El estrés oxidativo ocasionado por la exposición de sujetos nativos a mediana altura por acción de los radicales libres de oxígeno, fue evaluado por la actividad de enzimas antioxidantes eritrocitarias. Se determinaron las actividades de las enzimas antioxidantes: Glutatión Peroxidasa (GPx), Superóxido Dismutasa (SOD) y Catalasa (CAT); y la concentración de Malondialdehído (MDA) como un indicador de la peroxidación lipídica, en eritrocitos de 60 personas aparentemente sanas: 30 residentes de mediana altura (Huaraz, 3050 msnm) y 30 residentes de nivel del mar (Lima, 154 msnm). Se encontró diferencia estadísticamente significativa entre la actividad de Superóxido dismutasa (SOD) de los nativos de mediana altura (938.4 ± 239.5 U /g Hb) y los de nivel del mar (769.3 ± 279.9 U /g Hb), (p<0,05); así como la actividad de la Catalasa (CAT) a mediana altura (110.7 ± 42.5 kU /g Hb) y los del nivel de mar (83.7 ± 40.4 kU /g Hb), (p<0.05). No se encontró diferencia estadísticamente significativa entre la actividad de la Glutatión peroxidasa (GPx) a mediana altura y nivel del mar (65.1 ± 25.7 U /g Hb vs. 56.4 ± 14.6 U /g Hb), respectivamente. La concentración de Malondialdehído en los nativos de mediana altura no mostraron diferencia estadística significativa (35.1 ± 21.7 μmoles /g Hb) con los de nivel del mar (27.1 ± 6.3 μmoles /g Hb), (p>0,05). La exposición a la mediana altura influye en la actividad de enzimas antioxidantes eritrocitarias, especialmente en la SOD y CAT que juegan un rol importante en la detoxificación de especies reactivas de oxigeno, lo que explicaría el incremento de su actividad a mediana altura. Palabras clave: Superóxido dismutasa, glutatión peroxidasa, catalasa, malondialdehído, peroxidación lipídica, hipoxia y estrés oxidativo en la altura. / --- The effect of oxidative stress by exposure to medium altitude native subjects by the action of oxygen free radicals was assessed by the activity of erythrocyte antioxidant enzymes. It was determined the levels of the antioxidants enzymes: Glutathione Peroxidase (GPx), Superoxide Dismutase (SOD) and Catalase (CAT); and the concentration of Malondialdehyde (MDA) like an indicator of the lipid peroxidation in erythrocytes of 60 seemingly healthy people: 30 residents at the medium altitude (Huaraz, 3050 m above sea level) and 30 residents at sea level (Lima, 154 m above sea level). It was found significant difference stadistic between the activity of Superoxide dismutase higher in the native of medium altitude (938.4 ± 239.5 U/g Hb) and people living at sea level (769.3 ± 279.9 U/g Hb), (p<0,05). The activity of catalase at medium altitude (110.7 ± 42.5 kU/g Hb) and people living at sea level (83.7 ± 40.4 kU/g Hb), (p<0.05). It was not found significant difference stadistic between the activity obtained of Glutathione Peroxidase at medium altitude and sea level (65.1 ± 25.7 U/g Hb vs. 56.4 ± 14.6 U/g Hb), respectively. The levels of Malondialdehyde in the native of medium altitude not significant diference (35.1 ± 21.7 μmoles/g Hb) that sea level obtained (27.1 ± 6.3 μmoles/g Hb), (p>0,05). Exposure to medium altitude influences the activity of erythrocyte antioxidant enzymes, especially SOD and CAT play an important role in the detoxification of reactive oxygen species, which may explain the increased activity at a medium altitude. Keys word: Superoxide dismutase, glutathione peroxidase, catalase, malondialdehyde, lipid peroxidation, hypoxia and oxidative stress at high altitude. Keys word: Superoxide dismutase, glutathione peroxidase, catalase, malondialdehyde, lipid peroxidation, hypoxia and oxidative stress at high altitude. / Tesis

Grado de magíster en ciencias médicas y ciencias biológicas / Más de 140 millones de personas residen en un ambiente hipóxico por sobre los 2500 m de altura, susceptibles a desarrollar alteraciones cardiovasculares. Este ambiente es más riesgoso cuando afecta la adecuada transición feto-neonato en la etapa perinatal, siendo capaz de generar hipertensión pulmonar del recién nacido. El estrés oxidativo, es uno de los mecanismos a través del cual la hipoxia genera daño vascular. Por otro lado, melatonina es una neurohormona con importantes propiedades antioxidantes. Como la hipertensión pulmonar neonatal actualmente carece de tratamiento definitivo, esta tesis propone utilizar melatonina, como tratamiento emergente para reducir el estrés oxidativo pulmonar generado por la hipoxia crónica en neonatos gestados y nacidos en altura. Como modelo experimental se utilizaron recién nacidos de oveja gestados y nacidos a 3.600 m, constituyendo 2 grupos, uno control (vehículo 0,5 ml.kg-1.d-1 v.o., CN, n=6) y un grupo tratado con melatonina (1 mg.kg-1.d-1 v.o., MN, n=6), recibiendo tratamiento por 8 días. Al final del tratamiento (12 días de edad) los neonatos se eutanizaron para obtener muestras de tejido pulmonar y realizar medición de actividad de enzimas antioxidantes, marcadores de estrés oxidativo y el factor de transcripción Nrf2. Los resultados muestran que melatonina logró aumentar el mRNA de las enzimas antioxidantes superóxido dismutasa 2 (SOD2), catalasa (CAT) y glutatión peroxidasa 3 (GPx3) e incrementó la actividad de CAT. Además, los animales tratados con melatonina mostraron menores niveles de productos de lipoperoxidación, con disminución de los de 8-isoprostanos y menor expresión de 4- HNE. Los resultados de esta tesis confirman la capacidad antioxidante de melatonina, atribuyéndole aún más un rol como emergente antioxidante y potencialmente útil coadyuvante en el tratamiento de la hipertensión pulmonar neonatal. / More than 140 million people inhabit in hypoxic environments over 2500 m of altitude, susceptible to develop cardiovascular disorders. This condition involves a higher risk when affecting the normal fetal – neonatal transition in the perinatal period, inducing pulmonary hypertension of the newborn. Oxidative stress is one of the hypoxic-induced mechanisms that cause vascular damage. Conversely, melatonin is a neurohormone with important antioxidant properties. As neonatal pulmonary hypertension currently has no definitive treatment, this thesis put forward the therapeutic use of melatonin as an emerging treatment for reducing pulmonary oxidative stress caused by chronic hypoxia in neonates gestated and born at high altitude. As experimental model we used newborn sheep gestated and born at 3,600 m. Two groups were constituted, one control (vehicle 0,5 ml.kg-1.d-1 orally, CN, n=6) another treated with melatonin (1 mg.kg-1.d-1 orally, MN, n=6), both treated for 8 days. At the end of treatment (12 days old), the neonates were euthanized obtaining lung tissue samples to perform antioxidant enzymes analysis, oxidative stress biomarkers and expression of the transcription factor Nrf2. The results show that melatonin increases the mRNA for the antioxidant enzymes superoxide dismutase 2 (SOD2), catalase (CAT) and glutathione peroxidase 3 (GPx3) and enhances CAT activity. Also, melatonin treated animals show decreased levels of lipoperoxidation products, with decreased 8-isoprostanes and 4-HNE. These thesis outcomes, support melatonin antioxidant capacity and establish melatonin as an emerging antioxidant potentially useful as coadyuvant in treating neonatal pulmonary hypertension.

La acumulación de hierro (Fe) y el estrés oxidativo son eventos patognomónicos de las retinas de pacientes que padecen degeneración macular relacionada con la edad (AMD, del inglés age-related macular degeneration). En este trabajo de tesis hemos caracterizado un modelo de sobrecarga de Fe en retinas bovinas incubadas in vitro con la finalidad de estudiar los eventos que ocurren en la degeneración retiniana provocada por el estrés oxidativo. Específicamente, hemos estudiado la función de las siguientes isoformas de la fosfolipasa A2 (PLA2): la isoforma citosólica (cPLA2), la isoforma independiente de calcio (iPLA2) y la isoforma secretoria (sPLA2), durante la toxicidad retiniana inducida por Fe2+. También analizamos las implicancias de las diferentes PLA2s en la regulación de la ciclooxigenasa (COX)-2, el factor de transcripción nuclear kappa B (NF-κB, del inglés nuclear factor kappa B) y las proteínas quinasas activadas por mitógenos (MAKP, del inglés mitogen-activated protein kinase). En retinas enteras aisladas y expuestas a concentraciones crecientes de Fe2+ (25, 200 o 800 M) o a su vehículo, logramos determinar cuál es la incorporación efectiva de Fe por medio de técnicas analíticas e histoquímicas (espectrometría de emisión atómica por plasma de acoplamiento inductivo y tinción de Perls). El estrés oxidativo asociado a esta incorporación fue evaluado a través del estudio de diversos parámetros, tales como los niveles de peroxidación lipídica, la generación de dienos conjugados, la funcionalidad mitocondrial, la capacidad antioxidante de la retina, y la integridad de la membrana celular. La incorporación de Fe en las retinas fue dependiente de la concentración de Fe2+ utilizada en cada incubación. Esta acumulación de Fe produjo un incremento tiempo- y concentración-dependiente en los niveles de peroxidación lipídica de la retina. Por su parte, la viabilidad mitocondrial solo se vio afectada en menor grado luego de 60 minutos de exposición a la injuria oxidativa. Los niveles de dienos conjugados sufrieron un incremento tiempo-dependiente en tanto que la capacidad de captación de radicales libres solo se vio afectada a altas concentraciones de Fe2+. En concordancia con estos resultados, se observó que la pérdida de la integridad de la membrana celular evidencia un leve incremento en las retinas expuestas a todas las concentraciones de Fe2+ consideradas. Los niveles de peroxidación lipídica, la viabilidad celular y la pérdida de integridad de la membrana celular también fueron analizados en presencia de inhibidores específicos de las distintas isoformas de la PLA2, a saber araquidonoil trifluorometil cetona (ATK, del inglés arachidonoyl trifluoromethyl ketone –inhibidor de la cPLA2–), bromoenol lactona (BEL, del inglés bromoenol lactone –inhibidor de la iPLA2–) e YM 26734 (inhibidor de la sPLA2). La pre-incubación de las retinas con ATK provocó una disminución de los niveles de peroxidación lipídica y también una inhibición de la activación de las proteínas quinasas reguladas por señal extracelular (ERK1/2, del inglés extracellular signal-regulated kinase) a bajas y medianas concentraciones de Fe2+. Por su parte, el inhibidor BEL provocó un aumento en los niveles de peroxidación lipídica y retrasó la activación de las ERK1/2. En cuanto al inhibidor YM 26743, si bien este no demostró tener efecto alguno en la peroxidación lipídica, sí demostró tener la capacidad de retrasar la activación de las ERK1/2. También fue posible observar que ninguno de estos inhibidores afecta la viabilidad celular ni la permeabilidad de la membrana plasmática. Se detectó también una liberación diferencial de ácido araquidónico (AA, del inglés arachidonic acid) y de ácido palmítico (PAL, del inglés palmitic acid) catalizada por la cPLA2 y la iPLA2, respectivamente, en las fracciones microsomales y citosólicas obtenidas a partir de retinas incubadas con Fe2+. En el caso de la cPLA2, demostramos que, en respuesta a la incubación con Fe2+, la forma activa (la forma fosforilada en los residuos de Serina 505) se encuentra asociada principalmente a las fracciones citosólicas y que dicha asociación disminuye en las fracciones microsomales. Fue posible demostrar también que el perfil de liberación de AA producido por la actividad de la cPLA2 se encuentra regulado por acción de las ERK1/2 ya que la inhibición de estas quinasas por medio del inhibidor U0126 provocó la completa abolición de la liberación diferencial del AA. Por otra parte, observamos que la liberación de AA disminuye a la vez que la asociación de la proteína COX-2 aumenta en los microsomas de las retinas expuestas al Fe2+. Se observó también que la sPLA2 se localiza en la fracción citosólica de manera concentración-dependiente. Mediante ensayos de inmunoprecipitación fue posible observar que aumenta la asociación entre la sPLA2 y la proteína COX-2 en las retinas expuestas a la sobrecarga de Fe2+. Sin embargo, a pesar de la mayor asociación de esta proteína con la sPLA2, la generación de prostaglandinas se vio disminuida. Al estudiar los niveles de p65 (RelA) NF-κB encontramos que estos aumentan en las fracciones nucleares de las retinas expuestas a Fe2+. En presencia de los inhibidores ATK e YM 26734, observamos que la localización nuclear de ambas subunidades de NF-κB, p65 y p50, es restaurada a los niveles control en las retinas expuestas al estrés oxidativo inducido por Fe2+. 4 Resumen Los mecanismos de reparación de la membrana también fueron analizados mediante el estudio de la participación de las aciltransferasas en la remodelación fosfolipídica que ocurre durante el estrés oxidativo sufrido por la retina. Los fosfolípidos acídicos, tales como el fosfatidilinositol (PI) y la fosfatidilserina (PS), mostraron una inhibición en el perfil de acilación en las retinas expuestas a Fe2+ mientras que la fosfatidiletanolamina (PE) mostró resultados opuestos. El uso de inhibidores de la PLA2 demostró que la PS es activamente deacilada durante el estrés oxidativo inducido por Fe2+. Nuestros resultados demuestran que las distintas isoformas de la PLA2 participan en diferentes mecanismos regulatorios en este modelo experimental que mimetiza la DME del siguiente modo: i) la cPLA2 promueve el daño inducido por el estrés oxidativo dado que cumple una función en la señalización inflamatoria, liberando AA. ii) La iPLA2 tiene un rol protector debido a que interviene en la remodelación de las membranas mediante la remoción de los ácidos grasos peroxidados, lo cual atenúa los efectos nocivos del Fe2+ sobre las membranas celulares. iii) La sPLA2 Grupo V tiene múltiples blancos intracelulares relacionados con la respuesta inflamatoria porque participa en la regulación del factor NF-κB y de la proteína COX-2. Los hallazgos aquí presentados aportan nuevos conocimientos acerca de los mecanismos moleculares que operan en la degeneración retiniana inducida por el estrés oxidativo. / Iron (Fe) accumulation and oxidative stress are hallmarks of retinas in patients with age-related macular degeneration (AMD). In this thesis work we have characterized an in vitro model of iron-overloaded bovine retinas for the study of retinal degeneration during iron-induced oxidative stress. In particular, we have studied the role of the different phospholipase A2 (PLA2) isoforms, namely cytosolic isoform (cPLA2), calcium-independent isoform (iPLA2) and secretory isoform (sPLA2) during iron-induced retinal toxicity. Furthermore, we have analyzed the implications of PLA2s in the regulation of cyclooxigenase (COX)-2, nuclear factor kappa B (NF-κB) and MAPK pathways. In isolated retinas exposed to increasing Fe2+ concentrations (25, 200 or 800 M) or its vehicle, the effective iron incorporation into retinas was analyzed by means of analytical and histochemical techniques (inductively coupled plasma atomic emission spectroscopy and Perls´ staining). Oxidative stress associated to this incorporation was also analyzed taking into account several parameters, such as lipid peroxidation and conjugated diene levels, mitochondrial function, anti-oxidant ability and cell membrane integrity. Fe accumulation led to a time- and concentration-dependent increase in retinal lipid peroxidation levels whereas retinal cell viability was only affected after 60 minutes of oxidative injury. Conjugated diene levels underwent a time-dependent increase whereas radical scavenging ability was only affected at high Fe2+ concentrations. In agreement with these results, cell membrane integrity was slightly increased at all Fe2+ concentrations. Retinal lipid peroxidation, cell viability and cell membrane integrity were also analyzed in the presence of specific PLA2 isoform inhibitors, namely arachidonoyl trifluoromethyl ketone (ATK, cPLA2 inhibitor), bromoenol lactone (BEL, iPLA2 inhibitor) and YM 26734 (sPLA2 inhibitor). ATK was found to decrease lipid peroxidation levels as well as ERK1/2 activation. BEL showed the same effect on ERK1/2 activation but the opposite effect on lipid peroxidation. YM 26743 was observed to have no effect on lipid peroxidation although it demonstrated to have the ability to delay ERK1/2 activation. None of these inhibitors was found to affect either cell viability or cell membrane permeability. A differential release of arachidonic acid (AA) and palmitic acid (PAL), catalized by cPLA2 and iPLA2 activities, respectively, was also observed in microsomal and cytosolic fractions obtained from Fe2+-incubated retinas. In the case of cPLA2, we demonstrated that in response to Fe2+ incubation, the active form (the phosphorylated form) is associated mainly to the cytosolic fraction whereas this association is lower in the microsomal fraction. We also demonstrated that AA release profile caused by cPLA2 activity is regulated through ERK1/2 action as shown by the complete abolition of AA differential release through ERK 1/2 inhibition. It was also observed that AA release decreases whereas COX-2 association increases in microsomes of the retinas exposed to Fe2+. It could also be observed that sPLA2 is localized in the cytosolic fraction in a concentration-dependent manner. Via immunoprecipitation assays we demonstrated an increase in the association between sPLA2 and COX-2 in the retinas exposed to Fe2+ overload. Furthermore, in spite of the higher association of COX-2 with sPLA2, prostaglandins generation was found to decrease. The analysis of p65 (RelA) NF-κB levels showed that they increased in the nuclear fractions from the retinas exposed to Fe2+. In the presence of ATK and YM 26734, the nuclear localization of both p65 and p50 NF-κB subunits was found to be restored to control levels in the retinas exposed to Fe2+-induced oxidative stress. Membrane repair mechanisms were also analyzed by studying the participation of acyltransferases in phospholipid remodeling during retinal oxidative stress. Acidic phospholipids, such as phosphatidylinositol (PI) and phosphatidylserine (PS), were observed to show an inhibited acylation profile in the retinas exposed to Fe2+ whereas phosphatidylethanolamine (PE) showed exactly the opposite. The use of PLA2 inhibitors demonstrated that PS is actively deacylated during Fe2+-induced oxidative stress. Our results demonstrate that the PLA2 isoforms analyzed in this Ph. D. thesis participate in different regulatory mechanisms in our experimental model mimicking AMD. Such participation can be summarized as follows: i) cPLA2 promotes oxidative stress-induced damage by having a role in inflammatory signaling; ii) iPLA2 has a protective role by remodeling membranes to remove peroxidated fatty acids, thus attenuating the harmful effects of Fe2+ on cell membranes; iii) Group V sPLA2 has multiple intracellular targets related to the inflammatory response by its participation in the regulation of NF-κB and COX-2. The findings herein reported provide new knowledge about the molecular mechanisms operating in retinal degeneration induced by oxidative stress.

La enfermedad de Parkinson (EP) es el segundo trastorno neurodegenerativo más común en la población mundial. Esta patología es causada principalmente por la degeneración y muerte progresiva de las neuronas dopaminérgicas de la substantia nigra pars compacta (SNpc). La señalización celular en la EP ha sido y es uno de los aspectos más estudiados de la enfermedad, para tratar de comprender su etiopatogenia y encontrar nuevas dianas terapéuticas que permitan un tratamiento más específico de la enfermedad. Un componente clave en la muerte de las neuronas dopaminérgicas es el estrés oxidativo (EO), sin embargo, poco se sabe sobre el papel que juega la señalización mediada por las fosfolipasas D y A2 (PLD y PLA2, respectivamente) en este evento que inicia en etapas tempranas de la EP. El objetivo de este trabajo de tesis fue caracterizar el rol que cumplen las isoformas más importantes y estudiadas de las enzimas PLD y PLA2 en la respuesta neuronal frente al daño oxidativo. Para esto, se utilizaron como estímulo la 6-hidroxidopamina (6-OHDA) y la sobrecarga de hierro (Fe), dos agentes neurotóxicos ampliamente utilizados en el estudio de esta patología. La exposición neuronal a la 6-OHDA, un análogo hidroxilado de la dopamina, constituye una estrategia útil para estudiar los eventos moleculares asociados con la muerte neuronal en la EP. La 6-OHDA aumenta los niveles de oxidantes celulares y deteriora la cadena respiratoria mitocondrial, promoviendo así la lesión neuronal y la muerte. A pesar del uso extensivo de 6-OHDA en modelos animales, los eventos moleculares precisos desencadenados por este neurotóxico a nivel neuronal aún no se han dilucidado completamente. Las células de neuroblastoma humano IMR-32 expuestas a concentraciones crecientes de 6-OHDA mostraron altos niveles de especies reactivas de oxígeno (EROs) y aumento de la permeabilidad de la membrana plasmática con disminución concomitante de la viabilidad celular. Como parte de la respuesta neuronal a la exposición a 6-OHDA, se observó la translocación de la subunidad p65 del factor nuclear potenciador de las cadenas ligeras kappa de las células B activadas (NF-κB) hacia el núcleo. La localización nuclear de NF-κB también fue acompañada por un aumento de la fosforilación del inhibidor de kappa B (IκB), así como por un aumento en los niveles de ARNm de la ciclooxigenasa-2 (COX-2) y el receptor 4 de prostaglandina E2 (RP4). Aunque las vías canónicas que participan en la modulación de NF-κB se han descrito ampliamente, aquí se trabajó con la hipótesis de que la lesión inducida por 6-OHDA puede activar las vías de señalización de lípidos y, a su vez, modular la respuesta transcripcional. El EO generado en la célula por la 6-OHDA desencadenó la activación de vías de señalización de lípidos y produjo un aumento de los niveles de ácido fosfatídico (PA), diacilglicerol (DAG) y ácidos grasos libres en las células de neuroblastoma humano. La inhibición de la producción de PA pudo prevenir la disminución de la viabilidad celular provocada por 6-OHDA, la translocación nuclear de la subunidad p65 de NF-κB y el aumento en la expresión del ARNm de COX-2. En el primer capítulo de esta tesis, nuestros resultados indican que la respuesta neuronal desencadenada por 6-OHDA implica la activación de vías de señalización mediadas por PA que, a su vez, gobiernan la localización subcelular de NF-κB y la expresión de COX-2 de manera diferencial. La acumulación de Fe y la sobre-expresión de α-sinucleína son rasgos característicos de varios trastornos neurodegenerativos. Previamente en nuestro laboratorio hemos demostrado que el EO inducido por Fe activa la liberación de ácidos grasos catalizada por diferentes isoformas de PLA2 en el sistema nervioso. En este trabajo, nuestro objetivo fue estudiar la participación de las PLA2 en la regulación de la biología de la α-sinucleína y en la respuesta neuronal a la sobrecarga de Fe. También investigamos el papel de los factores secretados por la glía en la resolución del daño oxidativo por parte de las neuronas. Se estudió el estado redox, la fosforilación de α-sinucleína y la participación de las isoformas de PLA2 citosólica e independiente de calcio (cPLA2 e iPLA2, respectivamente) en la regulación de estos eventos. Las neuronas IMR-32 expuestas a una sobrecarga de Fe, bajo la forma del compuesto denominado citrato amonio férrico (FAC), mostraron un aumento de los niveles de expresión de iPLA2, concomitantemente con un aumento de los peróxidos lipídicos y las EROs. El bloqueo farmacológico de la actividad de iPLA2 aumentó, aún más, los niveles de peróxidos lipídicos y el contenido de EROs. Por el contrario, la inhibición conjunta de cPLA2 e iPLA2 mostró el efecto opuesto al promover una disminución de los marcadores de EO asociados con una mayor viabilidad neuronal. Las neuronas estimuladas con Fe también mostraron un aumento de la fosforilación de α-sinucleína. La fosforilación de α-sinucleína fue bloqueada por la inhibición de la actividad de la iPLA2. Gran parte de estos resultados también fueron corroborados por estudios en la línea celular de neuronas dopaminérgicas de rata (N27). Para estudiar el papel de la glía en la respuesta neuronal al Fe, se expusieron las células de astroglioma C6 a FAC o su vehículo, y los medios derivados de los astrocitos incubados en estas condiciones se añadieron, luego, a cultivos neuronales. En la caracterización de los astrocitos expuestos a Fe, estos mostraron un aumento en el marcador glial S100β y en los niveles de peroxidación lipídica, indicando una reactividad al EO. Los astrocitos fueron positivos para γ-glutamilcisteína ligasa, enzima limitante de la reacción de biosíntesis de glutatión. La respuesta de las neuronas a los medios condicionados de los astrocitos fue diferente dependiendo del origen de la línea celular. Mientras que el medio condicionado de astrocitos demostró ser neuroprotector para las neuronas humanas IMR-32, el efecto contrario se observó en las células dopaminergicas N27 derivadas de mesencéfalo de rata. Los resultados del segundo capítulo de esta tesis muestran roles específicos para la iPLA2 en cuanto a la neuroprotección y modulación de la fosforilacion de α-sinucleína en la respuesta neuronal a la lesión inducida por Fe. En conjunto los hallazgos de este trabajo de tesis contribuyen a dilucidar nuevos mecanismos de acción de determinadas isoformas de la PLA2 y la PLD en procesos de injuria neuronal asociados con la EP. / Parkinson's disease (PD) is the second most common neurodegenerative disorder worldwide. This pathology is mainly caused by the degeneration and progressive death of the dopaminergic neurons of the substantia nigra pars compacta (SNpc). Cell signaling in PD has always been one of the most studied key aspects of the disease in an attempt not only to understand its etiopathogenesis but also to find new therapeutic targets towards a more specific treatment of this pathology. However, little is known to date about the role of phospholipase D and A2 signaling (PLD and PLA2, respectively) in the neuronal response to oxidative injury, beginning in the early stages of PD. The objective of this thesis work was to begin to delineate the role played by the most important and studied isoforms of PLD and PLA2 enzymes in the neuronal response to oxidative damage, when they were subjected to the stimulus of 6-hydroxydopamine (6-OHDA) and to iron overload (Fe), two neurotoxic agents widely used in the study of PD. Likewise, the relationship and impact of the latter on the biology of α-synuclein were figured. Neuronal exposure to 6-OHDA, a hydroxylated analog of dopamine, is a useful strategy to study the molecular events associated with neuronal death in PD. 6-OHDA increases the levels of cellular oxidants and impairs the mitochondrial respiratory chain, thus promoting neuronal damage and death. Despite the extensive use of 6-OHDA in animal models, the exact molecular events triggered by this neurotoxic at the neuronal level have not yet been fully understood. Human IMR-32 neuroblastoma cells exposed to increasing concentrations of 6-OHDA showed high levels of reactive oxygen species (ROS) and increased plasma membrane permeability with concomitant decrease in cell viability. As part of the neuronal response to exposure to 6-OHDA, the translocation to the nucleus of the p65 subunit of the nuclear factor enhancer of the kappa light chains of activated B cells (NF-κB) was observed. The nuclear localization of NF-κB was also accompanied by an increase in phosphorylation of the inhibitor of kappa B (IκB) as well as an increase in the levels of mRNA of cyclooxygenase-2 (COX-2) and prostaglandin E2 receptor 4 (RP4). Although the canonical pathways involved in NF-κB modulation have been extensively described, the hypothesis that 6-OHDA-induced injury can activate lipid signaling pathways and, in turn, modulate the transcriptional response has been challenged here. The oxidative stress generated in the cell by 6-OHDA triggered the activation of lipid signaling pathways and produced an increase in the levels of phosphatidic acid (PA), diacylglycerol (DAG) and free fatty acids in human neuroblastoma cells. Inhibition of PA production could prevent the decrease in cell viability caused by 6-OHDA, the nuclear translocation of the p65 subunit of NF-κB and the increase in the expression of COX-2 mRNA. Our results indicate that the initiation of the inflammatory process triggered by 6-OHDA involves the activation of PA signaling which, in turn, governs the subcellular localization of NF-κB and the expression of COX-2 mRNA. Iron accumulation and α-synuclein overexpression are characteristic features of several neurodegenerative disorders. We have previously shown in our laboratory that oxidative stress induced by Fe activates the release of fatty acids catalyzed by different isoforms of PLA2 in the nervous system. In this work, our objective was to study the participation of PLA2 in the regulation of α-synuclein biology and the redox response developed by neurons in response to Fe overload. We also investigated the role of factors secreted by the glia in the resolution of oxidative damage by neurons. The redox state, the phosphorylation of α- synuclein and the participation of the calcium-dependent and independent PLA2 isoforms (cPLA2 and iPLA2, respectively) in the regulation of these events were studied. IMR-32 neurons exposed to Fe overload, in the form of the compound called ferric ammonium citrate (FAC), showed an increase in iPLA2 expression levels, concomitantly with an increase in lipid peroxides and ROS. The pharmacological blocking of iPLA2 activity further increased the levels of lipid peroxides and the content of ROS. In contrast, cPLA2 inhibition showed the opposite effect by promoting a decrease in oxidative stress markers associated with higher neuronal viability. Fe-stimulated neurons also showed increased α-synuclein phosphorylation. The phosphorylation of α-synuclein was blocked by the inhibition of iPLA2 activity. Several of these results were also corroborated by studies in the rat dopaminergic neuron cell line (N27). To study the role of glia in the neuronal response to Fe, C6 astroglioma cells were subjected to FAC or vehicle, and astrocyte-derived media was added to neuronal cultures of the same species (N27). In the characterization of the astrocytes exposed to Fe, they showed an increase in the glial marker S100β and the levels of lipid peroxidation, indicating a reactivity to oxidative stress. Neurons incubated with the above-mentioned astrocyte-derived media showed higher levels of oxidative damage than neurons exposed solely to Fe. Astrocytes were positive for the rate-limiting step enzyme for glutathione biosynthesis. Taken together, our results show specific roles for iPLA2 in terms of neuroprotection and modulation of α-synuclein phosphorylation in the neuronal response to Fe-induced injury. Together, the results of this thesis work contribute to elucidate new mechanisms of action of certain isoforms of PLA2 and PLD in neuronal injury processes associated with PD.

Memoria para optar al Titulo Profesional de Médico Veterinario / La fisiopatología de la preeclampsia (PE) ha sido relacionada recientemente con la ocurrencia de estrés oxidativo. Consecuentemente, se sugirió que los antioxidantes, tales como la vitamina E (alfa tocoferol) y la vitamina C (ácido ascórbico), pueden ayudar a prevenir la enfermedad y ser utilizados como posibles tratamientos durante la gestación. El propósito de este estudio, fue conocer el efecto de la administración precoz de vitaminas antioxidantes en mujeres con alto riesgo de desarrollar PE. Además, se determinaron valores predictivos de indicadores de estrés oxidativo en el plasma, eritrocitos y la placenta. Se realizó un estudio de cohorte retrospectivo seleccionando mujeres embarazadas chilenas controladas en el Departamento de Obstetricia y Ginecología, Hospital Clínico de la Universidad de Chile. A un grupo de 31 mujeres con alto riesgo de PE fueron administradas con dosis diarias de 400 UI de vitamina E sobre 1000 mg de ácido ascórbico. Otro grupo similar de 31 mujeres recibió placebo. Muestras de sangre fueron obtenidas en ambos grupos a las 12 semanas de gestación y al parto. También, se obtuvieron muestras de las placentas al parto. Se realizaron determinaciones de las defensas antioxidantes en el plasma, (ferric reducing ability of plasma (FRAP)) y a nivel tisular (eritrocitos y placenta), tales como la actividad de las enzimas antioxidantes [superóxido dismutasa (SOD), Catalasa (CAT) y glutatión peroxidasa (GSH-Px)]. El estrés oxidativo, se cuantificó mediante los indicadores bioquímicos de lipoperoxidación F2-isoprostanos libres y malondialdehido (MDA). También, se evaluó el impacto del estrés oxidativo sobre la actividad enzimática de la (Na+ + K+) – ATPasa en placenta como indicador funcional. Las mujeres que recibieron tratamientos con vitaminas antioxidantes, respecto de las del grupo con placebo, presentaron valores similares de FRAP en plasma, de actividad de SOD, CAT y GSH-Px en eritrocitos y placenta (p>0.05). Además, se detectó el mismo grado de lipoperoxidación, el cual se reflejó tanto en los niveles plasmáticos de F2-isoprostanos libres en plasma como en el contenido de malondialdehido en eritrocitos y placenta (p>0.05). También se detectó que la actividad enzimática de la (Na+ + K+) – ATPasa en placenta, no fue significativamente diferente entre las pacientes tratadas con vitaminas respecto al grupo placebo (p>0.05). Estos resultados rechazan la hipótesis de la eficacia de un tratamiento con vitaminas antioxidantes en la patogenia de la PE y apoyan la evaluación de la condición de esta enfermedad a través de los indicadores bioquímicos de estrés oxidativo señalados

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / Las especies reactivas del O2 y del N2 son importantes mecanismos de defensa antimicrobianos. Salmonella necesita sobrevivir al daño oxidativo producido por estas defensas para poder establecer la infección. Debido a que previamente se ha observado variabilidad fenotípica entre cepas de S. Enteritidis, en este trabajo se estudió la resistencia a estrés oxidativo de 18 cepas de S. Enteritidis provenientes de distintos hospederos, comparándose la capacidad de supervivencia de estos grupos de bacterias frente al desafío con radicales libres derivados del O2 y del N2. Los resultados muestran diferencias significativas en la capacidad de supervivencia de las cepas de S. Enteritidis, pero no se detectaron diferencias significativas en la capacidad de supervivencia entre grupos y que existe baja correlación entre los ensayos. Finalmente, se sugiere la realización de nuevos estudios para complementar los resultados obtenidos / Proyecto ISID 9102.012

En el último tiempo, los deportistas de elite han recurrido al entrenamiento en altura, con el fin de aumentar sus rendimientos a nivel del mar. Sin embargo, existen dudas y controversias en el conocimiento científico acerca de los efectos sobre diferentes aspectos del rendimiento deportivo. Esto se debe a los variados métodos de investigación que emplean diferentes protocolos y distintas altitudes, además de que las respuestas de adaptación pueden ser diferentes en cada individuo. Por ejemplo, muchos estudios se llevan a cabo en altitudes demasiado elevadas para lograr efectos positivos de adaptación para el rendimiento deportivo, las que tienen un efecto paradójico, invirtiendo las adaptaciones de altitudes medias. Por esta razón se requiere estudiar las distintas consecuencias de la exposición a la condición de hipoxia hipobárica sobre el organismo; como el daño pulmonar generado por estrés oxidativo. Es por ello, que el objetivo de la presente investigación fue determinar el efecto de la realización de ejercicio anaeróbico en altura, evaluado a través de la concentración de malondialdehído (MDA) en un condensado de aire espirado, como indicador de estrés oxidativo a nivel pulmonar. La presente investigación contó con la participación de 10 ciclistas (sexo masculino, 17.5 ± 1.9 años, 62.7 ± 6.5 Kg, 172 ± 6.9 cm., IMC 20.9 ± 1.3), miembros de la Selección Chilena de Mountain Bike, quienes fueron sometidos a un ejercicio de carácter anaeróbico en Santiago (670 m.s.n.m.) y dos días después se repitió la experiencia en la localidad cordillerana de Lagunillas (2160 m.s.n.m.). Se tomaron muestras de condensado de aire espirado, con el objetivo de medir la concentración de MDA. Para analizar los datos recolectados se utilizó el programa WINKS 4.65. La estadística utilizada fue el Test de Wilcoxon para muestras pareadas. Como conclusión de la presente investigación, es posible afirmar que la realización de un ejercicio de tipo anaeróbico a una altura de 2160 metros de altura, produce un aumento (p  0.04) en la concentración de MDA en un condensado de aire espirado, lo que indicaría la producción de un daño pulmonar debido a la generación de estrés oxidativo.

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / El objetivo de este estudio fue determinar el efecto de los antioxidantes, vitamina C y E, sobre variables sanguíneas y endocrinas fetales, en ovejas que gestaron a gran altura. Se utilizaron 12 ovejas preñadas, seis originarias de la altura (grupo HH+V) y seis originarias del nivel del mar que fueron llevadas a la altura (grupo LH+V), las cuales fueron suplementadas diariamente con vitamina C (500 mg /animal/ día) y vitamina E (350 UI/ animal/ día), durante el encaste y toda la gestación desarrollada a 3600 m.s.n.m. Las ovejas y los fetos se operaron para la implantación de catéteres crónicos arteriales y venosos. Se tomaron muestras de sangre arterial y venosa tanto de madres y fetos cada tres días hasta la fecha de parto para la determinación de las variables sanguíneas: presión parcial de oxígeno (PaO2), presión parcial de dióxido de carbono (PaCO2), pH, concentración de hemoglobina (Hb), saturación de hemoglobina (Sat Hb), volumen globular aglomerado (V.G.A.) y endocrinas: cortisol, insulina, además de glicemia. Como resultado, las variables sanguíneas se igualaron entre fetos de altura y subidos, mejorando positivamente respecto de lo reportado para fetos sin administración de antioxidantes, incrementando la PaO2, Sat Hb, pH y disminuyendo la PaCO2. A su vez, se incrementaron las concentraciones plasmáticas de insulina y glucosa fetal, sin exhibir mayores cambios en el cortisol. En el caso de las madres, las variables sanguíneas también se asemejaron entre grupos de altura y subidos. La insulina y glicemia se incrementaron y el cortisol se redujo respecto de ovejas sin administración de vitaminas. Se concluye que, las mejoras observadas en las variables sanguíneas y endocrinas fetales pueden atribuirse al efecto que tiene la suplementación con antioxidantes sobre el organismo al combatir el estrés oxidativo, lo que contribuyó a una mejora en la respuesta adaptativa a la gestación a gran altura, expresándose en un aumento del peso al nacimiento en ambos grupos. / Proyecto Fondecyt No. 1020706

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / La preeclampsia es un síndrome caracterizado por remodelación anormal de las arterias espirales, defectuosa vasculogénesis y disfunción en el endotelio vascular materno. Sus características clínicas más importantes son: hipertensión y proteinuria. El objetivo de este estudio fue evaluar el valor predictivo de marcadores bioquímicos relacionados con angiogénesis y estrés oxidativo sobre la ocurrencia de esta enfermedad. Se invitó a participar de este estudio a mujeres embarazadas entre las 11 – 14 semanas y se obtuvieron muestras de sangre que se congelaron hasta ser analizadas. Se seleccionaron todas las muestras de sangre de embarazos preeclámpticos (n=32) y cinco controles para cada caso provenientes de embarazos normotensos (n=143). El análisis multivariado mostró que solamente dos marcadores bioquímicos (sFlt1 y PlGF) y uno clínico (IMC) son independientes y significativamente predictores de la aparición de preeclampsia a las 11-14 semanas de gestación. Además, se demostró que la combinación de éstos, pueden predecir en el primer trimestre de la gestación a más de las mitad de las mujeres que desarrollarán preeclampsia, con solo un 10% de falsos positivos

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / La enfermedad de Chagas o tripanosomiasis americana tiene como agente biológico el parásito hemoflagelado Trypanosoma cruzi. Esta enfermedad posee un carácter endémico en América Latina y se estima un promedio de 10-15 millones de personas infectadas y 75-90 millones en riesgo de contraer la enfermedad. T. cruzi posee un ciclo de vida indirecto y se presenta en tres formas celulares; epimastigote, forma extracelular replicativa y no infectiva, presente en los vectores triatominos; tripomastigote, forma no replicativa e infectiva, que se encuentra tanto en el vector como en hospederos mamíferos y finalmente, la forma amastigote, intracelular replicativa, presente en hospederos mamíferos. Trypanosoma cruzi es capaz de sobrevivir frente al daño oxidativo del DNA producido por especies reactivas de oxígeno y nitrógeno (ROS/RNS) del hospedero mamífero. Este daño podría ser reparado mediante la actividad de la endonucleasa APE1 de la vía de escisión de bases (BER). Sin embargo, sólo hemos identificado APE1 de T.cruzi (TcAP1) en la forma epimastigota del parásito, pero no se ha detectado en las formas tripomastigotes o amastigotes. NL1 de T. cruzi (NL1Tc) es una endonucleasa retrotransposónica de la familia AP que podría realizar la misma función que cumple TcAP1 en epimastigotes, pero en tripomastigotes y amastigotes de T. cruzi. Se clonó el gen que codifica para NL1Tc y se confirmó su pertinencia por secuenciación. Por otra parte, se generó la proteína recombinante NL1Tc y por modelamiento en 3D por homología se confirmó corresponde a una endonucleasa. La proteína recombinante purificada se empleó para producir un anticuerpo policlonal específico, el cual se utilizó posteriormente para la identificación de NL1Tc en homogeneizados de las distintas formas celulares del parásito y evidenciar su grado de expresión en epimastigotes de la cepa Dm28c tratados con H2O2 200 μM. Se concluye que la proteína NL1Tc se expresa en las tres formas celulares de T. cruzi, y en las condiciones experimentales empleadas, no se observa sobreexpresión de NL1Tc frente a estrés oxidativo, sin embargo no se descarta su participación en la reparación del DNA / Financiamiento: Proyecto Bicentenario Anillo ACT-29, Proyecto Bicentenario Anillo ACT-112, Proyecto RED-07, Proyecto Fondecyt 1090124