A cana-de-açúcar (Saccharum spp.) desempenha um papel de grande importância no cenário socioeconômico brasileiro, e representa 42% da matriz energética renovável do país. A expansão da área de cultivo da cana-de-açúcar para solos marginais e a necessidade de manutenção da alta produtividade dessa cultura tem levado à maior aplicação de fertilizantes a base de nitrogênio (N). Tal fato aliado à baixa responsividade da cana-de-açúcar a fertilizantes nitrogenados acarreta altos custos econômicos e ambientais. O amônio é a fonte preferencial de N para essa gramínea, sendo que pouco se conhece sobre a funcionalidade dos transportadores de NH4+ pertencentes à família gênica AMT (AMMONIUM TRANSPORTER). Neste contexto, é relevante esclarecer os mecanismos que influenciam na eficiência do uso de N (NUE), visando reduzir o impacto econômico e ambiental da aplicação dos fertilizantes nitrogenados nos sistemas agrícolas. Dessa forma, esse trabalho teve como objetivo a caracterização molecular e funcional de membros da subfamília AMT2 de cana-de-açúcar através de expressão heteróloga em mutantes de Saccharomyces cerevisiae (cepa 31019b) e Arabidopsis thaliana (qko), defectivos no transporte de amônio. As sequências gênicas e promotoras de ScAMT2;1 e ScAMT3;3A foram identificadas em biblioteca de BAC (bacterial artificial chromosome) de cana-de-açúcar (cultivar \'R570\'). Análises de expressão gênica de ScAMT2;1 e ScAMT3;3A em cana-de-açúcar demonstraram uma expressão preferencial em raízes e em folhas maduras, respectivamente, e que estes genes são regulados de maneira distinta entre si e entre os órgãos, de acordo com o desenvolvimento e com o status de N da planta. A complementação de levedura com os AMT2 de cana-de-açúcar demonstrou que estes genes restauram o crescimento do mutante, sendo que ScAMT2;1 permite maior absorção de amônio; porém o experimento não indicou sensibilidade dessas proteínas ao metilamônio (análogo tóxico ao amônio). Experimentos de localização da expressão órgão/tecido específico em arabidopsis selvagem \'Col-0\', utilizando os promotores de ScAMT2;1 ou ScAMT3;3A fusionados a GUS ou GFP, demonstraram que esses AMTs são preferencialmente expressos na região da endoderme/periciclo e vascular das células das raízes e região vascular da parte aérea, sendo regulados pela disponibilidade e fonte de N. Plantas de arabidopsis qko superexpressando ScAMT2;1, ScAMT3;3A ou transformadas com ScAMT2;1 dirigido por seu promotor endógeno, crescidas in vitro com amônio como fonte exclusiva de N, apresentaram um aumento significativo na produção de biomassa em relação a qko não transformada, principalmente para ScAMT2;1, indicando que essas proteínas são capazes de transportar amônio e complementar o mutante. Dados de influxo e acúmulo de 15N-amônio in vivo em raízes e parte aérea de plantas qko superexpressando ScAMT2;1 ou ScAMT3;3A demonstraram que ScAMT2;1 atua na absorção de amônio pelas raízes e provavelmente do carregamento do xilema, enquanto ScAMT3;3A está possivelmente envolvida na remobilização de amônio na parte aérea, podendo atuar aditivamente na absorção de NH4+ em raízes sob alto amônio. Esses resultados indicam que os transportadores ScAMT2;1 e ScAMT3;3A de cana-de-açúcar são funcionais, atuando com propriedades e funções distintas no transporte de amônio nessa gramínea e de acordo com a disponibilidade de N. / Sugarcane (Saccharum spp.) plays a major role in the Brazilian socio-economic scenario, and represents 42% of renewable energy sources in the country. The expansion of sugarcane cultivation to marginal lands and the requirement to maintain high yields have led to increased application of nitrogen (N) fertilizer. This fact, coupled with the low response of sugarcane to N fertilization, entails high economic and environmental costs. Ammonium is the preferred source of N by this grass; however, little is known about the functionality of NH4+ transporters belonging to the AMT gene family (AMMONIUM TRANSPORTER). In this context, it is important to clarify the mechanisms that affect the nitrogen use efficiency (NUE) in order to reduce the economic and environmental impact of the application of N fertilizers in agricultural systems. Therefore, this study aimed to conduct the molecular and functional characterization of members of the AMT2 subfamily from sugarcane by heterologous expression in mutants of Saccharomyces cerevisiae (strain 31019b) and Arabidopsis thaliana (qko), both defective in ammonium transport. Gene and regulatory region sequences of ScAMT2;1 and ScAMT3;3A were identified in a bacterial artificial chromosome (BAC) library of sugarcane (cultivar \'R570\'). Expression analysis of ScAMT2;1 and ScAMT3;3A in sugarcane showed a preferential expression in roots and mature leaves, respectively, and indicated a distinct expression pattern between genes and organs according to the ontogeny and the N status of the plant. The yeast complementation with AMT2 of sugarcane demonstrated that these genes restore the mutant growth, with ScAMT2;1 enabling higher ammonium absorption; however, the experiment did not indicate sensitivity to methylammonium (toxic ammonium analog). Arabidopsis wild type \'Col-0\' transformed with the promoter region of ScAMT2;1 or ScAMT3;3A directing the expression of GUS or GFP, demonstrated preferential expression in the endodermis/pericycle regions of roots and vascular region in shoots, being regulated by the availability and source of N. Arabidopsis qko overexpressing ScAMT2;1, ScAMT3;3A or transformed with ScAMT2;1 driven by its endogenous promoter, grown in vitro with ammonium as the sole source of nitrogen, showed a significant increase in biomass production compared to untransformed qko, especially for ScAMT2;1, indicating that these proteins are capable of transporting ammonium and complementing the mutant. Data of 15N-ammonium influx and accumulation in vivo in roots and shoots of qko plants overexpressing ScAMT2;1 or ScAMT3;3A showed that ScAMT2;1 acts in ammonium uptake by roots and probably in the xylem loading, while ScAMT3;3A is possibly involved in ammonium remobilization in shoots, and may act additively in the absorption of NH4+ in roots under high ammonium. These results indicate that ScAMT2;1 and ScAMT3;3A from sugarcane are functional, working with distinct properties and functions in ammonium transport according to the availability of N

Segundo a classificação CAZy (Carbohydrate Active enZymes), as glicosil hidrolases (GH) da família 93 são exo-?-1,5-arabinanases que atuam nas ligações ?-1,5 que unem os resíduos de L-arabinofuranosideo que conformam a cadeia principal de arabinana desramificada, liberando arabinose ou arabinobiose. Esta recém descrita família de enzimas, além de ter o potencial de participar junto com outras proteínas na sacarificação de resíduos industriais como a polpa de beterraba, oferece a possibilidade de sintetizar novas moléculas, pois alguns membros desta família podem catalisar reações de transarabinosilação utilizando glicerol, xilitol e sorbitol como aceptores. Embora as GH93 apresentem caraterísticas atrativas para aplicações industriais, até o momento apenas cinco enzimas desta família foram caraterizadas bioquimicamente, sendo que a maioria delas apresentou maior atividade em pHs ácidos e nenhuma com caraterísticas termofílicas. Neste trabalho uma exo-?-1,5-arabinanase abnt do fungo termofílico Thielavia terrestris foi expressa heterólogamente pela primeira vez em fungo filamentoso, utilizando Aspergillus nidulans linhagem A773 transformado com o vetor pEXPYR como sistema de expressão. A enzima foi caraterizada bioquimicamente e sua produção fermentativa avaliada, utilizando dois tipos de indutores em diferentes concentrações e condições de cultivo, escolhendo a melhor condição para o escalonamento. A proteína recombinante de 39,8 KDa mostrou ser uma glicoproteína com uma atividade especifica de 248 U.mg-1 em arabinana desramificada 0,28 mM, pH 5 e temperatura de 70 ?C (valores ótimos para enzima), um Km 0,29 mM, Vmax 0,45 ?mol.min-1, Kcat 115,4 s-1, e eficiência catalítica de 3,9 *105 s-1 M-1, mostrando também um aumento de 34% na liberação de produto quando incubada na presença de CoCl2 1mM. Esta é a primeira exo-arabinanase reportada na literatura com comportamento termofílico e prolongada estabilidade em pHs ácidos. No processo fermentativo a melhor produção de abnt foi atingida usando 3% (m/v) do indutor em condições de cultivo submerso, o escalonamento do processo não afetou a produção enzimática. O sistema de expressão A. nidulans+pEXPYR foi capaz de produzir a mesma quantidade de proteína recombinante utilizando como indutor, um composto cinquenta vezes mais barato que o normalmente utilizado. / According to CAZy (Carbohydrate Active enZymes) classification, glycosyl hydrolases (GH) from family 93 are exo-?-1,5-arabinanases acting on ?-1,5 bonds that bind L-arabinofuranose residues in the main chain of arabinan releasing arabinose or arabinobiose. This new family of enzymes was described recently and, besides having the potential to participate along with other proteins in the saccharification of agro industrial wastes such as sugar beet pulp, offers the possibility of synthesize new molecules, since some members of this family can catalyze reactions of transarabinosylation using glycerol, xylitol and sorbitol as acceptors. Although, GH93 presents attractive characteristics for industrial applications, only five enzymes have been characterized biochemically so far, most of them presenting higher activity in acidic pHs and none with thermophilic characteristics. In this work an exo-?-1,5-arabinanase abnt of the thermophilic fungus Thielavia terrestris was heterologously expressed for the first time in a filamentous fungus using Aspergillus nidulans strain A773 transformed with the pEXPYR vector as expression system. The enzyme was characterized biochemically and its fermentative production was evaluated using two types of inducers in different concentrations and conditions of cultivation, setting the best condition for scale up. The recombinant protein of 39.8 KDa showed be a glycoprotein with a specific activity of 248 U.mg-1 in 0.28 mM debranched arabinana at pH 5 and temperature of 70 °C (optimum values for enzyme), a Km 0,29 mM, Vmax 0.45 ?mol.min-1, Kcat 115.4 s-1, and catalytic efficiency of 3.9 * 105 s-1 M-1, also showed an increase of 34% in product release when incubated in the presence of 1 mM CoCl2. This, is the first exo-arabinanase reported in the literature with thermophilic behavior and prolonged stability at acidic pHs. In the fermentation process the best abnt production was achieved using 3% (m/v) of the inducer under submerged culture conditions, and the scaling process did not affect the enzymatic production. The A. nidulans+pEXPYR expression system was able to produce the same amount of recombinant protein using as an inducer, a compound fifty fold less expensive then the normally used.

A biomassa lignocelulósica é uma fonte abundante de açúcares simples passíveis de serem fermentados em uma variedade de bioprodutos de maior valor agregado, além do etanol de segunda geração. Tal diversidade é relevante ao desenvolvimento e aprimoramento do conceito de biorrefinarias e da bioeconomia, em um viés mais amplo. Todavia, a elevada recalcitrância dos lignocelulósicos dificulta a sua sacarificação enzimática, resultando em bioprocessos mais onerosos. Por isso, coquetéis com diferentes enzimas ativas em carboidrato (CAZymes) são desenvolvidos, em busca de uma maior eficiência e melhor relação custo/benefício, para processos em larga escala. Dentre as CAZymes estudadas, encontram-se as mono-oxigenases líticas de polissacarídeo (LPMOs), tendo em vista a sua atestada capacidade de otimizar a hidrólise da lignocelulose, quando em sinergismo com diversas hidrolases. Levando isto em conta, selecionou-se, ao atual estudo, o ascomiceto termofílico Thermothelomyces thermophila (anteriormente denominado Myceliophthora thermophila), pois este tem se mostrado capaz de expressar e secretar ampla gama de LPMOs ativas em diferentes substratos. Objetivando-se estudar duas LPMOs derivadas deste organismo, as mesmas foram expressas, heterologamente, por Aspergillus nidulans linhagem A773, utilizando-se o vetor de expressão pEXPYR construído para viabilizar a secreção de altas concentrações de proteínas recombinantes. As proteínas heterólogas aqui analisadas foram denominadas TtLPMO1A9 e TtLPMO2A9. Embora ambas tenham sido capazes de gerar peróxido de hidrogênio na presença de oxigênio molecular e de um doador de elétrons, apenas TtLPMO2A9 apresentou atividade contra substratos celulósicos e bagaço de cana pré-tratado hidrotermicamente, atuando, em associação com hidrolases homemade e o preparo enzimático comercial Celluclast 1.5L, a degradação de tais materiais. / The lignocellulosic biomass is an abundant source of simple sugars that can be fermented to various value-added bio-based products. This diversity is seen as relevant to the improvement of biorefinery and bioeconomy concept. Nevertheless, the significant recalcitrance of lignocellulose imposes dificulties to its enzymatic saccharification, resulting in onerous bioprocessing. This scenario stimulates studies based on the development of efficient and cost-effective customizable carbohydrate-active enzyme (CAZymes) cocktails for large-scale processes. Among the available CAZymes, there are the lytic polysaccharide monooxygenases (LPMOs), a set of oxidative proteins capable of optimizing the lignocellulose hydrolysis, when acting in synergism with various hydrolases. Based on this fact, in the current study, the thermophilic ascomycete Thermothelomyces thermophila (previously known as Myceliophthora thermophila) was adopted, because of its ability of expressing and secreting large amounts of LPMOs. Thus, two LPMOs derived from this fungus was heterologously produced by an expression system composed by Aspergillus nidulans strain A773 and the vector pEXPYR: an expression vector built to increase the secretion of recombinant proteins. The heterologous proteins herein analysed were termed as TtLPMO1A9 and TtLPMO2A9. Although both enzymes were able to produce hydrogen peroxide in the presence of molecular oxygen and an electron donor, only the second one was active in reactions with cellulosic substrates and hydrothermally pre-treated sugar cane bagasse. When tailor-made hydrolases and the commercial enzymatic mixture Celluclast 1.5L were supplemented with TtLPMO2A9, it was noticed na improvement of the deconstruction of the aforementioned substrates.

As serinoproteases de peçonha de serpentes (SVSPs) agem sobre pontos específicos do sistema circulatório, sendo consideradas promissoras para o tratamento de uma diversidade de desordens hemostáticas. No presente estudo, é descrita a expressão de uma serinoprotease de Crotalus durissus collilineatus (Collineina-1) em Pichia pastoris, bem como a purificação dessa toxina a partir da peçonha de C. d. collilineatus e a caracterização estrutural e enzimática da Collineina-1 nas formas nativa e recombinante. O cDNA que codifica a serinoprotease foi amplificado a partir da biblioteca de cDNA da glândula de peçonha de C. d. collilineatus e ligado ao vetor pPICZ A. A linhagem KM71H de P. pastoris foi transformada com o plasmídeo recombinante e as colônias foram selecionadas por resistência à zeocina. A expressão heteróloga foi realizada em meio mínimo suplementado com metanol, resultando em um rendimento de 56 mg de proteína por litro de cultura. A proteína recombinante foi purificada por um protocolo baseado em técnicas cromatográficas de troca iônica e fase reversa. A purificação da serinoprotease a partir da peçonha de C. d. collilineatus foi realizada pela combinação de técnicas de cromatografia de exclusão molecular, troca iônica e fase reversa, e resultou no isolamento de duas isoformas, denominadas Collineina-1 e 2. Quando analisada por espectrometria de massas, a Collineina-1 recombinante apresentou massa molar de 28.868 Da, enquanto as enzimas Collineina-1 e 2 apresentaram massas de 29.475 Da e 29.388 Da, respectivamente. A partir do alinhamento das sequências parciais das serinoproteases, foi possível determinar 100% de identidade dos aminoácidos para a Collineina-1 nativa e recombinante. O alinhamento múltiplo da sequência deduzida de aminoácidos da Collineina-1 indica uma semelhança estrutural dessa proteína com outras serinoproteases de peçonha de serpente. As enzimas nativa e recombinante mostraram efeitos similares sobre fibrinogênio bovino por clivarem preferencialmente a cadeia A do fibrinogênio, liberando o fibrinopeptídeo A. Ambas as enzimas induziram a coagulação do plasma bovino de forma dose-dependente, sendo que a Collineina-1 recombinante apresentou maior potencial coagulante, com uma dose mínima coagulante (DMC) de 0,08 mg/uL contra 0,225 mgu/L para a proteína nativa. As serinoproteases foram capazes de hidrolisar os substratos cromogênicos S-2222, S-2238 e S2302, embora ambas as enzimas tenham demonstrado maior atividade sobre o substrato S-2302. A atividade esterásica sobre o TAME foi avaliada em diferentes condições de temperatura e na presença de íons divalentes. As duas enzimas demonstraram alta termoestabilidade e tiveram a atividade inibida na presença dos íons Zn2+ e Cu2+. A cinética enzimática de ambas as serinoproteases seguiram o modelo de Michaelis-Menten. A Collineina-1 nativa apresentou um valor de Km de 1,43 mM, contra 1,682 mM para a proteína recombinante, indicando que a proteína nativa apresenta maior afinidade pelo substrato TAME. No entanto, as enzimas apresentaram valores similares de Kcat/Km (250,69 mM.min-1 para a Collineina-1 e 248,03 mM.min-1 para a rCollineina-1), sugerindo que as serinoproteases não diferem significativamente na eficiência em hidrolisar o substrato. Estes resultados demonstraram a adequação do sistema de escolha na produção heteróloga da Collineina-1, já que a proteína recombinante foi expressa com integridade funcional sobre os parâmetros avaliados. / Snake venom serine proteases (SVSPs) act on specific points of the circulatory system and are promising for the treatment of a variety of hemostatic disorders. In the present study, we describe the expression of a serine protease from Crotalus durissus collilineatus (Collineina- 1) in Pichia pastoris, the purification of the native toxin from C. d. collilineatus venom and the structural and enzymatic characterization of Collineina-1 in native and recombinant forms. The cDNA encoding the serine protease was amplified from cDNA library of C. d. collilineatus venom gland and cloned into pPICZ A vector. KM71H P. pastoris strain was transformed with the recombinant plasmid and colonies were selected by zeocin resistance. Heterologous expression was carried out in minimal medium supplemented with methanol, resulting in a yield of 56 mg of protein per liter of culture. The recombinant protein was purified by ion exchange and reverse phase chromatography. Purification of the native serine protease was accomplished by combining techniques of molecular exclusion, ion exchange and reversed phase, and resulted in the isolation of two isoforms, named Collineina-1 and 2. When analyzed by mass spectrometry, the recombinant Collineina-1 showed a molar mass of 28,868 Da, while Collineina-1 and 2 presented masses of 29,475 and 29,388 Da, respectively. The alignment of partial sequences of the enzymes resulted in 100% of amino acid identity between native and recombinant Collineina-1. The multiple alignment of deduced amino acid sequence of Collineina-1 indicates structural similarity with other snake venom serine proteases. The native and recombinant forms of the enzyme showed similar effects on bovine fibrinogen by cleaving preferentially A chain, releasing fibrinopeptide A. Both enzymes induced coagulation of bovine plasma in a dose-dependent way, though recombinant Collineina-1 presented a higher coagulant potential, with a minimum coagulant dose (MCD) of 0.08 mg/uL against 0.225 mg/uL for the native form. The serine proteases hydrolyzed S- 2222, S-2238 and S2302 chromogenic substrates, although both enzymes demonstrated increased activity upon S-2302. The esterase activity on TAME was evaluated at different temperatures and in the presence of divalent ions. Both enzymes showed high thermostability and their activity were inhibited in the presence of Zn2+ and Cu2+. The enzyme kinetics of both serine proteases followed Michaelis-Menten model. The native Collineina-1 showed a Km value of 1.43 mM, against 1.682 mM for the recombinant form, indicating that the native protein has a higher affinity for TAME substrate. However, enzymes had similar values for Kcat/Km (250.69 mM.min-1 for Collineina-1 and 248.03 mM.min-1 for rCollineina-1), suggesting that the serine proteases did not differ significantly in the efficiency to hydrolyze the substrate. These results demonstrated the adequacy of the system of choice in producing the snake venom serine protease, since the recombinant protein was expressed with functional integrity on the evaluated parameters.

Um dos eventos mais importantes durante o amadurecimento da banana é a degradação do amido, concomitante com o acúmulo de açúcares solúveis. Várias enzimas, que supostamente atuam na degradação do amido, já tiveram sua atividade/proteína específica detectadas nesta fase na banana. Entre elas a α-amilase, a β-amilase, as amido-fosforilases, as α-glicosidases e as isoamilases. A síntese do amido e, normalmente, sua degradação, ocorrem dentro do amiloplasto, que possui duas membranas a serem transpostas antes do acesso ao grânulo de amido ou aos produtos da ação de outras enzimas. Uma das isoformas da β-amilase em banana possui um peptídeo de transporte predito em sua seqüência, necessário para transpor estas membranas e entrar no amiloplasto. Uma maneira de contornar a dificuldade em estabelecer a real importância de cada enzima na degradação do amido é isolar os grânulos e as enzimas e submetê-lo à atividade seqüencial das enzimas supostamente responsáveis pela degradação. O ideal é utilizar a enzima endógena, mas o processo de purificação de enzimas em frutos é demorado e nem sempre bom em termos de pureza, quantidade e atividade. Estudos baseados na expressão heteróloga de genes da β-amilase permitiriam melhor compreender os mecanismos de atuação dessa enzima presente na polpa da banana. Assim, foram feitos ensaios de expressão heteróloga em Pichia pastoris na tentativa de produzir essa enzima em quantidade suficiente para purificação, aplicação nos grânulos de amido e produção de anticorpos policlonais. Foram testadas várias condições de indução da proteína, tais como aeração, temperatura, pH, concentração de metanol e tempo de indução, bem como a montagem de uma nova construção gênica com tag de histidina no vetor de expressão pPICZαA com confirmação do fenótipo dos transformantes positivos. Porém, a obtenção de β-amilase recombinante com atividade não foi bem sucedida, necessitando talvez de alterações nesses padrões de indução. / One of the most important events that occurs during ripening of banana is the starch degradation concomitantly with the accumulation of soluble sugars. Several enzymes, known by acting on starch degradation, had their activity and/or specific protein detected at this stage of banana. These include the α-amylase, the β-amylase, the starch-phosphorylases, the α-glucosidase and the isoamilases. The synthesis and starch degradation occur inside of the amyloplast that contain two membranes which has to be reach before accessing the starch granule or the products of the other enzymes. One of the isoforms of β-amylase in bananas has a transit peptide predicted in the sequence, required to access the amyloplast. To establish the real importance of each enzyme in the starch degradation it is necessary to isolate the granules and enzymes and submit them to the sequential activity to confirm the supposed degradation. The idea is to use the endogenous enzyme, but the process of purification of the enzyme in fruits demands a lot of time and the results of purity, quantity and activity are not guaranteed. Studies based on heterologous expression of the β-amylase genes allow us to understand the mechanisms of action of this enzyme present in the pulp of banana. Thus, tests were carried out with heterologous expression in Pichia pastoris in order to produce this enzyme in sufficient quantity to purification, and then, applied on starch granules and produce a polyclonal antibody. We tested different conditions of protein induction such as aeration, temperature, pH, methanol concentration and induction time, as well as the new genic construction with the histidine tag with an expression vector pPICZαA confirming the phenotype of positive transformants. However, recombinant β-amylase with activity was not obtained successfully, necessitating changes in these patterns of induction.

A produção de biocombustíveis e a obtenção de alguns compostos químicos a partir de materiais renováveis, como a biomassa lignocelulósica, ainda não são processos triviais, principalmente devido a recalcitrância destes materiais. Estudos recentes reconheceram as enzimas acessórias, como xilanases e enzimas com Atividade Auxiliar, como potencializadores da atividade de celulases no processo de despolimerização da lignocelulose. A prospecção de enzimas com características termoestáveis é vantajosa para este tipo de aplicação e além disso, estudos sobre o secretoma de diversos fungos cultivados em biomassa como fonte de carbono, tem encontrado enzimas com mecanismo oxidativo, dentre eles, o fungo termofílico Myceliophthora thermophila M77. Porém, estas enzimas tem sido pouco estudadas quanto a sua aplicação na sacarificação da biomassa. Sendo assim, este trabalho visou a expressão heteróloga, a caracterização bioquímica e a ação da enzima oxidativa celobiose desidrogenase do fungo M. thermophila (M77CDH) em conjunto com outras celulases no processo de sacarificação da biomassa. Pela análise filogenética a M77CDH prospectada foi classificada como pertencente a Classe IIB das CDHs. O gene que codifica esta enzima foi clonado no vetor pEXPYR e heterólogamente expresso em A. nidulans. A proteína recombinante M77CDH foi purificada e teve sua identidade confirmada por espectrometria de massas. Nas análises bioquímicas, apresentou atividade ótima a 65 °C e reteve mais de 80% da sua atividade a 50°C por 2 horas e pela análise de dicroísmo circular apresentou um desenovelamento da sua estrutura na temperatura de transição de 62,8 °C. Apresentou mais de 80% de atividade em uma faixa ampla de pH (4,5 - 9), em que o domínio citocromo mostrou maior afinidade em pHs alcalinos, característica incomum entre as CDHs descritas na literatura. A atividade da M77CDH foi ligeiramente aumentada pela adição de MgCl2 e Na2MoO4 e altamente afetada por CuSO4 e FeCl3. A eficiência catalítica (kcat/km=266 mM-1s-1) utilizando celobiose foi bastante similar aos valores indicados por CDHs da Classe IIA. O envelope da M77CDH gerado por SAXS foi satisfatório e conveniente com a literatura. Na sacarificação de bagaço de cana pré-tratado hidrotermicamente, utilizando coquetel de A. niveus suplementado com M77CDH, foi possível observar que a adição de M77CDH modificou o perfil de produtos liberados na desconstrução da biomassa. Por fim, na sacarificação do PASC observou-se a sacarificação e produção de ácido celobiônico. / The production of biofuels and chemicals from renewable materials such as lignocellulosic biomass are non-trivial processes mainly due to the recalcitrance of the material. Recent studies have recognized accessory enzymes such as xylanases and Auxiliary Activity enzymes as potentiators in cellulase activity during the depolymerization of lignocellulose. The prospection of thermostable enzymes can be an advantage the improve the depolymerization of these materials. In addition, several enzymes showing oxidative mode of action were found in the secretoma of the thermophilic fungus Myceliophthora thermophila strain M77. However, these enzymes are poor studied regarding their application in biomass saccharification. Therefore, this project aimed the heterologous expression and biochemical characterization of the oxidative enzyme cellobiose dehydrogenase of the fungus M. thermophila (M77CDH). By phylogenetic analysis the M77CDH was classified as belonging to Class IIB of CDHs. The gene encoding this enzyme was cloned and heterologously expressed in A. nidulans, the M77CDH was purified and had its identity confirmed by mass spectrometry. In the biochemical analyzes the M77CDH showed an optimum activity at 65 °C and retained more than 80% of its activity at 50 °C for 2 hours. The circular dichroism analysis showed a denaturation of its structure at the transition temperature of 62.8 ° C. M77CDH also kept more than 80% of its activity in a wide pH range (4.5 - 9), in which the cytochrome domain showed higher affinity at alkaline pH, an unusual behavior compared with other CDHs described in the literature. The activity of M77CDH was increased slightly in the presence of MgCl2 and Na2MoO4 and was highly affected by CuSO4 and FeCl3. The catalytic efficiency (kcat/km = 266 mM-1s-1) in cellobiose was quite similar to the values indicated by CDHs from Class IIA. The envelope of M77CDH generated by SAXS was satisfactory and convenient with the literature. In saccharification of sugarcane bagasse hydrothermally pretreated using A. niveus cocktail supplemented with M77CDH was possible to observe the addition of M77CDH modified the profile of released products in the deconstruction of the biomass. Finally, in the action on PASC was observed the saccharification and production of cellobionic acid.

Orientador: João Pessoa Araujo Junior / Resumo: A suinocultura vem alcançando grande desenvolvimento de técnicas eficientes associadas ao melhoramento genético, nutrição, manejo e sanidade. Entretanto, devido aos métodos intensivos de criação, os suínos se tornaram mais susceptíveis a um grande número de doenças infecciosas. Entre os mais importantes patógenos que afetam a indústria suinícola mundial está o circovírus suíno 2 (PCV2), um pequeno vírus icosaédrico, não-envelopado, de DNA circular, de fita simples (ssDNA), ambisenso, composta por 1767-1768 nucleotídeos. Este vírus é altamente resistente a variações ambientais e agentes desinfetantes, é endêmico no mundo todo e está associado a várias manifestações clínicas distintas, que acarretam importantes perdas econômicas aos produtores. Um dos fatores possivelmente implicados na patogenicidade do PCV2 é a proteína Cap, a unidade fundamental constituinte do capsídeo deste vírus. Estudos realizados pela equipe do Prof. Dr. João Pessoa Araújo Jr., do Instituto de Biotecnologia da Unesp em Botucatu/SP, comprovaram que vírus com mutações em suas proteínas Cap isolados a partir de cultivo celular aumentavam a morte celular em culturas celulares infectadas. Estes resultados evidenciaram a importância do capsídeo nos mecanismos de infecção e patogenicidade do PCV2, tornando interessante a realização de estudos estruturais com as proteínas Cap mutantes. A execução de estudos estruturais in silico mostrou a baixa frequência das mutações identificadas na proteína Cap dos vírus pro... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Swine breeding has achieved a high development based on genetic improvement, nutrition, management and sanity. However, due to the intensive breeding methods, swine have become more susceptible to a higher number of infectious diseases. Among the most important pathogens that affect the swine world industry is the porcine circovirus 2 (PCV2), a small, icosahedral, non-enveloped virus, ambisense single-stranded circular DNA, composed by 1,767-1,768 nucleotides. This virus is highly resistant to environmental variations and disinfecting agents, endemic worldwide and has been associated to several distinct clinical manifestations that entail important economic losses to the producers. One of the factors possibly implicated on the PCV2 pathogenicity is the Cap protein, the fundamental unity that constitutes this virus capsid. Studies performed by the group of Dr. João Pessoa Araújo Jr. rom the Instituto de Biotecnologia da Unesp em Botucatu/SP, confirmed that viruses with mutated Cap proteins from cell culture increased cell death in infected cultures. Such results highlight the importance of capsid in the infection mechanisms and pathogenicity of PCV2 and the importance of structural and comparative studies with Cap protein structures. In silico structural studies showed the low frequency of the mutations identified in the mutant Cap proteins and also indicated a clear difference between the physico-chemical properties of the new amino acid residues in comparison to those found ... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Submitted by Pâmela Merlo Marson (pam.marson@aluno.ibb.unesp.br) on 2018-06-05T17:11:43Z No. of bitstreams: 1 Dissertação_Mestrado_Pamela-Merlo-Marson_2018_vf.pdf: 1757229 bytes, checksum: ed7b8faed4d956e7a1ba89178199507d (MD5) / Approved for entry into archive by Sulamita Selma C Colnago null (sulamita@btu.unesp.br) on 2018-06-07T14:10:28Z (GMT) No. of bitstreams: 1 marson_pm_me_bot.pdf: 1757229 bytes, checksum: ed7b8faed4d956e7a1ba89178199507d (MD5) / Made available in DSpace on 2018-06-07T14:10:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 marson_pm_me_bot.pdf: 1757229 bytes, checksum: ed7b8faed4d956e7a1ba89178199507d (MD5) Previous issue date: 2018-02-28 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / A suinocultura vem alcançando grande desenvolvimento de técnicas eficientes associadas ao melhoramento genético, nutrição, manejo e sanidade. Entretanto, devido aos métodos intensivos de criação, os suínos se tornaram mais susceptíveis a um grande número de doenças infecciosas. Entre os mais importantes patógenos que afetam a indústria suinícola mundial está o circovírus suíno 2 (PCV2), um pequeno vírus icosaédrico, não-envelopado, de DNA circular, de fita simples (ssDNA), ambisenso, composta por 1767-1768 nucleotídeos. Este vírus é altamente resistente a variações ambientais e agentes desinfetantes, é endêmico no mundo todo e está associado a várias manifestações clínicas distintas, que acarretam importantes perdas econômicas aos produtores. Um dos fatores possivelmente implicados na patogenicidade do PCV2 é a proteína Cap, a unidade fundamental constituinte do capsídeo deste vírus. Estudos realizados pela equipe do Prof. Dr. João Pessoa Araújo Jr., do Instituto de Biotecnologia da Unesp em Botucatu/SP, comprovaram que vírus com mutações em suas proteínas Cap isolados a partir de cultivo celular aumentavam a morte celular em culturas celulares infectadas. Estes resultados evidenciaram a importância do capsídeo nos mecanismos de infecção e patogenicidade do PCV2, tornando interessante a realização de estudos estruturais com as proteínas Cap mutantes. A execução de estudos estruturais in silico mostrou a baixa frequência das mutações identificadas na proteína Cap dos vírus provenientes do cultivo in vitro e também indicou uma clara diferença entre as propriedades físico-químicas dos novos resíduos de aminoácidos em relação àqueles substituídos. Estas alterações, associadas à localização dos resíduos na superfície viral e a menor flexibilidade das proteínas Cap dos vírus mutantes, indicaram a possibilidade de alterações estruturais/funcionais relevantes, incluindo a alteração da afinidade por receptores celulares e diminuição da efetividade de anticorpos produzidos contra vírus vacinais. Foram também realizados trabalhos experimentais para a produção heteróloga da proteína Cap de um vírus selvagem, os quais envolveram ensaios de subclonagem da sequência de interesse em um vetor de expressão, testes de transcrição e experimentos de expressão protéica. Os resultados destes procedimentos foram compatíveis com a produção da proteína Cap, porém novos estudos são necessários para confirmar a produção da molécula alvo e melhorar o rendimento dos ensaios de expressão. / Swine breeding has achieved a high development based on genetic improvement, nutrition, management and sanity. However, due to the intensive breeding methods, swine have become more susceptible to a higher number of infectious diseases. Among the most important pathogens that affect the swine world industry is the porcine circovirus 2 (PCV2), a small, icosahedral, non-enveloped virus, ambisense single-stranded circular DNA, composed by 1,767-1,768 nucleotides. This virus is highly resistant to environmental variations and disinfecting agents, endemic worldwide and has been associated to several distinct clinical manifestations that entail important economic losses to the producers. One of the factors possibly implicated on the PCV2 pathogenicity is the Cap protein, the fundamental unity that constitutes this virus capsid. Studies performed by the group of Dr. João Pessoa Araújo Jr. rom the Instituto de Biotecnologia da Unesp em Botucatu/SP, confirmed that viruses with mutated Cap proteins from cell culture increased cell death in infected cultures. Such results highlight the importance of capsid in the infection mechanisms and pathogenicity of PCV2 and the importance of structural and comparative studies with Cap protein structures. In silico structural studies showed the low frequency of the mutations identified in the mutant Cap proteins and also indicated a clear difference between the physico-chemical properties of the new amino acid residues in comparison to those found in the wild-type virus. These mutations, associated with the location of the mutated residues on the viral surface and the lower mutated Cap protein flexibility, could lead to relevant structural/functional changes, including alteration of affinity for cellular receptors and decreased effectiveness of antibodies produced against vaccine viruses. Experimental works aiming the heterologous production of a wild-type Cap protein were also carried out, which involved expression vector subcloning, transcription tests and protein expression experiments. The results of these procedures were compatible with the production of the Cap protein, but further studies are needed to confirm the production of the target molecule and improve the yield of the expression assays.

BEZERRA, Walderly Melgaço. Expressão de uma proteína YD de Chromobacterium violaceum em sistemas heterólogos: potencial no controle de pragas e fungos. 2008. 53 f. Dissertação (Mestrado em Bioquímica) - Universidade Federal do Ceará, Fortaleza-CE, 2008. / Submitted by Eric Santiago (erichhcl@gmail.com) on 2016-07-19T11:44:51Z No. of bitstreams: 1 2008_dis_wmbezerra.pdf: 488580 bytes, checksum: 8867bb56552a329eb81d971c78c66730 (MD5) / Approved for entry into archive by José Jairo Viana de Sousa (jairo@ufc.br) on 2016-08-02T20:26:50Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2008_dis_wmbezerra.pdf: 488580 bytes, checksum: 8867bb56552a329eb81d971c78c66730 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-08-02T20:26:50Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2008_dis_wmbezerra.pdf: 488580 bytes, checksum: 8867bb56552a329eb81d971c78c66730 (MD5) Previous issue date: 2008 / Chromobacterium violaceum is a free-living betaproteobacterium, which is found in the water and soil environments of tropical and subtropical regions. C. subtsugae, another species of the same genus, is toxic towards insects belonging to several orders. Among the genes that may be involved in the insecticidal activity displayed by these bacteria are those that encode chitinases. In addition to these chitinases, a protein containing YD repeats with potential insecticidal activity, encoded by the gene cv2776, was also identified in the genome of C. violaceum ATCC 12472. Similar proteins have also been found in the genomes of Xenorhabdus bovienii and Photorhabdus luminescens. The YD motif comprises 20 amino acids, with the consensus sequence Gx3-9YxYDx2GR(L, I or V)x3-10G, where x represents any amino acid. The protein TccC, from P. luminescens, has nine YD repeats in its sequence, as well as the protein SepC, from Serratia entomophila. SepC, along with two other toxins, SepA and SepB, are able to cause the "amber" disease in Costelytra zealandica (Coleoptera: Scarabaeidae). In the present work, the DNA coding seuquence of the gene cv2776 of C. violaceum ATCC 12472 was cloned in two different heterologous systems. In Escherichia coli, the coding sequence was expressed under control of the promoter araBAD, induced by L-arabinose. The protein rCV2776 was detected by imunoblotting in the insoluble fraction of induced E. coli cells. The rCV2776 present in the total insoluble cell fraction caused the death of Callosobruchus maculatus larvae, reducing the number of emerged adults in 78% and also decreasing the average weight of the insects. The E. coli cell fraction containing the recombinant protein also affected the vegetative growth of the phytopatogenic fungi Macrophomina phaseolina, Rhizoctonia solani and Sclerotium rolfsii. When the fraction containing rCV2776 was incorporated at 1.% (w/v) in the medium, the inhibition percentages of the mycelium growth were 38.5% (R. solani), 60.7% (M. phaseolina) and 71.1% (S. rolfsii). In the yeast Pichia pastoris, the coding sequence was expressed under the control of the promoter PAOX, which is induced by methanol as the sole carbon source. When expressed in P. pastoris, the recombinant protein was apparently degraded by endogenous proteases and could not be detected by SDS-PAGE or Western Blotting, even when 8 mg of protein was loaded into the gel. In conclusion, the recombinant protein CV2776 present in the insoluble fraction of induced E. coli cells was effective in controlling the emergence of the cowpea weevil, as well as slowing the growth of M. phaseolina and S. rolfsii / Chromobacterium violaceum é uma betaproteobactéria de vida livre encontrada em regiões tropicais e subtropicais. C. subtsugae, bactéria do mesmo gênero, possui atividade tóxica contra insetos de diversos gêneros. Entre os genes que podem estar envolvidos no potencial inseticida dessa bactéria, destacam-se aqueles que codificam quitinases. Em adição, identificou-se também no genoma de C. violaceum ATCC 12472 uma proteína contendo repetições YD com potencial atividade inseticida, codificada pelo gene cv2776, similar àquelas produzidas por Xenorhabdus bovienii e Photorhabdus luminescens. O motivo YD compreende 20 aminoácidos, com sequência consenso Gx3-9YxYDx2GR(L, I ou V)x3-10G (x representa qualquer aminoácido). A proteína TccC, de P. luminescens, possui 9 repetições YD, assim como a proteína SepC, de Serratia entomophila. SepC, juntamente com outras duas toxinas, SepA e SepB, são suficientes para causar a doença “âmbar” em Costelytra zealandica (Coleoptera: Scarabaeidae). No presente trabalho, a região codificadora do gene cv2776 de C. violaceum ATCC 12472 foi clonada em dois diferentes sistemas de expressão heteróloga. Em Escherichia coli, o gene foi expresso sob controle do promotor araBAD, induzido por L-arabinose. A proteína rCV2776 foi detectada por ensaio de imunoblotting na fração insolúvel das células de E. coli induzidas. A rCV2776 presente na fração insolúvel das células dessa bactéria teve efeito letal sobre larvas de Callosobruchus maculatus, diminuindo em até 78% o número de insetos adultos emergidos, além de diminuir o peso médio desses insetos. Além disso, a fração celular de E. coli contendo rCV2776 mostrou-se capaz de inibir o crescimento vegetativo de três fungos fitopatogênicos, Macrophomina phaseolina, Rhizoctonia solani e Sclerotium rolfsii. Quando incorporada no meio de cultura em uma concentração de 1% (m/v), essa fração causou percentuais de inibição de crescimento do micélio de 38.5% (R. solani), 60.7% (M. phaseolina) e 71.1% (S. rolfsii), respectivamente. Na levedura Pichia pastoris, a região codificadora foi expressa sob controle do promotor PAOX, que é induzido na presença de metanol como única fonte de carbono. Quando expressa em P. pastoris, a proteína recombinante foi aparentemente degradada por proteases endógenas, e não pôde ser detectada em análises de SDS-PAGE ou Western Bloting, mesmo quando foram aplicados 8,0 mg do sobrenadante concentrado e liofilizado no gel de eletroforese. Em conclusão, a proteína rCV2776 presente na fração insolúvel das células de E. coli induzidas foi efetiva em controlar a emergência do caruncho do feijão-de-corda, bem como em retardar o crescimento de M. phaseolina e S. rolfsii

Made available in DSpace on 2016-06-02T20:21:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 4058.pdf: 1157673 bytes, checksum: 2346bf567a5ddfbb9217c250df00ce8e (MD5) Previous issue date: 2011-09-09 / Universidade Federal de Sao Carlos / Saccharomyces cerevisiae is the most important microorganism used in alcoholic fermentation process. A strain of Saccharomyces cerevisiae widely used to produce alcohol in Brazil is the PE-2, due to its high fermentation capacity. The goal of this study was to develop an expression system for recombinant proteins using the industrial strain of Saccharomyces cerevisiae, PE-2. The protein chosen to be used as a model for this system was the Cane-CPI-1, an inhibitor of cysteine protease. Initially the construction of plasmids containing CaneCPI-1 gene was performed and yeast cells were transformed with pYADE4-CaneCPI-1 construction. The transformed strain was submitted to expression analyses during batch fermentative process with cell recycle. The recombinant protein was expressed in yeast cells and it was possible to purify the recombinant protein by affinity chromatography on nickel column. This purified protein was immunodetected using a polyclonal anti-CaneCPI-1antibody and monoclonal anti His-Tag antibody, which were also able to detect the CaneCPI-1 in a crude extract from Saccharomyces cerevisiae cells. Assays of inhibitory activity performed with the purified CaneCPI-1 revealed its ability to inhibit the catalytic activity of a cysteine proteinase. This study showed that the use of transformed strain did not affect the fermentation process and that the PE-2 industrial strain of S. cerevisiae can be a viable expression system for recombinant protein production and open perspectives for production of any protein of biotechnological applications during fermentation alcoholic process. / Saccharomyces cerevisiae é o microrganismo mais importante usado no processo de fermentação alcoólica. Uma linhagem de S. cerevisiae amplamente utilizado para produzir álcool no Brasil é a PE-2, devido à sua alta capacidade de fermentação e persistência no sistema. Neste trabalho utilizou-se esta linhagem industrial de levedura como um sistema de expressão de proteínas de interesse biotecnológico. A proteína escolhida como modelo para este sistema foi a CaneCPI-1, uma cistatina de cana-de-açúcar que possui ação inseticida. Inicialmente, foi realizada a construção de um plasmídeo contendo o gene que codifica para a proteína CaneCPI-1 e este foi utilizado para transformar células da levedura S.cerevisiae linhagem PE-2. Posteriormente foram realizados sucessivos ciclos de fermentação (5 ciclos) com esta levedura transformada e as células fermentadas foram submetidas a análises de expressão da proteína CaneCPI-1. Foi possível purificar a proteína recombinante por cromatografia de afinidade em coluna de níquel. Anticorpo policlonal anti-CaneCPI-1 e anticorpo monoclonal anti-His-Tag foram capazes de imunodetectar a proteína purificada e no extrato proteico bruto do último ciclo fermentativo. Ensaios da atividade inibitória mostraram que a CaneCPI-1 purificada foi capaz de inibir a atividade hidrolítica da papaína. A utilização da linhagem transformada não afetou a eficiência do processo fermentativo durante os quatro primeiros reciclos. A produção da CaneCPI-1 em uma linhagem industrial de S. cerevisiae ao longo do processo fermentativo se mostrou viável, abrindo-se novas perspectivas para a produção de qualquer proteína de aplicações biotecnológicas durante o processo de fermentação alcoólica.