is an enveloped virus of about 50 to 70 nm in diameter, positive strand RNA, and belongs to the genus Hepacivirus and the family Flaviridae. The detection and quantification of the core antigen, HCV nucleocapsid protein, has been successful in many trials and is considered a marker of viral replication, since it presents a sequence of highly conserved amino acids, giving it high sensitivity and specificity. The E2 protein is an envelope glycoprotein of HCV with 11 glycosylation sites, most of these well-conserved, making it a target antigen. The aim of this study was to develop high sensitivity, low cost diagnostic methods for HCV which could be used for serological screening. The genomic regions encoding the core (part 136 aa) and E2 proteins of HCV were expressed in E. coli Rosetta strain, cloned in expression vector pET-42a, and induced with 0.4 mM IPTG, producing recombinant proteins fused to GST protein (glutathione S-transferase), which were then purified by affinity chromatography. The immunoreactivity was assessed by Western blot, Slot Blot and the developed and improved diagnostic methods (enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) capture and indirect, immunoblotting and immunochromatographic). The methods developed were more sensitive and specific using the mixture of the recombinant proteins fused to GST (core + E2) / Doutor

Orientador: João Pessoa Araújo Junior / Banca: Alexandre Secorun Borges / Banca: Alice Fernandes Alfieri / Banca: Hélio Jose Montassier / Banca: Marcos Bryan Heinemann / Resumo: A quantificação de anticorpos é muito importante para monitoramento sorológico em granjas e associação com proteção contra o circovírus suíno tipo 2 (PCV2). Dessa forma este trabalho teve como objetivo padronizar e aplicar ELISA indireto com anticorpo de captura e utilizá-lo na quantificação de anticorpos contra o PCV2 em soros de suínos. Na padronização, os soros teste e os imunoreagentes básicos, incluindo, anticorpo de coelho anti-PCV2 purificado utilizado como captura e suspensão viral tiveram suas concentrações de uso ótimas determinadas. Aplicou-se o índice ELISA (IE) nos resultados dos soros de suínos para correção de variações entre testes. O teste mostrou-se específico do ponto de vista analítico e com alta reprodutibilidade podendo adequadamente ser utilizado na quantificação de anticorpos em soros de suínos contra o PCV2. Na aplicação, um total de 138 amostras de soros foi testado sendo cinco de porcas na gestação e 133 de leitões nascidos dessas porcas, acompanhados nas fases de maternidade ao crescimento em uma granja comercial com SMDS. Na avaliação da resposta de anticorpos contra o vírus, houve uma diminuição dos anticorpos da maternidade para a creche, coincidindo com o declínio dos anticorpos de origem materna e com a ocorrência da soroconversão simultaneamente com a detecção de PCV no sangue total pela PCR quantitativa. Em dois leitões com alta carga relativa de DNA viral e sinais clínicos sugestivos de SMDS, a quantidade de anticorpos detectada foi extremamente baixa / Abstract: Antibody quantification is important for serological monitoring in swine herds and association with protection against porcine circovirus type 2 (PCV2). The aim of this work was to standardize and apply indirect trapping ELISA and use it in the quantification of antibodies against PCV2 in sera from pigs. The immunoreagents, including rabbit antibody anti-purified PCV2 used as trapping antibody and viral suspension had their optimum use dilution previously determined. The absorbance index (ELISA Index, EI), was used to determine the antibody concentration in pig serum directed against PCV2. The test showed high analytical specificity and reproducibility. A total of 138 serum samples was tested including five sows in gestation and 133 piglets accompanied by phases from lactation to growth in a commercial swine herd where PCV2 was previously detected. In anti PCV2 antibody response it was observed a decreasing in the phases of lactation to nursery due to decline of maternal antibodies. The seroconversion was concurrent with PCV DNA detection by quantitative PCR in total blood. In two piglets with high relative DNA viral load and compatible clinical signs of PMWS, the anti PCV2 antibody concentration was very low / Doutor