Grado de magíster en fisiopatología / Las enfermedades cardiovasculares corresponden a una de las mayores causas de muerte en el mundo, donde el infarto agudo del miocardio es responsable de la mayoría de ellas. Diferentes vías confluyen en el daño y muerte del tejido cardiaco durante el infarto. Sin embargo las principales corresponden al aumento descontrolado tanto de especies reactivas de oxígeno (EROS), como de iones calcio (Ca2+) citoplasmáticos. A pesar de esto se desconoce la totalidad de mecanismos implicados durante este tipo de patología. La policistina-1 (PC1) es una proteína transmembrana, producto del gen PKD1, clave en la función cardiaca en condiciones fisiológicas, lo cual podría estar relacionado al hecho de que regula los niveles proteicos de los canales de Ca2+ sensibles a voltaje tipo-L en la membrana de los cardiomiocitos. Además, se ha reportado que la PC1 regula las concentraciones de Ca2+ y de ROS citoplasmáticos y que su ausencia aumenta el daño posterior a la isquemia reperfusión renal. A pesar de lo anterior, se desconoce el papel de la PC1 en condiciones de isquemia-reperfusión (IR) cardiaca. En esta tesis se evaluó la hipótesis que la ausencia de la PC1 en los cardiomiocitos aumenta el estrés oxidativo y el daño producido por la IR cardiaca. Utilizamos un modelo ex vivo de IR en corazones de ratones controles (PC1F/F) y knockout para la PC1 en los cardiomiocitos (PC1 KO). Los resultados indican que los corazones de los ratones PC1 KO sometidos a IR, en comparación a los PC1F/F, presentan un mayor tamaño de infarto y cantidad de LDH, dando cuenta de una mayor muerte del miocardio posterior a una IR. Sin embargo, al comparar los parámetros hemodinámicos, no existieron diferencias entre ambos grupos. En cuanto a los EROS, los corazones PC1 KO sometidos a IR, presentaron niveles mayores de proteínas carboniladas y nitradas que los ratones PC1F/F. En su conjunto, nuestros resultados sugieren que la PC1 es una proteína que evita un mayor daño durante la IR cardiaca, lo cual podría estar asociado con su capacidad para evitar un aumento del estrés oxidativo durante la IR. / Cardiovascular diseases are one of the most important causes of death world wide, and acute myocardial infarction is responsible for the most of them. Different mechanisms are involved in the injury and death of the myocardium during an infarct. However, the main mechanisms are the uncontrolled increase of reactive oxygen species (ROS) and citoplasmatic calcium (Ca2+). Nevertheless, many of the mechanisms implicated in this pathology are still unknown. Polycistin-1 (PC1) is a transmembrane protein product of the translation of PKD1 gene, which plays a key role in the cardiac function in physiological conditions; this could be related to the fact that PC1 regulates the voltage-dependent Ca2+ channels in the membrane of the cardiomyocites. It has been reported that PC1 regulates the concentrations of Ca2+ and ROS in the cytoplasm, and that the absence of PC1 increases the damage after renal ischemia-reperfusion. In spite of this, the role of PC1 under myocardial ischemia reperfusion (IR) is uncleared. The hypothesis that the absence of PC1 in the cardiomyocites increases the oxidative stress and the damage produced by myocardial IR was evaluated in this thesis. An ex vivo model of myocardial IR, in control mouse hearts (PC1F/F) and knockout for PC1 mouse hearts (PC1 KO) was used for this purpose. The results show that the PC1 KO hearts submitted to IR presented bigger infarct size and higher amount of LDH in comparison with PC1F/F, indicating more death of the myocardium after IR, although they did not show differences in hemodynamic parameters. In relation to the levels of ROS after IR, PC1 KO hearts showed higher levels of protein carbonilation and nitrotyrosination in comparison with PCF/F. The results of this investigation suggest that PC1 is a protein that prevents the damage during myocardial IR, and this could be associated to its role in preventing the increase of ROS during IR.

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / Nrf2 es un factor de transcripción que estimula la expresión de genes citoprotectores frente al estrés oxidativo (EOX). En condiciones homeostáticas Nrf2 está en el citoplasma formando un complejo con su inhibidor Keap1. Bajo condiciones de EOX moderado, este complejo se disocia, Nrf2 transloca al núcleo y se une al DNA, regulando la expresión de proteínas citoprotectoras, como hemoxigenasa-1. El hierro (Fe) es un micronutriente esencial que cataliza reacciones de óxido reducción, generando EOX celular. Se ha demostrado que la aplicación de un protocolo de tratamiento subcrónico con Fe, genera EOX transitorio y preacondiciona al hígado de rata frente a la isquemia reperfusión (IR). El objetivo de este estudio fue probar la hipótesis de que la administración subcrónica de Fe+3 en ratas incrementa el estado de estrés oxidativo hepático activando al factor de transcripción Nrf2 y la consiguiente expresión de hemoxigenasa-1. Para tales efectos, se utilizó un protocolo de 6 dosis subcrónicas de Fe (50mg/kg i.p. en días alternados) o suero salino (controles) en ratas macho Sprague-Dawley y se evaluaron muestras hepáticas obtenidas 24 horas después de cada dosis. Los cambios cinéticos en el estado de EOX hepático se evidenciaron utilizando la medición espectrofotométrica del contenido total de equivalentes de glutatión reducido (GSH). La translocación nuclear de Nrf2 y sus posibles efectos, se evaluaron mediante la técnica de Western blot a través de la detección de cambios en las relaciones Nrf2 nuclear / Nrf2 citosólico y Keap1 nuclear / Keap1 citosólico y la expresión citosólica de hemoxigenasa-1. Se observó un aumento en el EOX hepático, seguido de su normalización. En paralelo, la relación Nrf2 nuclear / Nrf2 citosólico incrementó significativamente, señalando su mayor disociación de Keap1 y translocación al núcleo; acompañado de un aumento citosólico de hemoxigenasa-1 / Financiamiento: Proyecto Fondecyt No.1110006

Grado de magíster en farmacología / La obesidad se considera actualmente una de las enfermedades crónicas de mayor importancia a nivel mundial, tanto por su alta prevalencia en la población como por su asociación con múltiples comorbilidades que afectan negativamente la salud de los individuos que las padecen. La etiopatogenia de la obesidad es compleja y multifactorial, pero la malnutrición por exceso de consumo de lípidos y carbohidratos explica la mayor parte de la prevalencia en la población. Se encuentra fuertemente asociada al síndrome metabólico, el cual abarca un conjunto de factores de riesgo que predisponen el desarrollo de enfermedad cardiovascular y diabetes mellitus tipo 2, tales como la obesidad visceral, hipertensión arterial, dislipidemia y anormalidades en el metabolismo de la glucosa. En un trabajo reciente realizado en nuestro laboratorio se probó que el aceite de rosa mosqueta (Rosa rubiginosa) que se caracteriza por ser una fuente rica de ácido α-linolénico (ALN), precursor que se bioconvierte en ácido eicosapentaenoico (EPA) y docosahexaenoico (DHA), y altos niveles de alfa y gamma tocoferoles, polifenoles y fitoesteroles, previene el desarrollo de la obesidad, la resistencia a la insulina, la inflamación hepática y sistémica y la esteatosis hepática en un modelo murino alimentado con dieta alta en grasas (DAG). Sin embargo, los hallazgos encontrados no revelan el papel que juega cada uno de los componentes de la rosa mosqueta (RM), y estudiar los componentes mayoritarios, como los tocoferoles, es primordial para dilucidar el rol en la protección contra los parámetros del síndrome metabólico. En este trabajo se estudió como los alfa y gama tocoferoles disminuyen el desarrollo de alteraciones del hígado y del tejido adiposo visceral: hipertrofia de los adipocitos, esteatosis hepática, y además la disminución de parámetros de inflamación y estrés oxidativo en ratones machos C57BL/6J inducidos por una dieta alta en grasa. El diseño experimental consistió en ratones divididos en cinco grupos (n=9), alimentados con dieta control (DC) o con DAG, suplementados o no con tocoferoles (TF), durante 12 semanas. Además, un grupo alimentado con DAG y suplementando con aceite de RM sin tocoferoles, DAG+RM(-). La alimentación con DAG aumentó significativamente el peso corporal, el peso del tejido adiposo y el tamaño de los adipocitos e indujo esteatosis hepática, junto con elevar los niveles de expresión de citoquinas pro-inflamatorias (TNF-α, IL-1β), efectos que disminuyeron significativamente en los animales DAG+T. Entre estos grupos no se observaron cambios en la expresión del factor de transcripción Nrf2. Se concluye que la suplementación alimentaria de una mezcla de alfa y gamma tocoferoles (1:5) disminuyó significativamente la hipertrofia del tejido adiposo visceral, la esteatosis hepática, y marcadores de la inflamación en ratones alimentados con una dieta alta en grasa. / Obesity is currently considered one of the most important chronic diseases worldwide, both due to its high prevalence in the population and its association with multiple comorbidities that negatively affect the health of individuals who suffer from them. The etiopathogenesis of obesity is complex and multifactorial, but malnutrition due to excess consumption of lipids and carbohydrates accounts for most of the prevalence in the population. It is strongly associated with the metabolic syndrome, which encompasses a set of risk factors that predispose the development of cardiovascular disease and type 2 diabetes mellitus, such as visceral obesity, hypertension, dyslipidemia and abnormalities in glucose metabolism. In a recent work carried out in our laboratory it was proved that rosehip oil (Rosa rubiginosa) is characterized as a rich source of α-linolenic acid (ALN), a precursor that bioconverts into eicosapentaenoic acid (EPA) and docosahexaenoic acid ( DHA), and high levels of alpha and gamma tocopherols, polyphenols and phytosterols, prevents the development of obesity, insulin resistance, hepatic and systemic inflammation and hepatic steatosis in a murine model fed a high-fat diet (DAG ). However, the findings do not reveal the role played by each of the components of the rose hip (MRI), and study the major components, such as tocopherols, is essential to elucidate the role in protecting against the metabolic syndrome parameters. In this work we studied how alpha and gamma tocopherols decrease the development of liver and visceral adipose tissue alterations: adipocyte hypertrophy, hepatic steatosis, and also the decrease of inflammation and oxidative stress parameters in male C57BL / 6J induced mice for a diet high in fat. The experimental design consisted of mice divided into five groups (n = 9), fed control diet (DC) or with DAG, supplemented or not with tocopherols (TF), for 12 weeks. In addition, a group fed with DAG and supplemented with RM oil without tocopherols, DAG + RM (-). Feeding with DAG significantly increased body weight, adipose tissue weight and adipocyte size and induced hepatic steatosis, along with raising the levels of expression of pro-inflammatory cytokines (TNF-α, IL-1β), effects that decreased significantly in the DAG + T animals. Among these groups no changes were observed in the expression of the transcription factor Nrf2. It is concluded that dietary supplementation of a mixture of alpha and gamma tocopherols (1: 5) significantly decreased visceral adipose tissue hypertrophy, hepatic steatosis, and markers of inflammation in mice fed a high-fat diet.

Menciona que el eugenol es un fenilpropanoide derivado de plantas medicinales y con actividad antifúngica. El estrés oxidativo es uno de los mecanismos que explican su actividad anti-Candida. Este estudio determinó las propiedades fisicoquímicas y la reactividad in silico del eugenol, epóxido de eugenol y quinona metilada; se encontró que el eugenol y derivados poseen la capacidad para atravesar membranas biológicas y que el eugenol puede ser metabolizado hasta epóxido de eugenol. Además, se determinaron las propiedades fisicoquímicas y reactividad, in silico, de aductos de epóxido de eugenol y quinona metilada con glutatión, aminoácidos, espermidina y espermina. Se encontró que la formación de aductos de epóxido de eugenol-glutatión y quinona metilada-glutatión es termodinámicamente favorable, por lo que, podría ser un mecanismo que explique la disminución de la concentración de glutatión reducido en Candida albicans tratada con eugenol. Además, se halló que los aductos de epóxido de eugenol con cisteína, lisina y arginina, son termodinámicamente favorables, igualmente, los aductos de quinona metilada con cisteína y lisina. Asimismo, la formación de los aductos de epóxido de eugenol y quinona metilada con espermina y espermidina, es un proceso termodinámicamente no favorable. Por último, se determinó in silico las reacciones metabólicas de cada aducto en microorganismos aeróbicos, siendo los aductos de epóxido de eugenol-glutatión y quinona metilada-glutatión susceptibles a la desaminación oxidativa y desalquilación oxidativa. / Tesis

[ES] En esta tesis doctoral, se realizaron tres estudios exhaustivos con Seriola mediterránea (Seriola dumerili) con el propósito de evaluar su potencial para la acuicultura marina. Cada experimento se centró en aspectos específicos de la sustitución de harina de pescado (HP) y aceite de pescado (AP) en la dieta de estas especies, abordando múltiples parámetros de salud, crecimiento y respuesta fisiológica. En el primer estudio, se diseñaron tres experimentos para evaluar la sustitución parcial y total del AP por una combinación de aceites vegetales (linaza, girasol y palma). Además, se investigó la adición de un probiótico compuesto por Lactobacillus brevis y Lactobacillus buchneri en el pienso con sustitución total de aceite de pescado. A lo largo de 109 días, se observó que no hubo diferencias significativas en el crecimiento ni en los parámetros nutritivos entre los distintos tratamientos. Sin embargo, la sustitución de AP afectó la supervivencia, siendo el grupo con sustitución parcial (FO 25) el que presentó mayor supervivencia, mientras que el grupo con sustitución total de aceite de pescado (FO 0+) mostró una mayor mortalidad. Además, se identificaron diferencias en índices biométricos y en el perfil de ácidos grasos, indicando cambios en la histología intestinal e hepática. La investigación reveló que la sustitución total de aceite de pescado no afectó negativamente a las seriolas, pero la adición de probióticos no generó mejoras sustanciales en los parámetros analizados. En el segundo estudio, se evaluó el efecto de la alimentación de Seriola mediterránea sobre el estrés oxidativo y los parámetros plasmáticos, utilizando las mismas dietas que en el estudio anterior. La sustitución de AP no afectó la actividad de las enzimas analizadas en el hígado y el tracto digestivo, aunque se observaron diferencias en la peroxidación lipídica, especialmente en los grupos con sustitución total de aceite de pescado (FO 100 y FO 0+). Los parámetros hematológicos también mostraron diferencias, destacando la disminución del colesterol en los peces alimentados sin aceite de pescado (FO 0 y FO 0+). En este contexto, se concluyó que la sustitución total de AP no afectó significativamente al estrés oxidativo ni a los parámetros sanguíneos, y la inclusión de probióticos no generó efectos positivos sustanciales en estos aspectos. El tercer estudio se centró en la sustitución de harina de pescado y aceite de pescado, ensayando seis dietas diferentes. La supervivencia fue el único parámetro significativamente afectado, observando un impacto negativo con la sustitución total de harina de pescado (FM100). A nivel histológico, se identificaron cambios en el intestino y el hígado, siendo más prominentes con la sustitución total de harina de pescado. El análisis de la microbiota intestinal reveló diferencias en la diversidad y riqueza entre los grupos con máxima sustitución de HP y AP que no afectaron negativamente el crecimiento y la supervivencia. En términos generales, se concluyó que es posible una sustitución completa del AP sin afectar a los animales, pero la sustitución total de la harina de pescado no obtuvo buenos resultados en la supervivencia y presentó mayores efectos en el hígado e intestino. Al analizar los resultados de los tres estudios, se concluye que la sustitución completa del AP es viable sin afectar negativamente a las seriolas en términos de crecimiento, parámetros nutritivos, estrés oxidativo y parámetros sanguíneos. En contraste, la sustitución completa de harina de pescado afecta negativamente la supervivencia y genera alteraciones a nivel histológico en el intestino e hígado, siendo posible hasta un 66%. Estos hallazgos contribuyen significativamente a la comprensión de las implicaciones de la sustitución de ingredientes en la alimentación de Seriola mediterránea en contextos acuícolas, proporcionando información valiosa para la gestión sostenible de estas especies. / [CA] En aquesta tesi doctoral, s'han realitzat tres estudis exhaustius amb Seriola mediterrània (Seriola dumerili) amb la finalitat d'avaluar el seu potencial per a la aqüicultura marina. Cada experiment s'ha centrat en aspectes específics de la substitució de farina de peix (FP) i oli de peix (OP) en la dieta d'aquestes espècies, abordant múltiples paràmetres de salut, creixement i resposta fisiològica. En el primer estudi, es van dissenyar tres experiments per avaluar la substitució parcial i total de l'AP per una combinació d'olis vegetals (llinatge, gira-sol i palma). A més, es va investigar l'addició d'un probiòtic compost per Lactobacillus brevis i Lactobacillus buchneri en el pinso amb substitució total d'oli de peix. Al llarg de 109 dies, es va observar que no hi havia diferències significatives ni en el creixement ni en els paràmetres nutritius entre els diferents tractaments. No obstant això, la substitució de l'OP va afectar la supervivència, sent el grup amb substitució parcial (FO 25) el que va presentar major supervivència, mentre que el grup amb substitució total d'oli de peix (FO 0+) va mostrar una major mortalitat. A més, es van identificar diferències en índexs biomètrics i en el perfil d'àcids grassos, indicant canvis en la histologia intestinal i hepàtica. La investigació va revelar que la substitució total d'oli de peix no va afectar negativament les serioles, però l'addició de probiòtics no va generar millores substancials en els paràmetres analitzats. En el segon estudi, es va avaluar l'impacte de la alimentació de Seriola mediterrània sobre l'estrès oxidatiu i els paràmetres plasmàtics, utilitzant les mateixes dietes que en l'estudi anterior. La substitució de l'AP no va afectar l'activitat d'enzims analitzades en el fetge i el tracte digestiu, encara que es van observar diferències en la peroxidació lipídica, especialment en els grups amb substitució total d'oli de peix (FO 100 i FO 0+). Els paràmetres hematològics també van mostrar diferències, destacant la disminució del colesterol en els peixos alimentats sense oli de peix (FO 0 i FO 0+). En aquest context, es va concloure que la substitució total d'OP no va afectar significativament l'estrès oxidatiu ni els paràmetres sanguinis, i la inclusió de probiòtics no va generar efectes positius substancials en aquests aspectes. El tercer estudi es va centrar en la substitució de farina de peix i oli de peix, assajant sis dietes diferents. La supervivència va ser l'únic paràmetre significativament afectat només en la substitució total de farina de peix (FM100). A nivell histològic, es van identificar canvis en l'intestí i el fetge, sent més prominents amb la substitució total de farina de peix. L'anàlisi de la microbiota intestinal va revelar diferències en la diversitat i riquesa entre els grups amb màxima substitució de FP i OP que no van afectar negativament el creixement i la supervivència. En termes generals, es va concloure que és possible una substitució completa d'OP sense afectar els animals, però la substitució total de la farina de peix no va obtenir bons resultats en la supervivència i va presentar majors efectes en el fetge i intestí. En analitzar els resultats dels tres estudis, es conclou que la substitució completa d'OP és viable sense afectar negativament les serioles en termes de creixement, paràmetres nutritius, estrès oxidatiu i paràmetres sanguinis. En contrast, la substitució completa de farina de peix afecta negativament la supervivència i genera alteracions a nivell histològic en l'intestí i fetge, essent possible fins a un 66%. Aquests descobriments contribueixen significativament a la comprensió de les implicacions de la substitució d'ingredients en l'alimentació de Seriola mediterrània en contextos aquiculturals, proporcionant informació valuosa per a la gestió sostenible d'aquestes espècies. / [EN] In this doctoral thesis, three comprehensive studies were conducted with Mediterranean yellowtail (Seriola dumerili) to assess its potential for marine aquaculture. Each experiment focused on specific aspects of fishmeal (FM) and fish oil (FO) substitution in the diet of these species, addressing multiple parameters of health, growth, and physiological response. In the first study, three experiments were designed to evaluate the partial and total substitution of AP with a combination of vegetable oils (flaxseed, sunflower, and palm). Additionally, the addition of a probiotic composed of Lactobacillus brevis and Lactobacillus buchneri was investigated in the feed with total substitution of fish oil. Over 109 days, no significant differences were observed in either growth or nutritional parameters among the various treatments. However, the substitution of FO affected survival, with the partial substitution group (FO 25) showing higher survival, while the group with total substitution of fish oil (FO 0+) exhibited higher mortality. Differences in biometric indices and fatty acid profiles were identified, indicating changes in intestinal and hepatic histology. The research revealed that the total substitution of fish oil did not adversely affect yellowtails, but the addition of probiotics did not yield substantial improvements in the analyzed parameters. In the second study, the effect of feeding Mediterranean yellowtail on oxidative stress and plasma parameters was evaluated using the same diets as in the previous study. The substitution of AP did not affect the activity of enzymes analyzed in the liver and digestive tract, although differences were observed in lipid peroxidation, especially in groups with total substitution of fish oil (FO 100 and FO 0+). Hematological parameters also showed differences, with a decrease in cholesterol in fish fed without fish oil (FO 0 and FO 0+). In this context, it was concluded that the total substitution of AP did not significantly affect oxidative stress or blood parameters, and the inclusion of probiotics did not generate substantial positive effects in these aspects. The third study focused on the substitution of fishmeal and fish oil, testing six different diets. Survival was the only parameter significantly affected, with a negative impact observed with the total substitution of fishmeal (FM100). At the histological level, changes in the intestine and liver were identified, being more prominent with the total substitution of fishmeal. The analysis of intestinal microbiota revealed differences in diversity and richness among groups with maximum substitution of FM and FO that did not negatively affect growth and survival. In general, it was concluded that complete substitution of FO is possible without affecting the animals, but total substitution of fishmeal did not yield good results in terms of survival and presented greater effects on the liver and intestine. Analyzing the results of the three studies, it is concluded that complete substitution of FO is viable without negatively affecting yellowtails in terms of growth, nutritional parameters, oxidative stress, and blood parameters. In contrast, complete substitution of fishmeal negatively affects survival and induces alterations at the histological level in the intestine and liver, being possible up to 66%. These findings contribute significantly to understanding the implications of ingredient substitution in the feeding of Mediterranean yellowtail in aquacultural contexts, providing valuable information for sustainable management of these species. / Los trabajos publicados han tenido financiación por parte de distintas administraciones como: Generalitat Valenciana: “Ingredientes alternativos en piensos para Seriola dumerili: efecto en el crecimiento y en la calidad de la carne”. Ref: AICO/2015/123; Universitat Politècnica de València. Ayudas para investigadores predoctorales para publicación PAID-12-21. “Seriola dumerili”. Salud intestinal de la Seriola dumerili alimentada con ingredientes alternativos a la harina y aceite de pescado y Gobierno de España: Ministerio de Economía y Empresa “sustitución de harina y aceite de pescado en dietas para Seriola dumerili. Pruebas de alimentación y estudios analíticos: proteínas”. Ref: AGL2011-30547-C03-02 / Milián Sorribes, MC. (2024). Salud intestinal de la Seriola dumerili alimentada con ingredientes alternativos a la harina y aceite de pescado [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/202902

Esta tesis doctoral se centra en el aprovechamiento de varias metodologías basadas en técnicas electroquímicas y analíticas para la detección del estrés oxidativo en medios complejos biológicos, en partículas, proteínas y medios complejos biológicos. 1. Modificación covalente de aminoácidos en proteínas redox y no redox por métodos electroquímicos, químicos o mediante irradiación ultrasónica, y estudios de cinética de la transferencia electrónica sobre electrodos serigrafiados de carbón. 2. Estudios metabolómicos de medios de cultivo celular complejos y desarrollo de sensores y biosensores para la identificación, determinación y detección de biomarcadores relacionados con el metabolismo celular y el estrés oxidativo.

El estrés oxidativo es un desequilibrio entre la producción de radicales libres y los sistemas antioxidantes encargados de su neutralización. El resultado de este desequilibrio es la acumulación de daños en diversas estructuras celulares incluyendo el DNA. El cáncer se acompaña de un mayor estrés oxidativo a nivel celular, por este motivo, muchos de los tratamientos terapéuticos van dirigidos a aumentar los niveles citotóxicos de ROS, conduciendo a la célula tumoral a la apoptosis. Sin embargo, durante la tumorigénesis las células van adquiriendo una serie de características que permiten mantener la homeostasis de los ROS y desarrollar resistencia a los tratamientos antineoplásicos. El cáncer de mama es un tipo de neoplasia en la que el factor endocrino juega un papel relevante tanto en la etiología como en la evolución de la enfermedad. En esta tesis nos planteamos como objetivo estudiar los efectos del 17β-estradiol (E2), la genisteína y la leptina, como factores hormonales, sobre la modulación del estrés oxidativo en la carcinogénesis de mama. E2 es uno de los principales factores de riesgo en la iniciación y progresión de la enfermedad; la genisteína es uno de los fitoestrógenos de mayor actividad estrogénica y, por su parte, la leptina también ha mostrado efectos potenciadores sobre el cáncer de mama, considerándose a nivel epidemiológico como un posible enlace entre obesidad y cáncer. Para alcanzar estos objetivos se estudió: i) el efecto dual de E2 y genisteína sobre el estrés oxidativo en función de la dotación de ERα y ERβ en líneas celulares de cáncer de mama (MCF-7 y T47D), y el estrés oxidativo en muestras de carcinomas ductales infiltrantes en función de la ratio de receptores estrogénicos; ii) la influencia de la leptina crónica sobre el estrés oxidativo y su respuesta al fármaco antineoplásico cisplatino en la línea celular MCF-7; y iii) la importancia de la UCP2 en la regulación del estrés oxidativo endógeno e inducido en las células MCF-7, así como, en líneas celulares de cáncer de páncreas con p53 mutado. Los resultados indican que E2 induce estrés oxidativo de forma dependiente de la dotación de ERα/ERβ. Así, el aumento del estrés oxidativo, debido en parte a un descenso de los sistemas antioxidantes, está mediado por ERα. En cambio, la activación de ERβ por la genisteína implica un menor estrés oxidativo y una mejor función mitocondrial, promovido por una respuesta antioxidante. En consonancia con el estudio in vitro, los carcinomas mamarios con una menor ratio ERα/ERβ también mostraron una mayor respuesta detoxificante, favoreciendo la supervivencia celular. Por su parte, la leptina parece disminuir el nivel de estrés oxidativo basal, lo que podría jugar un papel en la adquisición de resistencia a los tratamientos anticancerígenos. El desacoplamiento mitocondrial mediado por UCP2 protege a la célula cancerosa del daño oxidativo, lo que posiblemente podría conferir citoprotección a través de la adquisición de quimioresistencia. En células de cáncer de páncreas, p53 mutado induce la producción de ROS debido a una disminución de UCP2, contribuyendo al crecimiento celular. En conclusión, los resultados de la presente tesis sugieren que tanto ERβ como UCP2 podrían ser biomarcadores interesantes para conseguir una mejor caracterización del tumor en relación a su nivel de estrés oxidativo y la posible respuesta al tratamiento. / L'estrès oxidatiu és un desequilibri entre la producció de radicals lliures i els sistemes antioxidants encarregats de la seva neutralització. El resultat d'aquest desequilibri és l'acumulació de danys a diverses estructures cel•lulars incloent el DNA. El càncer va acompanyat d'un major estrès oxidatiu a nivell cel•lular, per aquest motiu, molts dels tractaments terapèutics van dirigits a augmentar els nivells citotòxics de ROS, conduint a la cèl•lula tumoral a la apoptosi. No obstant això, durant la tumorigènesi les cèl•lules van adquirint una sèrie de característiques que permeten mantenir l'homeòstasi dels ROS i desenvolupar resistència als tractaments antineoplàstics. El càncer de mama és un tipus de neoplàsia en la qual el factor endocrí juga un paper rellevant tant en la etiologia como en l'evolució de la malaltia. En aquesta tesi ens vàrem plantejar com a objectius estudiar els efectes del 17β-estradiol (E2), la genisteïna i la leptina, com a factors hormonals, sobre la modulació de l'estrès oxidatiu en la carcinogènesi de mama. E2 és un dels principals factors de risc en la iniciació i progressió de la malaltia, la genisteïna és un dels fitoestrògens de major activitat estrogènica i, per la seva part, la leptina també ha mostrat efectes potenciadors sobre el càncer de mama, considerant-se a nivell epidemiològic un possible enllaç entre obesitat i càncer. Per a assolir aquests objectius es va estudiar: i) l'efecte dual de E2 i genisteïna sobre l'estrès oxidatiu en funció de la dotació de ERα i ERβ en línies cel•lulars de càncer de mama (MCF-7 i T47D), i l'estrès oxidatiu a mostres de carcinomes ductals infiltrants en funció de la ràtio de receptors estrogènics; ii) la influència de la leptina crònica sobre l'estrès oxidatiu i la seva resposta al fàrmac antineoplàstic cisplatí en la línea cel•lular MCF-7; i iii) la importància de la UCP2 en la regulació de l'estrès oxidatiu endogen i induït en les cèl•lules MCF-7, així como, en línies cel•lulars de càncer de pàncrees amb p53 mutat. Els resultats indiquen que E2 indueix estrès oxidatiu de forma depenent de la dotació de ERα/ERβ. Així, l'augment de l'estrès oxidatiu, causat en part per un descens dels sistemes antioxidants, està mediat per ERα. En canvi, l'activació de ERβ per la genisteïna implica un menor estrès oxidatiu i una millor funció mitocondrial, promogut per una resposta antioxidant. En consonància amb l'estudi in vitro, els carcinomes mamaris amb una menor ràtio ERα/ERβ també varen mostrar una major resposta detoxificant, afavorint la supervivència cel•lular. Per la seva part, la leptina sembla disminuir el nivell d'estrès oxidatiu basal, la qual cosa podria jugar un paper en l'adquisició de resistència als tractaments anticancerígens. El desacoblament mitocondrial mediat per UCP2 protegeix a la cèl•lula cancerosa del dany oxidatiu, fet que possiblement podria conferir citoprotecció a través de l'adquisició de quimioresistència. En cèl•lules de càncer de pàncrees, p53 mutat indueix la producció de ROS a causa d'una disminució de UCP2, contribuint al creixement cel•lular. En conclusió, els resultats de la present tesi suggereixen que tant ERβ com UCP2 podrien ser biomarcadors interessants per a aconseguir una millor caracterització del tumor en relació al seu nivell d'estrès oxidatiu i la possible resposta al tractament. / Oxidative stress is an imbalance between free radical production and the antioxidant systems responsible for counteracting them. The result of this imbalance is accumulation of damage in several cellular structures, including DNA. Cancer is associated with increased oxidative stress, therefore, many therapeutic treatments are targeted to raise cytotoxic ROS levels, which would lead to tumor cell apoptosis. However, during tumorigenesis, cells acquire several features that maintain ROS homeostasis and develop resistance to anticancer treatments. Breast cancer is a type of neoplasia in which the endocrine factor plays an important role in etiology and disease progress. In the preset thesis we set out to study the effects of hormonal factors: 17β-estradiol (E2), genistein and leptin, on oxidative stress modulation in breast carcinogenesis. E2 is one of the main risk factors for breast cancer initiation and progression; genistein is one of the phytoestrogens with greater estrogenic activity and, while, leptin has also shown enhancing effects on breast cancer, epidemiologically it is also considered to be a possible link between obesity and cancer. The aim of this work was to study: i) the dual effect of E2 and genistein on oxidative stress depending on the ERα and ERβ ratio in breast cancer cell lines (MCF-7 and T47D), and oxidative stress in invasive ductal carcinoma samples depending on estrogen receptor ratio; ii) the influence of chronic leptin on oxidative stress and response to anticancer drug cisplatin in MCF-7 cell line; iii) the significance of UCP2 in the regulation of endogenous and induced oxidative stress in MCF-7 cells as well as in mutant p53 pancreatic cancer cell lines. Results indicate that E2 induces oxidative stress in a ERα/ERβ ratio-dependent manner. Thus, the increase in oxidative stress, due to in part to a decrease in antioxidant systems, is mediated by ERα. In contrast, ERβ activation by genistein involves a lower oxidative stress and better mitochondrial function, which is promoted by an antioxidant response. In agreement with the in vitro study, breast tumors with a lower ERα/ERβ ratio showed a higher detoxifying response, which also improved cellular survival. In turn, leptin appears to decrease the basal level of oxidative stress, which could play a role in the acquisition of resistance to anticancer treatments. UCP2-mediated mitochondrial uncoupling protects the cancer cell from oxidative damage, which may possibly confer cytoprotection through chemoresistance acquisition. In pancreatic cancer cells, p53 mutant induces ROS production due to a decrease in UCP2, contributing to cell growth. In conclusion, the results of this thesis suggest that both ERβ and UCP2 may be interesting biomarkers for a better characterization of the tumor in relation to its level of oxidative stress and possible treatment response.

Queda claro que los efectos de la insulina son tan complejos, inter-relacionados y diversos que es muy difícil explicar el cambio final observado en nuestros pacientes DM2 tras la administración de la hormona. Esto se agrava por la falta de estudios previos de este tipo de problemática desde una perspectiva mecanística. Por un lado la hormona podría ejercer efectos pro-aterogénicos, pero por otro sus actividades directa o indirectamente anti-aterogénicas se hacen prevalentes y el resultado final resulta ser protectivo. Esta conclusión debe ser necesariamente acompañada de una consideración especial sobre el nivel de hiperinsulinismo y resistencia periférica a la hormona que exhiba el paciente. La suplementación estaría indicada cuando el nivel de insulina circulante no es excesivo o en términos mas sencillos cuando los marcadores convencionales superen ciertos valores de referencia que aún no han sido investigados (por ejemplo Hb A1c ≥ 7%). De modo que se requieren estudios más exhaustivos y con un mayor n para decidir cual sería la línea de corte y la condición de hiper-insulinismo que desacosejarían su implementación. En general, podemos decir que la administración de insulina en combinación con hipoglucemiantes orales modifica significativamente y de manera beneficiosa a todos los biomarcadores de inflamación, y a la mayoría de los marcadores de riesgo aterogénico y disfunción endotelial. Estos efectos son independientes del tipo de insulina administrada, pero correlacionan con otras variables sustentando la idea de obtener un beneficio tras su administración. Existe una clara dependencia entre el deterioro evaluado por cualquiera de los marcadores y el tiempo de evolución clínica, y una compleja inter-relación entre ellos que se ve mejorada por efecto de la hormona siempre y cuando se considere exceptuar a los pacientes con muy significativa hiperinsulinemia. Los resultados apoyan la implementación de una terapia combinada de hipoglucemiantes orales e insulina como una mejor opción para disminuir las complicaciones de la DM2, siempre que se tomen los recaudos pertinentes para evitar el riesgo de hipoglucemia (sobre todo en pacientes susceptibles). Asimismo, podría favorecer una mayor expectativa funcional de las células beta que de este modo no se verían tempranamente agotadas para acometer con la demanda creciente de insulina a nivel periférico. Se justificaría ampliar este tipo de investigaciones longitudinales a grandes poblaciones de pacientes DM2 cuidadosamente seleccionadas a fin de rectificar o ratificar estos hallazgos como generadores de hipótesis de trabajo, las cuales conducirían finalmente a una descripción mecanística clara sobre los eventos sobre los cuales se sustentan. Tras la dilucidación de estas cuestiones podría ser posible entonces admitir su inclusión como un protocolo o una recomendación farmacológica sentada sobre bases mucho más convincentes.

Magíster en fisiopatología / La transición cardiopulmonar del recién nacido es vital al nacimiento. En la hipertensión pulmonar del recién nacido (HTPRN) esta adaptación se ve comprometida, generando un aumento crónico de la postcarga del ventrículo derecho (VD) debido a una excesiva vasoconstricción pulmonar hipóxica. La persistencia de este fenómeno genera un remodelamiento cardíaco maladaptativo, principalmente a nivel parietal y septal, e insuficiencia cardíaca que determinan una alta morbimortalidad al recién nacido. El tratamiento de la HTPRN se ha enfocado principalmente en intentar revertir la vasoconstricción pulmonar, sin embargo, la efectividad del mismo es relativamente baja. Esto podría explicarse en parte por el insuficiente conocimiento sobre los mecanismos responsables de la falla ventricular sumado al escaso abordaje terapéutico de los cambios en la estructura y función del corazón. Estudios previos han evidenciado que el desarrollo de estrés oxidativo/nitrosativo (EON) tiene un rol importante en la fisiopatología de la HTPRN, sin embargo, su impacto a nivel cardíaco no ha sido estudiado. Melatonina, una neurohormona con acción scavenger de especies reactivas de oxígeno/nitrógeno y capacidad de aumentar las enzimas antioxidantes, ha mostrado revertir los cambios anatómicos y funcionales del pulmón en la HTPRN. Pusimos a prueba la hipótesis que los cambios de estructura y función cardíaca en la HTPRN están relacionados con EON, y que melatonina es capaz de revertir dichos cambios. Diez neonatos de oveja gestados y nacidos en hipoxia hipobárica (INCAS, Putre, 3600 m) fueron divididos en grupo control (CN, n = 5) y tratado (MN, n = 5), a los cuales se les administró vehículo o melatonina (1 mg/kg/día oral), respectivamente. Los tratamientos se administraron entre los días 4 y 12 de vida, período en el cual se registraron diariamente variables hemodinámicas para el análisis de la función cardíaca (gasto y variabilidad cardíaca). Al final de dicho período, se obtuvieron las muestras para el estudio comparativo macro y microscópico de la estructura cardíaca, así como la medición de marcadores de EON (nitrotirosina y 4-hidroxinonenal) y expresión de proteínas antioxidantes (SOD, catalasa y GPx) en VD. Desde el punto de vista funcional, el grupo MN mostró un aumento del gasto cardíaco hacia el final del período de tratamiento, sin una clara diferencia en índices de variabilidad cardíaca entre ambos grupos. Estructuralmente, el grupo MN mostró menores valores de área miocárdica en la cavidad y pared del VD y septum interventricular, respecto del grupo CN. Finalmente, el grupo MN mostró una mayor expresión de catalasa en el tejido ventricular respecto del grupo CN, sin embargo, no se evidenciaron diferencias en los marcadores de EON entre los grupos. Concluimos que melatonina podría favorecer la reversión de los cambios estructurales cardíacos propios de HTPRN, así como mejorar la función ventricular. / The cardiopulmonary transition at birth is vital phenomenon. In the persistent pulmonary hypertension of the newborn (PPHN) this aspect is compromised, generating an excesive afterload to the right ventricule (RV) due to an increased hypoxic pulmonary vasoconstriction. As this persists, the RV develops a maladaptative hypertrophy, mainly basal and septal, and failure with an increased morbimortality. Treatment of PPHN has focused mainly on reverting vasoconstriction, with low efectiveness. This could be explained due to lack of knowlegde on the pathophysiology of heart failure and lack of attention of this issue on treatment. There is evidence of the role of oxidative/nitrosative stress (ONS) on the pathophysiology of PPHN, however, there are no studies of the impact in the heart. The neurohormone melatonin has shown a scavenger effect over reactive oxigen/nitrogen species and the ability to increase level of antioxidant enzymes. It has also shown beneficial in reverting the anatomical and functional changes in PPHN. With this evidence we tested the hypotesis that ONS is related to the changes in structure and function of the heart in PPHN, and that melatonin is capable to revert this changes. Ten neonate sheep that where gestated and borned in hypobaric hipoxia (INCAS, Putre, 3600 m) where divided in control (CN, n = 5) and treatment (MN, n = 5) groups, with the administration of vehicule or melatonin (1 mg/kg/d PO), respectively. Intervention occurred within 4 and 12 days after birth, where hemodynamic variables where recorded to estimate cardiac function (cardiac output [CO] and variability [CV]). At the end of the period, samples where obtained for macro and microscopic study of the heart, and also for markers of ONS (nitrotyrosine and 4-hydroxynonenal) and expression of antioxidant enzymes (SOD, catalase and GPx) on RV. Functionally, the MN group showed an increase in CO by the end of the period, with no changes in CV. Structurally, the MN group showed a decrease in myocardial area of the RV cavity, wall and interventricular septum. Finally, the MN group showed an increase in the expression of catalase in RV with no differences in ONS between groups. With these results we postulate that melatonin could revert the structural changes in PPHN, with a beneficial effect on its function.

[ES] Las antraciclinas son fármacos antineoplásicos ampliamente utilizados en el trata-miento de varios tipos de cáncer, incluyendo tanto tumores sólidos como hematoló-gicos. A pesar de su eficacia, su uso se ve limitado por su efecto cardiotóxico. El aumento de los supervivientes de cáncer, especialmente pediátrico, ha provocado que cada vez haya más personas con cardiotoxicidad inducida por antraciclinas. Por este motivo, es necesaria la búsqueda de nuevos modelos de enfermedad relevan-tes para comprender la fisiopatología del daño cardíaco inducido por antraciclinas, así como el desarrollo de nuevas terapias cardioprotectoras que permitan el uso de las antraciclinas evitando su efecto cardiotóxico. En este trabajo se ha estudiado, por una parte, la susceptibilidad al daño por do-xorrubicina (una de las principales antraciclinas empleadas en clínica) de cardiomio-citos obtenidos a partir de células madre pluripotentes inducidas derivadas de pa-cientes pediátricos oncológicos que experimentaron cardiotoxicidad causada por an-traciclinas. Los cardiomiocitos de los pacientes fueron tratados con doxorrubicina y se evaluaron diferentes parámetros, incluyendo la viabilidad, apoptosis, estrés oxida-tivo, daño genómico, daño mitocondrial, desorganización sarcomérica, etc. compa-rándolos con cardiomiocitos control. Nuestros resultados mostraron que estos car-diomiocitos recapitulan la susceptibilidad a la doxorrubicina observada en los pacien-tes, constituyendo un buen modelo de enfermedad para estudiar los mecanismos de cardiotoxicidad de la doxorrubicina o el cribado de fármacos. Por otra parte, se ha evaluado el papel cardioprotector de un miARN, el miR-4732-3p, frente al daño inducido por antraciclinas. Este miARN está desregulado en pa-cientes con cáncer de mama que sufrieron cardiotoxicidad inducida por antraciclinas. Para comprobar su efecto cardioprotector, este miARN fue sobreexpresado en célu-las cardíacas de rata, las cuales fueron tratadas con doxorrubicina, observándose que incrementaba la supervivencia de las células y reducía el estrés oxidativo. Tam-bién se estudió la cardioprotección in vivo en un modelo de cardiotoxicidad inducida por doxorrubicina en rata, observando que mejora la función cardíaca, reduce la fi-brosis intersticial y el estrés oxidativo. Además, se hizo un estudio de los posibles genes diana de este miARN. En su conjunto, nuestros resultados muestran que el miR-4732-3p tiene un efecto cardioprotector frente al daño por doxorrubicina, y po-dría ser una herramienta terapéutica para el tratamiento del daño cardíaco causado por las antraciclinas. / [CAT] Les antraciclines són fàrmacs antineoplàstics àmpliament utilitzats en el tractament de diversos tipus de càncer, incloent tant tumors sòlids com hematològics. Tot i la seva eficàcia, el seu ús es veu limitat pel seu efecte cardiotòxic. L'augment dels su-pervivents de càncer, especialment pediàtric, ha provocat que cada cop hi hagi més persones amb cardiotoxicitat induïda per antraciclines. Per aquest motiu, cal cercar nous models de malaltia rellevants per comprendre la fisiopatologia del dany cardíac induït per antraciclines, així com el desenvolupament de noves teràpies cardiopro-tectores que permetin l'ús de les antraciclines evitant-ne l'efecte cardiotòxic. En aquest treball s'ha estudiat, d'una banda, la susceptibilitat al dany per doxorrubi-cina (una de les principals antraciclines emprades en clínica) de cardiomiòcits obtin-guts a partir de cèl¿lules mare pluripotents induïdes derivades de pacients pediàtrics oncològics que van experimentar cardiotoxicitat causada per antraciclines. Els cardi-omiòcits dels pacients van ser tractats amb doxorrubicina i es van avaluar diferents paràmetres, incloent-hi la viabilitat, apoptosi, estrès oxidatiu, dany genòmic, dany mitocondrial, desorganització sarcomèrica, etc. comparant-los amb cardiomiòcits control. Els nostres resultats van mostrar que aquests cardiomiòcits recapitulen la susceptibilitat a la doxorrubicina observada en els pacients, constituint un bon model de malaltia per estudiar els mecanismes de cardiotoxicitat de la doxorrubicina o el cribratge de fàrmacs. D'altra banda, s'ha avaluat el paper cardioprotector d'un miARN, el miR-4732-3p, davant del dany induït per antraciclines. Aquest miARN està desregulat en pacients amb càncer de mama que van patir cardiotoxicitat induïda per antraciclines. Per comprovar el seu efecte cardioprotector, aquest miARN va ser sobreexpressat en cèl·lules cardíaques de rata, les quals van ser tractades amb doxorrubicina, obser-vant-se que incrementava la supervivència de les cèl·lules i reduïa l'estrès oxidatiu. També es va estudiar la cardioprotecció in vivo en un model de cardiotoxicitat induï-da per doxorrubicina en rata, observant que millora la funció cardíaca, redueix la fi-brosi intersticial i l'estrès oxidatiu. A més, es va fer un estudi dels possibles gens di-ana d'aquest miARN. En conjunt, els nostres resultats mostren que el miR-4732-3p té un efecte cardioprotector davant el dany per doxorrubicina, i podria ser una eina terapèutica per al tractament del dany cardíac causat per les antraciclines. / [EN] Anthracyclines are drugs widely used in the treatment of several types of cancer, including both solid tumors and hematologic malignancies. Despite its proven effica-cy, its use is hampered by its cardiotoxic effect. The increase in cancer survivors, especially pediatric, has led to more and more people with anthracycline-induced cardiotoxicity. Therefore, it is necessary to search for new relevant disease models to better understand the physiopathology of cardiac damage-induced by anthracy-clines, as well as the development of new cardioprotective therapies that allow the clinic use of anthracyclines avoiding their cardiotoxic effect. In this work we have studied, on the one hand, the susceptibility against doxorubicin damage (major anthracycline used in clinic) of cardiomyocytes obtained from in-duced pluripotent stem cells derived from oncology pediatric patients that underwent cardiotoxicity-induced by anthracyclines. Cardiomyocytes from these patients were treated with doxorubicin, and we evaluated several parameters, including cell viabil-ity, apoptosis, oxidative stress, genomic damage, mitochondrial damage, sarcomere disorganization, etc. comparing the results with control cardiomyocytes. Our results showed that these cardiomyocytes recapitulate the susceptibility against doxorubicin observed in the patients, making them a good disease model to study cardiotoxicity mechanisms of doxorubicin or drug screening. On the other hand, we evaluated the cardioprotective role of one miRNA, miR-4732-3p, against doxorubicin-induced damage. This miRNA is dysregulated in breast can-cer patients that suffered cardiotoxicity-induced by anthracyclines. To test its cardio-protective effect, this miRNA was overexpressed in rat cardiac cells that were treated with doxorubicin, showing an increment of cell survival and a reduction of oxidative stress levels. We also studied in vivo cardioprotection in a doxorubicin-induced cardi-otoxicity model in rat, showing an improvement in cardiac function, reduced intersti-tial fibrosis and reduced oxidative stress levels. Moreover, we studied possible target genes of this miARN. Overall, our results showed that miR-4732-3p has a cardiopro-tective role against doxorrubicin-induced damage and could be used as a therapeutic tool for treatment of cardiac damage caused by anthracycline. / Reinal Ferré, I. (2023). Modelado de la cardiotoxicidad inducida por antraciclinas en hiPSC-CM de pacientes oncológicos pediátricos y estudio del papel cardioprotector del miR-4732-3p [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/193075