A transferência de oxigênio para o meio, durante o cultivo de Candida kefyr DSM 70106, mostrou ter grandE influência na produção de inulinase extracelular. O KLa (coeficiente volumétrico de transferência de oxigênio) de 43 h-1 foi o que proporcionou a obtenção de atividade enzimática mais elevada (37,5 U.mL-1). Este parâmetro foi utilizado como critério para ampliação de escala do cultivo em biorreator de 15 litros para 300 litros. O volume de meio obtido foi congelado para utilização nos processos seguintes de separação de células e purificação da inulinase. Para isto foram utilizados três processos diferentes, a saber, filtração (microfiltração, diafiltração e ultrafiltração), extração líquido-líquido por micela reversa e cromatografia de troca iônica em leito fluidizado. Durante a separação de células, a membrana de microfiltração tipo HVLP com 0,45 µm de diâmetro de poro foi a que possibilitou a passagem de maior fluxo de filtrado (324 L.h-1.m-2) quando comparada com outras membranas de poros e materiais diferentes. Associado a este fluxo obteve-se ainda a passagem pela membrana de 99% da enzima presente. Foram também estudados diferentes tipos de módulos de filtração. Os filtros rotativos foram os que apresentaram melhores desempenhos, com destaque para o tipo \"Biodruckfilter\". Fluxo de filtrado de 300 L.h-1.m-2 e transmissão de 99% da enzima foram obtidos neste filtro. Os filtros tipo cassete e os tubulares apresentaram desempenhos, em geral, inferior a 50% quando comparados em termos de fluxo de filtrado. O processo de filtração em escala ampliada, realizada no filtro cassete, apresentou fluxo de filtrado 45% inferior ao obtido na pequena escala. Os estudos de extração líquido-líquido por micela reversa foram feitos utilizando um agente tensoativo catiônico (BDBAC- [N-Benzyl-N-Dodecyl-N bis(2-hydroxyethyl) ammonium chloride] e um aniônico (AOT- sodium-di-2ethyl-hexyl-sulphosuccinate). O BDBAC proporcionou recuperação de 91 % da enzima presente inicialmente. Na ampliação de escala do processo foi verificado um rendimento de 77%, e o aumento da atividade enzimática específica, nos dois casos, foi de aproximadamente 2,8 vezes. Em comparação com os dois processos anteriores, o processo de purificação da inulinase com separação simultânea de células por cromatografia de trocaiônica em leito fluidizado foi o que proporcionou maior aumento da atividade enzimática específica (da ordem de 4,3 vezes). Após adsorção e eluição do leito cromatográfico, 93,1% da enzima foi recuperada. / It has been observed that the production of extracellular inulinase by Candida kefyr DSM 70106 was markedly affected by the rate of oxygen transfer to the medium. The highest inulinase activity (37,5 U.Ml-1) was attained at a KLa value (volumetric coefficient of oxygen transfer) equal to 43 h-1. As such, KLa was chosen as a criterion for scaling-up the bioreactor capacity from 15 L to 300 L. Once the fermentation ended, the whole fermented broth was frozen for further cell separation and inulinase purification. For that, three different processes were used, namely filtration (microfiltration, diafiltration and ultrafiltration), liquid-liquid extraction by reversed micelles and ion-exchange chromatography in fluidized bed. Microfiltration membranes differing in the chemical nature and on the pores diameter were used in cell separations. The highest filtrate flow (FF = 324 L.h-1.m-2) occurred when HVLP type membrane (0,45 µm pore diameter) was employed. Moreover, 99% of inulinase passed through the membrane. Several types of filtration modules were also studied. The rotatory filter, such as the \"Biodruckfilter\" (FF=300 L.h-1.m-2 and 99% of inulinase transmission), presented remarkable performance when compared with cassette and tubulartype filters, in which FF was lower than 50%. Furthermore, filtration carried out with a scaled-up cassette module presented a FF 45% lower than that observed on a smaller scale. Studies on liquid-liquid extraction by reverse micelles were made utilizing a cationic surfactant (BDBAC- [N-Benzyl-N-Dodecyl-N-bis(2-hydroxyethyl) ammonium chloride] and an anionic surfactant (AOT-sodium-di-2-ethyl-hexylsulphosuccinate). The use of BDBAC resulted in a recuperation of 91 % of the enzyme initially present, which decreased about 77% when the process was scaled-up. Neverthless, in both cases the increase in specific enzymatic activity was about 2.8 times. In comparison with the aforementioned processes, the ion-exchange chromatography in fluidized bed, in which inulinase purification and cell separation take place simultaneously, provided. an increase in specific enzymatic activity of about 4.3 times. After adsorption and elution of the chromatographic bed about 93% of the inulinase was recovered.

Metarhizium anisopliae é um fungo filamentoso entomopatogênico muito versátil que infecta, aproximadamente, 300 espécies de artrópodes, e também é adaptado à vida na rizosfera de plantas, sendo de extrema importância para o controle biológico de pragas na agricultura e pecuária. De acordo com o comportamento promíscuo desse fungo, pesquisadores têm identificado um grande número de genes relacionados à interação com o hospedeiro, e que são regulados de acordo com a sua indução. Em sua maioria, são genes que codificam para enzimas hidrolíticas. O número e a diversidade desses genes podem ser a chave para a habilidade desse patógeno em infectar uma larga variedade de artrópodes, podendo expressar genes diferentemente para cada tipo de hospedeiro. M. anisopliae secreta, entre outros, complexos quitinolítico e proteolítico para a degradação da quitina e proteínas presentes na cutícula do hospedeiro.Desse modo, o estudo da regulação dessas enzimas é de fundamental importância para o entendimento do processo de infecção; sendo assim, através desse trabalho foi observada e analisada a especialização na expressão de proteínas, especialmente de quitinases e proteases, secretadas por uma linhagem selvagem de M. anisopliae, na presença de cutículas de diferentes artrópodes, particularmente, de Dysdercus peruvianus, Boophilus microplus, Anticarsia gemmatalis e de quitina cristalina, através de ensaios de detecção enzimática e eletroforese uni e bidimensional. Em todos os experimentos, variando-se as condições de fonte de carbono e tempo de cultivo, a secreção de proteínas se mostrou altamente diferenciada, demonstrando comportamento diferencial do fungo a vários hospedeiros, o que seria um sinal da versatilidade do entomopatógeno, aqui estudado, para a capacidade de infectar centenas de hospedeiros. / Metarhizium anisopliae is a very versatile entomopathogenic filamentous fungus that infects, approximately, 300 species of arthropods, and is also adapted to the life in the rhizosphere of plants, being of extreme importance for the biological control of pests in agriculture and pecuary. In accordance with this promiscuous behavior of this fungus, researchers have identified a great number of genes related to the interaction with the host, and that they are regulated in accordance with its induction. In their majority, these genes encode for hydrolytic enzymes. The diversity of these genes can be the key for the ability of this pathogen in infect a wide variety of arthropods, being able to differently express genes for each type of host. M. anisopliae secretes chitinolytic and proteolytic complexes for the degradation of the chitin and proteins present in the cuticle of the host. In this way, the study of the regulation of these enzymes is of up fundamental importance for the understanding of the infection process. Through this research, the specialization in the expression of proteins, especially chitinases and proteases, secreted by a wild strain of M. anisopliae, in the presence of cuticles of different arthropods, particularly, of Dysdercus peruvianus, Boophilus microplus, Anticarsia gemmatalis and crystalline chitin, was observed and analyzed through enzymatic assays and one- and two-dimensional electrophoresis. In all the experiments, the conditions of the carbon source and time of culture, the protein secretion showed highly differentiated, demonstrating distinguishing fungus behavior to various hosts, which would be a sign of the versatility of this entomopathogen for the capacity of infecting hundreds of hosts.

Dois experimentos foram realizados no Departamento de Zootecnia da Universidade de São Paulo (USP), na faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos (FZEA), em Pirassununga/SP, com o objetivo de estudar o desempenho de frangos de corte alimentados com rações suplementadas com enzimas exógenas. A ração experimental foi constituída de milho, farelo de soja, vitaminas, minerais e enzimas exógenas (50 g / 100 kg). No experimento I foram utilizados 504 pintainhos Cobb distribuídos em um delineamento inteiramente casualizado em esquema fatorial 2x3: 2 sexos - fêmeas e machos, 3 níveis nutricionais - Reduzido, reduzido + complexo enzimático e convencional, totalizando 6 tratamentos com 7 repetições de 12 animais cada. Os resultados revelaram que machos e fêmeas, recebendo dietas com níveis nutricionais reduzidos com adição de enzima, apresentaram maiores peso médio e ganho de peso aos 21 e 42 dias de idade quando comparados aos demais tratamentos (P<0,05). Não foram encontradas diferenças significativas para as características de carcaças. No experimento II foram utilizados 1.080 frangos de corte, machos, de sete dias de idade, Cobb 500, distribuídos em um delineamento inteiramente casualizado em esquema fatorial 3X3: sendo três níveis nutricionais - convencional, reduzido e reduzido + complexo enzimático e três níveis de restrição - 0%, 2% e 4% - totalizando 9 tratamentos com 10 repetições de 12 animais. Os resultados encontrados revelaram um efeito significativo sobre o desempenho das aves com a redução do ganho de peso dos animais e conversão alimentar. Não foram observados efeitos sobre a mortalidade e incidência de transtornos metabólicos. Não foram encontradas diferenças significativas para as características de carcaças e percentagem de gordura abdominal, porém, ocorreu um aumento no rendimento de peito para aves alimentadas com o complexo enzimático na dieta. / Two experiments were conducted at the Department of Animal Science, University of São Paulo (USP), College of Animal Science and Food Engineering (FZEA) in Pirassununga / SP, with the aim of studying the performance of broilers fed diets supplemented with exogenous enzymes. The experimental diets consisted of corn, soybean meal, vitamins, minerals and exogenous enzymes (50 g / 100 kg). In the first experiment were used Cobb 504 chicks distributed in a completely randomized 2x3 factorial: two sexes - males and females, three nutritional levels - Low, low + enzyme complex and conventional, totaling 6 treatments with seven replicates of 12 animals each. The results revealed that males and females, fed diets with reduced nutrient levelswith the addition of enzyme, showed higher average weight and weight gain at 21 and 42 days of age when compared to other treatments (P<0.05). There were no significant differences for carcass traits. In experiment II were used 1080 broilers, males, seven-day-old Cobb 500, distributed in a completely randomized design in factorial 3X3: with three levels of nutrition - conventional, reduced and reduced + enzyme complex and threelevels of restriction - 0%, 2% and 4% - a total of nine treatments with 10 replicates of 12animals. The results showed a significant effect on broiler performance with reducedweight gain and feed the animals. No effects on mortality and incidence of metabolic disorders. There were no significant differences for carcass traits and abdominal fat percentage, however, there was an increase in breast yield for birds fed the enzyme complex in the diet.

Orientadora: Lorena Benathar Ballod Tavares. / Dissertação (mestrado) - Universidade Regional de Blumenau, Centro de Ciências Tecnológicas, Programa de Pós-Graduação em Engenharia Ambiental.

Orientador: Renato Wendhausen Júnior. / Dissertação (mestrado) - Universidade Regional de Blumenau, Centro de Ciências Exatas e Naturais, Programa de Pós-Graduação em Química.

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Orientador: João Matins Pizauro Júnior / Coorientador: Cecília Maria Costa do Amaral / Banca: Jesus Aparecido Ferro / Banca: Luís Henrique Souza Guimarães / Resumo: Bactérias do gênero Enterobacter sp. são conhecidas por produzir ácidos orgânicos e solubilizar fosfato inorgânico presente no solo. O objetivo do trabalho foi caracterizar a enzima fosfatase ácida ligada à membrana de Enterobacter sp. isolada de raízes de orquídeas Cyrtopodium paludicolum. A enzima ligada à membrana foi purificada por centrifugação a 100.000 x g durante uma hora a 4ºC. A atividade da p-nitrofenilfosfatase (PNFFásica) foi determinada descontinuamente a 37°C. A bactéria foi inoculada em meio de cultura líquido e a enzima foi estritamente regulada pelo fósforo, atingindo expressão máxima a 5 mM, em pH ótimo aparente de 3,5. Em relação aos inibidores avaliados, verificouse que o cobre apresentou inibição não-competitiva. Já o arsenato, vanadato e fosfato inibiram competitivamente a enzima, demonstrando que são análogos estruturais. A enzima exibiu comportamento "michaeliano" para a hidrólise do PNFF (atividade específica de 30,67 U/mg, Km = 0,55 mM e n = 1). Interações sítio-sítio foram observadas para a hidrólise do ATP (atividade específica de 11,2 U/mg, Km = 0,62 mM e n = 1,8) e para a hidrólise do pirofosfato (atividade específica de 15,64 U/mg, Km = 0,89 mM e n = 2,8). Os valores obtidos pela inativação térmica demonstraram que a enzima manteve-se estável a 45°C e a atividade enzimática diminuiu com o aumento da temperatura. Os resultados sugerem que a produção da fosfatase ácida promove aumento na disponibilidade dos nutrientes para as plantas, solubilizando minerais insolúveis através da produção de enzimas, sendo um dos mecanismos que esses microrganismos utilizam para solubilização de fosfato mineral / Abstract: Bacteria of the genus Enterobacter sp. are known as organic acid producers and are able to solubilize inorganic phosphate which is present in soil. The aim of this work was to characterize the cell-wall associated acid phosphatase of Enterobacter sp. symbionts of plants and were isolated from roots of orchid Cyrtopodium paludicolum. The enzyme was obtained by centrifugation at 100.000 x g, for one hour at 4ºC and the activity from p-nitrophenilphosphatase (PNPPase) was determined at 37°C Culture medium was inoculate d with bacteria and supplemented with phosphorus. Under optimal conditions (5mM phosphorus, pH 3.5) the enzyme was expressed. The activity from p-nitrophenylphosphatase (PNPPase) was determined at 37°C. The enzyme presen ted Michaelis behavior for the hydrolysis of PNPP (specific activity of 30.67 U/mg, Km = 0.55 mM and n = 1). Besides site-site interactions were observed for ATP hydrolysis (specific activity of 11.2 U/mg, Km = 0.62 mM and n = 1.8) and pyrophosphate hydrolysis (specific activity of 15.64 U/mg, Km = 0.89 mM and n = 2.8). It was observed that enzyme activity decreased with increasing temperature. Inhibition studies revealed that copper inhibited the enzyme in a non-competitive manner. In contrast arsenate, and vanadate which are structural analogues of phosphate presented a competitive inhibition. The results suggest that plants expressing acid phosphatase are able to solubilize mineral phosphate and are able to hydrolyse insoluble minerals thereby increasing the availibilty of nutrients which can be used by the plant / Mestre

Título original: Avaliação bioquímica (sangue e urina) e morfohistológica (fígado) de coelhas expostas a acaricida obtido a partir do ácido ricinoléico do óleo de mamona / Orientador: Maria Izabel Souza Camargo / Coorientador: Patricia Rosa de Oliveira / Banca: Rusleyd Maria Magalhães de Abreu / Banca: Matheus Mantuanelli Roberto / Resumo: No presente trabalho verificou-se o efeito dos ésteres do ácido ricinoléico do óleo de mamona, acaricida químico natural pela avaliação dos parâmetros bioquímicos do sangue e da urina e a morfofisiologia do fígado de coelhas, aqui utilizadas como modelo de hospedeiros de carrapatos, alimentadas com ração enriquecida com os referidos ésteres. Os resultados obtidos a partir dos Bioensaios 1 (ração + NaCl) e 2 (ração + ésteres + NaCl) mostraram que os parâmetros clínicos nas análises das enzimas hepáticas fosfatase alcalina (FAT), gama glutamil transferase (GGT) e alanina aminotransferase (ALT) não foram significativamente alterados, exceto para a enzima hepática aspartato aminotransferase (AST) das coelhas do Bioensaio 2, que apresentou maior variância indicando que os ésteres são hepatotóxicos. Os resultados obtidos nas análises das amostras de urina para os parâmetros hemoglobina livre, proteína, bilirrubina e urobilinogênio demonstraram que os índices de referência não foram alterados. Os dados morfohistológicos e histoquímicos do fígado mostraram que as coelhas alimentadas com ração enriquecida tiveram o tecido hepático alterado, o que foi confirmado pela desorganização dos cordões hepáticos, aumento do espaço intercelular, presença de hepatócitos com limites celulares pouco distintos e de núcleos irregulares e picnóticos, geralmente deslocados para a periferia da célula devido a presença de vacúolos. Histoquimicamente detectou-se nas coelhas do Bioensaio 2 redução na prese... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The present study verified the effects of castor oil ricinoleic acid, a natural chemical acaricide, on the clinical blood and urine parameters and on the liver morphophysiology of female rabbits (used as a model of tick hosts) fed with commercial food enriched with castor oil esters. Bioassays 1 (commercial food + NaCl) and 2 (food + esters + NaCl) demonstrated that the clinical parameters of the hepatic enzyme alkaline phosphatase (FAT), gamma glutamyl transferase (GGT) and alanine aminotransferase (ALT) were not significantly altered, except for the hepatic enzyme aspartate aminotransferase (AST) of the rabbits belonging to Bioassay 2, which presented greater variability, indicating that the esters are hepatotoxic. The analyses of the urine samples for the parameters free hemoglobin, protein, bilirubin and urobilinogen demonstrated that the esters were not toxic to the female rabbits. The morphohistological and histochemical data showed that the rabbits fed with enriched food had the hepatic tissue altered, which was confirmed by the disorganization of the hepatic cords, enlargement of the intercellular space, presence of hepatocytes with little evident limits and irregular and pyknotic nuclei, mostly dislocated to the cell periphery due to the presence of vacuoles. Histochemically, the female rabbits of Bioassay 2 presented a decrease in the number of lipids and increased amount of glycogen. In addition, the hepatic cells of these rabbits showed activity of acid phosphatas... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

El estrés oxidativo ocasionado por la exposición de sujetos nativos a mediana altura por acción de los radicales libres de oxígeno, fue evaluado por la actividad de enzimas antioxidantes eritrocitarias. Se determinaron las actividades de las enzimas antioxidantes: Glutatión Peroxidasa (GPx), Superóxido Dismutasa (SOD) y Catalasa (CAT); y la concentración de Malondialdehído (MDA) como un indicador de la peroxidación lipídica, en eritrocitos de 60 personas aparentemente sanas: 30 residentes de mediana altura (Huaraz, 3050 msnm) y 30 residentes de nivel del mar (Lima, 154 msnm). Se encontró diferencia estadísticamente significativa entre la actividad de Superóxido dismutasa (SOD) de los nativos de mediana altura (938.4 ± 239.5 U /g Hb) y los de nivel del mar (769.3 ± 279.9 U /g Hb), (p<0,05); así como la actividad de la Catalasa (CAT) a mediana altura (110.7 ± 42.5 kU /g Hb) y los del nivel de mar (83.7 ± 40.4 kU /g Hb), (p<0.05). No se encontró diferencia estadísticamente significativa entre la actividad de la Glutatión peroxidasa (GPx) a mediana altura y nivel del mar (65.1 ± 25.7 U /g Hb vs. 56.4 ± 14.6 U /g Hb), respectivamente. La concentración de Malondialdehído en los nativos de mediana altura no mostraron diferencia estadística significativa (35.1 ± 21.7 μmoles /g Hb) con los de nivel del mar (27.1 ± 6.3 μmoles /g Hb), (p>0,05). La exposición a la mediana altura influye en la actividad de enzimas antioxidantes eritrocitarias, especialmente en la SOD y CAT que juegan un rol importante en la detoxificación de especies reactivas de oxigeno, lo que explicaría el incremento de su actividad a mediana altura. Palabras clave: Superóxido dismutasa, glutatión peroxidasa, catalasa, malondialdehído, peroxidación lipídica, hipoxia y estrés oxidativo en la altura. / --- The effect of oxidative stress by exposure to medium altitude native subjects by the action of oxygen free radicals was assessed by the activity of erythrocyte antioxidant enzymes. It was determined the levels of the antioxidants enzymes: Glutathione Peroxidase (GPx), Superoxide Dismutase (SOD) and Catalase (CAT); and the concentration of Malondialdehyde (MDA) like an indicator of the lipid peroxidation in erythrocytes of 60 seemingly healthy people: 30 residents at the medium altitude (Huaraz, 3050 m above sea level) and 30 residents at sea level (Lima, 154 m above sea level). It was found significant difference stadistic between the activity of Superoxide dismutase higher in the native of medium altitude (938.4 ± 239.5 U/g Hb) and people living at sea level (769.3 ± 279.9 U/g Hb), (p<0,05). The activity of catalase at medium altitude (110.7 ± 42.5 kU/g Hb) and people living at sea level (83.7 ± 40.4 kU/g Hb), (p<0.05). It was not found significant difference stadistic between the activity obtained of Glutathione Peroxidase at medium altitude and sea level (65.1 ± 25.7 U/g Hb vs. 56.4 ± 14.6 U/g Hb), respectively. The levels of Malondialdehyde in the native of medium altitude not significant diference (35.1 ± 21.7 μmoles/g Hb) that sea level obtained (27.1 ± 6.3 μmoles/g Hb), (p>0,05). Exposure to medium altitude influences the activity of erythrocyte antioxidant enzymes, especially SOD and CAT play an important role in the detoxification of reactive oxygen species, which may explain the increased activity at a medium altitude. Keys word: Superoxide dismutase, glutathione peroxidase, catalase, malondialdehyde, lipid peroxidation, hypoxia and oxidative stress at high altitude. Keys word: Superoxide dismutase, glutathione peroxidase, catalase, malondialdehyde, lipid peroxidation, hypoxia and oxidative stress at high altitude. / Tesis

El presente trabajo se realizó con el objetivo de inmovilizar la lipasa sobre el quitosano por medio de un enlace covalente usando la base de Schiff como unión entre la enzima, glutaraldehído y quitosano. El quitosano es un derivado de la quitina, ambos presentan múltiples áreas de aplicación. El quitosano se ha obtenido en el laboratorio a partir de la cubierta de “cangrejo” Cancer setosus por el método químico, siendo modificado en el proceso de desacetilación usando la autoclave. El quitosano obtenido presenta un alto grado de desacetilación 67,06 determinado por espectroscopía infrarroja y bajo porcentaje de proteína 0,5445 % determinado por el método de Bradford, siendo el soporte para la inmovilización de la lipasa con un rendimiento del proceso de inmovilización de 49,55 % y el rendimiento de reciclado de la enzima inmovilizada fue de 79,40 %, según el modelo basado en la generación de ácido oleico a partir de la hidrólisis del aceite de oliva. Palabras claves: Quitosano, autoclave, lipasa inmovilizada, espectroscopía infrarroja, actividad específica enzimática, ácido oleico. / Tesis