A radiação ultravioleta (UV) pode ser absorvida por diferentes moléculas celulares, incluindo o DNA no qual provoca distorções estruturais. As lesões mais comuns induzidas pela radiação UV são o ciclobutano de pirimidina (CPD) e o fotoproduto (6-4)-pirimidina-pirimidona [(6-4)PPs]. Estas lesões podem ser reparadas pela fotorreativação, caracterizada por ter uma única proteína (fotoliase) que remove lesões empregando luz visível (320-500 nm) como fonte de energia. Foram identificados dois tipos de fotoliases que diferem por sua especificidade ao substrato: CPD-fotoliase e (6-4)-fotoliase. Um outro mecanismo de reparo é o reparo por excisão de nucleotídeos (NER), um mecanismo que envolve múltiplos passos e proteínas. Enquanto os efeitos genotóxicos da UVC e UVB já estão relativamente esclarecidos e bem aceitos, ainda existem controvérsias sobre a genotoxicidade da radiação UVA, devido ao fato de ser fracamente absorvida pelo DNA. Alguns autores acreditam que os seus principais efeitos são gerados de forma indireta pela produção de espécies reativas de oxigênio enquanto outros acreditam que a UVA pode gerar danos ao DNA de forma direta, provocando a formação de dímeros de pirimidina. O objetivo deste trabalho foi verificar os efeitos genotóxicos da radiação UVA em fibroblastos humanos deficientes e proficientes em NER utilizando adenovírus recombinantes contendo uma ou outra fotoliase para verificar se as lesões CPD e (6-4)PP são geradas pela UVA e se elas teriam alguma importância nas respostas verificadas após irradiação. Foi verificado que as células deficientes no gene XPA são mais sensíveis à radiação UVA quando comparadas às células selvagens. Por meio da detecção imunológica, confirmamos a geração das lesões CPD, (6-4)PP e Dewar, fotoisômero da lesão (6-4)PP, após irradiação com UVA no genoma de células humanas. Empregando vetores adenovirais para transdução de fotoliase específica para lesões tipo CPD ou (6-4)PP, confirmamos que de fato essas lesões são formadas em células humanas deficientes em reparo de DNA após irradiação com UVA. Além disso, esses vírus permitiram verificar a relevância biológica dessas lesões na indução de morte celular em células XP-A irradiadas. De fato, os dados indicam que para doses baixas de radiação UVA essas lesões desempenham um importante papel na indução de morte. Não podemos descartar, porém, que lesões indiretas (provavelmente geradas por estresse oxidativo) também tenham papel na indução de morte pela radiação UVA, o que parece ser mais importante a doses médias e altas dessa radiação. / Ultraviolet radiation (UV) is absorbed by different cellular molecules, including DNA in which induces structural distortions. The most common lesions induced by UV radiation are the cyclobutane pyrimidine (CPD) and the photoproduct (6-4)-pyrimidine-pyrimidone [(6-4)PP]. These lesions can be repaired by the photoreactivation, characterized by a single protein (photolyase) that removes lesions using visible light (320-500 nm) as energy source. Two types of photolyases had been identified that differ by their substrate specificity: CPD-photolyase and (6-4)-photolyase. Another repair mechanism is the nucleotide excision repair (NER), a mechanism that involves multiple steps and proteins. While the genotoxic effects of UVB and UVC are already relatively well-understood and accepted, there is still controversy about the genotoxicity of UVA radiation, due to its low absorption by DNA. Some authors believe that the major effects are generated indirectly by the production of reactive oxygen species, while others believe that UVA can cause damage to DNA directly, inducing the formation of pyrimidine dimers. The aim of this study was to assess the genotoxic effects of UVA radiation in human fibroblasts deficient and proficient in NER, using recombinant adenovirus expressing the photolyases to verify if CPDs and (6-4)PPs are generated by UVA and whether they had any importance in the responses observed after irradiation. It was found that cells deficient in the XPA gene are more sensitive to UV radiation compared to wild type cells. By immunological detection, we confirm the generation of CPD, (6-4)PP and Dewar, photoisomer of the (6-4)PP lesion, in the genome of human cells after irradiation with UVA. Using adenoviral vectors for the transduction of photolyases specific for CPD or (6-4)PP lesions, we confirm that in fact these lesions are generated in human cells deficient in DNA repair after irradiation with UVA. Moreover, these viruses allowed us to verify the biological relevance of these lesions in the induction of cell death in irradiated XP-A cells. In fact, our data indicates that for low doses of UVA radiation, these lesions play important roles in the induction of death. We cannot rule out, however, that indirect lesions (probably caused by oxidative stress) could also have a role in the induction of death by UVA radiation, which seems to be more important in intermediate and high doses of this radiation.

DNA is often damaged by environmental agents which lead to the up-regulation of several genes involved in different repair pathways. The regulation of DNA repair is important for cell survival following exposure to DNA-damaging agents. Schistosoma mansoni is a parasite that undergoes several modifications in its complex life cycle, being exposed to a subset of DNA-damaging agents, such as the environment and host immune response, and therefore, such as many other organisms, it is likely to be provided for efficient repair mechanisms. Recently, studies have shown that Nucleotide Excision Repair (NER) consists in an indispensable mechanism for removing a broad spectrum of DNA lesions. In the current study, it was analyzed the gene expression of Nucleotide Excision Repair Factor 2 (NEF2) - SmRad23 and SmRad4, in different developmental stages of S. mansoni, as well as the expression level of these genes in S. mansoni adult worms treated with DNA-damaging agents. Together, the results have confirmed the expression of these two proteins in all of the evolutive stages studied of the parasite, and shown a differential expression in front of the treatment with the different chemical agents. Furthermore, it was revealed the correlation of these genes with their orthologues in other eukaryotes. Therefore, the presence of SmRad23 and SmRad4 in all of the developmental stages of S. mansoni, as well as their differential expression following exposition to DNA-damaging agents, suggest that the NER is an important repair pathway during the complex life cycle of this parasite. / O DNA é freqüentemente danificado por agentes ambientais que levam à ativação de vários genes envolvidos em diferentes vias de reparo. A regulação do reparo do DNA é importante para a sobrevida da célula mediante exposição a agentes causadores de dano. Schistosoma mansoni é um parasito que passa por várias modificações em seu complexo ciclo de vida, estando exposto a uma série de agentes lesivos ao DNA, tais como aqueles presentes no meio ambiente e na própria resposta imune do hospedeiro, e, portanto, assim como muitos outros organismos, é provável que seja provido de eficientes mecanismos de reparo. Recentemente, estudos têm demonstrado que a via de reparo por excisão de nucleotídeos (NER) consiste em um mecanismo indispensável em eucariotos para a remoção de um amplo espectro lesões no DNA. No presente estudo, foi analisada a expressão gênica do fator de reparo por excisão de nucleotídeos 2 (NEF2) - SmRad23 e SmRad4, em diferentes estágios de desenvolvimento de S. mansoni, assim como o nível de expressão destes genes em vermes adultos tratados com agentes lesivos ao DNA. Em conjunto, os resultados confirmaram a expressão dessas duas proteínas em todos os estágios evolutivos estudados do parasito, e mostraram uma expressão diferencial destes genes mediante tratamento com os diferentes agentes químicos. Além disso, foi revelada a correlação destes genes com seus ortólogos em outros eucariotos. Portanto, a presença de SmRad23 e SmRad4, em todos os estágios de desenvolvimento de S. mansoni, bem como sua expressão diferencial mediante exposição a agentes lesivos ao DNA, sugere que NER constitui uma importante via de reparo durante o complexo ciclo de vida deste parasito. / Mestre em Imunologia e Parasitologia Aplicadas

INTRODUÇÃO: O câncer gástrico precoce que invade a submucosa pode apresentar acometimento linfonodal em torno de 20% dos casos. O tratamento cirúrgico clássico com gastrectomia e linfadenectomia D2 é um procedimento não isento de mortalidade e morbidade. Determinar quais pacientes têm maior risco de acometimento linfonodal permitiria tratamentos com menores complicações. Recentemente diversos autores relatam maior expressão imuno-histoquímica de p53 e p21ras em tumores avançados e com pior prognóstico. Tem sido relatada também perda da expressão de p21waf1, p27kip1 e p16ink4a nos tumores avançados e algumas publicações relatam também relação entre a expressão dos marcadores e acometimento linfonodal. MÉTODOS: Foram estudados retrospectivamente 81 pacientes submetidos à gastrectomia com linfadenectomia D2 no período de 1971 a 2004 no Serviço de Cirurgia do Estômago e Intestino Delgado do Departamento de Gastroenterologia do HC-FM/USP. Os blocos de parafina contendo fragmentos dos tumores foram recuperados e novo exame histopatológico confirmou o diagnóstico. Selecionaram-se áreas representativas de mucosa normal, mucosa metaplásica e tumor para confecção de novos blocos de tissue microarrays. Foi avaliada a expressão imuno-histoquímica de p21ras, p53, p21waf1/cip1, p27kip1 e p16ink4a nos tecidos. Foram investigadas as correlações entre a expressão dos marcadores e as características clínico-patológicas dos pacientes. A análise da associação entre os dados clínicos e a positividade dos marcadores foi realizada pelo teste Qui-quadrado. RESULTADOS: Na mucosa normal, metaplásica e tumoral p53 apresentou positividade em 53%, 87,3% e 87,1% dos casos respectivamente. Nos mesmos tecidos p21ras apresentou positividade de 85,3%, 86% e 96,8%. Para p16ink4a a positividade foi de 46,3%, 91,1% e 86%. Para p27kip1 a positividade foi de 60%, 94,7% e 95,3%. Para p21waf1/cip1 a positividade foi 32,4%, 72,7% e 71,4%. Todos os tumores tiveram alguma positividade para p53. Os tumores com acometimento linfonodal apresentaram hiper-expressão(+4) de p53 em 47% dos casos contra 17% nos pacientes que não tinham acometimento. Nenhum tumor com positividade para p53 baixa(0 e +1) teve linfonodos acometidos. Nenhum tumor com p21ras negativo apresentou linfonodos acometidos. Nos pacientes com acometimento linfonodal p21ras teve positividade intensa(+2 e +3) em 88% dos casos contra 50% dos casos sem acometimento linfonodal. Houve positividade intensa(+2,+3 e +4) de p21waf1/cip1 em 71% dos tumores com acometimento linfonodal contra 28% nos pacientes sem acometimento. Não observamos perda de expressão de p21waf1, p27kip1 e p16ink4a nos tumores com acometimento linfonodal. Na mucosa normal p16ink4a foi hiper-expresso (+4) em 20% dos casos com infiltração perineural contra 0% nos casos sem acometimento. O mesmo marcador foi hiperexpresso em 50% dos casos com infiltração vascular contra 0% dos casos sem infiltração. Os tumores com padrão de infiltração Sm2 tiveram pouca positividade(0 e +1) de p27kip1 na mucosa normal em 89% dos casos contra 55% dos casos Sm1. CONCLUSÕES: Maior expressão de p53, p21ras e p21waf1/cip1 no tumor teve relação estatística significante com acometimento linfonodal. Ocorre aumento da expressão imuno-histoquímica de todos os marcadores da mucosa normal para o tumor. A maior hiper-expressão de p16ink4a na mucosa normal de pacientes tem relação com infiltração perineural e vascular nos tumores. A expressão dos marcadores é diferente nas raças estudadas. As pacientes do sexo feminino apresentam maior positividade de p21waf1 na mucosa normal. Pacientes com história familiar de câncer gástrico apresentam maior positividade de p16ink4a na mucosa normal, menor positividade de p21waf1/cip1 e p21ras na mucosa metaplásica. Maior positividade na mucosa normal de p21waf1/cip1 relaciona-se a sexo feminino e infiltração tipo Sm1 / INTRODUCTION: Early gastric cancer that invades the submucosa might have a lymphonodal involvement in about 20% of the cases. Gastrectomy and D2 linfadenectomy is a procedure that has presented mortality and morbidity. Determining which patients would have a greater risk of lymphonodal involvement would allow treatments with fewer complications. Recently, several authors reported a greater immunohistochemical expression of p53 and p21ras in advanced tumors with worst prognosis. It has also been reported the expression loss of p21wafl, p27kip1, and p16ink4a in advanced tumors, and, some studies also observed the relationship between the markers expression and lymphonodal involvement. METHODS: Eightyone patients who had undergone gastrectomy with D2 linfadenectomy from 1971 to 2004 were retrospectively studied. A new histopathological exam confirmed the diagnosis. Representative areas of both normal and metaplastic mucosa and of the tumor were selected for obtaining new blocks of tissue microarrays. The immunohistochemical expression of p21ras, p53, p21waf1/cip1, p27kip1 and p16ink4a in the tissues was evaluated. RESULTS: In normal, metaplastic and tumoral mucosa, p53 showed positivity in 53%, 87.3%, and 87.1% of the cases, respectively. In the same tissues, p21ras showed positivity in 85.3%, 86%, and 96.8%, respectively. The positivity of p16ink4a was 46.3%, 91.1%, and 86%, respectively. p27kip1 showed a positivity of 60%, 94.7%, and 95.3%, respectively. p21wafl/cip1 presented a positivity of 32.4%, 72.7%, and 71.4%, respectively. All tumors showed positivity for p53. Tumors with lymphonodal involvement presented hyperexpression (+4) of p53 in 47% of the cases versus 17% in patients who had not showed any involvement. No tumor with low positivity (0 and +1) of p53 showed lymphonodal involvement. No tumor with negative p21ras showed lymphonodal involvement. In patients with lymphonodal involvement, p21ras presented strong positivity (+2 and +3) in 88% of the cases versus 50% of the cases without lymphonodal involvement. There was a strong positivity (+2,+3, and +4) of p21wafl/cip1 in 71% of the tumors with lymphonodal involvement versus 28% in patients without involvement. It was not observed an expression loss of p21waf1, p27kip1 e p16ink4a in tumors with lymphonodal involvement. In normal mucosa, p16ink4a showed a hyper-expression (+4) in 20% of the cases with perineural invasion versus 0% of the cases without invasion. This same marker showed a hyper-expression in 50% of the cases with vascular invasion versus 0% of the cases without invasion. Tumors with Sm2 invasion pattern showed low positivity (0 and +1) of p27kip1 in normal mucosa in 89% of the cases versus 55% of the cases of Sm1 tumors. CONCLUSIONS: Higher expression of p53, p21ras, and p21wafl/cip1 in tumor showed a significant statistical relationship with lymphonodal involvement. A higher hyper-expression of p16ink4a in patients normal mucosa was related to perineural and vascular invasion of tumors

Este estudo teve o objetivo de avaliar a eficácia da movimentação precoce do braço, no controle da formação de seroma, em mulheres com câncer de mama submetidas a linfadenectomia axilar (LA). Foi realizado um estudo comparativo com a participação de 39 mulheres, com diagnóstico de câncer de mama, unilateral de qualquer extensão, submetidas à cirurgia com LA. A coleta dos dados foi realizada de julho de 2004 à janeiro de 2005, Setor de Onco-ginecologia e Mastologia do Departamento de Ginecologia e Obstetrícia do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo (FMRP-USP). As mulheres foram divididas, aleatoriamente, em dois grupos: Grupo Movimento (GM) e Grupo Controle (GC). No GC, as 20 mulheres receberam as orientações rotineiras da unidade e no GM, as 19 mulheres foram orientadas à movimentação precoce e sistemática do braço, com um programa específico de movimentos iniciados antes da alta hospitalar e continuando no domicílio. Todas as participantes foram avaliadas antes da cirurgia, no primeiro dia pós operatório, de 5 a 10 dias e de 30 a 40 dia depois da cirurgia. Através do teste estatístico de Mann-Whitney observou-se que os grupos foram homogêneos para as variáveis idade e índice de massa corpórea, apesar de o número de sujeitos não ter sido estatisticamente significante. O tempo de permanência do dreno e o volume drenado, foram menores no GM. A incidência de seroma foi igual para os dois grupos, mas a resolução foi mais rápida e menos invasiva no GM. Pode-se assim concluir que apesar de a amostra não ter sido estatisticamente significante, a movimentação precoce e sistematizada favoreceu uma melhor absorção do seroma e não esteve associada a outras complicações cirúrgicas. / This study aimed to evaluate the efficacy of early arm movement in the control of seroma formation, in women who underwent complete axillary lymphadenectomy (AL) due to breast cancer. A comparative study involved 39 women with diagnosis of unilateral breast cancer of any extension who underwent LA. Data were collected between July 2004 and January 2005, at the onco-gynecology and mastology sector - Gynecology and Obstetric Department of the University of São Paulo at Ribeirão Preto Medical School Hospital das Clínicas. Participants were randomly distributed in two groups: Movement Group (MG) and Control Group (CG). In the CG, 20 women received routine orientation while, in the MG, 19 women were oriented towards systematic early arm movement, with a specific movement program initiated before hospital discharge and continued at home. All women were evaluated the day before surgery, the first day after surgery, 5-10 days and 30-40 days after surgery. The Mann-Whitney statistical test revealed that the groups were homogeneous in terms of age and body mass index, although the number of subjects was found statistically insignificant. The permanence of the drain and the volume drained were lower in MG. Incidence levels of seroma were equal in the two groups, but the resolution was faster and less invasive in MG. In spite of a statistically insignificant number of subjects, early and systematic arm movement provided better seroma absorption and was not associated with other surgical complications.

A radiação ultravioleta (UV) pode ser absorvida por diferentes moléculas celulares, incluindo o DNA no qual provoca distorções estruturais. As lesões mais comuns induzidas pela radiação UV são o ciclobutano de pirimidina (CPD) e o fotoproduto (6-4)-pirimidina-pirimidona [(6-4)PPs]. Estas lesões podem ser reparadas pela fotorreativação, caracterizada por ter uma única proteína (fotoliase) que remove lesões empregando luz visível (320-500 nm) como fonte de energia. Foram identificados dois tipos de fotoliases que diferem por sua especificidade ao substrato: CPD-fotoliase e (6-4)-fotoliase. Um outro mecanismo de reparo é o reparo por excisão de nucleotídeos (NER), um mecanismo que envolve múltiplos passos e proteínas. Enquanto os efeitos genotóxicos da UVC e UVB já estão relativamente esclarecidos e bem aceitos, ainda existem controvérsias sobre a genotoxicidade da radiação UVA, devido ao fato de ser fracamente absorvida pelo DNA. Alguns autores acreditam que os seus principais efeitos são gerados de forma indireta pela produção de espécies reativas de oxigênio enquanto outros acreditam que a UVA pode gerar danos ao DNA de forma direta, provocando a formação de dímeros de pirimidina. O objetivo deste trabalho foi verificar os efeitos genotóxicos da radiação UVA em fibroblastos humanos deficientes e proficientes em NER utilizando adenovírus recombinantes contendo uma ou outra fotoliase para verificar se as lesões CPD e (6-4)PP são geradas pela UVA e se elas teriam alguma importância nas respostas verificadas após irradiação. Foi verificado que as células deficientes no gene XPA são mais sensíveis à radiação UVA quando comparadas às células selvagens. Por meio da detecção imunológica, confirmamos a geração das lesões CPD, (6-4)PP e Dewar, fotoisômero da lesão (6-4)PP, após irradiação com UVA no genoma de células humanas. Empregando vetores adenovirais para transdução de fotoliase específica para lesões tipo CPD ou (6-4)PP, confirmamos que de fato essas lesões são formadas em células humanas deficientes em reparo de DNA após irradiação com UVA. Além disso, esses vírus permitiram verificar a relevância biológica dessas lesões na indução de morte celular em células XP-A irradiadas. De fato, os dados indicam que para doses baixas de radiação UVA essas lesões desempenham um importante papel na indução de morte. Não podemos descartar, porém, que lesões indiretas (provavelmente geradas por estresse oxidativo) também tenham papel na indução de morte pela radiação UVA, o que parece ser mais importante a doses médias e altas dessa radiação. / Ultraviolet radiation (UV) is absorbed by different cellular molecules, including DNA in which induces structural distortions. The most common lesions induced by UV radiation are the cyclobutane pyrimidine (CPD) and the photoproduct (6-4)-pyrimidine-pyrimidone [(6-4)PP]. These lesions can be repaired by the photoreactivation, characterized by a single protein (photolyase) that removes lesions using visible light (320-500 nm) as energy source. Two types of photolyases had been identified that differ by their substrate specificity: CPD-photolyase and (6-4)-photolyase. Another repair mechanism is the nucleotide excision repair (NER), a mechanism that involves multiple steps and proteins. While the genotoxic effects of UVB and UVC are already relatively well-understood and accepted, there is still controversy about the genotoxicity of UVA radiation, due to its low absorption by DNA. Some authors believe that the major effects are generated indirectly by the production of reactive oxygen species, while others believe that UVA can cause damage to DNA directly, inducing the formation of pyrimidine dimers. The aim of this study was to assess the genotoxic effects of UVA radiation in human fibroblasts deficient and proficient in NER, using recombinant adenovirus expressing the photolyases to verify if CPDs and (6-4)PPs are generated by UVA and whether they had any importance in the responses observed after irradiation. It was found that cells deficient in the XPA gene are more sensitive to UV radiation compared to wild type cells. By immunological detection, we confirm the generation of CPD, (6-4)PP and Dewar, photoisomer of the (6-4)PP lesion, in the genome of human cells after irradiation with UVA. Using adenoviral vectors for the transduction of photolyases specific for CPD or (6-4)PP lesions, we confirm that in fact these lesions are generated in human cells deficient in DNA repair after irradiation with UVA. Moreover, these viruses allowed us to verify the biological relevance of these lesions in the induction of cell death in irradiated XP-A cells. In fact, our data indicates that for low doses of UVA radiation, these lesions play important roles in the induction of death. We cannot rule out, however, that indirect lesions (probably caused by oxidative stress) could also have a role in the induction of death by UVA radiation, which seems to be more important in intermediate and high doses of this radiation.

Submitted by Leonardo Freitas (leonardo.hfreitas@ufpe.br) on 2015-04-15T13:19:28Z No. of bitstreams: 2 Dissertação KASSANDRA FUKUSHIMA.pdf: 2780908 bytes, checksum: d9a640ff8297b048176efd7042969fb7 (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-04-15T13:19:28Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação KASSANDRA FUKUSHIMA.pdf: 2780908 bytes, checksum: d9a640ff8297b048176efd7042969fb7 (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Previous issue date: 2013-04-22 / O câncer de mama é a neoplasia maligna mais frequente entre as mulheres brasileiras. O tratamento cirúrgico é parte fundamental da terapêutica, a qual ainda engloba quimioterapia, radioterapia e terapia hormonal. O aumento da detecção precoce deste câncer e o tratamento menos agressivo tornaram possível maior sobrevida às mulheres com essa neoplasia. As morbidades pós-tratamento têm, então, despertado especial interesse na comunidade científica a fim de minimizar seus efeitos e proporcionar acréscimo à qualidade de vida dessas pacientes. O presente estudo objetivou investigar uma dessas morbidades, a síndrome da rede axilar, cuja ocorrência se dá após a injúria dos vasos linfáticos da axila. Entre dezembro de 2011 e julho de 2012, obedecidos os critérios de inclusão e exclusão, 97 pacientes, tratadas cirurgicamente de câncer de mama, foram arroladas, entrevistadas e submetidas a exame físico direcionado no Hospital de Câncer de Pernambuco. A pesquisa dos cordões na axila, característicos dessa síndrome, a goniometria da articulação do ombro e a perimetria dos membros superiores ipsilateral e contralateral à mama acometida foram realizadas em todas as pacientes. As variáveis em escala nominal ou ordinal foram apresentadas sob a forma de tabelas, contendo distribuição das frequências absolutas e relativas. As variáveis em escala intervalar foram expressas como média e desvio padrão da média. Para comparação entre as aferições goniométricas e perimétricas empregou-se o teste t de Student, com análise de variância de Lévené. Utilizaram-se ainda os testes Qui quadrado e exato de Fisher para comparação de proporções. Adotou-se o nível de significância de 0,05 em todos os testes inferenciais. Realizou-se a análise variada de fatores de Spearman e para aqueles fatores com significância foi calculado o odds-ratio. A síndrome da rede axilar foi diagnosticada em 28,86% das mulheres. O risco de desencadeamento da síndrome esteve aumentado para idade mais jovem (21,7%), maior tempo entre o primeiro tratamento instituído e a coleta dos dados (29,3%), maior número de linfonodos ressecados (149,7%) e manejo cirúrgico menos conservador (113,2%)

Orientadores: Luiz Carlos Zeferino, Fernando Carlos de Landér Schmitt / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-19T10:11:46Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Alvarenga_CesarAugusto_D.pdf: 4979947 bytes, checksum: 8da78ad01d29e47c7c97bb4d231ee04b (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: A maioria dos carcinomas invasivos da mama são classificados como carcinoma ductal invasivo, sem outras especificações (CDI-SOE), enquanto que cerca de 25% são definidos como tipos especiais histológicos (TEH). Esses TEH de carcinomas da mama são categorizados em pelo menos 17 entidades patológicas distintas. Como a maioria dos estudos realizados na literatura em relação à classificação molecular (luminais A e B, sobre expressão de HER2, "basal-like") tenham utilizado somente CDI-SOE e lobulares invasivos, um estudo com mais TEH seria necessário. A CK19 pode ser utilizada como método de avaliação do linfonodo sentinela através de uma técnica molecular chamada de OSNA (amplificação de ácido nucléico de um passo). A expressão de sua positividade foi avaliada somente nos carcinomas ductais, lobulares, medulares e de pequenas células. Realizado tissue microarray (TMA) no IPATIMUP (Porto-Portugal) de 157 casos selecionados dos arquivos do Instituto de Patologia de Campinas. Obtido um total de 121 e 116 casos no TMA do perfil molecular e da CK19, respectivamente, estes incluíram carcinomas tubulares, mucinosos, papilares encapsulados e invasivo, lobulares, micropapilares, medulares, metaplásicos, apócrinos e mistos. Foram utilizados marcadores imunoistoquímicos tais como: RE, RP, RA (somente nos apócrinos), HER2, Ki67, P-caderina, CK5, EGFR e p63 para classificá-los quanto à classificação molecular e CK19 para avaliar sua expressão na mama antes da realização da técnica de OSNA em linfonodo sentinela. Tubulares, papilares e mucinosos foram todos luminais A e B, dado semelhante ao perfil de expressão genética; medulares e metaplásicos foram quase todos "basais-like" (76.2% e 90%, respectivamente), enquanto que ao nível transcriptômico, todos os casos pertencem ao subtipo "basallike"; micropapilares foram luminais A e B e sobre-expressão de HER2, sendo que ao nível transcriptômico são praticamente todos luminais B devido à alta expressão de HER2; apócrinos foram os mais heterogêneos de todos com casos luminais A e B, sobre-expressão de HER2 e "basais-like", dado diferente ao nível transcriptômico que revela o subtipo "molecular apócrino" (RE-/RA+/HER2- ou +). O risco relativo do Ki67 aumentou entre os TEH, sendo que o carcinoma medular teve 110 vezes mais risco de aumento do Ki-67 em relação ao tubular. A CK19 foi expressa em 98.2% dos TEH de carcinomas da mama, dado idêntico ao estudo anterior de Chu et al, sendo que sua positividade aumentou nos casos em que o bloco de parafina foi inteiramente estudado, pois sua marcação foi focal em muitos casos avaliados no TMA. Isso pode produzir eventualmente resultados falso-negativos nas "corebiopsies" / Abstract: Most invasive breast carcinomas are classified as invasive ductal carcinoma, not otherwise specified (IDC-NOS), while approximately 25% are defined as special histological types (HST). These HST of breast carcinomas are categorized into at least 17 distinct pathological entities. Most studies in the literature regarding the molecular classification (luminal A and B, HER2- overexpression, "basal-like") were evaluated only in IDC-NOS and in lobular invasive carcinoma, a study with more HST of breast carcinoma would be necessary. The CK19 can be used as a method of evaluation of sentinel lymph node using a molecular technique called OSNA (one step acid nucleic amplification). The expression of CK19 positivity was assessed only in ductal, lobular, medullary and small cell carcinomas. It was performed tissue microarray (TMA) in IPATIMUP (Porto-Portugal) of 157 cases selected from the archives of the Instituto de Patologia de Campinas, a private laboratory. A total of 121 and 116 TMA cases in the molecular profiling and in the CK19 studies was obtained, respectively, including tubular, mucinous, papillary encapsulated and invasive, lobular, micropapillary, medullary, metaplastic, apocrine and mixed carcinomas. It was used immunohistochemical markers such as ER, PR, RA (only in apocrine carcinomas), HER2, Ki67, P-cadherin, CK5, EGFR and p63 to classify them as the molecular classification and as the CK19 expression in the breast before performing the technique of OSNA in sentinel lymph node. Tubular, papillary and mucinous were all luminal A and B, as similar as the geneexpression profiling; medullary and metaplastic were almost all "basal-like" (76.2% and 90%, respectively), while at transcriptome level, all cases belong to subtype "basal-like"; micropapillary was luminal A and B and HER2- overexpression and in the transcriptomic level was virtually all luminal B due to high expression of HER2; apocrine was the most heterogeneous tumours of our study with luminal A and B, HER2-overexpression and "basal-like" cases. This data was different from transcriptomic level that revealed the "molecular apocrine" subtype (RE-/ RA+/ HER2- or +). The relative risk of Ki67 increased between HST, because medullary carcinomas had 110 times more risk of increased Ki-67 than tubular carcinomas. The CK19 was expressed in 98.2% of HST of breast carcinomas, data identical to the Chu et al study, and the positivity increased in cases where the entire paraffin block had been fully studied, because its labeling was focal in many cases evaluated on TMA. This CK19 focal expression can produce false-negative results in the breasts "corebiopsies" / Doutorado / Oncologia Ginecológica e Mamária / Doutor em Ciências da Saúde

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / In this work we presented the idea to perform excision assays using the piggyBac transposable element as enzyme supplier and the inverted terminal sequences of the element, both necessary for mobilization of a transposable element. Drosophila S2 cells were electroporated to perform insertion of two different plasmids in the cytoplasm of cells, a plasmid carrying the terminal inverted repeats of piggyBac element flanking a GFP gene and other with the transposase coding sequence enzyme which recognizes the terminal inverted repeats, excise of the region where the element is and insert it into another locus. This is a vector-helper system, in which a fragment is excised from a plasmid with the help of the transposase located in the other. Conventional PCR was used to verify excision events showing a 200bp amplification region where the fragment was excised and a region 3kb amplification reagion at times when the fragment was full, ie, it has not mobilized. The qPCR technique was used to quantify the excision of this fragment, carrying out comparisons of the amount of plasmid DNA recovered from the S2 cells after the end of experiment with serial dilutions of the original plasmids carrying the ITRs, which was used as standard. The results showed that the technique involving electroporation and qPCR is feasible and can be used to quantify mobilization of transposable elements. Paralleling with existing tools for this type of quantification, qPCR shows up as a very sensitive technique of detection mobilization, as well as a low cost technique budget. / Neste trabalho apresentamos a ideia de realizar ensaios de excisão utilizando o elemento transponível piggyBac como fornecedor da enzima e das sequências terminais invertidas do elemento, ambos necessários para mobilização. Células S2 de Drosophila melanogaster foram eletroporadas para que houvesse inserção de dois diferentes plasmídeos no citoplasma das células, um plasmídeo portando as repetições terminais invertidas do elemento piggyBac flanqueando um gene GFP e o outro com a sequência codificadora da enzima transposase, a qual reconhece as repetições terminais invertidas e excisa o elemento da região onde está inserido, num sistema vector-helper, em que um fragmento é excisado de um plasmídeo com ajuda da transposase localizada no outro. PCR convencional foi usado para verificar os eventos de excisão, mostrando uma região de amplificação de 200pb nos casos de excisão do fragmento e uma região amplicada de 3kb, nas ocasiões em que o fragmento ficou inteiro, ou seja, não foi mobilizado. A qPCR foi utilizada para quantificar a excisão desse fragmento, realizando comparações da quantidade de DNA plasmidial recuperado das células S2 após o término do experimento com diluições em série do plasmídeo com as ITRs, que foi utilizado como standard. Os resultados mostraram que a técnica envolvendo eletroporação e qPCR é exequível e pode ser utilizada para quantificar mobilização de elementos transponíveis. Fazendo um paralelo com as ferramentas já existentes para esse tipo de quantificação, qPCR mostra-se como uma técnica bastante sensível de detecção de mobilização, bem como uma técnica de baixo custo orçamentário.

O envelhecimento da população mundial no último século elevou significativamente o número de casos da doença de Alzheimer (DA), bem como os custos para os sistemas de saúde pública. Apesar de avanços significativos no entendimento da fisiopatologia da doença, pouco se sabe a respeito dos mecanismos moleculares que desencadeiam a perda de memória e a morte neuronal. Resultados recentes sugerem que o acúmulo de bases oxidadas no DNA mitocondrial e alterações nas vias que removem essas lesões desempenham um papel importante na morte neuronal observada em DA. A maioria das lesões em DNA induzidas oxidativamente são removidas pela via de reparo por excisão de bases (BER, do inglês Base Excision Repair). Resultados da literatura mostraram que a atividade da via BER está reduzida no lóbulo parietal e no cerebelo de pacientes com DA, quando comparadas com amostras de indivíduos com cognição normal da mesma faixa etária. Entretanto, esse trabalho mediu a atividade de BER apenas em extratos celulares totais. No presente estudo, foram medidas as atividades de BER em extratos mitocondriais de cérebros de indivíduos com DA, uma vez que lesões no DNA mitocondrial acumulam mais significativamente nos pacientes. Para testar a hipótese que alterações em BER mitocondrial estão associadas ao desenvolvimento da doença, foram analisadas atividades de BER em mitocôndrias em duas regiões cerebrais de indivíduos normais, indivíduos com DA e um grupo de indivíduos que apresentam alterações neuropatológicas de DA (agregados proteicos), porém que se mantiveram cognitivamente normais, nomeados DA assintomático. A atividade da enzima AP endonuclease apresentou-se elevada no cerebelo do grupo DA assintomático, enquanto que não apresentou variação no córtex temporal. Esses resultados sugerem que a preservação de APE1 no grupo DA assintomático pode exercer um papel protetor às lesões neuropatológicas, bem como indicar que as regiões cerebrais apresentam suscetibilidade distinta aos danos. Já a atividade de uracil DNA glicosilase está reduzida no cerebelo tanto em indivíduos com DA quanto com DA assintomático, quando comparados ao grupo controle, enquanto que, no córtex temporal, a redução é verificada somente no grupo DA. Além disso, observou-se que a atividade de UDG e o critério Braak apresentam uma correlação negativa. Os resultados referentes à enzima UDG sugerem que a redução da sua atividade compromete a viabilidade neuronal tornando as células mais propensas às lesões da DA. Assim, o comprometimento da via BER em mitocôndriais de cérebros humanos pode contribuir para os eventos moleculares que ocasionam a morte neuronal associada ao desenvolvimento de DA. / The number of Alzheimer\'s disease cases (AD) has increased steadly over the last century, paralleling a sharp rise in mean Iife expectancy. Consequently, AD- associated public health costs have also increased. Despite several important findings in AD physiopathology, a clear understanding of the molecular events leading to memory loss and neuronal death is still lacking. Recent results show that oxidized DNA lesions accumulate in mitochondrial DNA in neurodegenerative diseases, including AD. Moreover, alterations in DNA repair may also play a causative role in neuronal death. Most oxidized lesions are repaired by the Base Excision Repair (BER) pathway. It has been recently shown that BER activities are reduced in whole cell extracts from parietal lobule and cerebellum from AD patients, when compared with age-matched controls. As accumulation of oxidized bases is seen more prominently in mitochondrial DNA, here we investigated whether changes in BER activities in mitochondria are associated with the development of AD. Thus, we measured BER activities in mitochondria from two brain regions from age-matched normal individuais, AD patients and a group of individuais that show AD-like neuropathological alterations but remained cognitively normal, thus called asymptomatic AD. AP endonuclease activity is elevated in asymptomatic AD cerebellum, while not changed in temporal cortex. Theses results suggest that APE1 activity in asymptomatic AD may play a protective role against neuropatological lesions, and indicate that brain regions show different susceptibility to damage. On the other hand, uracil DNA glycosylase activity is reduced in cerebellum in both AD and asymptomatic individuais, when compared to controls. In temporal cortex, this reduction is observed only in AD group. In addition, UDG activity and Braak stage showed a significant negative correlation. These results indicate that decreased UDG activity may compromise neuronal viability, making the cells more prone to AD lesions. Thus, impairtment of BER in human brain mitochondria may contribute to the molecular events that cause neuronal death during the development of this disease.

INTRODUÇÃO: Tradicionalmente, a omentectomia total (OT) é realizada juntamente com a ressecção gástrica associada à linfadenectomia na cirurgia do câncer gástrico (CG). No entanto, evidências sólidas em relação ao seu benefício oncológico são escassas. Este estudo foi elaborado para avaliar a incidência de metástases em linfonodos (LN) do grande omento em pacientes submetidos à gastrectomia potencialmente curativa por CG, assim como, avaliar os fatores de risco para a ocorrência de linfonodos metastáticos no grande omento e a evolução dos pacientes. PACIENTES E MÉTODOS: Foram avaliados 284 pacientes operados pelo Serviço de Cirurgia de Estômago, Duodeno e Intestino Delgado do HCFMUSP, no período de março de 2009 a abril de 2016, com diagnóstico de adenocarcinoma. Critérios de inclusão: pacientes submetidos a cirurgias potencialmente curativas com ressecção R0, com linfadenectomia a D2 ou D2 modificada conforme preconizado pela Escola Japonesa. Foram excluídos os pacientes que apresentaram doença disseminada ou metástases a distância, mesmo sendo submetidos a ressecções paliativas, assim como, pacientes com invasão macroscópica do grande omento, pacientes com neoplasias sincrônicas ou metacrônicas, neoplasia de coto gástrico, cirurgia com menos de 15 LN ressecados e ausência de tumor na análise anatomopatológica. O tempo de seguimento de todos os pacientes variou entre 1 e 89,5 meses, com mediana de 27,6 meses. O tempo de seguimento mediano dos pacientes livres de doença foi de 34,3 meses (mínimo de 1 e máximo de 89,5). A associação entre o acometimento de LN no omento com variáveis categóricas foram investigadas por testes exatos de Fisher ou teste qui-quadrado e com variáveis numéricas por testes de Wilcoxon-Mann-Whitney. Adotou-se nível de significância de 5%. RESULTADOS: A média de idade foi 61,8 anos (±11,9; entre 25 e 86). Dos 284 pacientes, cinco (1,8%) tinham LN metastáticos no grande omento (um: pT3N3bM0; dois: pT4aN3bM0; um: pT4aN2M0 e um pT4bN3bM0). Quatro deles faleceram e um estava sob tratamento paliativo com quimioterapia devido à recidiva da doença. Os LN metastáticos no grande omento tiveram correlação significativa com o tamanho do tumor, no qual se encontrou o ponto de corte de 5,25cm (área sob a curva ROC: 0,8072; IC95%: 0,6645 - 0,9498), estádio N (p < 0,001), estádio clínico (p=0,022), invasão venosa (p=0,003), recorrência (p=0,006), local de recorrência (peritôneo: p=0,008; fígado: p=0,023; ovário: p=0,035) e óbito (p=0,008). CONCLUSÃO: A incidência de LN metastático no grande omento de pacientes submetidos à gastrectomia radical por CG é baixa. A OT pode ser evitada em tumores menores que 5,25 cm e estádios T1/T2. Entretanto, a presença de metástases linfonodais no grande omento está associada a recidiva no peritônio, fígado, ovário e óbito / BACKGROUND: Traditionally, total omentectomy is performed along with gastric resection and extended lymphadenectomy in gastric cancer (GC) surgery. However, solid evidences regarding its oncologic benefit still lacks. The aim of this study was to evaluate the incidence of metastatic omental lymph nodes (LN) in patients undergoing potentially curative gastrectomy for GC, as well as its risk factors and patients\' outcomes. PATIENTS AND METHODS: In order to perform this analysis, 284 patients with adenocarcinoma operated at the Department of Surgery of Stomach, Duodenum and Small Intestine at HCFMUSP from March 2009 to April 2016 were reviewed. Inclusion criteria was: patients who underwent potentially curative R0 surgery with D2 lymphadenectomy as recommended by the Japanese School. Patients with disseminated disease or distant metastases, even if undergoing palliative resections were excluded from the study. As well as patients with macroscopic omental invasion, synchronic or metachronous neoplasms, gastric stump neoplasia, surgery with less than 15 harvested LN and absence of tumor in pathological analysis. The follow-up period of all patients ranged from 1 to 89.5 months, with a median of 27.6 months. The median follow-up period of disease-free patients was 34.3 months (minimum of 1 and maximum of 89.5 months). The association between omental LN involvement with categorical variables was investigated by Fisher\'s exact tests or chi-square test and numerical variables by Wilcoxon-Mann-Whitney tests. A significance level of 5% was adopted. RESULTS: The mean age was 61.8 years (± 11.9, range 25 - 86). Of 284 patients included, five (1.8%) patients had metastatic omental LN (one: pT3N3bM0; two: pT4aN3bM0; one: pT4aN2M0 and one pT4bN3bM0). Four of them deceased and one was under palliative chemotherapy due relapse. LN metastases in the greater omentum significantly correlated with tumor\'s size in which the cut-off found was 5.25cm (area under the ROC curve: 0.8072; IC95%: 0.6645 - 0.9498), N stage (p < 0.001), clinical stage (p=0.022), venous growth (p=0.003), recurrence (p=0.006), site of recurrence (peritoneum: p=0.008; liver: p=0.023; ovary: p=0.035) and death (p=0.008). CONCLUSION: The incidence of metastatic omental LN of patients undergoing radical gastrectomy due to GC is extremely low and may be avoided in tumors smaller than 5.25cm and T1/T2 tumors. Though, when present is associated with recurrence in peritoneum, liver, ovary and death