El síndrome de Down constituye la cromosomopatía más frecuente que ocurre en uno de cada 700 a 1000 nacimientos y está causado por la trisomía completa o por una parte del cromosoma 21 humano (HSA21). Aún se desconoce cómo la presencia del cromosoma 21 extra da lugar al fenotipo característico de este síndrome. En este sentido la participación de las especies reactivas de oxígeno (ROS) ha sido propuesta como uno de los mecanismos que intervienen en la patogénesis del mismo. Dicho mecanismo se fundamenta en la sobreexpresión de al menos 16 genes del HSA21 relacionados con el metabolismo de las especies reactivas de oxígeno (ROS) y con la generación de energía mitocondrial. Uno de estos genes es el que codifica una importante enzima del sistema antioxidante celular, el gen SOD1, propuesto como potencial culpable del estrés oxidativo inusual en los individuos con SD. En condiciones normales, los ROS, producidos in vivo principalmente por la respiración aeróbica, se eliminan de la célula por la acción de las enzimas antioxidantes, superóxido dismutasa (SOD), catalasa (CAT) y glutatión peroxidasa (GPx). La Cu/Zn superóxido dismutasa (SOD1) convierte el radical superóxido a peróxido de hidrógeno, el cual es eliminado por la glutatión peroxidasa y/o catalasa a agua y oxígeno. La sobreexpresión de la SOD1 puede producir un desequilibrio en la relación de las enzimas antioxidantes (SOD1, GPx y CAT) generando estrés oxidativo y podría resultar en el daño oxidativo a biomoléculas tales como ácidos grasos poliinsaturados en los lípidos de las membranas, proteínas esenciales y el DNA, ya que existe una variabilidad en los niveles de enzimas antioxidantes dentro de la población con SD, lo que puede estar relacionado con una desregulación compleja que afecte no sólo a los genes del HSA21 sino también en otros cromosomas. Así, el daño celular puede ser inducido por los ROS y asociarse a algunas de las alteraciones celulares en el SD, causando diversas patologías y conducir a un envejecimiento prematuro. Se obtuvieron 18 muestras de fibroblastos primarios fetales humanos, 9 de ellos con síndrome de Down (FT21) y 9 controles (FC), en los cuales se evaluó la disminución de la capacidad endógena antioxidante debido a la sobreexpresión de la SOD1, causando un exceso en la producción intracelular de ROS y el origen prematuro de estrés oxidativo asociado al daño oxidativo a lípidos y proteínas, así como a una disfunción mitocondrial. Se analizaron varios marcadores de senescencia celular con la finalidad de contribuir al conocimiento de un nuevo aspecto de la patología de este síndrome, el envejecimiento prematuro. Estos mecanismos fisiopatológicos podrían estar relacionados con la aparición y establecimiento de la senescencia celular prematura en los fibroblastos con trisomía del cromosoma 21 (FT21). / Down syndrome is the most common chromosomal disorder that occurs in 1 in 700 to 1,000 births and is caused by trisomy full or part of human chromosome 21 (HSA21). It is still unknown how the presence of the extra chromosome 21 results in the phenotype of this syndrome. In this sense the involvement of reactive oxygen species (ROS) has been proposed as one of the mechanisms involved in the pathogenesis of same. This mechanism is based on the overexpression of at least 16 genes related HSA21 metabolism of reactive oxygen species (ROS) and mitochondrial energy generation. One of these genes encoding is an important cellular antioxidant enzyme system, the SOD1 gene, proposed as a potential culprit unusual oxidative stress in individuals with DS. Under normal conditions, the ROS produced in vivo mainly by aerobic respiration of the cells are removed by the action of antioxidant enzymes, superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT) and glutathione peroxidase (GPx). The Cu/Zn superoxide dismutase (SOD1) converts the superoxide radical to hydrogen peroxide, which is eliminated by glutathione peroxidase and/or catalase into water and oxygen. SOD1 overexpression can produce an imbalance in the ratio of antioxidant enzymes (SOD1, GPx and CAT) generating oxidative stress and may result in oxidative damage to biomolecules such as polyunsaturated fatty acids in the membrane lipids, proteins and essential DNA, since there is a variability in the levels of antioxidant enzymes in the DS population, which can be related to a complex deregulation affects not only Hsa21 genes but also on other chromosomes. Thus, cell damage can be induced by ROS and associated with some of the cellular changes in the DS, causing various diseases and lead to premature aging. Eighteen samples were obtained from primary human fetal fibroblasts, 9 with Down syndrome (TF21) and 9 normal (NF), which was evaluated in decreasing endogenous antioxidant capacity due to overexpression of the SOD1, causing excess in intracellular production of ROS and oxidative stress origin associated premature oxidative damage to lipids and proteins, as well as mitochondrial dysfunction. We analyzed several markers of cellular senescence in order to contribute to the knowledge of a new aspect of the pathology of this syndrome, premature aging. These pathophysiological mechanisms may be related to the emergence and development of premature cellular senescence in fibroblasts with trisomy 21 (FT21).

Hcm1, es un factor transcripcional de la familia de los forkhead en Saccharomyces cerevisiae. Los factores forkhead se encuentran evolutivamente conservados, desde levaduras hasta humanos. En mamíferos estos factores regulan diversos procesos, entre ellos el ciclo celular, la supervivencia y la proliferación en respuesta a factores de crecimiento. Además, los factores FoxM, FoxO y sus ortólogos, participan en procesos como el envejecimiento y en enfermedades como el cáncer. Los estudios sobre Hcm1 en S. cerevisiae, indican que este factor es un regulador de la formación del spindle pole y de la expresión del cluster de genes necesarios en la fase S del ciclo celular. En el presente trabajo se estudió la regulación de Hcm1 sobre nuevos procesos celulares. En primer lugar, se demostró que Hcm1 regula positivamente la masa mitocondrial, el número de copias de ADN en esta organela y su actividad metabólica. Además, induce la metabolización de la glucosa favoreciendo el proceso oxidativo sobre la fermentación. Este cambio metabólico inducido por Hcm1, viene acompañado por una mayor resistencia celular al estrés. Además, se demostró que Hcm1 responde al estrés oxidativo aumentando su localización nuclear y su actividad transcripcional. Esta misma respuesta se observó cuando las células eran sometidas a restricción de glucosa o nitrógeno. En esta dirección estudiamos los mecanismos regulatorios de estas respuestas y se determinó que Sir2, una histona deacetilasa NAD+-dependiente relacionada con el envejecimiento y el silenciamiento genético, interacciona con Hcm1 y regula la respuesta a estrés de Hcm1. Paralelamente, analizamos la implicación de las vías AMPK y TOR/Sch9 en la regulación de Hcm1. De esta manera, demostramos que ambas vías son reguladoras de la respuesta de Hcm1 a restricción nutricional, ya que experimentos in vitro indicaron que Snf1 y Sch9 fosforilan Hcm1. El análisis de la expresión génica en la cepa salvaje y en el mutante hcm1, en diferentes puntos de la curva de crecimiento del cultivo, indicó que genes que se inducen durante esta cinética, y que están relacionados con el estrés y el metabolismo, son regulados por este factor. Los resultados obtenidos en este trabajo, permiten concluir que, además de su implicación en el ciclo celular, Hcm1 es un factor clave en la adaptación temprana de las células a la restricción nutricional y en la posterior entrada en fase diáuxica, a través de la inducción de metabolismo oxidativo mitocondrial y la respuesta a estrés. / Hcm1 is a forkhead transcription factor in Saccharomyces cerevisae. The forkhead factors are evolutionary conserved from yeast to human. In mammals, these factors regulate different processes, among them, cell cycle, cell survival and cell proliferation in response to growth factors. Moreover, FoxO, FoxM and their orthologues have been related to the aging process and cancer. Studies on Hcm1 in S. cerevisae indicate that this factor is related to spindle pole dynamics and the regulation of the cluster of genes required during the S phase of the cell cycle. In this work we studied Hcm1 implication on novel cellular processes. First, we demonstrated that Hcm1 positively regulates mitochondrial mass, mtDNA copy and mitochondrial activity. In addition, Hcm1 favours oxidative metabolism of glucose over its fermentation. This metabolic shift, is accompanied by an increase in cellular stress resistance. In response to oxidative stress treatments, Hcm1 shifts to the nucleus and its transcriptional activity is activated. A similar Hcm1 response was observed when the cells were submitted to glucose or nitrogen restriction. Additionally, we analyzed the regulatory mechanisms behind these responses. We demonstrated that Sir2, a NAD+ dependent histone deacetylase involved in aging and genetic silencing, interacts with Hcm1 and regulates its response to oxidative stress. In parallel, we analyzed the role of AMPK and TOR/Sch9 pathways on Hcm1 regulation. In this context, we observed that both pathways regulate Hcm1 in response to nutrient restriction in vivo. Moreover, Snf1 and Sch9 phosphorylate Hcm1 in vitro. Gene expression analysis on wild type cells and in hcm1 mutant at different points along the growth curve, indicated that genes that are upregulated during this kinetic and are related to stress response and metabolism, are regulated by Hcm1. Taken together, our results indicate that Hcm1 not only regulates cell cycle dynamics, but is also a key factor in the early adaptation of the cells to nutrient deficiency and later, to the entry into the diauxic phase. This adaptation is mediated by Hcm1 induction of oxidative metabolism and stress response.

El objetivo de este trabajo es profundizar en el conocimiento de las bases fisiológicas de las respuestas de los cítricos a condiciones de estrés abiótico y biótico. Se ha diseñado un sistema que ha permitido el establecimiento de las condiciones óptimas para el cultivo in vitro de cítricos en condiciones de estrés abiótico. Los resultados obtenidos indican que pese a su sensibilidad, las plantas de citrange Carrizo sometidas a estrés hídrico mantienen su maquinaria antioxidante y su sistema de señalización hormonal intactos, incluso cuando se cultivan brotes sin raíz. Además, tras cultivar plantas de distintos genotipos in vitro en medio salinizado con o sin sistema radicular, se concluye que la tolerancia al estrés salino en cítricos no está relacionada con adaptaciones bioquímicas sino con la capacidad para excluir iones de la parte aérea. La infección con el virus de la tristeza provoca una reducción de la actividad fotosintética en plantas de lima mejicana que, unida a la incapacidad de activar mecanismos de disipación de energía en el fotosistema II, provoca daño oxidativo en los tejidos vegetales. Los datos también sugieren una precisa regulación hormonal de las respuestas de los cítricos al estrés biótico junto con una represión generalizada del metabolismo secundario.

[EN] ocp3 mutant plants exhibit an accelerated and intensified callose deposition in response to infection by Botrytis cinerea or Plectosphaerella cucumerina. After phenotypic analysis of a series of double mutants ocp3 we observed that both, the increase callose deposition and resistance, require PMR4 callose synthase and hormone abscisic acid (ABA). In wild plants after infection with any of these necrotrophic fungi, ABA synthesis increases, this increase is even higher in ocp3. The greater resistance observed in ocp3 plants also requires the correct perception of jasmonic acid (JA) through COI1 receptor. However, JA is not required for the synthesis and basal callose deposition. In this way it could propose a model in which OCP3 exerts a specific control for callose deposition regulated by JA and requires, indispensably, ABA. The OCP3 protein, sequence homology, is classified as a nuclear transcription factor family member of Homeobox. However, we found that OCP3 imported and accumulates in the chloroplasts, and colocalized with pentatricopeptide repeat proteins involves in RNA editing. Specifically, OCP3 participates regulating ndhB transcript editing. ndhB encodes one subunit of the multiprotein chloroplast complex NADPH dehydrogenase (NDH). The absence of OCP3 results in a decay of ndhB editing; a fact which entails a reduction of the activity of NDH complex and therefore leads to a defect in the cyclic electron flow (CEF) around the photosystem I (PSI). We were also able to confirm that mutants having altered activity of NDH complex, as crr2 and crr21 turn have an increased resistance to infection by P. cucumerina, and show an increased callose deposition. Moreover, we note that the editing of the mRNA for other subunits encoded in the chloroplast NDH complex are also subject to regulation which is significantly altered in the presence of a pathogenic stimuli. At the same time, the stability of NDH complex also compromised after a pathogenic insult. All these results indicate that the NDH complex is subject to a subtle regulation in accordance with the changing environment. The ABA is a key player in activating plant defense against P. cucumerina infection. Moreover, hemibiotrofos pathogens such as Pseudomonas syringae DC3000 also cause increased synthesis of ABA. However, this increase leads to the suppression of defensive responses, which can be attributed a dual role. The regulation of dual role of this hormone, activator and repressor some other defenses, indicates the existence of a post-regulating hormone synthesis. In this Doctoral Thesis, it has been identified as PYR1 family member receptor ABA PYR/PYL/RCAR perceives this hormone to trigger a response to infection by a pathogen. PYR1 reduces the salicylic acid (SA) dependent response against the biotrophic pathogens attack. Thus exerts a positive control JA-dependent responses required to activate the defenses against necrotrophic pathogens. The loss of the perception of ABA through PYR1 activates the expression of SA-responsive genes, alteration of chromatin remodeling and increase in the activation of MAP kinases after the attack biotrophic pathogens. Thus, the ABA through PYR1 receptor and through an epigenetic control, have a regulatory role in plant immunity depending on the lifestyle of pathogens infecting the plant. / [ES] Las plantas mutantes ocp3, presentan una acelerada e intensificada deposición de calosa en respuesta a la infección producida por Botrytis cinerea o Plectosphaerella cucumerina. Tras el análisis fenotípico de una serie de dobles mutantes en el fondo ocp3 observamos que tanto el incremento en la deposición de calosa como de la resistencia requieren de la calosa sintasa PMR4, y de la hormona ácido abscísico (ABA). En las plantas silvestres, tras la infección por alguno de estos hongos necrotrofos, se incrementa la síntesis de ABA, incremento éste que aún es mayor en las plantas ocp3. La mayor resistencia que se observa en las plantas ocp3 también requiere de la correcta percepción del ácido jasmónico (JA) a través del receptor COI1. Sin embargo, el JA no es requerido para la síntesis y deposición de calosa basal. De esta forma se podría proponer un modelo en el que OCP3 ejerce un control específico para la deposición de calosa regulada por JA y que requiere, indispensablemente, de ABA. La proteína OCP3, por homología de secuencia, se clasifica como un factor de transcripción nuclear miembro de la familia de los Homeobox. Sin embargo, encontramos que OCP3 se importa y acumula en los cloroplastos, y se colocaliza con proteínas que contienen motivos de repetición pentatricopeptidos e implicadas en la edición de RNA. Concretamente, OCP3 participa regulando el mecanismo de edición del transcrito ndhB que codifica una de las subunidades del complejo multiprotéico NADPH deshidrogenasa (NDH) del cloroplasto. La ausencia de OCP3 se traduce en una deficiente edición de ndhB; hecho éste que conlleva un deterioro en la funcionalidad del complejo NDH y que por tanto acarrea un defecto en el flujo cíclico de electrones (CEF) alrededor del fotosistema I (PSI). También pudimos confirmar que mutantes que presentan alteraciones en la actividad del complejo NDH, como crr2 y crr21, a su vez presentan un incremento en la resistencia frente a la infección por P. cucumerina, además de mostrar una mayor deposición de calosa. Por otra parte, observamos que la edición de los mRNA para otras subunidades del complejo NDH codificadas en el cloroplasto están, también, sujetas a una regulación que se ve notablemente alterada en presencia de un estimulo patogénico. Al mismo tiempo, la estabilidad del complejo NDH también se ve comprometida tras un insulto patogénico. Todos estos resultados indicarían que el complejo NDH está sujeto a una sutil regulación en concordancia con las condiciones cambiantes del entorno. El ABA es determinante en la activación de mecanismos de defensa frente a P. cucumerina. Por otra parte, patógenos hemibiotrofos como por ejemplo Pseudomonas syringae DC3000 también provocan incremento en la síntesis de ABA. Sin embargo, este incremento acarrea la supresión de las respuestas defensivas, por lo que se le puede atribuir un papel dual. La regulación del papel dual de esta hormona, activador de unas defensas y represor de otras, indica la existencia de una regulación posterior a la síntesis de la hormona. En la presente Tesis Doctoral, se ha identificado a PYR1 como el miembro de la familia de los receptores de ABA PYR/PYL/RCAR que percibe esta hormona para desencadenar una respuesta a la infección por un patógeno. PYR1 amortigua la respuesta dependiente de ácido salicílico (SA) frente al ataque de un patógeno biotrofo. De esta forma ejerce un control positivo sobre las respuestas dependientes de JA requeridas para activar las defensas frente a patógenos necrotrofos. La pérdida de la percepción del ABA por PYR1 provoca una activación de los genes de respuesta a SA, una alteración de la remodelación de la cromatina y un incremento en la activación de las MAP quinasas tras el ataque de patógenos biotrofos. De esta forma, el ABA a través del receptor PYR1 y a través de un control epigenético, tendría un papel regulador de la inmunidad vegetal en función del / [CAT] Les plantes mutants ocp3, presenten una accelerada e intensificada deposició de calosa en resposta a la la infecció produïda per Botrytis cinerea o Plectosphaerella cucumerina. Darrere l'anàlisi d'una sèrie de dobles mutants amb ocp3, observem que tant l'increment en la deposició de calosa com de la resistència requereixen de la calosa sintasa PMR4, i de l'hormona àcid abscisic (ABA). Les plantes silvestres infectades amb algú d'aquests fongs necrotrofs, incrementen la síntesi de ABA, increment aquest que encara és major en les plantes ocp3. La major resitència que s'observa en les plantes ocp3 també requereix de la correcta percepció de l'àcid jasmonic (JA) a través del receptor COI1. No obstant això, el JA no és requerit per a la síntesi i deposició de calosa basal. D'aquesta forma, es podria proposar un model en el qual OCP3 exerceix un control especific per a la deposició de calosa regulada pel JA i que requerix, indispensablement, de l'ABA. La proteïna OCP3, per homologia de seqüència, es classifica com un factor de transcripció nuclear membre de la familia dels Homeobox. No obstant això, trobem que OCP3 s'importa i acumula en el cloroplasts, i es colocaliza amb proteïnes que contenen motius de repetició pentatricopeptids i implicades en l'edició de RNA. Concretament, OCP3 participa regulant el mecanisme d'edició del transcrit ndhB que codifica una de les subunitats del complex multiproteic NADPH deshidrogenasa (NDH) del cloroplast. L'absència d'OCP3 es tradueix en una deficient edició de ndhB; fet aquest que comporta una pèrdua de la funcionalitat del complex NDH i que per tant implica un defecte en el flux cíclic d'electrons (CEF) al voltant del fotosistema I (PSI). També vam poder confirmar que mutants que presenten alteracions en la activitat del complex NDH, com crr2 i crr21, al seu torn presenten un increment en la resistència enfront de la infecció per P. cucumerina, a més de mostrar una major deposició de calosa. D'altra banda, observem que l'edició dels mRNA per a altres subunitats del complex NDH codificades en el cloroplast estan, també, subjectes a una regulació que es ceu notablement alterada en preséncia d'un estimulo patogenic. Tots aquests resultats indicarien que el complex NDH està subjecte a una sutil regulació en concordaça amb les condicions canviants de l'entorn. El ABA es determinatn en l'activació de mecanismes de defensa enfront de P. cucumerina. D'altra banda, patògens hemibiotrofs com per exemple Pseudomonas syringae DC3000 també provoquen increment en la síntesi de ABA. No obstant això, aquest increment implica la supressió de les respostes defensives, per la qual cosa se li pot atribuir un paper dual. La regulació del paper dual d'aquesta hormona, activador d'unes defenses i repressor d'unes altres, indica l'existència d'una regulació posterior a la síntesi de l'hormona. En la present Tesis Doctoral, s'ha indentificat a PYR1 com el membre de la familia dels receptors de ABA PYR/PYL/RCAR que percep aquesta hormona per desencadenar una resposta a la infecció per un patogen. PYR1 esmorteeix la resposta dependent d'acid salicílic (SA) enfornt de l'atac d'un patogen biotorof. D'aquesta forma exerceix un control positiu sobre les respostes dependents de JA requerides per activar les defenses enfront de patògens necrotofs. La pèrdua de la percepció del ABA per PYR1 provoca una activació de les MAP quinases després de l'atac de patògens biotrofs. Així donçs, el ABA a través del receptor PYR1 i a través d'uun control epigenètic, tindria un paper regulador de la immunitat vegetal en funció de l'estil de vida del patogen que infecti a la planta. / García-Andrade Serrano, J. (2016). Función de OCP3 en la resistencia de Arabidopsis frente a hongos necrotrofos [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/63147 / TESIS

Con el fin de investigar los efectos en la homeostasis de iones de un aumento en la concentración celular de peróxido de hidrógeno, se aisló un mutante de inserción de T-DNA en el gen CATALASA 2 de Arabidopsis. El mutante cat2-1 presenta una reducción del 80% de la catalasa de hoja en comparación con genotipos silvestres y acumula más peróxido de hidrógeno en condiciones sin estrés. Además de presentar un tamaño reducido, un color verde más pálido y gran reducción en el número de raíces secundarias, el mutante cat2-1 presenta una marcada sensibilidad a peróxido de hidrógeno, cloruro sódico, norespermidina, alta intensidad lumínica y estrés por frío. Por otra parte, el mutante cat2-1 presenta una tolerancia parcial cuando es crecido en medios con cloruro de litio en comparación con el genotipo silvestre. Este novedoso fenotipo no puede ser explicado por cambios en el transporte de este catión. Realmente, la toma de litio y de otros cationes tóxicos como sodio y norespermidina es mayor en el mutante cat2-1, mientras que los niveles de potasio de la planta son inferiores. La tolerancia a litio de este mutante parece ser resultado de una insensibilidad a la inhibitoria respuesta de etileno producida por el catión y a su reducida capacidad de producción de etileno. De acuerdo con esto, la inducción por etileno de genes de respuesta tales como PR4 y EBP/ERF72 es menor en el mutante cat2-1. Mutantes insensibles a etileno como etr1-1 y ein3-3 son tolerantes a litio y la inhibición de la biosíntesis de etileno con 2-aminoisobutirato protege contra la toxicidad del litio. Análisis de la expresión génica con micromatrices indican que la expresión de genes relacionados al transporte de cationes y a la síntesis y percepción de etileno no están alterados en el mutante cat2-1, lo que nos hace suponer que el peróxido de hidrógeno modula estos procesos a nivel de proteína. Todos estos resultados descubren una estrecha relación entre estrés oxidativo, la homeostasis de cationes y el / Bueso Ródenas, E. (2008). La tolerancia a litio del mutante cat2 de arabidopsis revela una estrecha relación entre estrés oxidativo y etileno [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/2341 / Palancia

[ES] Las especies reactivas de oxígeno (ROS), el oxígeno molecular (O2) y el óxido nítrico (NO) son factores comunes en las respuestas a diferentes tipos de estrés en las plantas. En los últimos años, las condiciones ambientales adversas han aumentado debido al cambio climático y, entre ellas, las fuertes lluvias que provocan anegaciones o inundaciones en los campos suponen un grave problema para el desarrollo y el futuro de la agricultura. Estas inundaciones provocan que la planta se enfrente a condiciones de hipoxia severas y a la re-oxigenación que ocurre cuando se retira el agua. Es importante, por tanto, conocer los factores genéticos y moleculares que modulan las respuestas de las plantas a la hipoxia u otros tipos de estrés abiótico para hacer frente a estas situaciones. La familia de proteínas VQ de Arabidopsis thaliana incluye cinco miembros codificados por genes que se inducen en respuesta a la hipoxia, al NO y al estrés oxidativo. Dos de ellos, VQ1 y VQ10, codifican dos proteínas con una gran homología de secuencia y estructura, que no poseen actividad transcripcional. En este trabajo, se describe que VQ1 y VQ10 interaccionan entre sí y con ellas mismas, y con las otras tres proteínas VQ y cuatro factores de transcripción WRKY cuyos genes también se inducen en respuesta a hipoxia, NO y estrés oxidativo. Un rastreo de doble híbrido de levadura de una genoteca de Arabidopsis utilizando VQ1 como cebo permitió identificar alrededor de 300 proteínas interactoras de VQ1 y probablemente también de VQ10, sugiriendo que ambas proteínas tienen patrones similares de interacción proteína-proteína. VQ1 y VQ10 son proteínas citoplásmicas y nucleares, por lo que la identificación de casi 50 proteínas cloroplásticas que interaccionan con VQ1 en el cloroplasto sugiere que estas interacciones deben ocurrir en el citoplasma. En el rastreo se identificó la 1-desoxi-D-xilulosa-5-fosfato sintasa (DXS), una enzima clave para la biosíntesis de isoprenoides, la fotosíntesis y el crecimiento de las plantas. Al co-inmunoprecipitar DXS y VQ1 o VQ10 se observó que VQ1 y sobre todo VQ10 favorecieron la monomerización de DXS en un ambiente reductor. A partir de la identificación de un mutante hipermórfico vq10-H se ha procedido a caracterizar algunas de las funciones reguladoras ejercidas por VQ10. El análisis transcriptómico comparado de vq10-H y plantas silvestres Col-0 permitió identificar la regulación ejercida por VQ10 en el desarrollo de las raíces, en las respuestas a NO y estrés oxidativo, así como una potencial función reguladora del procesamiento alternativo de ARNs. La sobreexpresión de VQ10 provocó el aumento de la elongación de la raíz primaria, y de la división y elongación celular en la raíz. También provocó una mayor tolerancia al estrés oxidativo, una menor sensibilidad al NO, y una mayor eficiencia fotosintética en comparación con las plantas silvestres. En conjunto, el trabajo realizado en esta Tesis sugiere que algunas funciones reguladoras de VQ1 y VQ10 en el desarrollo y las respuestas a estrés de las plantas podría estar basado en mecanismos de regulación redox. / [CA] Les espècies reactives d'oxigen (ROS), l'oxigen molecular (O2) i l'òxid nítric (NO) són factors comuns en les respostes a diferents tipus d'estrés en les plantes. En els últims anys, les condicions ambientals adverses han augmentat a causa del canvi climàtic i, entre elles, les fortes pluges que provoquen inundacions als camps suposen un greu problema per al desenvolupament i el futur de l'agricultura. Aquestes inundacions provoquen que la planta s'enfronte a condicions d'hipòxia severes i a la re-oxigenació que ocorre quan es retira l'aigua. És important, per tant, conéixer els factors genètics i moleculars que modulen les respostes de les plantes a l'hipòxia o altres tipus d'estrés abiòtic per a fer front a aquestes situacions. La família de proteïnes VQ d'Arabidopsis thaliana inclou cinc membres codificats per gens que s'indueixen com a resposta a l'hipòxia, al NO i a l'estrés oxidatiu. Dos d'ells, VQ1 i VQ10, codifiquen dues proteïnes amb una gran homologia de seqüència i estructura, que no posseeixen activitat transcripcional. En aquest treball, es descriu que VQ1 i VQ10 interaccionen entre si i amb elles mateixes, i amb les altres tres proteïnes VQ i quatre factors de transcripció WRKY, els gens dels quals també s'indueixen com a resposta a hipòxia, NO i estrés oxidatiu. Un rastreig amb la técnica del doble híbrid en llevat d'una genoteca d'Arabidopsis utilitzant VQ1 com a esquer va permetre identificar al voltant de 300 proteïnes interactores de VQ1 i probablement també de VQ10, suggerint que ambdues proteïnes tenen patrons similars d'interacció proteïna-proteïna. VQ1 i VQ10 són proteïnes citoplasmàtiques i nuclears, de manera que la identificació de gairebé 50 proteïnes cloroplàstiques que interaccionen amb VQ1 en el cloroplast suggereix que aquestes interaccions han d'ocorrer al citoplasma. En el rastreig es va identificar la 1-desoxi-D-xilulosa-5-fosfat sintasa (DXS), un enzim clau per a la biosíntesi d'isoprenoides, la fotosíntesi i el creixement de les plantes. En co-immunoprecipitar DXS i VQ1 o VQ10 es va observar que VQ1 i sobretot VQ10 van afavorir la monomerització de DXS en un ambient reductor. A partir de la identificación d'un mutant hipermòrfic vq10-H s'ha procedit a caracteritzar algunes de les funcions reguladores exercides per VQ10. L'anàlisi transcriptòmic comparat de vq10-H i plantes silvestres Col-0 va permetre identificar la regulació exercida per VQ10 en el desenvolupament de les arrels, en les respostes a NO i estrès oxidatiu, així com una potencial funció reguladora del processament alternatiu d'ARNs. La sobreexpressió de VQ10 va provocar l'augment de l'elongació de l'arrel primària, i de la divisió i elongació cel·lular a l'arrel. També va provocar una major tolerància a l'estrès oxidatiu, una menor sensibilitat al NO, i una major eficiencia fotosintètica en comparació amb les plantes silvestres. En conjunt, el treball realitzat en aquesta Tesi suggereix que algunes funcions reguladores de VQ1 i VQ10 en el desenvolupament i les respostes a estrés de les plantes podria estar basat en mecanismes de regulació redox. / [EN] Reactive oxygen species (ROS), molecular oxygen (O2), and nitric oxide (NO) are common factors in diverse plant stress responses. In the past few years, adverse environmental conditions have increased due to climate change, including heavy rains leading to waterlogging or flooding in fields, posing a serious problem for agriculture's development and future. Floods impose severe hypoxia conditions to plants to be later re-oxygenated when water recedes. Therefore, it is essential to understand the genetic and molecular factors that modulate plant responses to hypoxia and other abiotic stresses to address these situations. The VQ-motif containing protein family in Arabidopsis thaliana includes five members encoded by genes induced in response to hypoxia, NO, and oxidative stress. Two of them, VQ1 and VQ10, encode two proteins with significant sequence and structural homology, lacking transcriptional activity. In this study, it is described that VQ1 and VQ10 interact with each other and themselves, as well as with the other three VQ proteins and four WRKY transcription factors whose genes are also induced in response to hypoxia, NO, and oxidative stress. A yeast two-hybrid screening of an Arabidopsis library using VQ1 as bait allowed us identifying almost 300 VQ1-interacting proteins, that likely also interact with VQ10, suggesting that their homology can be extended to protein-protein interaction patterns. VQ1 and VQ10 are cytoplasmic and nuclear proteins, so the identification of nearly 50 chloroplast proteins interacting with VQ1 in the chloroplast suggests that these interactions may be occurring in the cytoplasm. 1-Deoxy-D-xylulose-5-phosphate synthase (DXS), a key enzyme in isoprenoid biosynthesis, photosynthesis, and plant growth, was identified in the screening. Co-immunoprecipitation of DXS with VQ1 or VQ10 showed that VQ1 and, particularly, VQ10 promoted the monomerization of DXS under reducing conditions. Based on the identification of a hypermorphic vq10-H mutant, some of the regulatory functions exerted by VQ10 have been characterized. Comparative transcriptomic analysis of the hypermorphic vq10-H mutant and Col-0 wild type plants allowed us identifying the regulation exerted by VQ10 in root development, in responses to NO and oxidative stress, as well as in the alternative splicing of RNAs. Overexpression of VQ10 led to increased primary root elongation, and increased root cell division and elongation. It also triggered an enhanced oxidative stress tolerance, reduced sensitivity to NO, and enhanced photosynthetic efficiency compared to wild type plants. Altogether, the work carried out in this thesis suggest that some of the regulatory functions exerted by VQ1 and VQ10 on development and stress responses in plants, could be based on redox mechanisms. / Gayubas Balaguer, B. (2023). Función de las proteínas VQ1 y VQ10 codificadas por genes inducibles por hipoxia, óxido nítrico, y estrés oxidativo en la regulación del desarrollo y las respuestas a estrés en Arabidopsis thaliana [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/202571

OBJETIVO: Estudiar el efecto del tratamiento con 2-metoxiestradiol en el remodelado vascular miocárdico inducido por la hipertensión y tras una lesión vascular por denudación endotelial en arteria femoral.MATERIAL Y MÉTODOS: modelo de hipertensión: se han utilizado 5 grupos experimentales de ratas SHR de 10 semanas de vida: rata hembra intacta, rata hembra ovarioectomizada, rata hembra ovarioectomizada y tratada con 2-metoxiestradiol, rata macho y rata macho tratada con 2-metoxiestradiol. Se les midió la presión por pletismografía una vez por semana hasta la semana 18. En la semana 18 se les extrae en corazón y los vasos del lecho mesentérico para realizar los protocolos de análisis de la estructura vascular miocárdica y de producción de anión superóxido y expresión de proteínas relacionadas con la proliferación celular. Modelo de lesión vascular: se han utilizado 5 grupos experimentales de ratas SD: rata hembra intacta, rata hembra ovarioectomizada, rata hembra ovar ioectomizada y tratada con 2-metoxiestradiol, rata macho y rata macho tratada con 2-metoxiestradiol. A la semana de establecer los grupos, se les realiza la cirugía de lesión endotelial por denudación y a las dos semanas se extrae la muestra y se cuantifica la formación de neoíntima.RESULTADOS: Modelo de Hipertensión: Existen diferencias entre sexos en las ratas SHR, tanto en la evolución de la Hipertensión como en el remodelado vascular miocárdico, en la actividad de la NADPH oxidasa vascular de lecho mesentérico y en los factores protéicos de proliferación celular. El tratamiento con 2-metoxiestradiol atenuó el aumento de la presión arterial sistólica provocada por la ovarioectomía así como en el remodelado vascular miocárdico. En la expresión de proteínas y en la actividad de la enzima NADPH oxidasa disminuyó pero no de forma significativa. En las ratas macho, el tratamiento con 2-metoxiestradiol atenuó la evolución de la hipertensión, el remodelado vascular miocárdico, e l incremento de la actividad de la enzima NADPH oxidasa y los factores de proliferación celular. Modelo de Lesión Vascular: No hemos observado diferencias entre sexos en la formación de neoíntima. La ovarioectomía provocó un incremento en la formación de neoíntima y el tratamiento con 2-metoxiestradiol atenuó dicho incremento. En ratas macho, este metabolito no mostró efecto ninguno.

The present thesis aims to evaluate the use of antioxidant enzyme activities (AEA) of biofilm communities as biomarkers of metal pollution (mainly Zn) in fluvial ecosystems. In order to test AEA as biomarkers of metal pollution as well as their responses to environmental variables, several ecotoxicological experiments have been performed. A zoom from field studies (with high ecological realism) to microcosm experiments (under controlled conditions) has been done to fill the gap between both approaches and understand AEA responses under a multiple-stress (environmental and metallic) scenario. The field studies were carried out in the Riera d’Osor, a tributary of the Ter, located in the region of La Selva (Girona province) / L’objectiu d’aquesta tesi és avaluar l’ús de les activitats enzimàtiques antioxidants (AEA) dels biofilms com a biomarcadors de contaminació metàl·lica (principalment per zinc (Zn)) en els ecosistemes fluvials. Per tal d’estudiar la resposta de les AEA a la contaminació metàl•lica, així com també la resposta a altres canvis ambientals (situacions d’estrès múltiple), s’han realitzat diversos experiments ecotoxicològics fent un zoom des d’estudis de camp (amb un elevat realisme ecològic) fins a un estudi de laboratori utilitzant microcosmos (amb condicions controlades). Els estudis de camp s’han dut a terme a la riera d’Osor, afluent del Ter, situada a la comarca de la Selva (província de Girona)

La vida aeróbica conlleva la formación de especies reactivas derivadas del oxígeno: el radical hidroxilo (OH·), el ión superóxido (O2·-) y el peróxido de hidrógeno (H2O2). En Schizosaccharomyces pombe, dos rutas controlan las respuestas antioxidantes en respuesta a estrés oxidativo por H2O2: la del factor de transcripción Pap1 y la de la MAP quinasa Sty1. En esta tesis doctoral, hemos determinado que la activación de Pap1 se da en respuesta a dosis moderadas, pero no severas, de H2O2. Hemos identificado a la peroxirredoxina Tpx1 como sensor y transmisor de la señal de estrés oxidativo a Pap1. La inactivación temporal de Tpx1, durante estrés oxidativo severo, por oxidación a sulfínico de su cisteína catalítica inhibe la transmisión de señal a Pap1. En dichas condiciones, se activa la ruta de Sty1, que media la inducción de Srx1, cuya función es reducir y, con ello, reactivar a Tpx1. Finalmente, hemos estudiado el papel esencial de Tpx1 en aerobiosis. / Aerobic life involves formation of reactive oxygen species: hydroxyl radical (OH·), superoxide ion (O2·-) and hydrogen peroxide (H2O2). In Schizosaccharomyces pombe, two pathways respond to H2O2 and trigger independent antioxidant-gene responses: the Pap1 and the Sty1 pathways. In this thesis project, we have determined that the activation of the transcription factor Pap1 occurs only at low, but not elevated, H2O2 concentrations. We have identified the peroxiredoxin Tpx1 as a H2O2-sensor and redox activator of Pap1. The temporal inactivation of Tpx1 during severe oxidative stress, by oxidation of its catalytic cysteine to sulfinic acid, inhibits signal transduction to Pap1. During these conditions, the MAP kinase Sty1 is activated and expression of the sulfiredoxin Srx1 is triggered. Srx1 functions to reduce and thus reactivate Tpx1. Finally, we have analysed the essential function of Tpx1 in aerobiosis.

Els organismes responen a la temperatura i a molts altres estressos sintetitzant un grup de proteïnes anomenat proteïnes de xoc de calor (HSPs). En plantes les sHsps, d'entre 15 i 30 kDa formen el grup més abundant i divers, classificat en funció de la seva localització subcel.lular i homologia en: mitocondrials, cloroplàstiques, de reticle endoplasmàtic i citoplàsmiques de classe I i II. Les sHsps-CI s'ha descrit que s'indueixen per estrès tèrmic, hídric i oxidatiu (peròxid d'hidrògen, llum UV, ozó) i en resposta a algunes hormones. També s'expressen durant el desenvolupament, per exemple durant l'embriogènesi, on es creu que podrien tenir un paper protector de l'embrió enfront la dessecació. Tot i que hi ha abundants treballs que correlacionen la resistència a l'estrès i l'acumulació de sHsps-CI, els mecanismes moleculars d'aquesta activitat són poc conguts. Tot i això, per diverses sHsps-CI ha estat descrita una activitat xaperona in vitro i, més recentment, que la seva sobreexpressió augmenta la viabilitat de cèl.lules d'E.coli en condicions d'estrès tèrmic.L'estudi de l'acumulació de sHsps-CI en surera (Quercus suber) mitjançant immunodetecció en electroforesi bidimensional mostra uns patrons d'acumulació complexos i formats per dos grups d'espècies proteiques principals, a l'entorn dels 10 i 17 kDa respectivament, que mostren una inducció diferencial en funció del teixit i l'estrès. Mentre que les espècies proteiques de 17 kDa s'indueixen per temperatura però no per estrès oxidatiu, les de ca. 10 kDa ho fan per estrès oxidatiu i no per temperatura. Ambdós grups d'espècies proteiques s'acumulen conjuntament en fel.lema. Assajos de PCR i RT-PCR han permès clonar parcialment tres noves sHsps-CI en surera: Qshsp10-CI, QshspC-CI i QshspD-CI. Aquest fet confirma la multigeneïcitat de les sHsps-CI en surera que apuntava el patró bidimensional. Dels nous clons obtinguts destaca especialment Qshsp10-CI, un gen que presenta un codó stop enmig del domini -cristal.lí que fa que a la proteïna que se'n dedueix li manqui un 55% del domini -cristal.lí i tota l'extensió C-terminal. Es tractaria de la sHsp més petita i més truncada descrita fins al moment. L'anàlisi de l'expressió de Qshsp10-CI mitjançant RT-PCR mostra expressió en plantes tractades amb H2O2 però no en les que han estat sotmeses a un xoc de calor. Aprofitant l'oportunitat que oferia aquesta sHsp-CI de ser utilitzada com a model per l'estudi de la importància del domini -cristal.lí i l'extensió C-terminal en l'activitat protectora enfront l'estrès, es va voler determinar la capacitat que tenia d'augmentar la viabilitat de cèl.lules d'E. coli en condicions d'estrès tèrmic i oxidatiu. Els resultats mostren que la proteïna recombinant QsHsp10-CI, tot i la important truncació que té, és capaç de protegir cèl.lules d'E. coli en condicions d'estrès tèrmic i, remarcablement, en condicions d'estrès oxidatiu. Tots aquests resultats indiquen que les espècies proteiques de ca. 10 kDa podrien correspondre a Qshsp10-CI i tenir un paper en les cèl.lules del fel.lema en la protecció enfront l'estrès oxidatiu.L'estrès oxidatiu provoca lesions al DNA que poden produir errors en la replicació, transcripció o traducció i generar proteïnes aberrants. Donades les condicions d'estrès oxidatiu a les quals es troben sotmeses les cèl.lules del fel.lema, s'ha volgut estudiar la variabilitat dels seus àcids nucleics. La determinació de la taxa de mutació de la regió codificant del gen Qshsp17.4-CI en mRNA i DNA de fel.lema i àpex radicular, un teixit jove i en creixement actiu va mostrar unes taxes sorprenentment elevades en l'mRNA (1/1784 pb) i el DNA genòmic (1/1520 pb) del fel.lema. Aquestes taxes són les més altes descrites en un genoma nuclear eucariota i són similars a les dels virus d'RNA d'evolució ràpida com el virus de l'Hepatitis C. Amb aquestes taxes de mutació, un terç dels mRNAs del fel.lema de la surera contindrien missatges aberrants i la supervivència de les cel.lules es veuria compromesa. Això implica que el fel.lema hauria de ser considerat com un mosaic de cèl.lules genèticament heterogènies i, per tant, una sola seqüència no defineix en tota la seva amplitud un gen en aquest teixit. No es va detectar cap mutació en àpex de rel. Amb l'objectiu d'aprofundir en el coneixement de les mutacions que es donen en aquests dos teixits i per tal de poder fer una anàlisi qualitativa més completa que permetés especular sobre el seu origen, es va aplicar un mètode de selecció de seqüències mutants en base a la utilització d'enzims de restricció. Les mutacions detectades en fel.lema es corresponen amb les relacionades, en altres sistemes no nuclears (plasmidis, fags i DNA bacterià), amb l'estrès oxidatiu. En conseqüència, l'estrès oxidatiu al qual estan sotmeses les cèl.lules del fel.lema podria ser el causant de l'elevada taxa de mutació detectada. D'acord amb això, el tipus majoritari de productes d'oxidació de les bases del DNA que s'acumulen en brots de plàntules de surera en resposta al peròxid d'hidrògen produeixen el mateix tipus de mutacions detectades en l'mRNA del fel.lema de la surera. La major sensibilitat d'aquest nou mètode ha permès, a més, detectar mutacions en molècules d'mRNA de rel, un teixit en el qual no s'havia trobat cap mutació utilitzant el mètode de clonatge i seqüenciació directa. Tot i això, el tipus de mutacions predominants no estan relacionades amb l'estrès oxidatiu sinó amb erros en la reparació dels àcids nucleics. / Small heat shock proteins (sHsps,15-30 kDa) are the most abundant and diversified Hsps in plants. They have been classified according to its homology and cellular localisation in: mitochondrial, chloroplastic, endoplasmic reticulum and class I and II citoplasmic sHsps. Although sHsps-CI are involved in the stress response and accumulate at some stages of embryonic development and there is abundant work correlating stress resisitance and sHsps accumulation, the molecular mechanisms of their activity are not well known. However, in vivo and in vitro chaperone activity under temperature stress has been described. 2D immunodetection patterns of cork oak (Quercus suber) sHsps-CI (thermic, hydric and oxidative). At the 17 kDa region there is a set of protein species highly induced by temperature and, at least some of them correspond to QsHsp17.4-CI. On the other hand, protein species at the ca. 10 kDa region are highly induced under oxidative stress conditions and accumulate in the endogenous oxidatively stressed tissues xylem and phellem but not after a heat shock. PCR and RT-PCR assays allowed us to clone three new members of the sHsps-CI multigenic family in cork oak. Among them, Qshsp10-CI is specially interesting because codes for a truncated protein that lacks 55% of the -crystallin domain and all the C-terminal extension, being the more C-terminal truncated sHsp reported to date. Overexpression of recombinant QsHsp10-CI and a more truncated protein lacking the whole -crystallin domain in E. coli cells shows that most of the -crystallin domain and all the C-terminal extension are dispensable, but amino acids 1 to 41 of the -crystallin domain (including the consensus II region) are essential for sHsps-CI protective activity under temperature and oxidative stress conditions. The expression of Qshsp10-CI in response to oxidative but not temperature stress and its protective activity of E. coli cells under oxidative stress conditions points to a correspondence between Qshsp10-CI and the ca. 10 kDa protein species detected in 2D immunodetections and a protective activity of those in the oxidatively stressed phellem cells. Endogenous oxidative stress of phellem cells might generate mutations accumulation in nucleic acids. Variability analyses of DNA and mRNA of phellem cells in the coding region of Qshsp17.4-CI showed a surprisingly high rate of mutation in both mRNA (1/1784 bp) and genomic DNA (1/1520 bp). These are the highest rates described for a nuclear eukariotic genome and are similar to those detected in RNA viruses. With these mutation rates one third of mRNAs of phellem cells would contain mutations and code for abnormal proteins. No mutations were detected in root tip, a normally growing young tissue. With the aim of deeping into the nature of mutations that accumulate in phellem cells, we applied a method to in vitro select mutant sequences using restriction enzymes. The types of mutation predominant in phellem cells mRNA were those related with oxidative stress in other systems (plasmids, phages and bacterial DNA). In addition, the predominant DNA lesions that accumulate in H2O2 treated cork oak plantlets, as shown by GC-MS analyses, generate the same type of mutations detected in mRNA of phellem cells. Accordingly, the high accumulation of mutations detected in phellem cells might be due to its endogenous oxidative stress. Moreover, young and actively growing tissues are also subjected to a certain degree of base lesions and mRNA mutations. However, both mutational spectrum and accumulation levels are different compared to oxidatively stressed tissues.