Orientador: Ana Maria Centola Vidal / Banca: Karina Paes Bürger / Banca: Andréia Cristina Nakashima Vaz / Resumo: O tratamento térmico por UAT elimina formas vegetativas dos microrganismos, porém, formas esporuladas altamente resistentes ao calor podem permanecer nos produtos e após a germinação dos esporos são capazes de liberar toxinas causadoras de doenças transmitidas por alimentos (DTAs). No presente estudo, objetivou-se avaliar a qualidade microbiológica de produtos tratados por UAT, por meio da contagem de microrganismos heterotróficos aeróbios mesófilos, isolamento e contagem de bactérias do grupo do Bacillus cereus e de Clostridium perfringens, comparar lotes dos três produtos quanto a tais microrganismos, identificar a espécie dos isolados e a presença dos fatores de virulência de bactérias do grupo do B. cereus. Para isso, foram obtidas 75 amostras, sendo 25 de cada produto (de leite de cabra UAT, alimento com soja UAT e bebida de leite de cabra e soja UAT), de 5 diferentes lotes, no comércio do interior do Estado de São Paulo. Os resultados evidenciaram possíveis falhas de processamento e utilização de matéria-prima inadequada, uma vez que altas populações (>104UFC/mL) de microrganismos heterotróficos aeróbios mesófilos foram verificadas em 100% dos lotes de alimento com soja e bebida de leite de cabra e soja e 80% dos lotes de leite de cabra. Microrganismos do grupo do B. cereus foram isolados de 80% dos lotes de alimento com soja, e 60% dos lotes de bebida de leite de cabra e soja e leite de cabra, com populações superiores a 1018 UFC/mL. C. perfringens foi isolado de 20% d... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Heat treatment by UHT (ultra-high temperature) eliminates the vegetative forms of microorganisms, however, sporulated forms highly resistant to heat can remain in the products and following spore germination are capable of releasing toxins that cause foodborne diseases (FD's). The objective of this study is to evaluate the microbiological quality of products submitted to UHT, namely goat milk, soy food, and goat and soy milk drinks, by the counting of heterotrophic aerobic mesophilic microorganisms, the isolation and counting of bacteria from the Bacillus cereus groups and Clostridium perfringens, comparing batches of the three products for such microorganisms, to identify the species of the isolated and the presence of the virulence factors of bacteria of the B. cereus group. For this, 75 samples were obtained, 25 of each product (from UAT goat milk, food with UAT soy and drink from goat milk and UAT soy) from 5 different lots, in the interior trade of the State of São Paulo. The results demonstrated possible failures in the processing and use of inadequate raw material since high population (>104 ) of heterotrophic aerobic mesophilic microorganisms were found in 100% of the lots of soy food and goat and soy milk drinks and 80% of the lots of goat milk. Microorganisms from the B. cereus group were isolated from 80% of the lots of soy food and 60% of the lots of goat and soy milk drinks, with population above 1018 . The C. perfringens microorganisms were isolated from 20% of the soy food lots, with population above 103 . In the comparison between the lots, the expiration date did not influence the population of the analyzed microorganisms, therefore, they were conveyed by the raw material used. Of the B. cereus isolated, 100% (29/29) showed amplification for the hbl complex gene, 96,5% (28/29) for the nhe complex gene and 75,8% (22/29) for t... Complete abstract click electronic access below / Mestre

Submitted by Reginaldo Soares de Freitas (reginaldo.freitas@ufv.br) on 2017-03-30T11:24:54Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 234148 bytes, checksum: e87c51395b549c59f32533fea0cc9040 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-03-30T11:24:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 234148 bytes, checksum: e87c51395b549c59f32533fea0cc9040 (MD5) Previous issue date: 2004-07-30 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Este trabalho teve como objetivo investigar a presença de Paenibacillus larvae subsp. larvae em mel de colméias do Estado do Piauí, pelo método analítico oficial brasileiro, e avaliar modificações nesta metodologia para reduzir seu limite de detecção. Esporos de P. larvae subsp. larvae não foram detectados em mel das colméias de diferentes regiões do Estado do Piauí. Comparando meios de cultura, o ágar P. larvae isolou maior número esporos desta bactéria presentes em mel e inibiu do mesmo modo contaminantes aeróbios presentes. A diluição de uma parte de mel em quatro partes de solução salina fosfatada tamponada recuperou maior número de esporos P. larvae subsp. larvae presentes em mel. As forças centrífugas 6000 g e 8000 por 30 ou 40 minutos não diferiram entre si, contudo recuperaram maior número de esporos de P. larvae subsp. larvae em comparação com a oficialmente recomendada. A redução no limite de detecção é relevante para analise de mel, principalmente, quando o patógeno encontra-se em quantidades mínimas, tanto na colméia quanto no produto comercializado. / This work had the following aims: detect the presence of Paenibacillus larvae subsp. larvae spores in honey collected in Piauí State apiaries using official Brazilian analytical method and to verify modifications in this methodology to reduce its detection limit. Spores of P. larvae subsp. larvae were not found in honey of hives from different regions of Piauí State. Comparing mediums, P. larvae agar isolated bigger spores quantities of these bacteria found in honey and inhibited, in the same way, other aerobical bacteria presented. Addition of one part of honey in four parts of phosphate buffer saline pH 7.2 isolated a bigger number of P. larvae subsp. larvae spores presented in honey. Comparisons between centrifuge forces of 6000 g and 8000 during 30 or 40 minutes showed that they were not different, however they recuperated a bigger number of P. larvae subsp. larvae spores than centrifuge force recommended in Brazilian law. Reduction in detection limit is important to honey analyses, mainly when pathogen is present in minimal quantities in hives or in commercialized product.

O leite produzido a ultra alta temperatura denominado oficiamente como UHT é o leite de maior aceitação no mercado consumidor brasileiro. Com a finalidade de ampliar o conhecimento sobre a segurança microbiológica do leite UHT, objetivou-se estudar tanto os Bacillus spp, que vêm sendo relatados como contaminantes do leite UHT no Brasil, como os eventuais esporos sobreviventes ao processamento. A partir de 65 análises de leite UHT para a determinação de microrganismos mesófilos aeróbios estritos e facultativos viáveis, no leite UHT procedente das indústrias sob Inspeção Federal no estado de São Paulo, 7 apresentaram contagens acima de 100 UFC/ml, indicando um percentual de 10,76 % de provas fora dos padrões para essa determinação, no período de jul a nov de 2003. Entretanto por atuação dos controles de qualidade das indústrias partidas foram inutilizadas e o leite que foi ao consumo apresentou 7,69% de microrganismos mesofílicos aeróbios acima dos padrões, sendo que 6.15% destes microrganismos foram considerados como Bacillus sporothermodurans. Dos isolamentos das contagens de microrganismos mesófilos acima dos padrões, foram efetuados estudos de seis cepas de Bacillus spp do leite UHT das indústrias, além de três cepas isoladas do leite UHT alvo de reclamações de consumidores procedente do Instituto Adolfo Lutz da capital de São Paulo. O objetivo do presente projeto foi, após a identificação cultural, microscópica, bioquímica e genética de culturas do Bacillus spp, estudar a patogenicidade das amostras em diversos modelos experimentais como: Teste do camundongo neonatos, alça ligada de coelho, inoculação intraperitoneal em camundongo BALB C e culturas celulares (Vero, HEp2 e Fibroblastos de Embrião de Galinha). As 3 amostras isoladas de leite de reclamações dos consumidores do Instituto Adolfo Lutz de São Paulo foram tipificadas preliminarmente pela técnica de Espectroscopia Infra-Vermelho a Transformada Fourier (FT- IR) como Bacillus flexus, enquanto que as amostras isoladas do leite procedente de três indústrias de São Paulo apresentaram presença de B. flexus e B.oleronius e Bacillus sporothermodurans. Exemplares de B.flexus testados quanto a patogenicidade apresentaram efeito citopático nas culturas celulares Vero, HEP2 e Fibroblastos de Embrião de Galinha e morbidade em camundongo BALB C. O Bacillus sporothermodurans não apresentou patogenicidade a nenhum dos modelos biológicos citados. / The milk produced at ultra high temperature, denominated UHT, is the most popular milk in the Brazilian market. With the intention of increasing the knowledge of microbiologic safety in UHT milk, we concentrated our study on the Bacillus spp, described as the most important contaminants of UHT milk in Brazil, and on possible survivors of the processing procedures. From the 65 analysis of UHT milk collected to determine the presence of strict, aerobe, mesophile microorganisms and viable options, coming from industries under Federal Inspection in São Paulo state, 7 presented a microbial count higher than 100CFU/ml, indicating a percentage of 10.76% samples outside the standard for this determination, in the period between July and November 2003. However, due to the quality control in industries, batches were rendered useless and the milk that went for consumption presented 7.69% mesophile microorganisms above standard, being these organisms 6.15% was considered Bacillus sporothermodurans. From the isolation of mesophile Bacillus counts above average, 5 strains Bacillus spp species from UHT industries were studied, as well as 3 strains isolated from UHT milk denounced by consumers of São Paulo city\'s Adolfo Lutz Institute. The aim of the project, following cultural, microscopic, biochemical and genetic identification of the Bacillus spp, was to study pathogenicity in samples from several experimental models, such as: neonatal mice; rabbit ileum loops, intraperitoneal inoculation of BALB C mice and cell cultures: Vero, Hep2 and Chick Embryo Fibroblasts. The three isolated samples of milk denounced by São Paulo consumers were typified as Bacillus flexus by the Fourier Infrared Transformed Espectroscopy (IF-FR) technique, while isolated samples of milk from 3 industries in São Paulo, accused the presence of the B. flexus, B. oleronius and Bacillus sporothermodurans. Samples of the B. flexus tested in terms of pathogenicity presented a citopatic effect upon cell cultures Vero, HeP2 and Chick Embryo Fibroblasts and a morbidity in mice BalbC. The Bacillus Sporothermodurans did not present pathogenicity in any of the biological models mentioned.

Esporos de Bacillus subtilis podem ser utilizados como veículos vacinais capazes de expressar ou adsorver proteínas heterólogas em sua superfície. Estudos recentes indicaram que esporos de B. subtilis também conferem um forte efeito adjuvante para vacinas baseadas em proteínas purificadas administradas por via parenteral. Nesse cenário, o objetivo do presente projeto foi avaliar o papel adjuvante dos esporos de B. subtilis e viabilizar sua utilização como carregadores de vacinas de DNA pelo método da biobalística (gene gun). Nesta metodologia, os esporos foram utilizados como substitutos das micropartículas de ouro usualmente empregadas, mantendo a capacidade de transfecção de células eucarióticas in vitro, e produção de anticorpos específicos em camundongos C57BL/6 imunizados com o plasmídeo vacinal pgDE7h (que codifica para uma forma atóxica da oncoproteína E7 do HPV-16). Além disso, esporos de B. subtilis foram capazes de ativar células dendríticas in vitro e, quando coadministrados a pgDE7h pela via intramuscular, conferiram um aumento de 50% na proteção anti-tumoral de animais previamente transplantados com a linhagem tumoral TC-1 (que expressa a proteína E7 do HPV-16), em uma relação dose-dependente. / Bacillus subtilis spores can be used as vaccine vehicles capable of to display or adsorb heterologous proteins in its surface. Recent studies have indicated that spores of B. subtilis confer a strong adjuvant effect for vaccines based on purified proteins administered by the parenteral route. In this scenario, the objective of this project is to evaluate the adjuvant role of B. subtilis spores e viabilize its use as DNA vaccine carriers of biolistic method (gene gun). In this methodology, the spores are used as gold microparticles substitutes usually employed, maintaining the ability to transfect eukaryotic cells in vitro and production of specific antibodies in C57BL / 6 mice immunized with the vaccine plasmid pgDE7h (encoding a non-toxic form of the E7oncoprotein of HPV-16). Additionally, spores of B. subtilis were able to activate dendritic cells in vitro when co-administered intramuscularly to pgDE7h, conferring an increase of 50% of anti-tumor protection in animals previously transplanted with the TC-1 tumor cell line (expressing the E7 protein of HPV-16) in a dose-dependent manner.

A análise microbiológica atua como ferramenta fundamental para a obtenção de dados sobre a qualidade, sanidade, higiene e segurança na produção de alimentos; desta forma, tem sido adotada na indústria alimentícia para o controle de qualidade. Por sua composição completa e balanceada, o leite é um substrato ideal para o desenvolvimento de diversos grupos de microrganismos. Com o objetivo de pesquisar bactérias da espécie Bacillus cereus em amostras de leite fluido, bem como a capacidade de germinação de esporos e a multiplicação dessa bactéria após processo de fervura, com manutenção das amostras à temperatura ambiente e à temperatura de refrigeração por períodos de 1, 2, 4, 6, 8, 10 e 12 horas, foram analisadas 75 amostras de leite, conforme as metodologias recomendadas por Silva et al. (2007). Destas, 46 amostras (61,3%) mostraram-se com algum grau de contaminação pela bactéria antes de serem submetidas à fervura. Por sua vez, as amostras mantidas à temperatura ambiente após a fervura, tiveram suas contagens bacterianas, principalmente a partir da 8a hora, superiores à contagem inicial, inclusive atingindo níveis capazes de desencadear uma toxinfecção alimentar, demonstrando a ocorrência da germinação dos esporos e a multiplicação das células vegetativas. Por outro lado, alíquotas dessas mesmas amostras mantidas sob refrigeração (7ºC) não atingiram populações preocupantes, enfatizando, desse modo, a importância da necessidade da refrigeração do leite após a fervura. / The microbiological analysis acts as basic tool for the attainment of data on the quality, health, hygiene and security in the food production, in such a way, she has been adopted in the nourishing industry for the quality control. For its complete and balanced composition, milk is an ideal substratum for the development of diverse groups of microorganisms. With the objective to search cereus bacteria of the Bacillus species in fluid milk samples, as well as the capacity of germination of spores and the multiplication of this bacterium after boil process, with maintenance of the samples to the ambient temperature and the temperature of refrigeration for periods of 1, 2, 4, 6, 8, 10 and 12 hours, 75 milk samples had been analyzed, as the methodologies recommended for Silva et al. (2007). Of these, 46 samples (61.3%) had revealed with some degree of contamination for the bacterium before being submitted to the boil. In turn, the samples kept to the ambient temperature after the boil, had its bacterial countings, mainly from 8a hour, superiors to the initial counting, also reaching levels capable to unchain an alimentary toxinfection, demonstrating to the occurrence of the germination of the spores and the multiplication of the vegetative cells. On the other hand, aliquot of these same samples kept under refrigeration (7ºC) had not reached preoccupying populations, emphasizing, in this manner, the importance of the necessity of the refrigeration of milk after the boil.

O S. mutans é o agente etiológico da cárie dental humana, uma doença com ampla distribuição mundial. A adesão à superfície dental depende da interação entre a proteína de superfície P1 e a aglutinina salivar (SAG) adsorvida ao dente. A região N-terminal da P1 é um alvo vacinal importante que está diretamente associada às funções de adesão e agregação. Este trabalho teve o objetivo de avaliar estratégias vacinais contra o S. mutans baseadas na proteína P1 usando linhagens recombinantes de B. subtilis. O B. subtilis é uma bactéria gram positiva, formadora de esporos, não patogênica, empregada como sistema de expressão de proteínas heterólogas e como veículo vacinal administrado por vias de mucosas. Empregamos o B. subtilis para expressar e purificar a proteína P139-512 derivada da proteína P1 de S. mutans UA159. O antígeno P139-512 apresentou epítopos lineares e conformacionais semelhantes aos presentes na proteína P1 nativa. O sítio de ligação à SAG está preservado nessa proteína assim como suas propriedades imunogênicas. A coadministração parenteral do antígeno com adjuvantes vacinais promoveu resposta sistêmica específica com anticorpos eficazes no bloqueio da adesão de S. mutans. Por fim, usamos esporos de B. subtilis como veículo de entrega de mucosa para o antígeno alvo de S. mutans. Esporos de B. subtilis foram modificados para expressar na superfície adesinas bacterianas (SlpA, InvA ou Inv600) com capacidade de ligação ao epitélio intestinal e, quando no estágio de célula vegetativa, expressar intracelularmente o antígeno P139-512. A imunização oral com os esporos adesivos induziu altas concentrações de anticorpos sistêmicos e de mucosa. A imunização nasal ou sublingual com os esporos recombinantes induziu níveis de anticorpos sistêmicos maiores do que aqueles obtidos após a imunização oral. Além disso, esses anticorpos foram mais eficientes em bloquear a adesão de S. mutans à SAG imobilizada, sem interferir com a agregação. Em conclusão, os resultados obtidos abrem perspectivas interessantes para o desenvolvimento de vacinas anti-cárie baseadas em linhagens de B. subtilis. / S. mutans is the major etiologic agent of human dental caries, a disease with worldwide distribution. The adhesion to the tooth surface is dependent on the interaction of the P1 surface protein and salivary agglutinin (SAG) adsorbed to the tooth. The N-terminal region of P1 is an important vaccine target that is directly associated with adhesion and aggregation functions. This study aimed to evaluate vaccination strategies against S. mutans based on the P1 protein using recombinant B. subtilis strains. B. subtilis is a gram positive, spore-forming, non-pathogenic bacterium used as expression system for heterologous proteins and as a vaccine vehicle administered by mucosal routes. Inicially, we employed a recombinant B. subtilis strain to express and purify the P139-512 protein derived from the S. mutans UA159 P1 protein. The P139-512 antigen showed important conformational and linear epitopes similar to those present in the native P1 protein. The SAG-binding site is preserved in P139-512 as well as immunological properties. The parenteral co-administration of antigen with vaccine adjuvants stimulated systemic antibodies effective in blocking adhesion of S. mutans to SAG. Lastly, we used B. subtilis spores as a mucosal delivery vehicle for antigen targeting. B. subtilis endospores were modified to display bacterial adhesins (SlpA, InvA or Inv600), capable to bind to the intestinal epithelium, on the spore surface and to express intracellularly the P139-512 antigen during the vegetative cell stage. Oral immunization with adhesives spores induced high systemic and mucosal specific antibodies levels. The nasal or sublingual immunization with B. subtilis recombinant spores induced higher amounts of systemic antibodies than the oral immunization. Furthermore, the specific antibodies were highly effective in blocking the adherence of S. mutans to immobilized SAG, without interfering with aggregation. In conclusion, the results open interesting perspectives for the development of anti-caries vaccines based on B. subtilis strains.

A transmissão de parasitas da malária por mosquitos vetores é dependente do desenvolvimento bem sucedido das formas infectantes de Plasmodium sp., especialmente os esporozoítas, que são as formas que infectam o hospedeiro vertebrado. A manipulação genética de mosquitos vetores tem sido uma estratégia alternativa na tentativa de controle da malária. Um componente extremamente importante desta estratégia é a escolha de uma molécula efetora capaz de reduzir a transmissão do patógeno. Microplusina é um peptídeo antimicrobiano rico em cisteína, originalmente descrito como um componente antimicrobiano da hemolinfa e dos ovos de carrapato bovino Rhipicephalus (Boophilus) microplus. Testes anteriores utilizando o modelo experimental mosquito Aedes aegypti infectado por Plasmodium gallinaceum mostraram que a microplusina é altamente tóxico para esporozoítas de Plasmodium gallinaceum em concentração relativamente baixa, sem apresentar toxicidade aos mosquitos vetores Aedes aegypti. Nosso objetivo foi analisar a expressão da microplusina e seu efeito na infecção de P. gallinaceum em mosquitos transgênicos. Obtivemos quatro linhagens através da integração de um transgene contendo a região promotora do gene da vitelogenina de Ae. aegypti, peptídeo sinal maltase-like I de Ae. aegypti e a sequência codificadora da microplusina (PMOS [3xP3-EGFP-AeVg Micro]). A atividade anti esporozoítas da microplusina expressa pelos mosquitos transgênicos mostrou diferença significante as linhagens. O desenho de novas moléculas utilizando como molde moléculas efetoras existentes e testadas, possibilitará o aperfeiçoamento da expressão de genes exógenos em mosquitos transgênicos, tornando-os refratários ao parasita. / Transmission of malaria parasites by mosquito vectors is dependent on the successful development of Plasmodium sp. infective forms, particularly the sporozoites, which are the forms that enter the vertebrate host. The genetic manipulation of mosquito vectors has been a strategy for malaria control. An extremely important component of this strategy is the effector molecule of choice which reduces parasite transmission. Microplusin is a cysteine-rich antimicrobial peptide originally described as an hemolymph and eggs antimicrobial component of the cattle tick Boophilus microplus. Previous tests using the experimental model Plasmodium gallinaceum infected Aedes aegypti showed that microplusin is highly toxic to P. gallinaceum sporozoites in relatively low concentration, without showing toxicity to the mosquito vector A. aegypti. Our goal was to analyze transgenic mosquitoes expressing microplusin and its effect on infection of P. gallinaceum. We obtained four lines through the integration of transgene that containing the promoter region of the A. aegypti vitelogenin gene, the maltase-like I signal peptide of A. aegypti and microplusin coding sequence (pMos[3xP3-EGFPAeVg-Micro]). The activity anti sporozoites microplusin expressed by transgenic mosquitoes showed significant differences between strains. The design of effector molecules using information from existing and tested molecules as template will enable the improvement of the expression of foreign genes in transgenic mosquitoes, making them resistant to the parasite.

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2017-04-27T13:11:40Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 832503 bytes, checksum: c9ddb50df4ac046edfb1b18f02406400 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-04-27T13:11:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 832503 bytes, checksum: c9ddb50df4ac046edfb1b18f02406400 (MD5) Previous issue date: 2004-03-23 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais / Extratos enzimáticos de diferentes fungos foram avaliados quanto à maceração de raízes, a fim de se extrair mais fácil e rapidamente fêmeas de Meloidogyne spp. para estudos de controle biológico e para a identificação de espécies por eletroforese de isoenzimas. Raízes de tomateiro infectadas por Meloidogyne javanica foram imersas em extrato enzimático produzidas pelos fungos Aspergillus niger, Penicillium griseoroseum ou Penicillium italicum, separadamente ou em mistura de 50% de enzimas de cada fungo, em combinações de dois a dois, ou em tampão fosfato (testemunha), e incubadas a 30oC/24h. As enzimas produzidas pelo fungo P. griseoroseum foram as mais eficientes na degradação da parede das células das raízes de tomateiro, equiparando-se às enzimas comerciais importadas, pectinase + celulase (Clarex, Miles do Brasil - 15.000 ajdv/g; Sigma Chemical Ltda- 5.000 un.), utilizadas para a extração de fêmeas de Meloidogyne spp. Raízes com galhas parasitadas com as espécies M. incognita, M. javanica ou M. arenaria foram imersas em tampão de acetato de sódio apenas ou com enzimas liofilizadas de P. griseoroseum, em diferentes concentrações, e incubadas a 40°C/24h. A atividade de 200 U/mL proporcionou maior liberação de fêmeas, e essas foram submetidas à eletroforese de isoenzimas. Não foram observadas bandas, em gel de poliacrilamida, de fêmeas retiradas pela incubação em enzimas fúngicas, mas bandas foram vistas quando as fêmeas foram retiradas manualmente. Para avaliar o efeito das enzimas na adesão de endósporos aos juvenis de M. javanica, fêmeas foram retiradas manualmente e por maceração enzimática a 200 U/mL. Os endósporos de fêmeas extraídas por digestão enzimática apresentaram maior adesão a J2 de M. javanica em relação à testemunha. A reprodução dos endósporos de P. penetrans em fêmeas de M. javanica não foi afetada pela enzima. Para melhorar a quantificação de endósporos de P. penetrans em pó de raiz utilizado como inóculo para aplicação da bactéria no campo, as enzimas a 2% e 20% foram adicionadas a 2g do pó de raiz com P. penetrans e incubados a 40°C. O extrato enzimático na concentração de 20%, independente do tempo de incubação, possibilitou observar maior número de endósporos. O uso de enzimas fúngicas para a extração de fêmeas de Meloidogyne spp., demonstrou ser bastante eficiente e vantajoso, sem prejudicar a adesão e multiplicação de P. penetrans no nematóide; porém, não é recomendada para a identificação de M. javanica, M. incognita e M. arenaria por eletroforese de isoenzimas. / Enzymatic extracts from different fungi were evaluated for root maceration as an easier and faster way of extracting Meloidogyne spp. females from roots, to be used in biological control studies and in species identification by isozyme electrophoresis. Tomato roots infected by M. javanica were immersed in enzymatic extracts produced by Aspergillus niger, Penicillium griseoroseum or P. italicum, separately or in mixtures of 50% of enzymatic extracts of each fungus, two by two, or in phosphate buffer (control), and incubated at 30oC/24h. The enzymes produced by the fungus P. griseoroseum were the most efficient in the degradation of the tomato root cell walls, being comparable to the imported commercial enzymes pectinase + celulase (Clarex, Miles do Brasil - 15.000 ajdv/g; Sigma Chemical Ltda- 5.000 un.) used for Meloidogyne spp. females extraction. Galled roots parasitized by M. incognita, M. javanica or M. arenaria were immersed in sodium acetate buffer alone or with lyophilized enzymes of P. griseoroseum in different concentrations and incubated at 40°C/24h. The number of 200 U/mL of enzyme preparation provided the best female release, and the females attained using this concentration were subjected to isozyme electrophoresis analysis. No bands could be seen from the females extracted by incubation in fungal enzymes, in the poliacrilamide gel, but typic bands formed from females extracted manually. In order to evaluate the effect of enzymatic extraction on the attachment of endospores on second-stage juveniles (J2) of M. javanica, nematode females parasitized with Pasteuria penetrans were extracted from the roots manually or by maceration in enzyme extract at 200 U/mL. The endospores from females extracted by enzimatic digestion attached in higher number to the M. javanica J2 when compared to the control treatment. The endospore production in M. javanica females was not affected by the enzymes. To improve the endospore counting in root powder used as carrier for field applications, the enzymes at 2% and 20% were added to 2g of root powder containing P. penetrans endospores, and incubated at 40 °C. The enzyme extract at 20%, independent of the incubation time, allowed to observe a higher number of endospores. The use of fungal enzymes to extract Meloidogyne spp. showed to be very efficient and advantageous, without disturbing attachment or reproduction of P. penetrans in the nematode, however, it is not recommended for the identification of M. javanica, M. incognita nor M. arenaria by isozyme electrophoresis. / Dissertação importada do Alexandria

A transmissão de parasitas da malária por mosquitos vetores é dependente do desenvolvimento bem sucedido das formas infectantes de Plasmodium sp., especialmente os esporozoítas, que são as formas que infectam o hospedeiro vertebrado. A manipulação genética de mosquitos vetores tem sido uma estratégia alternativa na tentativa de controle da malária. Um componente extremamente importante desta estratégia é a escolha de uma molécula efetora capaz de reduzir a transmissão do patógeno. Microplusina é um peptídeo antimicrobiano rico em cisteína, originalmente descrito como um componente antimicrobiano da hemolinfa e dos ovos de carrapato bovino Rhipicephalus (Boophilus) microplus. Testes anteriores utilizando o modelo experimental mosquito Aedes aegypti infectado por Plasmodium gallinaceum mostraram que a microplusina é altamente tóxico para esporozoítas de Plasmodium gallinaceum em concentração relativamente baixa, sem apresentar toxicidade aos mosquitos vetores Aedes aegypti. Nosso objetivo foi analisar a expressão da microplusina e seu efeito na infecção de P. gallinaceum em mosquitos transgênicos. Obtivemos quatro linhagens através da integração de um transgene contendo a região promotora do gene da vitelogenina de Ae. aegypti, peptídeo sinal maltase-like I de Ae. aegypti e a sequência codificadora da microplusina (PMOS [3xP3-EGFP-AeVg Micro]). A atividade anti esporozoítas da microplusina expressa pelos mosquitos transgênicos mostrou diferença significante as linhagens. O desenho de novas moléculas utilizando como molde moléculas efetoras existentes e testadas, possibilitará o aperfeiçoamento da expressão de genes exógenos em mosquitos transgênicos, tornando-os refratários ao parasita. / Transmission of malaria parasites by mosquito vectors is dependent on the successful development of Plasmodium sp. infective forms, particularly the sporozoites, which are the forms that enter the vertebrate host. The genetic manipulation of mosquito vectors has been a strategy for malaria control. An extremely important component of this strategy is the effector molecule of choice which reduces parasite transmission. Microplusin is a cysteine-rich antimicrobial peptide originally described as an hemolymph and eggs antimicrobial component of the cattle tick Boophilus microplus. Previous tests using the experimental model Plasmodium gallinaceum infected Aedes aegypti showed that microplusin is highly toxic to P. gallinaceum sporozoites in relatively low concentration, without showing toxicity to the mosquito vector A. aegypti. Our goal was to analyze transgenic mosquitoes expressing microplusin and its effect on infection of P. gallinaceum. We obtained four lines through the integration of transgene that containing the promoter region of the A. aegypti vitelogenin gene, the maltase-like I signal peptide of A. aegypti and microplusin coding sequence (pMos[3xP3-EGFPAeVg-Micro]). The activity anti sporozoites microplusin expressed by transgenic mosquitoes showed significant differences between strains. The design of effector molecules using information from existing and tested molecules as template will enable the improvement of the expression of foreign genes in transgenic mosquitoes, making them resistant to the parasite.

Com este estudo, objetivou-se avaliar o efeito de estirpes de Bacillus thuringiensis (Bt) na degradabilidade e digestibilidade da dieta, emissão de gases, microbiota ruminal, parâmetros sanguíneos e desempenho de ovinos. O estudo foi dividido em 2 experimentos: ensaio in vitro de produção de gases para a avaliação de 6 diferentes estirpes de Bt (907, 1192, 2036, 2493, 2496 e S1185) e ensaio in vivo com a estirpe selecionada 2036 para investigação de possíveis interferências na digestão e saúde dos animais. A simulação do ambiente ruminal foi realizada em garrafas de vidro incubadas a 39 oC por 24 h. O delineamento foi o inteiramente casualizado com 7 tratamentos (Sem Bt (controle), Bt 907, Bt 1192, Bt 2036, Bt 2493, Bt 2496 e Bt S1185) com 4 repetições em duplicata. O processo fermentativo foi avaliado pelos resultados de matéria seca degradada (MSD), matéria orgânica degradada (MOD), produção líquida de gases totais, produção líquida de metano e eficiência da conversão de metano. Produtos da fermentação (pH, nitrogênio amoniacal (N-NH3) e ácidos graxos de cadeia curta (AGCC)) e micro-organismos ruminais (Fibrobacter succinogenes, Ruminococcus flavefaciens, fungos anaeróbicos, arqueas metanogênicas e protozoários) também foram estudados. Apenas a estirpe Bt 907 reduziu a MSD e MOD em relação ao controle, com manutenção da população de F. succinogenes, pois as demais estirpes reduziram a população desta bactéria. No ensaio in vivo 20 cordeiros Santa Inês com 3 meses de idade e 18 ± 3,5 kg PV foram utilizados e divididos em 2 grupos: 10 animais tratados com 2,5x106 esporos de Bt 2036 por kg PV/d e 10 animais não tratados (controle). Estes foram alojados em baias individuais em delineamento inteiramente casualizado e receberam dieta composta de feno de capim Tifton-85 (Cynodon spp.) ad libitum e 300 g/animal/d de concentrado, que foi ajustado de acordo com as exigências de crescimento. O período experimental in vivo teve duração de 63 dias, dos quais 53 compreendeu o teste de desempenho dos animais, com aferição do consumo 3 vezes na semana e pesagem quinzenal, e os 10 dias subsequentes destinou-se aos ensaios de digestibilidade aparente, balanço de nitrogênio, síntese de proteína microbiana e emissão de metano entérico. Durante todo o experimento, coletas se sangue foram realizadas quinzenalmente a fim de avaliar os parâmetros hematológicos (hemácias, hemoglobina, hematócrito e leucócitos) e bioquímicos (glicose, proteínas totais, albumina, aspartato aminotransferase, ureia e creatinina) dos animais para o diagnóstico de possível intoxicação. Características da fermentação ruminal também foram investigadas em 3 momentos (início, meio e fim do experimento) sobre as variáveis pH, N-NH3, AGCC, abundância relativa das espécies F. succinogenes, R. flavefaciens, populações de arqueas metanogênicas, fungos anaeróbicos e contagem de protozoários, por meio de coletas de líquido ruminal. Não houve influência da estirpe sobre as variáveis estudadas. Conclui-se que na avaliação in vitro apenas a estirpe Bt 907 reduziu a MSD e MOD com manutenção da população F. succinogenes e no experimento in vivo a inclusão de esporos de Bt 2036 na dieta não afetou de forma negativa o desempenho e nem a saúde dos ovinos / The objective of present study was to evaluate the effect of Bacillus thuringiensis (Bt) strains on degradability and digestibility of the diet, gas production, ruminal fermentation, blood parameters and performance in sheep. The study was divided into 2 experiments: in vitro gas production to evaluate six different Bt strains (907, 1192, 2036, 2493, 2496 and S1185) and in vivo assay with the selected strain (Bt 2036) to investigate possible interference in digestion and health of animals. The rumen simulation was performed in glass bottles incubated at 39 °C for 24 h. A completely randomized design with 7 treatments (No Bt (control), Bt 907, Bt 1192, Bt 2036, Bt 2493, Bt 2496 and Bt S1185) was used, with 4 replications in duplicate. The fermentation process was evaluated using dry matter degradability (DMD), organic matter degradability (OMD), net gas production, methane output and conversion efficiency. Fermentation products (pH, ammonia nitrogen (N-NH3), short chain fatty acids (SCFA)) and ruminal microorganisms (Fibrobacter succinogenes, Ruminococcus flavefaciens, anaerobic fungi, methanogenic archaea and protozoa) were also studied. Only strain Bt 907 reduced DMD and OMD in relation to the control and F. succinogenes populations were maintained, whereas other strains of this bacterium population were reduced. An in vivo assay using 20 Santa Ines lambs at 3 months of age and 18 ± 3.5 kg BW was carried out. These animals were divided into 2 groups: 10 animals treated with 2.5x106 spores of Bt 2036 per kg BW/d and 10 untreated animals (control). These were housed in individual pens in a completely randomized design and were fed a diet of Tifton-85 (Cynodon spp.) hay ad libitum and 300 g/animal/d of concentrate, which was adjusted according to animal growth. The in vivo experimental period lasted 63 days, of which 53 included the performance test of the animals, with measurement of feed consumption three times a week and fortnightly weighing. The final 10 days was devoted to tests of digestibility, nitrogen balance, microbial protein synthesis and enteric methane emission. Throughout the experiment, blood was collected fortnightly to assess hematological parameters (erythrocytes, hemoglobin, packed cell volume and leukocytes) and biochemical profiles such as (Glucose, total protein, albumin, aspartate aminotransferase, urea and creatinine) for the diagnosis of possible intoxication. Ruminal fermentation characteristics were investigated at three times (Initial, middle and end of the experiment) using pH, N-NH3, SCFA, microorganism population size (such as F. succinogenes, R. flavefaciens, methanogenic archaea, anaerobic fungi and protozoa) through ruminal fluid collections. There was no influence of Bt 2036 on ruminal fermentation characteristics. It is concluded that, for the in vitro evaluation, only strain Bt 907 reduced DMD and OMD, with F. succinogenes population being maintained and for the in vivo studies, the inclusion of Bt 2036 spores in the diet did not negatively affect health and performance of lambs