Orientador: Iveraldo dos Santos Dutra / Banca: Júlio Cesar de Freitas / Banca: Tereza Cristina Cardoso da Silva / Banca: Raul José Silva Girio / Banca: Samir Issa Samara / Resumo: Foi avaliado pelo teste de ELISA indireto a resposta humoral para as toxinas botulínicas tipos C e D em animais vacinados com quatro diferentes produtos comerciais. Empregou-se duas vacinas bivalentes C e D (vacina 1 e vacina 2) e duas polivalentes contendo ainda os toxóides botulínicos tipos C e D (vacina 3 e vacina 4). Para análise foram realizadas seis colheitas de sangue ao longo do experimento, nos dias 0, 42, 75, 160, 250 e 342 após a vacinação. A imunidade passiva em bezerros até os 90 dias de idade, filhos de mães vacinadas com diferentes toxóides comerciais foram avaliados em 75 bezerros, agrupados de acordo com a vacina utilizada na mãe (B1, B2, B3 e B4). Para análise foram realizadas 3 colheitas de sangue, nos dias 5 (± 2), 45 e 90 dias após o nascimento. A avaliação da resposta humoral de bovinos vacinados em diferentes faixas etárias também foi realizada empregando-se uma vacina antibotulínica bivalente (C e D) comercial. Para análise, 90 bovinos foram divididos em 3 grupos de acordo com a faixa etária; animais com idade inferior a 2 anos, entre 2 e 5 anos e superior a 5 anos. Na avaliação da resposta humoral de animais vacinados com quatro diferentes produtos comerciais, para a toxina tipo C, as vacinas 1, 2, 3 e 4 não apresentaram diferenças significativas aos 42 dias da primeira dose. Aos 75 dias, a vacina 1, foi superior às vacinas 3 e 4, induzindo maior produção de anticorpos nos animais, porém não diferiu da vacina 2. Aos 160 dias houve queda na quantidade de anticorpos em todos os grupos, não havendo mais diferenças significativas entre as quatro vacinas testadas. Para a toxina tipo D, aos 42 dias da vacinação, não houve diferenças significativas entre as vacinas 1, 2 e 4, que apresentaram neste momento, valores superiores a vacina 3. No entanto, quando avaliadas aos 75 dias, a vacina 1 apresentou maior produção de anticorpos, diferindo... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: To compare the efficiency of an "in house" ELISA test, standardized to measure antibody C and D from Clostridium botulinum, a survey to analysis four different commercial vaccines was conducted. The vaccines used were two commercial, bivalent botulinum containing subtypes C and D (vaccine 1 and vaccine 2) and other two polyvalent including subtypes C and D. The first trial was blood samples taken at 0, 42, 75, 160, 250 and 342 days after vaccination, whereas the booster was performed at day 42. The second trial, maternal antibodies were also measured taken blood samples from 1-3 months age steers obtained from vaccinated heifers with the same vaccines described above, and divided into four different groups (B1, B2, B3, B4). The blood samples were taken at days 5, 45 and 90 after birth. Third and last trial was humoral response from vaccinated cattle with different age evaluation performed using the commercial Clostridium botulinum vaccine subtype C and D. For this purpose, 90 animals never vaccinated, were divided into 3 groups: 1 - 2 years old; 2 - animals aged between 2 and 5 years old; 3 - animals 5 years old. The blood samples were taken 30 days after vaccination after second dose of the vaccine. From the first trial, no significant difference was observed when subtype C was search in sera from animals at 42 days after vaccination. However, at 75 days after vaccination, vaccine 1 was able to induce higher levels of antibodies when compared to vaccine 3 and 4. The antibody level was declining after 160 days post vaccination. For subtype D antigen, at 42 days after vaccination, no differences could be observed. However, at 75 day after vaccination, higher levels of antibodies were observed from animals vaccinated with vaccine 1. Comparing the bivalent vaccines, these were able to induce higher antibodies levels at 75 days after vaccination (toxoid C). In addition, the same... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Orientador: Mary Marcondes Feitosa / Banca: Márcia Dalastra Laurenti / Banca: Aparecido Antonio Camacho / Resumo: A importância do diagnóstico da leishmaniose visceral canina no Brasil reside no fato de que, dentre as estratégias de controle da doença indicadas pela Fundação Nacional de Saúde, encontra-se a eliminação do cão doméstico sorologicamente positivo. Desta forma, torna-se necessário o conhecimento da sensibilidade e da especificidade das provas sorológicas utilizadas para a correta identificação destes animais. Para avaliar o desempenho dos métodos sorológicos no diagnóstico da leishmaniose visceral canina, foram determinadas e comparadas as características dos métodos de ELISA, reação de imunofluorescência indireta (RIFI) e imunocromatografia, adotando-se como padrão o método parasitológico. Para tanto, foram utilizados 50 cães naturalmente acometidos por leishmaniose visceral e 45 cães sadios provenientes de área não endêmica para a doença. A RIFI revelou sensibilidade de 98% e especificidade de 91,1%, além de ótima concordância com o método parasitológico (Kappa = 0,893). Os métodos de ELISA e de imunocromatografia apresentaram boa concordância com o método parasitológico (coeficientes Kappa de 0,788 e 0,769, respectivamente) e valores de sensibilidade de 94% e 86% e especificidade de 84,4% e 91,1%, respectivamente. Com relação à ocorrência de reações cruzadas com leishmaniose visceral, das 14 amostras de soro positivas para doença de Chagas, nove (64,3%) foram consideradas positivas pela técnica de ELISA e seis (42,9%) pela RIFI, não se observando resultados positivos por imunocromatografia. Das 13 amostras de soros de animais portadores de erliquiose, uma (7,7%) apresentou resultado positivo por meio dos métodos de ELISA e de imunocromatografia. / Abstract: The importance of canine visceral leishmaniasis diagnosis in Brazil is based on the fact that, according to the Ministry of Health, a seropositive dog must be culled. Thus, itþs important to know the sensitivity and specificity values of the methods employed for the diagnosis of the disease. To evaluate the performance of the available sorological tests for the diagnosis of canine leishmaniasis it was determined and compared the sensitivity and specificity of ELISA, indirect immunofluorescent antibody test (IFAT) and immunochromatographic test using the parasitological test as the gold standard. For this purposal, the study was carried out with a group of 50 naturally infected dogs from an endemic area and 45 healthy dogs from a non endemic area for visceral leishmaniasis. The IFAT was 98% sensitive and 91,1% specific, and showed a very good concordance with the parasitiological test (k = 0,893). The ELISA showed a sensitivity of 94% and specificity of 84,4% and when kappa index was analysed, a good concordance was obseved (k = 0,788). The immunochromatographic test was 86% sensisitive and 91,1% specific and showed a good concordance with the parasitiological test (k = 0,769). About the occurrence of cross reaction with visceral leishmaniasis, nine (64,3%) out of 14 positive samples for Chagas’ disease were positive by ELISA and six (42,9%) out of 14 were positive by IFAT, while the immunocromatographic test didn’t yield any positive result. One (7,7%), out of 13 positive samples for ehrlichiosis, was positive by ELISA and immunocromatografic test. Five (83,3%) out of six positive samples for ehrlichiosis and babesiosis were positive by ELISA and three (50%) by immunocromatography, while IFAT didnþt yield any positive result. Five (50%) out of 10 positive samples for toxoplasmosis were positive by IFAT and one (10%) by immunocromatography. / Mestre

Orientador: Henrique Nunes de Oliveira / Coorientador: Márcia Cristina de Sena Oliveira / Banca: Jesus Aparecido Ferro / Banca: Teresa Cristina Goulart de Oliveira Sequeira / Banca: Anderson Ferreira da Cunha / Banca: Marcos Rogério André / Resumo: A babesiose bovina é uma hemoparasitose transmitida pelo carrapato Rhipicephalus (Boophilus) microplus que causa grandes prejuízos à bovinocultura do Brasil. Entre as espécies que causam as babesioses bovinas, B. bovis se destaca como a mais patogênica. É amplamente conhecida a resistência natural dos bovinos do grupo genético Bos taurus indicus frente a B. bovis. Entretanto, a relação quantitativa do nível de infecção em animais Bos taurus taurus e seus cruzamentos é desconhecida. O método clássico de detecção e quantificação da parasitemia por B. bovis apresenta baixa sensibilidade e falha no diagnostico em animais portadores. Recentemente, a técnica de qPCR tem sido utilizada com grande sucesso para este propósito. Assim, o presente estudo teve como objetivo verificar a associação entre o nível de infestação por R. (B.) microplus, a soroprevalência e a parasitemia por B. bovis, estimada através dos métodos do ELISA-teste e qPCR em bovinos de corte naturalmente infestados, de diferentes locais e grupos genéticos (grupos-locais).Verificou-se que a infestação por carrapatos foi maior nos grupos locais de taurinos, com diferenças significativas entre os grupos. Nos ensaios do ELISA-teste, 74,39% dos animais avaliados foram positivos, encontrando-se os maiores níveis de anticorpos em animais taurinos quando comparados aos cruzados. Nas quantificações do DNA através da qPCR, a técnica demonstrou alta sensibilidade analítica e todos os animais foram positivos. Foram verificadas diferenças significativas (P<0,05) para o numero de copias (NC) de DNA de B. bovis entre os grupos locais, onde o grupo Angus de José Bonifácio, SP (AJB) apresentou o maior nível de infecção. As repetibilidades encontradas para as contagens de R. (B.) microplus e os NC de DNA de B. bovis foram baixas, enquanto que para os níveis de anticorpos obtidos pelo ELISA-teste foram ... / Abstract: Bovine babesiosis is a tick-borne disease, transmitted by Rhiphicephalus (Boophilus) microplus tick, that imposes substantial economic losses in to Brazilian livestock, among the species that cause bovine babesiosis B. bovis is the most virulent. Is widely known the natural resistance of the Bos taurus indicus genetic group to B. bovis, however, the quantitative relationship of the infection levels when compared to Bos taurus taurus and their crosses is unknown. The classical detection and quantitation method is of low sensitivity and usually fails to diagnose carrier animals. Recently, the real-time PCR (qPCR) techniques have been used successfully for these purposes. The present study aimed to determine the association among infestations by R. (B.) microplus, infection levels by B. bovis, estimated by qPCR, and the antibody levels in beef cattle naturally infested, proceeding of different locations and genetic groups (local groups). It was found greater tick infestations in taurine local groups, with significant differences between groups. In the ELISA test, 74.39% of animals were positive, meeting the highest antibodies levels in taurine animals when compared to the crossbred. In the DNA quantification, the analytical sensitivity of qPCR technique was high and all animals were positive. There were significant differences (P <0.05) for the DNA copy number (NC) among local groups, where Angus-Jose Bonifácio group (AJB) showed the highest infection levels. R. (B.) microplus scores and DNA copy number of B. bovis show low repeatability, whereas the antibodies levels were higher. No correlation among the examined measures were found. It is concluded that there is variation in the seroprevalence and DNA copy number of B. bovis among different local groups and the antibodies levels in the animals is not directly associated with the DNA NC of B. bovis, and both are independent of tick infestation / Doutor

Made available in DSpace on 2016-04-27T12:33:38Z (GMT). No. of bitstreams: 2 jorlan_jesus_ioc_mest_2014.pdf: 5185988 bytes, checksum: 63a4974cee1e68256ee5f05dc1957bd0 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2014 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Os arenavírus são membros da família Arenaviridae que é constituída de um gênero único (Arenavirus), que atualmente compreende 25 espécies. Os reservatórios naturais dessa família são em sua maioria roedores. A exposição humana aos arenavírus ocorre, principalmente, através da inalação de aerossóis contendo partículas virais procedentes de urina, fezes ou saliva de roedores silvestres infectados. Arenavírus são responsáveis por causar graves doenças em humanos: febre hemorrágicas (FH) e/ou meningite, com altas taxas de letalidade. No Brasil, após a identificação do primeiro e único caso de febre hemorrágica Brasileira (FHB), em 1990, nenhum estudo até o momento conseguiu identificar o possível reservatório do vírus Sabiá. Em nosso país cinco espécies de arenavirus já foram descritas nos últimos anos em diferentes biomas e regiões. Além disso, o Brasil faz fronteira com três países onde FH causadas por arenavírus são endêmicas (Argentina, Bolívia e Venezuela), tornando factível a introdução de arenavírus exóticos em nosso território. O presente estudo foi desenvolvido com amostras humanas e de roedores silvestres no estado de Mato Grosso do Sul O estudo com amostras humanas foi constituído por dois distintos grupos: (i) amostras de profissionais de saúde, de diversas regiões do Brasil, que exercem atividades nas quais existe o contato com animais silvestres, com o objetivo de inferir as regiões do país onde esses vírus possam estar circulando; (ii) amostras de soro de casos suspeitos e confirmados de dengue provenientes do Mato Grosso do Sul. No inquérito sorológico nos profissionais que manuseiam animais foi encontrada uma prevalência de 0.7% pela técnica ELISA, confirmando o baixo risco de transmissão de arenavírus nesta população com elevada exposição. Não foi detectada a infecção ou contato prévio com arenavírus nas amostras de pacientes com suspeita de dengue, com ou sem confirmação laboratorial, procedentes do estado do Mato Grosso do Sul, porem foram detectadas altas prevalências (21.6%), por RT-PCR, de infecção por arenavírus nos roedores das espécies Calomys callosus e Necromys lasiurus no estado confirmando a hipótese de circulação de arenavírus em áreas onde os roedores reservatórios se encontram distribuídos e apontam para a importância da vigilância epidemiológica para os arenavírus considerados patogênicos para o homem Por fim, o sequenciamento de nucleotídeo do segmento S completo possibilitou a identificação de dois vírus, sem descrição prévia no Brasil, os vírus Latino em C. callosus e Oliveros em N. lasiurus / The arenaviruses are members of Arenaviridae family that consists of a single genus ( Arenavirus ), which cu rrently comprises 25 species. The natural reservoirs o f this family are mostly wild rodents. Human exposure to arenaviruses occurs mainly through inhalation of aerosols containing virus particles coming from urine, feces or saliva of infected rodents. Aren aviruses are responsible for causing serious diseases in humans: hemorrhagic fever (HF) and/or mening itis, with high mortality rates . In Brazil, after the identification of the first and only case o f Brazilian hemorrhagic fever (FHB ) in 1990, no study to d ate has identi fied the possible reservoir of Sabi á virus. In our country there are five Arenavirus species habitting different biomes and regions. In addition , Brazil is bordered b y three countries where the FH are endemic (Argentin a , Bolivia , and Venezuel a) , making feasible the introduction of exo tic arenavirus in our territory . This study was conducted with human and wild rodents’ specimens in the state of Mato Grosso do Sul . The study of human samples consist ed of two distinct gro ups : (i ) samples of heal th professionals , from many regions of Brazil , performing activities where there is direct contact with wild animals , with the goal of inferring regions of the country where t hese viruses may be circulating; (ii ) serum samples of suspected or confirmed cas es of dengue fever from the Mato Grosso do Sul . I n the serological survey on animal handlers a prevalence of 0 . 7 % was found using ELISA , confirming the low risk of arenaviruses transmission in this population with high exposure. We did not detect infectio n or previous contact with arenaviruses in samples from patients with suspition of dengue fever, with or without laboratory confirmation coming from the state of Mato Grosso do Sul, however we de tected high prevalence ( 21 .6 % ) of arenavirus es infection in Calomys callosus and Necromys lasiurus rodent s in the same state , usin RT - PCR, confirmi ng the hypothesis that these viruses circulation in areas where rodent reservoirs are distributed and point to the importance of survei llance of arenavirus considering i t’s abilit y to be pathogenic to man. Finally , the nucleotide sequencing of the complete S segment allowed the identification of two viruses without previous description in Brazil , the Latin virus in C. callosus and Oliveros virus in N.lasiurus / 2016-12-11

Made available in DSpace on 2015-03-03T11:52:24Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-03-11Bitstream added on 2015-03-03T12:07:20Z : No. of bitstreams: 1 000809501.pdf: 784712 bytes, checksum: 0ea0788bc46ef920205857dd55beb4e2 (MD5) / A Leishmaniose Visceral Canina (LVC) é uma zoonose parasitária causada pelo protozoário Leishmania infantum transmitido principalmente pela picada do vetor flebotomíneo da espécie Lutzomyia longipalpis. O presente estudo objetivou avaliar a prevalência da LVC em cães, a distribuição de flebotomíneos e os fatores de riscos associados à doença, em uma área rural periurbana denominada por Cinturão Verde, localizada do município de Ilha Solteira, SP. Dessa forma, amostras de 250 cães, incluindo aspirados de linfonodos, de sangue e de suabe conjuntival foram coletadas para a realização dos exames parasitológico direto (PA), sorológico (ELISA e RIFI) e PCR (suabe conjuntival). A positividade dos cães para LVC foi de 31,6% (79/250) à RIFI, 28,8% (72/250) ao teste ELISA, 25,2% (63/250) ao PA e 20,4% (49/240) à PCR. A concordância entre os métodos, quando analisada pelo índice Kappa (p ? 0,05), foi considerada excelente entre ELISA x RIFI (94,5%), moderada entre ELISA x PA (81,7%) e entre RIFI x PA (78,3%), mas foi baixíssima entre PCR e os demais testes analisados. Os flebotomíneos da espécie Lu. longipalpis foram capturados com auxilio de armadilhas luminosas do tipo CDC (“Center for Disease Control and Prevention”), colocadas mensalmente no peridomicílio das propriedades rurais do Cinturão Verde, no período de setembro/2012 a agosto/2013, com três coletas em três dias consecutivos por mês. O numero de flebotomíneos capturados totalizou 65 machos e 25 fêmeas em 12 meses. O maior número de flebotomíneos capturados foi nos meses de dezembro/2012, fevereiro/2013, maio/2013 e julho/2013. Os fatores de riscos associados à LVC foram determinados estatisticamente pela análise univariada, os quais foram estatisticamente significativos (p ? 0,05) para os cães de porte grande, mostrando serem estes os mais susceptíveis à LVC, além da presença de galinhas nas propriedades ... / Canine Visceral Leishmaniasis (CVL) is a parasitic zoonosis caused by Leishmania infantum, which is transmitted by the bite of Phebotominae insect of the Lutzomyia longipalpis species (sandfly). This study aimed to survey the prevalence of CVL in dogs, the distribution of sand flies and the risk factors associated with the disease in a rural area called “Cinturão Verde”, located in the municipality of Ilha Solteira, SP. Thus, samples of lymph node aspirates and blood were collected from 250 dogs for ELISA and indirect fluorescence antibody test (IFAT) and direct parasitological (PA) exams. In addition, conjunctival swab samples were also collected for Polymerase Chain Reaction (PCR). 79/250 (31.6%) dogs were positive by IFAT; 72/250 (28.8%) by ELISA; 63/250 (25.2%) by PA and 49/240 (20.4%) by PCR. The concordance of methods when statistically analysed two by two by the Kappa índexes (p ? 0.05) were considered of excellent agreement between ELISA and IFAT (94.5%), moderate between ELISA and PA (81.7%) and between IFAT and PA (78.3%), but when PCR was compared with the other tests, the agrrement indexes were very low. Lu. longipalpis were captured with the help of CDC (Center for Disease Control and Prevention) light traps, placed three consecutive times per month in the rural peridomiciliary properties of the “Cinturão Verde”, from September/2012 to August/2013 in 100 % of the properties visited. The parasite density ranged from 01 to 12 per month including males and females, totaling 64 males and 25 females over 12 months. The largest number of insects captured was in December 2012, February/2013, May/2013 and July/2013. The univaried statistical analysis of risk factors associated with CVL revealed that the big size-dogs, the presence of chickens in the properties as well as the lack of knowledge by the rural population about the CVL disease were considered indicators to predict infection ...

Orientador: Hélio José Montassier / Banca: Ricardo Luiz Moro de Sousa / Banca: José Moacir Marin / Banca: Eduardo Hilário / Banca: Maria da Glória Buzinaro / Resumo: Foram realizadas a clonagem e expressão do gene da nucleoproteína (N) de uma estirpe vacinal de referência M41 do vírus da bronquite infecciosa (VBI), como proteína recombinante de fusão, contendo uma cauda de poli-histidina na extremidade carboxi-terminal, em 2 sistemas hospedeiros; na levedura metilotrófica, Pichia pastoris e na bactéria Escherichia coli. A proteína N derivada de um isolado variante do VBI de surtos a campo no Brasil, também foi expressa em E. coli. As características bioquímicas e imunoquímicas de tais proteínas recombinantes, foram determinadas, tendo sido evidenciado maior eficiência de produção no sistema hospedeiro constituído por E. coli, comparativamente ao sistema composto por P. pastoris. Uma vez obtidas, caracterizadas e purificadas, através da técnica de cromatografia de afinidade em resina de níquel-sepharose, as preparações de proteína N recombinante expressas em E. coli e derivadas ou da estirpe de referência M41 ou do novo isolado de campo no Brasil, foram utilizadas de forma bem sucedida, como antígenos alvo de ensaios indiretos de ELISA, que foram aplicados na detecção e mensuração de anticorpos dos isótipos IgG e IgM em aves infectadas com estirpes homóloga ou variantes do VBI. Foi, também, investigada a atividade imunogênica da proteína N recombinante em aves, que depois de imunizadas e re-imunizadas com essas proteínas recombinantes, produziram no soro sanguíneo e na secreção lacrimal quantidades elevadas de anticorpos anti-VBI específicos, mas não desenvolveram proteção efetiva contra o desafio com a estirpe homóloga desse vírus. Concluindo, a proteína N recombinante do VBI expressa pela E. coli possui elevada imunogenicidade, no sentido de induzir altos níveis de anticorpos específicos, e reatividade cruzada com proteínas N de outras variantes desse vírus, tendo um grande potencial de ser aplicada em ... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Two host systems, represented by Escherichia coli and Pichia pastoris were used for cloning and protein expression of the nucleoprotein (N) gene of M41 strain of infectious bronchitis virus (IBV) as a fusion recombinant protein containing a poli-histidine tag. The N protein from a new variant Brazilian field isolate was also cloned and expressed by E. coli system. The biochemical and immunochemical properties of these recombinant N proteins were determined and higher efficiency on protein production was achieved by using the E. coli expression system. Both recombinant N proteins expressed by E. coli were purified in nickel-sepharose resin and used as antigen in indirect ELISA methods for the detection of IgG and IgM antibodies in birds infected with homologous and variant IBVs. The immunogenicity of N recombinant protein was also evaluated by immunizing and re-immunizing birds and high antibody levels were generated in lachrymal secretion and serum, but no effective protection against challenge with homologous virulent stain of IBV was induced. Concluding, the recombinant N IBV protein expressed by E. coli is highly immunogenic for inducing specific and crossreactive antibodies, and can be applied in the immuno-diagnosis of IB / Doutor

Orientador: Wilma Aparecida Starke Buzetti / Banca: Maria Conceição Zocoller Seno / Banca: Caris Maroni Nunes / Resumo: A Leishmaniose Visceral Canina (LVC) é uma zoonose parasitária causada pelo protozoário Leishmania infantum transmitido principalmente pela picada do vetor flebotomíneo da espécie Lutzomyia longipalpis. O presente estudo objetivou avaliar a prevalência da LVC em cães, a distribuição de flebotomíneos e os fatores de riscos associados à doença, em uma área rural periurbana denominada por Cinturão Verde, localizada do município de Ilha Solteira, SP. Dessa forma, amostras de 250 cães, incluindo aspirados de linfonodos, de sangue e de suabe conjuntival foram coletadas para a realização dos exames parasitológico direto (PA), sorológico (ELISA e RIFI) e PCR (suabe conjuntival). A positividade dos cães para LVC foi de 31,6% (79/250) à RIFI, 28,8% (72/250) ao teste ELISA, 25,2% (63/250) ao PA e 20,4% (49/240) à PCR. A concordância entre os métodos, quando analisada pelo índice Kappa (p ≤ 0,05), foi considerada excelente entre ELISA x RIFI (94,5%), moderada entre ELISA x PA (81,7%) e entre RIFI x PA (78,3%), mas foi baixíssima entre PCR e os demais testes analisados. Os flebotomíneos da espécie Lu. longipalpis foram capturados com auxilio de armadilhas luminosas do tipo CDC ("Center for Disease Control and Prevention"), colocadas mensalmente no peridomicílio das propriedades rurais do Cinturão Verde, no período de setembro/2012 a agosto/2013, com três coletas em três dias consecutivos por mês. O numero de flebotomíneos capturados totalizou 65 machos e 25 fêmeas em 12 meses. O maior número de flebotomíneos capturados foi nos meses de dezembro/2012, fevereiro/2013, maio/2013 e julho/2013. Os fatores de riscos associados à LVC foram determinados estatisticamente pela análise univariada, os quais foram estatisticamente significativos (p ≤ 0,05) para os cães de porte grande, mostrando serem estes os mais susceptíveis à LVC, além da presença de galinhas nas propriedades ... / Abstract: Canine Visceral Leishmaniasis (CVL) is a parasitic zoonosis caused by Leishmania infantum, which is transmitted by the bite of Phebotominae insect of the Lutzomyia longipalpis species (sandfly). This study aimed to survey the prevalence of CVL in dogs, the distribution of sand flies and the risk factors associated with the disease in a rural area called "Cinturão Verde", located in the municipality of Ilha Solteira, SP. Thus, samples of lymph node aspirates and blood were collected from 250 dogs for ELISA and indirect fluorescence antibody test (IFAT) and direct parasitological (PA) exams. In addition, conjunctival swab samples were also collected for Polymerase Chain Reaction (PCR). 79/250 (31.6%) dogs were positive by IFAT; 72/250 (28.8%) by ELISA; 63/250 (25.2%) by PA and 49/240 (20.4%) by PCR. The concordance of methods when statistically analysed two by two by the Kappa índexes (p ≤ 0.05) were considered of excellent agreement between ELISA and IFAT (94.5%), moderate between ELISA and PA (81.7%) and between IFAT and PA (78.3%), but when PCR was compared with the other tests, the agrrement indexes were very low. Lu. longipalpis were captured with the help of CDC (Center for Disease Control and Prevention) light traps, placed three consecutive times per month in the rural peridomiciliary properties of the "Cinturão Verde", from September/2012 to August/2013 in 100 % of the properties visited. The parasite density ranged from 01 to 12 per month including males and females, totaling 64 males and 25 females over 12 months. The largest number of insects captured was in December 2012, February/2013, May/2013 and July/2013. The univaried statistical analysis of risk factors associated with CVL revealed that the big size-dogs, the presence of chickens in the properties as well as the lack of knowledge by the rural population about the CVL disease were considered indicators to predict infection ... / Mestre

Orientador: Tereza Cristina Cardoso Silva / Banca: Maria Cecília Rui Luvizotto / Banca: Edviges Maristela Pituco / Resumo: A língua azul é uma doença viral, cujo agente etiológico pertence à família Reoviridae, gênero Orbivírus, transmitida por um vetor (artrópode) hematófago, do gênero Culicoides. Por se tratar de doença confundível com Febre Aftosa está incluída na lista de diagnóstico diferencial juntamente com Estomatite Vesicular, Varíola Ovina, Ectima Contagioso. O estudo teve como objetivo detectar a presença de anticorpos para língua azul em ovinos da região de Araçatuba, por ser esta uma região com rebanho expressivo e condições climáticas favoráveis à multiplicação de insetos. As amostras foram colhidas ao longo do ano de 2006, de ovinos adultos, em fase reprodutiva, (acima de 12 meses e com pelo menos uma parição, ou em caso de machos sexualmente maduros) e sem sintomas característicos da doença, de ambos os sexos, cadastrados no Núcleo de Produtores de Ovinos da Região de Araçatuba, distribuídas nos municípios da Região administrativa de Araçatuba. O tamanho da amostras foi calculado, considerando-se distribuição normal, prevalência de 50%, nível de confiança de 95% e precisão absoluta de 3%. Foram analisadas 1002 amostras de soros ovinos adultos, provenientes de 31 cabanhas, pelas provas de imunodifusão dupla em gel de agar (IDGA) e ELISA (Enzyme Linked immunosorbent Assay) de competição da fase sólida (ELISA CFS), provenientes do Centro Panamericano de Febre aftosa. Dessas amostras, 744 (74,3%) foram reagentes ao vírus da língua azul , pelo teste de ELISA-CFS e 651 (65,1%), pela técnica de IDGA. Não houve associação significante entre prevalência da doença e o sexo dos animais. Esses resultados revelam que o Vírus da Língua Azul encontra-se disseminado nessas regiões, sugerindo a ocorrência de infecções inaparente. / Abstract: Bluetongue (BT) is an infectious, non-contagious, insect-born viral disease of Ruminants. The causative agent of BT is bluetongue virus (BTV) that belongs to the family Reoviridae genus Orbivirus. Insect vectors in the genus Culicoides transmit this virus. BT affects domestic and wild ruminants, however small ruminants are considered the most affected specie. BT is included in the OIE list based on the differential diagnosis with Foot and Mouth Disease (FMDV), Vesicular Stomatitis Virus (VSV) and Sheep Pox Virus (SPV). The aim of the study was to detect antibodies against BTV in commercial sheep farms, of the Northeastern region of Sao Paulo State, Brazil. The size of the samples was calculated, considering normal distribution, prevalence of 50%, confidence level of 95% and absolute precision of 3%.A total of 1002 sera samples collected from adult sheep (above 1 year-old), comprising a total of 31 farms, were screened for the presence of BTV antibodies, by agar gel immunodiffusion test (AGID) and ELISA-CFS (Enzyme Linked Immunosorbent Assay - competitive solid phase), both produced by Pan American Center of FMDV. From a total of 744 samples 74,3% were positive by ELISA - CFS and 651 (65,1%) were positive by AGID. There was no significant association between prevalence of the disease and sex of animals.These results suggest that the BTV is widespread among farms, probably causing subclinical infections, with high level of antibodies. / Mestre

Orientador: Hélio José Montassier / Banca: Aramis Augusto Pinto / Banca: Camillo Del Cistia Andrade / Resumo: A nucleoproteina do vírus da doença de Newcastle (VDN) é um dos componentes antigênicos ideais para fazer o imunodiagnóstico da DN, por ser mais conservada e possuir uma elevada imunogenicidade. A sequência completa do gene da nucleoproteína (NP) (1470 pb) da estirpe La Sota do VDN foi amplificada, nesse estudo, por RT-PCR e submetida a clonagem no vetor de expressão em Escherichia coli pETSUMO (Invitrogen). A proteína NP foi expressa sob a forma de uma proteína recombinante de fusão contendo o peptídeo SUMO e a sequência de poli-histidina, em seguida foi purificada em resina de níquel-agarose e caracterizada por SDSPAGE e Western-blotting, apresentando um peso molecular de cerca de 66kDa e reatividade com anticorpos policlonais de galinhas hiperimunizadas com esse mesmo vírus. Foi então desenvolvido um método indireto de ELISA com essa proteína (NPVDN- ELISA) para ser aplicado na detecção de anticorpos anti-virais específicos. O NP-VDN-ELISA revelou ser capaz de diferenciar amostras de soros positivos para o VDN das amostras de soros negativos e, na comparação dos resultados obtidos na análise de 125 soros de campo pelo NP-VDN-ELISA com os do teste de Inibição da Hemaglutinação (HI), foi encontrado um coeficiente de correlação significante entre estes métodos (r = 0,8345), bem como elevadas sensibilidade (89,3%), acurácia (90,4%) e especificidade (95,5%). Concluindo, a proteína NP recombinante expressa pelo sistema pET SUMO - E. coli compartilha os principais epítopos para interagir com anticorpos de galinhas produzidos contra a proteína NP do VDN, tendo, portanto, um bom potencial de ser aplicada de forma bem sucedida e com vantagens no teste de ELISA para realizar de forma mais rápida e prática, o imunodiagnóstico da DN de um maior número de amostras séricas de galinhas / Abstract: The nucleocapsid protein (NP) of Newcastle Disease Virus (NDV), is a preferred choice to develop a serologic assay on account of highly conserved sequences, and high immunogenicity. The whole open-reading-frame (orf) of NP gene from LaSota strain of NDV was amplified by RT-PCR and cloned in pETSUMO vector (Invitrogen) and Escherichia coli as cellular host. The NP protein was expressed as a fusion recombinant protein containing SUMO peptide and poly-histidine tags. This protein was easily purified in nickel-agarose resin, and characterized by SDS-PAGE and Western-blotting, showing a molecular weight of approximately 66 kDa and reactivity with polyclonal antibodies from NDV hiperimmunized chickens. The recombinant NP protein was used as antigen to develop an indirect ELISA (NP-NDVELISA) for the detection chicken anti-NDV antibodies. The capability of the recombinant NP protein to differentiate positive from normal chicken sera was evident in NP-NDV-ELISA, and by comparing this ELISA with haemagglutination-inhibition test (HI) a high and significant correlation with the haemagglutination-inhibition test (r = 0,8345), as well as high sensitivity (89,3%), specificity (95,5%) and accuracy (90,4%) were obtained. In conclusion the results indicated that the recombinant NP protein shared the main epitopes with the homologous viral protein and has a great potential to be advantageously used in the ELISA for the analysis of large number of samples in the DN immunodiagnosis / Mestre

Orientador: João Pessoa Araujo Júnior / Banca: Marcelo de Souza Zanutto / Banca: Jenner karlisson Pimenta dos Reis / Banca: Valéria Maria Lara Carregaro / Banca: Regina Kiomi Takahira / Resumo: A infecção pelo vírus da imunodeficiência felina (FIV) é uma das mais importantes doenças infecciosas dos felinos domésticos. Os gatos infectados apresentam sinais clínicos inespecíficos, portanto para confirmar a infecção são necessários testes laboratoriais específicos. A detecção de anticorpos anti-FIV possui uma correlação direta com a infecção viral, pois uma vez infectado o gato permanece infectado permanentemente. No presente estudo, foram produzidos antígenos recombinantes do capsídeo viral (p24) e proteína de matriz (p17) do FIV. Os fragmentos codificantes da p24 e p17 foram amplificados a partir do DNA pró-viral extraído do sangue periférico de gatos naturalmente infectados pelo FIV (subtipo B), e clonados e expressos em fase com a cauda de histidina (6xHis) na porção amino ou carboxi-terminal. Os antígenos p24, p17, p24 fundido com o epítopo transmembrana (p24/TM) e peptídeo sintético TM do FIV foram utilizados na padronização e aplicação dos testes de ELISA indireto rápido e Western blot para detecção de anticorpos anti-FIV. A reatividade dos antígenos foi analisada separadamente no ELISA indireto rápido, e permitiu a comparação dos antígenos quanto aos valores de sensibilidade e especificidade relativa. O antígeno FIVp24/TM apresentou melhor desempenho, com concordância de 100% com o teste SNAP® FIV/FeLV Combo test (n=110). A validação do ELISA indireto rápido com o antígeno FIVp24/TM mostrou características desejáveis para o uso comercial, tais como alta precisão e manutenção da reatividade durante o armazenamento. Pode-se concluir que a produção de antígenos recombinantes do FIV foi eficiente e possibilitou o desenvolvimento de um teste rápido (ELISA indireto rápido) e um teste confirmatório (Western blot) para o diagnóstico da infecção pelo FIV / Abstract: Infection with feline immunodeficiency virus (FIV) is one of the most important infectious diseases of domestic cats. Infected cats exhibit non-specific clinical signs, so specific laboratory assays are necessary to confirm the diagnosis of FIV infection. Detection of anti-FIV antibodies has a direct correlation with the viral infection, because once a cat has been infected it will remain infected permanently. In the present study, we produced FIV recombinant capsid antigen (p24) and matrix protein (p17). The coding fragments of p24 and p17 were obtained from proviral DNA extracted from peripheral blood of cats naturally infected with FIV (subtype B). These fragments were cloned and expressed in phase with amino or carboxi-terminal histidine tag (6xHis). The antigens FIVp24, FIVp17, p24 fused to transmembrane epitope (FIVp24/TM) and synthetic peptide TM were used for standardization and implementation of rapid indirect ELISA and Western blot assays for detection of anti-FIV antibodies. The reactivity of the antigens was analyzed separately in rapid indirect ELISA and allowed the determination of relative sensitivity and specificity of the antigens. The FIVp24/TM antigen has better performance, with 100% of agreement with SNAP® FIV/FeLV Combo test (IDEXX laboratories). The validation of the FIVp24/TM rapid indirect ELISA showed desirable characteristics for commercial use, such as high precision and maintenance of reactivity during storage. In conclusion, production of FIV recombinant antigens was efficient and allowed the development of a rapid test (rapid indirect ELISA) and a confirmatory test (Western blot) for diagnosis of FIV infection / Doutor