Aujourd’hui, le Virus de l'Hépatite C (VHC) infecte plus 70 millions de personnes dans le monde. L’Organisation mondiale de la santé prévoit l’élimination du virus VHC d’ici 2030, grâce aux récentes découvertes dans le milieu du développement médical. Ces derniers ont conduit à la production des antiviraux pangenotypiques à action directe (ADD). Le VHC est un virus enveloppé de l’ARN, avec une polarité positive. Il est constitué de nucléocapside entouré d’une membrane lipidique. La nucléocapside contient l’acide ribonucléique (ARN) et la protéine core. La membrane lipidique quant à elle contient à la surface les glycoprotéines E1 et E2. Ainsi ces protéines, sont les premières à rencontrer les hépatocytes, c’est donc grâce à elles que le virus parvient à entrer dans les cellules. Parmi les deux protéines, l’E2 a été la mieux caractérisée pour ses fonctions de liaisons aux récepteurs spécifiques. De plus les anticorps neutralisants ciblent majoritairement cette protéine. En se basant sur le fait que ce virus est membre de la famille des Flaviviridae, il a été suggéré par analogie, que le VHC contient des protéines de fusion de classe II et que la protéine E2 est la protéine de fusion. Cependant, les structures cristallines récentes d’E2 ont révélé qu'il lui manquait les caractéristiques structurelles des protéines de fusion de classe II. Ainsi, tous les regards se sont tournés sur la glycoprotéine E1, suggérant qu’elle est responsable de l’étape de fusion, seule ou à l’aide d’E2. En effet, la partie N-terminale de l'ectodomaine E1 a été récemment cristallisée. La caractérisation des résidus conservés dans cette région a démontré son importance pour l'infectivité du virus, pour l'interaction entre E1 et E2, ainsi que pour son implication dans l'interaction avec les récepteurs du VHC. En soutenant le rôle potentiel d'E1 dans le processus de fusion, différents segments de l'extrémité C-terminale de l'ectodomaine seraient impliqués dans les interactions avec les membranes modèles. Nous avons étudié en particulier deux régions d’intérêt. La première située dans la zone du peptide de fusion putatif (PFP) entre les acides aminés 270 et 291. Cette région se compose des séquences hydrophobes, soutenant son implication dans l'étape de fusion. La deuxième région englobant les acides aminés 314-342, d’une activité membranotrope située à proximité de la zone transmembranaire d’E1, a été démontrée par la cristallographie aux rayons X et les études de RMN comme comprenant deux hélices α (α2 et α3).Nous avons introduit 22 mutations dans la partie C-terminale de l'ectodomaine E1 dans le contexte d'un clone infectieux JFH1. Nous avons remplacé les résidus les plus conservés par de l'alanine, puis analysé l'effet des mutations sur le cycle de vie du virus. Vingt des vingt-deux mutants ont été atténué ou ont perdu leur pouvoir infectieux, ce qui indique leur importance dans le cycle viral. Nous avons observé différents phénotypes; certaines mutations ont modulé la dépendance du virus vis-à-vis des récepteurs CLDN1 et SRBI pour l’entrée cellulaire. Plusieurs mutations dans la région PFP, ont affecté la sécrétion et l'assemblage du virus, ainsi que l'hétérodimérisation E1E2. D’autres mutations, telles que les mutations de l'hélice α2 ont entraîné une atténuation grave ou une perte complète d'infectivité, sans affecter le repliement d’E1 et E2, ni la morphogenèse virale. Une caractérisation plus poussée de certains mutants au sein de la région hélice α2 a suggéré l'implication de cette région dans une étape tardive de l'entrée du VHC. Enfin, nos résultats montrent le rôle important joué par la glycoprotéine E1 dans l'hétérodimérisation de E1E2, la morphogenèse du virus, ainsi que son interaction avec les récepteurs du VHC et son implication potentielle dans l'étape de fusion. / Hepatitis C virus is currently estimated to infect around 71 million people around the world. However, recent advances in drug development led to the generation of pangenotypic direct acting antivirals (DAA), which may make it possible to eliminate HCV by 2030 as planned by the World health organization (WHO). HCV is a small RNA enveloped virus of positive sense. The RNA is encapsidated and surrounded by a lipid bilayer in which the E1 and E2 envelope glycoproteins are anchored on the surface. Thus, E1 and E2 are the first viral proteins to encounter the hepatocytes and mediate the entry step. HCV entry into hepatocytes is a sophisticated process that includes several steps ranging from interaction of glycoproteins with cellular host attachment factors and HCV specific-receptors, which is followed by internalization via clathrin-mediated endocytosis. Finally, viral and endosomal membranes merge at acidic pH leading to the release of viral RNA into the cytoplasm. Among the two glycoproteins, E2 has been the better characterized, as it is responsible for binding to cellular receptors and targeted by neutralizing antibodies. As a member of the Flaviviridae family, it has been suggested by analogy that HCV encodes class II fusion proteins and that E2 is the fusion protein. Nevertheless, the recent crystal structures of E2 revealed that it lacks structural features of class II fusion proteins. Thus, E1 glycoprotein became under the spotlight with the assumption that it is responsible for the fusion step whether alone or with the help of E2. Indeed, the N-terminal part of E1 ectodomain was recently crystallized, and the characterization of conserved residues within this region demonstrated its importance for virus infectivity, E1E2 interaction as well as its involvement in the interplay with HCV receptors. Supporting the potential role of E1 in the fusion process, different segments in the C-terminal of the ectodomain have been reported to be involved in interactions with model membranes. In particular, we investigated two regions of interest. The first one located in the putative fusion peptide (PFP) region between amino acid 270 and 291, containing hydrophobic sequences, supporting its involvement in the fusion step. The second region spanning amino acids 314-342, a membranotropic region located proximal to the transmembrane region of E1 and has been shown by X-ray crystallography and NMR-studies to comprise two α-helices (α2 and α3). We introduced 22 mutations in the C-terminal part of E1 ectodomain in the context of a JFH1 infectious clone. We replaced the most conserved residues with alanine and analyzed the effect of the mutations on the viral life cycle. Twenty out of the 22 mutants were either attenuated or lost their infectivity, indicating their importance for the viral life cycle. We observed different phenotypes; some mutations modulated the dependence of the virus on CLDN1 and SRBI receptors for cellular entry. Most mutations in the PFP region affected virus secretion and assembly as well as E1E2 heterodimerization. Nevertheless, the majority of mutations in the α2-helix (aa 315-324) led to severe attenuation or complete loss of infectivity without affecting E1E2 folding or viral morphogenesis. Further characterization of some mutants within this region suggested the involvement of the α2-helix in a late step of HCV entry. Finally, our results show the important role of E1 played in E1E2 heterodimerization, virus morphogenesis, interaction with HCV receptors and its potential involvement in the fusion step.

Le VHC est une cause majeure de cancer du foie. Le traitement actuel est caractérisé par à un cout élevé, la présence de toxicité et l’émergence de résistance virale. Dans la 1ère partie de ma thèse, je me suis intéressé à l’entrée virale. L’entrée est nécessaire pour l’initiation ; la dissémination et le maintien de l’infection et représente ainsi une cible intéressante dans le développement de thérapies antivirales : CD81 et SRBI sont les 1ers facteurs décrits comme importants pour l’entrée : Nous avons confirmé leur rôle clé dans l’entrée et les étapes suivant l’entrée. De plus, nous avons montré leur rôle crucial dans la transmission cellule/cellule. Le VHC infecte principalement les hépatocytes, nous avons étudié en seconde partie de ma thèse le tropisme restreint du VHC aux hépatocytes. En définissant les facteurs essentiels à l’infection de cellules non hépatiques et en développant un modèle cellulaire afin d’identifier de nouveaux facteurs d’assemblage et de réplication du VHC. / HCV infection is the leading cause of chronic liver disease. The current SOC is still limited by high costs, toxicity and emergence of viral resistance. In the first part of my thesis we focused our workon viral entry. Viral entry is required for initiation, spread, and maintenance of infection, and thus is a promising target for the development of new antiviral therapies. CD81 and SR-BI are the first entry factors identified as important for HCV entry. In our work we confirmed their crucial role in entry, especially at the post-binding step. In addition we proved their key role in viral dissemination through the cell-cell transmission. As HCV mainly infects hepatocytes, we studied in the second part of my thesis, the restricted cellular tropism of HCV to hepatocytes and we defined the minimal host factors rendering non hepatic cell lines susceptible to HCV infection by the establishment of a powerful tool to identify new assembly and replication factors.

Le virus de l'hépatite C (HCV) représente un problème de santé publique à l'échelle mondiale. Les thérapies actuelles ne permettent pas de guérir tous les patients infectés par le HCV et certains antiviraux ont des effets secondaires importants. Dans la première partie de ma thèse, nous avons identifié des combinaisons d'antiviraux à action directe (DAA) et d'inhibiteurs d'entrée caractérisés par un effet synergique dans la prévention et le traitement du HCV dans des modèles de culture cellulaire et les souris uPA-SCID avec un foie chimérique. Ceci représente une nouvelle stratégies de lutte contre l'infection par le HCV. Dans la seconde partie de ma thèse, nous avons démontré que le mode de transmission du HCV de cellule à cellule est la voie de transmission dominante dans les modèles de culture cellulaire. De plus, les virus résistant aux DAA se propagent efficacement grâce à la transmission de cellule à cellule. L'inhibition de la transmission de cellule à cellule en utilisant des inhibiteurs d'entrée est un moyen efficace pour empêcher l'émergence de virus résistant aux DAA et pour potentialiser l'efficacité antivirale des DAA pour éradiquer l'infection par le HCV. / Hepatitis C virus (HCV) poses a threat to global health with infecting about 170 million people. Current therapies cannot cure all the patients infected with HCV and have obvious side effects. In the first part of my thesis, we uncovered combinations of direct-acting antivirals (DAAs) and entry inhibitors caracterized by a synergistic effect in prevention and treatment of HCV infection using HCV cell culture models and human liver chimeric uPA-SCID mice, thereby providing a new strategy to control HCV infection. In the second part of my thesis, we demonstrated that HCV cell-cell transmission is the dominant transmission route in cell culture models and that DAA-resistant HCV spread efficiently through cell-cell transmission to develop viral resistance. Blocking cell-cell transmission using entry inhibitors allows to prevent the emergence of DAA-resistant virus and potentiates the antiviral efficacy of DAAs to clear HCV infection. In summary, we provide novel strategies to enhance antiviral efficacy by combining entry inhibitors and DAAs and to prevent viral resistance by blocking viral cell-cell transmission.

Le virus de l'hépatite C (HCV) est une cause majeure de maladie chronique du foie et de carcinome hépatocellulaire. Les options thérapeutiques pour traiter l'hépatite chronique sont limitées par des coûts élevés, des effets secondaires et une résistance virale. L'entrée du HCV est la première étape d'interaction entre le virus et la cellule hôte. Elle est requise pour l'initiation, la propagation et le maintien de l'infection, ce qui en fait une cible prometteuse pour les traitements antiviraux. L'entrée du HCV nécessite l'interaction coopérative de plusieurs facteurs cellulaires, y compris CD81 et claudine-1 (CLDN1). Nous avons récemment identifié un rôle pour le récepteur à l'EGF (EGFR) et le récepteur à l'ephrine A2 (EphA2) dans l'entrée du HCV par la régulation de la formation du complexe de co-récepteurs CD81-CLDN1, ce qui suggère que la signalisation de ces récepteurs joue un rôle dans l'entrée du virus. Nous avons voulu identifier les mécanismes moléculaires de signalisation de l'EGFR requis pour l'entrée du HCV et avons identifié HRas comme un transducteur de signalisation clé de l'hôte. Des études d'imagerie ont révélées que la signalisation de HRas peut moduler la diffusion et le trafic membranaire de CD81, ce qui permet l'assemblage du complexe de récepteurs. De plus, HRas s'associe avec les récepteurs de l'hôte CD81 et CLDN1 et des facteurs d'entrée du HCV inconnus jusque là: l'intégrine beta1 et Rap2B. Le HCV profite donc de la signalisation de HRas pour l'entrée cellulaire. Ces données améliorent notre compréhension des mécanismes moléculaires de l'entrée du HCV induite par l'EGFR et ouvrent de nouvelles perspectives pour le développement d'antiviraux.

Le virus de l'hépatite C (HCV) est une cause majeure de maladie chronique du foie et de carcinome hépatocellulaire. Les options thérapeutiques pour traiter l'hépatite chronique sont limitées par des coûts élevés, des effets secondaires et une résistance virale. L'entrée du HCV est la première étape d'interaction entre le virus et la cellule hôte. Elle est requise pour l'initiation, la propagation et le maintien de l'infection, ce qui en fait une cible prometteuse pour les traitements antiviraux. L’entrée du HCV nécessite l'interaction coopérative de plusieurs facteurs cellulaires, y compris CD81 et claudine-1 (CLDN1). Nous avons récemment identifié un rôle pour le récepteur à l’EGF (EGFR) et le récepteur à l’ephrine A2 (EphA2) dans l'entrée du HCV par la régulation de la formation du complexe de co-récepteurs CD81-CLDN1, ce qui suggère que la signalisation de ces récepteurs joue un rôle dans l'entrée du virus. Nous avons voulu identifier les mécanismes moléculaires de signalisation de l’EGFR requis pour l'entrée du HCV et avons identifié HRas comme un transducteur de signalisation clé de l'hôte. Des études d'imagerie ont révélées que la signalisation de HRas peut moduler la diffusion et le trafic membranaire de CD81, ce qui permet l’assemblage du complexe de récepteurs. De plus, HRas s’associe avec les récepteurs de l'hôte CD81 et CLDN1 et des facteurs d’entrée du HCV inconnus jusque là: l’intégrine beta1 et Rap2B. Le HCV profite donc de la signalisation de HRas pour l'entrée cellulaire. Ces données améliorent notre compréhension des mécanismes moléculaires de l'entrée du HCV induite par l’EGFR et ouvrent de nouvelles perspectives pour le développement d'antiviraux. / Hepatitis C virus (HCV) is a major cause of chronic liver disease and hepatocellular carcinoma worldwide. Therapeutic options to treat chronic viral hepatitis are limited by high costs, side effects and viral resistance in most patients. HCV entry is the first step of interaction between the virus and the host cell. It is required for the initiation, propagation and maintenance of infection, making it a promising target for antiviral therapy. HCV entry requires the cooperative interaction of several cellular factors, including CD81 and claudin-1 (CLDN1). We have recently identified a role for EGF receptor (EGFR) and ephrin receptor A2 (EphA2) in HCV entry by regulating the formation of the co-receptor complex CD81-CLDN1, suggesting that the signaling of these receptors might play a role in viral entry. However, the precise mechanisms of regulation are unknown. We wanted to identify the molecular mechanisms of EGFR signaling required for the HCV entry process. We identify HRas as key host signaling transducer for HCV entry. Advanced imaging studies have revealed that HRas signaling can modulate the lateral diffusion and membrane trafficking of CD81. A modified diffusion of CD81 allows the assembly of the receptors complex. In addition, HRas associates with tetraspanin microdomains containing the host receptors CD81 and CLDN1 and HCV entry factors previously unknown: the integrin beta1 and Rap2B. HCV therefore exploits HRas signaling for cellular entry. These data improve our understanding of the molecular mechanisms of HCV entry induced by EGFR and open new perspectives for the development of antivirals targeting signaling pathways.

Mon travail de thèse porte sur l'identification d'un arbre médicinal africain par le DNA barcoding et l'étude de composés à activité anti-VIH de cet arbre. Une première analyse de la séquence du marqueur ITS2 déterminée à partir d'ADN extrait de copeaux de bois a suggéré que la plante pourrait appartenir au genre Cassia ou au genre apparenté Senna. En analysant la séquence de ce marqueur ITS2 et aussi celle du trnHpsbA spacer d'une cinquantaine d'espèces des genres Cassia et Senna j'ai pu identifier la plante comme étant Cassia abbreviata. L'alignement de ces séquences m'a permis d'identifier, pour les deux marqueurs,des structures particulières spécifiques aux espèces du genre Cassia, permettant donc de les différencier des espèces du genre Senna. J'ai utilisé ces alignements pour effectuer une étude phylogenetique qui illustre que,pour les deux marqueurs, les Cassia forment en effet un clade bien séparé du clade des Senna qui peut être divisé en plusieurs sous-clades. Dans un deuxième temps j'ai étudié les effets anti-VIH de l'extrait alcoolique ainsi que de 57 composés purifiés obtenus au laboratoire. L'extrait brut ainsi qu'un des composés purifiés, le piceatannol, ont montré un grand spectre d’activités antivirales pour le VIH et le virus de l’herpès. Ils inhibent,à un stade précoce, l'infection par le VIH de lignées cellulaires de référence et d'isolats cliniques, ceci indépendamment de l'utilisation du co-récepteur (IC50: 10.47-40.77 μg/ml, CC50>1000 μg/ml; IC50: 8.04-47.46 μM, CC50>300 μM, respectivement). Ni l'un ni l'autre n'a d'effet sur CD4 et CCR5/CXCR4. L'extrait brut,mais pas le piceatannol, bloque l'interaction CD4-gp120, suggérant que l'extrait brut cible gp120 alors que le piceatannol agit comme un inhibiteur non-spécifique d'attachement du virus. Aussi, dans un modèle in vitro de tract génital femelle, le piceatannol inhibe l'infection de cellules cibles TZM-Bl par le VIH et n'active pas les cellules PBMCs, suggérant qu'il pourrait être un bon candidat comme microbicide. D'autres composés à activité anti-VIH dans l'extrait comportent l'acide oléanolique, l'acide palmitique, la taxifoline, ainsi que troiscomposés dont la structure est en train d'être élucidée. / My thesis project deals with the identification, by DNA barcoding, of an African medicinal plant and the study of anti-HIV compounds from this plant. A first analysis of the ITS2 marker sequence determined from DNA extracted from the wood suggested that the plant could belong to the Cassia or the related Senna genus. A further analysis of ITS2 as well as of trnH-psbA spacer sequences from about 50 species of the two genera allowed me to identify the plant as Cassia abbreviata. The sequence alignments, which reveal unique features present in the Cassia but not the Senna sequences, were used to construct phylogenetic trees showing the clear separation of the species of the Cassia and the Senna genus. The two markers therefore allow a quick discrimination between the species of the Cassia and the Senna genus and appear to be excellent barcode markers for identification of these species. Following the identification of the plant I have tested the crude ethanol extract as well as 57 purified compounds from the plant for an anti-HIV activity. The extract, as well as one of the compounds, namely piceatannol, showed a broad spectrum of antiviral activities for HIV and HSV. They inhibited HIV-1 infection at the early stage against various reference strains and resistant clinical isolates independent of the co-receptor usage (IC50: 10.47-40.77 μg/ml, CC50>1000 μg/ml; IC50: 8.04-47.46 μM,CC50>300 μM, respectively). Neither the crude extract nor piceatannol had an effect on CD4 and CCR5/CXCR4. The crude extract blocked CD4-gp120 interaction while piceatannol did not, indicating that CE may target gp120 and piceatannol may act as a non-specific viral attachment inhibitor. Moreover, piceatannol inhibited HIV infection of TZM-Bl target cells in an in vitro female genital tract model and did not activate PBMCs, suggesting that it may represent a good candidate as microbicide. Other anti-HIV compounds found in Cassia abbreviata include oleanolic acid, palmitic acid, taxifolin and three other compounds the structure of which is presently being elucidated.

Du fait de leur présence à la surface de la particule virale, les glycoprotéines d’enveloppe E1 et E2 du virus HCV jouent un rôle essentiel dans sa morphogenèse ainsi que lors de son entrée dans la cellule hôte. Jusqu’à récemment, les travaux de recherche sur les glycoprotéines d’enveloppe du virus HCV se sont essentiellement focalisés sur E2 car elle est la protéine d’attachement du virus. De plus, elle est la cible majeure des anticorps neutralisants et il a été longtemps postulé qu’elle était la protéine de fusion du virus. Cependant, les récentes publications de la structure de E2 ne mettent pas en évidence la présence d’un peptide de fusion et sa structure ne correspond pas aux critères attendus pour une protéine de fusion, suggérant que la glycoprotéine E1 seule ou en association avec E2 pourrait être responsable de l’étape de fusion. La structure de la région N-terminale de E1 (acides aminés 192 à 270) a récemment été résolue et a mis en évidence la présence d’une épingle à cheveux formée par 2 feuillets beta (β1 et β2) suivie par un segment de 16 acides aminés qui forme une hélice alpha (α1) flanquant 3 feuillets beta antiparallèles (β3, β4 et β5). En plus de la caractérisation de ces structures secondaires de E1, une région qui se situe au milieu de la protéine (approximativement entre les résidus 274 et 292) a été proposée avoir un rôle actif au cours du processus de fusion et elle pourrait correspondre à un peptide de fusion.Nous nous sommes basés sur ces travaux récents pour investiguer le rôle fonctionnel de la glycoprotéine E1 par une approche de mutagenèse dirigée des résidus conservés dans la région N-terminale et dans la région du potentiel peptide de fusion, dans le contexte d’un clone infectieux du HCV. Comme attendu, nos résultats indiquent que ces mutations introduites dans E1 n’ont aucun effet sur la réplication virale. Cependant, vingt-et-un parmi les vingt-huit mutants produits conduisent à une atténuation ou une perte de l’infectiosité virale. D’une manière très intéressante, deux mutants atténués, le T213A et le I262A, se sont montrés moins dépendants au co-récepteur claudine-1. D’autre part, nous avons montré que ces mutants utilisent un autre récepteur de la famille des claudines (claudine-6) pour l’entrée virale, indiquant ainsi un changement de dépendance à son co-récepteur claudine-1. A l’opposé, deux autres mutants, le L286A et le E303A, se sont révélés avoir une plus grande dépendance au co-récepteur claudin-1 pour l’entrée dans les cellules d’hépatome. Au cours de ce travail, nous avons également identifié une mutation intéressante à proximité du potentiel peptide de fusion. Cette mutation, G311A, conduit à la sécrétion de particules virales entières mais non infectieuses, suggérant un défaut d’entrée cellulaire pour ce virus. De façon très surprenante, nous avons également identifié une mutation (D263A) qui conduit à la sécrétion de particules virales dépourvues d’ARN génomique. Une caractérisation plus poussée de ce mutant a de plus révélé une modification dans la co-localisation subcellulaire entre l'ARN viral et la glycoprotéine E1, mettant en évidence pour la première fois un dialogue croisé entre E1 et l'ARN génomique du HCV lors de la morphogenèse du virus.En conclusion, nos observations permettent d’identifier précisément les régions spécifiques de la protéine E1 qui jouent un rôle dans l’assemblage et l’entrée du virus dans la cellule, mettant en évidence le rôle majeur de la glycoprotéine E1 au niveau des différentes étapes du cycle infectieux du HCV. / Being part of the viral particle, HCV envelope glycoproteins E1 and E2 play an essential role in virion morphogenesis as well as in HCV entry into liver cells. These glycoproteins form a non-covalent heterodimer, and until recently, research on HCV envelope glycoproteins has been mainly focused on E2. Indeed, this glycoprotein is the receptor-binding protein, it is also the major target of neutralizing antibodies and it was postulated to be the fusion protein. However, the recent publications of the structure of E2 do not show the presence of a fusion peptide and its structure does not fit with what one would expect for a fusion protein, suggesting that E1 alone or in association with E2 might be responsible for the fusion step. Concerning E1, only the crystal structure of the two-fifth N-terminal region, comprising amino acids 192 to 270, has been reported. This partial structure reveals a complex network of covalently linked, intertwined homodimers. The overall fold of the N-terminal E1 monomer consists of a beta-hairpin (β1 and β2) followed by a segment composed of a 16 amino-acid long alpha-helix (α1) flanking a three-strand antiparallel beta-sheet (β3, β4 and β5). In addition to the characterization of secondary structures within E1, a region located in the middle of the polypeptide (approximately between aa 274 and 292) has been suggested to play an active role during the fusion process and might potentially act as a fusion peptide. We took advantage of these recently published data to further investigate the functional role of HCV glycoprotein E1 by using a site-directed mutagenesis approach targeting conserved amino acids in the N-terminal region as well as in the region postulated to contain the fusion peptide in the context of an infectious clone. As expected, our results indicate that these mutations have no effect on virus replication. However, twenty-one out of twenty-eight mutations led to attenuation or inactivation of infectivity. Interestingly, two attenuated mutants, T213A and I262A, were less dependent on tight junction protein claudin-1, a co-receptor for HCV. Instead, these mutant viruses relied on another claudin (claudin-6) for cellular entry, indicating a shift in receptor dependence. In contrast, two other mutants, L286 and E303, were more dependent on claudin-1 for cellular entry into hepatoma cells cells. We also identified an interesting mutation downstream of the putative fusion peptide, G311A, which leads to the release of non-infectious particles having a defect in cellular entry. Finally, an unexpected phenotype was also observed for D263A mutant, which was no longer infectious but led to the secretion of viral particles devoid of genomic RNA. Further characterization of the D263A mutant revealed a change in subcellular co-localization between HCV RNA and E1, highlighting for the first time a crosstalk between HCV glycoprotein E1 and the genomic RNA during HCV morphogenesis.In conclusion, our observations allowed for the identification of specific regions in the E1 glycoprotein that play a role in virion assembly and entry, highlighting the major role played by this protein at different steps of the HCV infectious cycle.