Orientador: Marilia de Freitas Calmon / Coorientador: Paula Rahal / Banca: Carolina Colombelli Pacca / Banca: Sebastião Roberto Taboga / Resumo: O Papilomavirus humano (HPV) é um dos vírus mais prevalentes entre as infecções sexualmente transmissíveis e está associado com doenças malignas. Os HPVs de alto risco possuem proteínas, denominadas de E6 e E7, caracterizadas como oncoproteínas devido aos seus papéis na transformação celular e na inativação de supressores de tumor. Um dos mecanismos usados na transformação celular pela proteína E6 do HPV de alto risco é a interação do seu domínio carboxi-terminal, PDZ, com domínios PDZs presentes em algumas proteínas celulares, destinando-as à degradação. Uma proteína que está associada com várias condições patológicas e tem domínio PDZ é a protease HtrA1. Esta proteína é pouco expressa em alguns cânceres, sugerindo um papel supressor de tumor. O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito da superexpressão de HTRA1 em linhagem celular HPV16 positiva (HF698) e HPV negativa (C33). As linhagens celulares foram transfectadas com vetor contendo a ORF de HTRA1 ou vetor vazio. A superexpressão do mRNA e proteína foi confirmada por qPCR e imuno-histoquímica, respectivamente. As linhagens celulares transfectadas foram submetidas a ensaio de formação de colônia, de viabilidade celular, de apoptose e ciclo celular. As células C33 superexpressando HtrA1 formaram significantemente menos colônias e apresentaram redução de viabilidade celular comparadas as células sem expressão de HtrA1. Diferentemente, na linhagem HPV positiva ocorreu aumento no número de colônias nas células superexpressando HtrA1 e não houve diferença no ensaio de viabilidade celular. Esses resultados sugerem que os diferentes padrões observados nas duas linhagens celulares são decorrentes da presença do HPV na HF698 e da ausência na C33. A fim de confirmar se o aumento do número de colônias nas células HF698 superexpressando HtrA1 é decorrente da interação dessa proteína com E6, foi produzida linhagem estável de C33 com ... / Abstract: The Human Papillomavirus (HPV) is one of the most prevalent virus among sexually transmitted infections and it is associated with some malignancies. High risk HPVs contain proteins, E6 and E7, characterized by oncoproteins due to their roles in cellular transformation and suppressor tumor inactivation. One of the mechanisms used in cell transformation by E6 protein from high-risk HPVs is the interaction of its carboxy-terminal domain, known as PDZ, with PDZs domains present in some cellular proteins, triggering them to degradation. A protein that is associated with various pathological conditions and has PDZ domain is the protease HtrA1. This protein is poorly expressed in some cancers, suggesting its tumor suppressor role. The aim of this study was to evaluate the effect of the HtrA1 overexpression in HPV 16 positive (HF698) and HPV negative (C33) cell lines. The cell lines were transfected with vector containing the HTRA1 ORF or empty vector. The mRNA and protein overexpression were confirmed by qPCR and immunohistochemical, respectively. The cell lines transfected were subjected to cell proliferation, viability, apoptosis and cell cycle assays. C33 cells expressing HtrA1 presented significantly fewer colonies and showed reduced viability than cells without HtrA1 expression. On the other hand, in HPV-positive cell line there was an increase in the number of colonies in cells expressing HtrA1 and there was no difference in the cell viability assay. These results suggest that the different patterns observed between the two cell lines studied may be due to the HPV presence in HF698 and its absence in C33 cells. To confirm if the increase in the number of colonies in HPV positive cells (HF698) overexpressing HtrA1 arises from the interaction of this protein with E6, stable lines of C33 containing gene E6 were produced and subsequently performed cell proliferation assay. C33 cells overexpressing E6 and HTRA1 showed an increased number of ... / Mestre

Orientador: Fernanda da Cruz Landim / Resumo: As células-tronco mesenquimais (CTM) representam uma atrativa ferramentapara a medicina regenerativa, a engenharia de tecidos e a terapia celular. Naespécie bovina, as pesquisas sobre a caracterização de CTM ainda são raras,principalmente utilizando-se o tecido adiposo como fonte de obtenção. Com oobjetivo de isolar e caracterizar CTM derivadas do tecido adiposo de bovinos,foram utilizadas amostras de seis vacas e isoladas CTM por meio de digestãoenzimática e cultivo celular em monocamada. As células em primeira (P0) eterceira passagem (P3) foram, então, submetidas a caracterizaçãoimunofenotípica por citometria de fluxo. A diferenciação osteogênica eadipogênica foi avaliada microscopicamente após 10 dias de indução e porqPCR em tempo real após 3 e 15 dias de indução. Foram obtidas célulasfibroblastóides e aderentes ao plástico. Estas apresentaram, na citometria defluxo, marcação positiva para CD44 (86,6 % em P0 e 76,6 % em P2) e vimentina(82,48 % em P2), baixa marcação de CD34 (8,7 % em P0 e 1,8 % em P2) emarcação negativa para MHC II (2,1 % em P0 e 2,3 % em P2). Na avaliaçãomicroscópica, todas as amostras responderam positivamente às diferenciaçõesnas linhagens osteogênica e adipogênica, além de apresentarem expressão deosteopontina e colágeno tipo I e PPAR-γ, respectivamente, pelo qPCR em temporeal. Não foi observada a expressão de osteocalcina em nenhuma amostrasubmetida a indução osteogênica. Os resultados obtidos indicam o tecidoad... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Mestre

Este trabalho debate o significado da liberdade de expressão à luz da teoria política normativa e da instrumentalidade dessa liberdade para a política democrática. Como instrumento da democracia, a liberdade de palavra costuma ser justificada com base na sustentação de dois objetivos: primeiramente, o de promover um debate público robusto e diversificado; em segundo lugar, o de ser um veículo para a realização da igualdade política. Os defensores da perspectiva que aqui analisamos chamada de coletivista-- afirmam que a realização desses objetivos só é possível se a liberdade de expressão é institucionalizada 1)levando em conta não só os interesses expressivos dos indivíduos (seu direito de falar), mas também os interesses expressivos do demos (o interesse a ter acesso a um conjunto diversificado de discursos); e, 2) superando o entendimento da liberdade de expressão como liberdade que se garante exclussivamente contra o Estado. Ao abrir as portas para a discussão de problemas como o estabelecimento de mecanismos de acesso aos meios de comunicação de massa, o poder corrosivo do dinheiro sobre a deliberação pública e os efeitos de expressões de ódio sobre a igualdade política, a teoria coletivista sobre a liberdade de expressão dá ensejo a uma reflexão sobre os diversos significado da igualdade na arena pública. / This thesis debates the significance of freedom of speech as a problem of normative political theory and as an instrument of democratic politics. Under this light, free speech is commonly justified as a way toward two specific goals: promoting a strong and diversified public deliberation and promoting political equality among the citizens. The perspective we consider here --called collectivistsays that unless we are prepeared to consider free speech not only as a negative liberty, but as a positive one, and thet unless free speech is understood not only as as a right of individuals (interest in speaking), but also as right of the community (interest in hearing diverse points of view), its goals will not be achievable. Discussing themes like acces to the media, the corrosive moneys effects on public deliberation and the effects of hate speech on political equility, the collectivist theory reflects on the meanings equiality at the political forum.

Submitted by Amanda Bernardi (bernardi.amanda@hotmail.com) on 2017-10-30T21:40:31Z No. of bitstreams: 2 Dissertação Corrigida Final Amanda Bernardi.pdf: 1051801 bytes, checksum: a8e56cbf6fa2d891e063691b223de490 (MD5) Encaminhamento do orientador.pdf: 91985 bytes, checksum: 5e1d11f7875f290e15898e8d137029e6 (MD5) / Approved for entry into archive by Alini Demarchi (alini@cca.ufscar.br) on 2017-11-30T14:11:04Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação Corrigida Final Amanda Bernardi.pdf: 1051801 bytes, checksum: a8e56cbf6fa2d891e063691b223de490 (MD5) Encaminhamento do orientador.pdf: 91985 bytes, checksum: 5e1d11f7875f290e15898e8d137029e6 (MD5) / Approved for entry into archive by Alini Demarchi (ri.bar@ufscar.br) on 2018-01-15T18:12:18Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação Corrigida Final Amanda Bernardi.pdf: 1051801 bytes, checksum: a8e56cbf6fa2d891e063691b223de490 (MD5) Encaminhamento do orientador.pdf: 91985 bytes, checksum: 5e1d11f7875f290e15898e8d137029e6 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-01-17T17:49:05Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação Corrigida Final Amanda Bernardi.pdf: 1051801 bytes, checksum: a8e56cbf6fa2d891e063691b223de490 (MD5) Encaminhamento do orientador.pdf: 91985 bytes, checksum: 5e1d11f7875f290e15898e8d137029e6 (MD5) Previous issue date: 2017-08-31 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / The genus Citrus contains a wide variety of fruit-producing species such as oranges, lemons, limes and mandarins that are highly popular in the world. Brazil is one of the main citrus producers, currently leading the world production of oranges. The Brazilian citrus industry is extremely important because of it is great activity that generates jobs, thus contributing to the socioeconomic development of the country. However, the genetic background used in the Brazilian citriculture is still very narrow, with few varieties being cultivated commercially. This is a reflection of the fact that there is still a great difficulty in obtaining superior individuals through traditional breeding due to the limitations presented by the citrus crop. This makes it necessary to develop new technologies, especially those that exploit the already sequenced genomes. One of these technologies is the genome editing, where it is possible to make disruptions in specific points in the genome of a given organism, leading to mutations or substitutions of DNA fragments. Among the various techniques used for genome editing, CRISPR / CAS9 is the most promising because of its ease of use. With its first studies in 2013, there is an increasing number of papers showing CRISPR / CAS9 mediated genome editing in different organisms, including plants. At the present time, for citrus there are works of two groups in which this technology was used to generate mutant plants. Therefore, the application of this technology could be better exploited to take citrus studies in Brazil to another level, with prospects of generation of new varieties. Thus, this project had a central objective to optimize systems for generation of mutants via CRISPR / CAS9 in citrus. In order to explore the existing methodologies for genome editing in plants, constructs of vectors with targets in genes of interest for the study of disease resistance were made using vectors available in the literature. From this initial work, it was possible to propose two improvements for optimization of the process: the use of transient transformation to identify mutations and consequent efficiency of the CRISPR vector and the construction of a new vector for plant genome editing. We were able to evaluate some parameters and to optimize the methodology of transient transformation in sweet orange, resulting in an average of up to 93% of transformed leaf discs. It was also possible to conclude the construction of a new vector for plant genome editing that has the advantages of having reduced size, easy customization in the vector itself and resistance to kanamycin in plants and bacteria. The advances obtained in this work can be applied in studies of several areas not only of citrus, but also of other cultures. / O gênero Citrus abrange uma grande diversidade de espécies produtoras de frutas como laranjas, limões, limas e tangerinas que são altamente populares no mundo. O Brasil é um dos principais produtores de citros, liderando a produção mundial de laranjas. A citricultura brasileira é de extrema importância pois é uma grande atividade geradora de emprego, contribuindo assim para o desenvolvimento socioeconômico do país. Entretanto, a base genética utilizada na citricultura brasileira é ainda muito estreita, com poucas variedades sendo cultivadas comercialmente. Isto é reflexo de ainda existir uma grande dificuldade na obtenção de indivíduos superiores através do melhoramento tradicional, pelas limitações apresentadas pela cultura dos citros. Isto faz com que seja necessário o desenvolvimento de novas tecnologias, principalmente aquelas que exploram os genomas já sequenciados. Uma destas tecnologias é a edição de genomas, onde se realiza disrupções em pontos específicos do genoma de um determinado organismo, levando a mutações ou substituições de fragmentos de DNA. Dentre as várias técnicas utilizadas para edição de genomas, CRISPR/CAS9 é a que tem se mostrado a mais promissora, pela facilidade de utilização. Com início de aplicação em 2013, há um número crescente de trabalhos mostrando edição de genoma mediada por CRISPR/CAS9 em diferentes organismos, incluindo plantas. Até o presente momento, para citros existem trabalhos de dois grupos nos quais esta tecnologia foi utilizada para gerar plantas mutantes. Portanto, a aplicação desta tecnologia poderia ser melhor explorada para levar estudos de citros no Brasil a um outro patamar, com perspectivas de geração de novas variedades. Assim, este projeto teve como objetivo central otimizar sistemas para geração de mutantes via CRISPR/CAS9 em citros. Afim de explorar as metodologias existentes para edição de genoma em plantas, foram feitas construções de vetores com alvos em genes de interesse para o estudo de resistência de doenças utilizando-se vetores disponíveis na literatura. A partir deste trabalho inicial, foi possível propor duas melhorias para otimização do processo: o uso de transformação transiente para identificação de mutações e consequente eficiência do vetor CRISPR, e a construção de um novo vetor para edição de genomas de plantas. Fomos capazes de avaliar alguns parâmetros e otimizar a metodologia de transformação transiente em laranja doce, resultando em uma média de até 93% de discos foliares transformados. Também foi possível finalizar a construção de um novo vetor para edição de genomas de plantas que possui as vantagens de ter tamanho reduzido, fácil customização no próprio vetor e resistência a canamicina em plantas e bactérias. Os avanços obtidos nesse trabalho poderão ser aplicados em estudos de diversas áreas não só de citros, mas também de outras culturas.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:23:00Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2012-03-01Bitstream added on 2014-06-13T20:49:46Z : No. of bitstreams: 1 bovolenta_la_me_botib.pdf: 1243263 bytes, checksum: ae0c358db6c21782ceadf7284345fd8a (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fatores de transcrição são proteínas que interagem com sequências nucleotídicas específicas situadas nas regiões promotoras de genes e, através dessa interação, regulam a transcrição dos genes. Devido a essa função reguladora, a identificação e a caracterização da rede de interações entre fatores de transcrição e seus genes alvos são importantes por que essa rede representa o arcabouço molecular através do qual os estímulos ambientais são convertidos em expressão diferencial dos genes. Como essa expressão diferencial, por sua vez, determina o comportamento da célula em resposta a um certo estímulo, a rede de interações de regulação transcricional pode, portanto, fornecer uma compreensão sistêmica de como os comportamentos celulares emergem a partir dos estímulos ambientais. A primeira etapa para a construção de uma rede de regulação transcricional consiste na coleta de dados relacionados às interações entre os fatores de transcrição e seus genes alvos. Porém, como esses dados são encontrados de forma dispersa na literatura ou em bancos de dados pagos, essa etapa demanda muito tempo. Com o objetivo de centralizar esses dados de forma a facilitar sua coleta e, consequentemente, a construção da rede de interações de regulação transcricional, desenvolvemos um banco de dados relacional chamado Human Transcriptional Regulation Interaction Database (HTRIdb). Desenvolvido em PostgreSQL e Java, o HTRIdb contém uma coleção de milhares de interações de regulação transcricional experimentalmente verificadas em seres humanos que podem ser acessadas e obtidas gratuitamente por toda a comunidade científica. Além do acesso gratuito e livre permissão para a obtenção dos dados, o HTRIdb oferece... / Transcription factors are proteins that interact with specific nucleotide sequences located in promoter regions of genes and, through this interaction, regulate gene transcription. Due of this regulatory function, the identification and characterization of the network of interactions between transcription factors and their target genes are important since this network represents the molecular framework that explains how environmental stimuli are converted into differential expression of genes. This network provides a systemic understanding of how cellular behaviors emerge from the environmental stimuli. The first step for the transcriptional regulatory network construction is the collection of data about interactions between transcription factors and their target genes. This step is very time-consuming as these data are found dispersed on the literature or in commercial databases. In an effort to provide researchers with a repository of transcriptional regulatory interactions from which such interactions can be directly and easily extracted, we developed a relational database called the Human Interaction Database Transcriptional Regulation (HTRIdb). HTRIdb was implemented using PostgreSQL and Java and contains a collection of thousands of experimentally verified human transcriptional regulation interactions. HTRIdb can be freely accessed by the scientific community and offers a visualization tool for the regulatory network and provides a communication interface between users and developers to enhance... (Complete abstract click electronic access below)

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:23:06Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2007-01-30Bitstream added on 2014-06-13T18:09:18Z : No. of bitstreams: 1 avaca_js_me_araiq.pdf: 1586941 bytes, checksum: 07a6c5702a63cebb17218e18a8aa2449 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Neste trabalho foi realizado o isolamento do cDNA e do gene que codifica a proteína semelhante à Pho85p de Saccharomyces cerevisiae, em Neurospora crassa. Um fragmento de 1,1 kb correspondendo à seqüência nucleotídica do gene em N. crassa foi amplificado e confirmado por sequenciamento, o qual foi utilizado no rastreamento de uma biblioteca de cDNA de N. crassa, resultando em um plasmídeo contendo a ORF que codifica a Ncpho85 e as seqüências upstream e downstream à ORF. Este inserto foi seqüenciado, a ORF isolada apresentou 1014 bp, a região upstream contém 304 bp e a downstream 561 nucleotídeos. Após sequenciamento do cDNA, a seqüência polipeptídica da proteína foi comparada com outras proteínas semelhantes à Pho85p de fungos miceliares, leveduriformes além de S. cerevisiae. Esta ORF isolada foi utilizada no rastreamento de uma biblioteca genômica de N. crassa, possibilitando o isolamento de um plasmídeo contendo a seqüência genômica, o qual foi submetido a sequenciamento. No inserto foi possível confirmar a presença do intron (de 89 bp) no nucleotídeo 69, confirmando os dados existentes no banco de dados de N. crassa. A expressão do gene foi analisada ao longo do crescimento do fungo, em diferentes meios de cultivo, através de experimentos de Northern blot. A presença de duas bandas de hibridização, uma de 2,2 kb e uma 2,7 kb foi observada em todos os experimentos realizados. Um pico de expressão dos dois transcritos ocorreu no tempo de 12 horas, sendo mais evidente para o transcrito de menor tamanho, o qual seria o transcrito do cDNA isolado anteriormente. Resultados preliminares da expressão da proteína ao longo do crescimento do fungo foram obtidos por Western blot. Apenas uma banda da proteína foi observada, a qual apresentou o tamanho aproximado de 40 kDa, próximo ao tamanho da proteína NcPHO85, deduzida a partir da seqüência do cDNA. / In this study we performed the isolation of the cDNA and the gene that codes for the Pho85p-like protein from Saccharomyces cerevisiae in Neurospora crassa. A fragment of 1.1 kb corresponding to the nucleotide sequence of the gene from N. crassa was amplified by PCR and confirmed by DNA sequencing. This fragment was used to screen a N. crassa cDNA library resulting in a plasmid containing the ORF plus and the upstream and downstream regions. The insert from the plasmid was sequenced and the ORF showed to have 1014 bp, whereas the upstream and downstream regions had 304 bp and 561 bp, respectively. After sequencing the cDNA, the polypeptide sequence was compared to the same protein from mycelial fungi and yeasts. The isolated ORF was used to screen a N. crassa genomic library leading to the isolation of a plasmid containing the genomic sequence. After DNA sequencing the insert showed the presence of an intron (89 bp) starting at nucleotide 69. This result was in agreement with the information from the N. crassa database. Gene expression analysis during the vegetative growth in different media was performed by Northern blot. Two hybridization bands were observed in the experiments, one of 2.2 kb and another one of 2.7 kb. The maximum expression of both transcripts happened at 12 h of growth, this was more pronounced for the smaller transcript, which probably is the transcript of the isolated cDNA. Preliminary results of protein expression during vegetative growth were obtained by Western blot analysis. Only one band with approximately 40 kDa was observed, the expected size for the NcPHO85 protein sequence deduced from the cDNA sequence. In order to evaluate the role of this protein in glycogen metabolism and in other cellular functions in N. crassa we started the gene inactivation.

Submitted by Amauri Alves (amauri.alves@ufv.br) on 2015-10-16T15:05:51Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 939004 bytes, checksum: 91690f8ed614b34a151ed34ced32bb7e (MD5) / Made available in DSpace on 2015-10-16T15:05:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 939004 bytes, checksum: 91690f8ed614b34a151ed34ced32bb7e (MD5) Previous issue date: 2011-03-29 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais / O presente trabalho teve por objetivo estudar as respostas fisiológicas e morfológicas de células de Lactobacillus delbrueckii UFV H2b20 aos estresses ácido e por sais biliares, alem de identificar e realizar análises filogenética e de expressão de genes possivelmente relacionados a esses estresses. Lactobacillus delbrueckii UFV H2b20 não cresce em caldo MRS pH 3,5 entretanto, células mantidas neste meio por quatro horas toleram o estresse ácido, como demonstrado por curvas de sobrevivência. A maior tolerância da bactéria aos sais biliares mistos e a menor ao ácido glicodeoxicólico são características de L. delbrueckii UFV H2b20 submetida a estes estresses, em estudo in vitro. A análise da morfologia das células por Microscopia de Força Atômica (MFA) mostrou que os estresses ácido e por sais biliares provocaram alterações na morfologia da célula - a superficie da parede se apresentou rugosa com acentuada redução na dimensão correspondente à altura, em todas as condições de estresse testadas. Em conjunto, os resultados demonstram caracteristicas de respostas fisiológicas de L. delbrueckii UFV H2b20 aos estresses ácido e por sais biliares desejáveis e necessárias em bactéria probiótica, ou seja, resistir e sobreviver em condições similares às prevalecentes no trato gastrointestinal (TGI) de humanos. Os genes clpP, clpE, clpL e cle de L. delbrueckii UFV H2b20, cujos produtos pertencem ao complexo proteolítico Clp apresentaram alta identidade de sequência, variando de 96 a 97 % com as de Lactobacillus delbreuckii subsp. bulgaricus ATCC 11842. As árvores filogenéticas reconstruídas por Inferência Bayesiana mostraram os genes clpP, clpL e clpE agrupados com os de L. delbreuckii subsp. bulgaricus ATCC 11842. As exposições das células aos meios MRS pH 3,5, MRS contendo O,l % de sais biliares mistos e a MRS contendo O,l % de ácido glicodeoxicólico por 30 e 60 minutos aumentaram a expressão dos quatro genes, enquanto a exposição a ácido taurodeoxicólico aumentou apenas a do gene clpL. Considerando o envolvimento dos genes clpP, clpL, clpE e cle nas respostas aos estresses ácido e por sais biliares infere-se que a atividade do complexo proteolítico Clp pode representar mecanismo de reparo e/ou degradação de proteínas danificadas pelas condições de estresse analisadas neste estudo. Os genes codificadores de ornitina descarboxilase e de permease de aminoácido identificados em L. delbrueckii UFV H2b20 agruparam na reconstrução filogenética com os de L. delbreuckii subsp. bulgaricus ATCC 11842, sendo de 96 a 98 % a identidade das sequências. O aumento da expressão do gene que codifica a ornitina descarboxilase após a exposição das células por 30 e 60 minutos em MRS pH 3,5, meio rico, mostra o envolvimento deste gene na resposta ao estresse ácidoem L. delbrueckii UFV H2b20 e evidencia que a proteína codificada por esse gene é a envolvida na regulação do pH intracelular. Sugere- se a descarboxilação de aminoácidos como mecanismo de adaptação à condição de acidez do meio. Com o estudo da expressão dos genes spx, dps e pax, todos envolvidos no estresse oxidativo em L. delbrueckii H2b20, caracterizou-se base molecular envolvida no fenômeno de proteção cruzada in vitro ao constatar-se a sobreposição e a inespecificidade de genes aos estresses investigados. Particularmente, o aumento da expressão do gene dps após exposição das células aos meios MRS pH 3,5 e MRS contendo 0,1 % de ácido glicodeoxicólico foi interpretado como mecanismo de proteção do DNA a acidez interna das células. No presente estudo, bases fisiológicas e moleculares que possibilitam a probiose por L. delbrueckii UFV H2b20 ficam esclarecidas no que tange à existência de mecanismos para sobrevivência e persistência em condições presentes no TGI de humanos. / The objective of this work was to study the physiological and morphological responses of Lactobacillus delbrueckiz' UFV H2b20 to acid and bile salts stress and to identify and accomplish phylogenetic and expression analysis of genes related to these stress. Lactobacz'llus delbrueckiz' UFV H2b20 does not grown MRS broth pH 3.5, however, cells treated in this medium for four hours tolerate acid stress, as demonstrated bysurvivalcurves. This bacterium is more tolerant to mixed bile salts and less tolerant to glycodeoxycolic. Analysis of cell morphology by atomic force microscopy (AFM) showed that acid stress and bile salts caused changes in cell morphology - the wall surface became rough and reducted in height, in all stress conditions tested. The results demonstrate that L. delbrueckz'z' UFV H2b20 may resist similar conditions prevailing in the gastrointestinal tract of humans. The genes clpP, clpE, clpL and cle of L. delbrueckz'z' UFV H2b20, whose products belong to the Clpproteolytic complex showed high sequence identity, ranging from 96 to 97% with those of Lactobacillus delbreuckiz' subsp.bulgaricus ATCC 11842. Phylogenetic treesreconstructedbyBayesian inferenceshowedthegenes clpP, clpE and clpL grouped with the genes of L.delbrueckii subsp. bulgaricus ATCC 11842. The expression increase of the clpP, clpE, clpL and clegenesin L. delbrueckz'z' UFV H2b20 in response to acid and bile salts stress was observed after 30 and 60 minutes. The exposure of cells to MRS pH 3,5, MRS containing 0,1 % mixed mixed bile salts and MRS containing 0,1 % glycodeoxycolic acid for 30 and 60 minutes increased the expression of four genes, while exposure to taurodexycolic acid increased the expression of clpL alone. The involvement of clpP, clpE, clpL and cle in the responses to acid stress and bile salts showed that the activity of the Clp proteolytic complex may represent the mechanism of repair and/or degradation of proteins damaged by the stress conditions analyzed in this study. The genes encoding ornithine decarboxylase and amino acid permease identified in L. delbrueckz'z' UFV H2b20 grouped in phylogenetic reconstruction with those of L. delbreuckiz' subsp. bulgarz'cus ATCC 11842, with 96 to 98% identity of sequences. The expression of the gene encoding omithine decarboxylase increased after exposing the cells for 30 and 60 minutes in MRS pH 3.5, a rich medium, an evidence of the involvement of this gene in acid stress response in L. delbrueckiz' UFV H2b20 and also that the protein encoded by this gene is involved in the regulation of intracellular pH. It is suggested that the decarboxylation of amino acids as a mechanism for adaptation to acid stress. The molecular basis of the cross protection phenomenon was characterized by the expression of pr, dps and pox, all involved in oxidative stress response. There are overlaps and inespecifity in the expression of those genes to stress investigated. The increased in dps expression following exposure to pH 3.5 to 0,1 % glycodexycolic acid was interpreted as a DNA protective mechanism to low internal cell acidity. In this study, physiological and molecular basis that enable probiose in L. delbrueckz'z' UFV H2b20 are clarified with regard to the existence of mechanisms for survival and persistence under conditions present in the human gut.

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2015-11-03T13:28:34Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 2083437 bytes, checksum: 8f479543c8dc090087a91955c71d8ba0 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-11-03T13:28:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 2083437 bytes, checksum: 8f479543c8dc090087a91955c71d8ba0 (MD5) Previous issue date: 2014-02-10 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Os parasitos do gênero Leishmania, que causam um amplo espectro de desordens clínicas referidas comumente como leishmanioses, são um grande problema de saúde pública em vários países. A leishmaniose tegumentar americana está entre as endemias de maior importância em saúde pública no Brasil, devido a fatores como: ampla distribuição pelo território nacional, ocorrência de formas clínicas graves e limitações referentes tanto ao diagnóstico como ao tratamento, sendo a L. (V.) braziliensis uma das principais espécies de importância epidemiológica para a LTA no Brasil. Atualmente existem diversas tecnologias que permitem o sequenciamento do DNA em larga escala, sendo a plataforma 454/Roche utilizada neste trabalho. Assim, este trabalho utilizou ferramentas de bioinformática para montar e analisar o transcriptoma de L. (V.) braziliensis através do sequenciamento do transcriptoma de dois isolados (ET e NSL), que apresentam diferença significativa na virulência em modelo murino. Foram preparadas duas formas evolutivas para cada isolado: metacíclica (MET) e procíclica (PRO). Desta forma foram analisadas quatro bibliotecas. Após sequenciamento, os dados foram visualizados com o programa fastQC, tratados com FASTX- Tollkit e Prinseq-Lite e montados com programa Newbler. A montagem (Assembly) foi efetuada de duas maneiras distintas: primeiro efetuou-se a montagem com as reads de cada biblioteca e posteriormente, as reads das quatro bibliotecas foram alocados em arquivo único para realização de um novo assembly. As open reading frame (ORFs), que são regiões com potencial para codificar proteínas, foram preditas utilizando as sequências resultantes da montagem. A anotação foi efetuada através de duas abordagens: transferência de informações do genoma anotado automaticamente para as ORFs preditas e pela abordagem baseada em homologia de sequências através da ferramenta de anotação funcional Blast2GO. Após anotação, efetuou-se a análise da expressão gênica diferencial através de duas abordagens diferentes: a primeira, utilizou o método de Blind do pacote DESeq do R/Bioconductor e a segunda utilizou uma abordagem baseada em RPKM. Foram produzidas 3.095.724 reads, sendo 916.546, 589.554, 1.083.312 e 506.312 sequências para ET-MET (biblioteca 1), ET- PRO (biblioteca 2), NSL-MET (biblioteca 3) e NSL-PRO (biblioteca 4), respectivamente. Após o tratamento, utilizou-se para o restante das análises 2.899.230 sequências. Com o intuito de validar algumas das análises, foi utilizado neste trabalho um segundo conjunto de reads (Illumina) baixado do banco de dados SRA (Sequence Read Archive) indexado ao NCBI, sendo este composto por 52.014.768 de reads paired end. Após o tratamento, utilizou- se para o restante das análises 47.377.233 de reads. Os resultados das análises com as reads sequenciadas neste trabalho e com os contigs montados, tal como o mapeamento destes no genoma anotado de L. (V.) braziliensis, produziu novas informações ao orfeoma anotado automaticamente de L. (V.) braziliensis. Após montagem, obteve-se 14.362, 13.145, 14.899 e 11.434 contigs maiores que 100 pb para as bibliotecas 1, 2, 3 e 4, respectivamente. Obteve-se como resultado da montagem, considerando as reads de todas as bibliotecas, 14.017 contigs. As ORFs preditas à partir dos contigs que não mapearam no genoma anotado foram utilizados para busca de novos genes de L. (V.) braziliensis. Como resultado, foi possível encontrar seis novos genes, 117 possíveis ORFs sem hits no banco de dados nr e 85 ORFs que, por algum motivo, deixaram de fazer parte do genoma anotado. Foram encontrados, ao se comparar as reads obtidas neste trabalho com o genoma anotado, 6.293 sítios com identidades diferentes, que pode ser devido a divergência alélica entre os isolados analisados ou devido ao polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs). / Parasites of the genus Leishmania, which cause a broad spectrum of clinical disorders referred to commonly as leishmaniasis, are a major public health problem in many countries. American cutaneous leishmaniasis is among the endemic most important in public health in Brazil, due to factors such as: wide distribution throughout the country, the occurrence of severe clinical forms and limitations relating to both diagnosis and treatment, with L. (V.) braziliensis being one of the main species of epidemiological significance to the LTA in Brazil. Currently there are several technologies that allow the DNA sequencing in large scale, being the 454/Roche platform used in this work. Thus, this study used bioinformatics tools for assembly and analyze the transcriptome of L. (V.) braziliensis through transcriptome sequencing of two isolates (ET and NSL), which present significant difference in virulence in murine model. Were prepared two evolutionary forms for each isolate: metacyclic (MET) and procyclical (PRO). Thus, four libraries were analyzed. After sequencing, the data were visualized with fastQC program, treated with FASTX-Tollkit and Prinseq-Lite and assembly with Newbler v.2.5.3 program. The assembly was conducted of two distinct ways: first performed the assembly whit the reads from each sample and then, the reads of the four samples were placed in single file to perform a new assembly. The open reading frame (ORF), which are regions with potential to encode a protein were predicted using the resulting assembly. The annotation was carried out using two approaches: transfer of information of automatically annotated genomic to predicted ORFs and by approach based on sequence homology by functional annotation tool Blast2GO. After annotation, performed the analysis of differential gene expression by two different approaches: first, was used the Blind method of DESeq package the R/Bioconductor and the second was used an approach based on RPKM. 3.095.724 reads were produced, with 916.546, 589.554, 1.083.312 and 506.312 sequences for ET-MET (sample 1), ET-PRO (sample 2), NSL-MET (sample 3) and NSL- PRO (sample 4), respectively. After treatment, was used for the remaining analysis 2.899.230 sequence. In order to validate some of the analysis, was used in this study, a second set of reads (Illumina) downloaded from the database SRA (Archive Sequence Read) indexed to NCBI, this being composed of 52.014.768 of reads paired end. After treatment, was used for the remainder analysis 47.377.233 of reads. The results of the analysis with the reads sequenced this work and with the assembly contigs, such as mapping of these in annotated genome the L. (V.) braziliensis, produced new information to automatically annotated orfeoma of L. (V.) braziliensis. After assembly, we obtained 14.362, 13.145, 14.899 and 11.434 contigs larger than 100 bp for samples 1, 2, 3 and 4, respectively. It was obtained as a result of assembly, considering the reads from all samples, 14.017 contigs. The ORFs predicted from contigs not mapped the annotated genome were used to search for new genes of L. (V.) braziliensis. So, were found six new genes, 117 ORFs possible without hits in the nr database and 85 ORFs that, for some reason, no longer in the annotated genome. Were found, when comparing the reads obtained in this work with the annotated genome, 6.293 sites with different identities, which may be due to the allelic divergence between the isolates analyzed or due to single nucleotide polymorphisms (SNPs).

Made available in DSpace on 2016-06-07T17:12:21Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2015-08-25. Added 1 bitstream(s) on 2016-06-07T17:17:00Z : No. of bitstreams: 1 000864285.pdf: 2759439 bytes, checksum: 7135a8f61ee29b84b93a0f8f1e4fb0b9 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Linfoma de Hodgkin clássico (LHc) é uma neoplasia maligna que apresenta um padrão aberrante de expressão de citocinas, incluindo IL-10 e TNF-a. Polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) nos genes codificadores de IL-10 e TNF-a ou de suas proteínas regulatórias, como NFkB, podem interferir na patobiologia do LHc. No presente estudo, SNPs nas regiões promotoras dos genes de IL-10 (SNP/pIL-10 -592, rs1800872; e SNP/pIL-10 -1082, rs1800896) e TNF-a (SNP/pTNF-a -238, rs361525; e SNP/pTNF-a -862, rs1800630), assim como na região intrônica do gene NFkB1 (SNP/iNFkB1, rs1585215) foram genotipados em 73 pacientes com LHc e avaliados em relação à sua associação com parâmetros prognósticos clínicos e laboratoriais da doença. SNPs/pIL-10 AA foram significativamente associados a maiores contagens de leucócitos e menores valores de linfócitos ao diagnóstico. No caso de TNF-a, SNP/pTNF-a -238 AG foi associado à presença de infecção pelo EBV enquanto SNP/pTNF-a -862 CC apresentou-se mais frequentemente com leucocitose. SNP/iNFkB1 AA associaramse à doença em estádio IV e padrão extranodal de apresentação. Entretanto, nenhum dos SNPs avaliados teve efeito no desfecho do tratamento. Esse estudo mostrou que alguns genótipos de SNPs nos genes de IL-10 e TNF-a estão associados a parâmetros prognósticos no LHc. Adicionalmente, pela primeira vez foram descritas associações entre SNP/iNFkB1 (rs1585215) e aspectos clínicos da doença / Classic Hodgkin lymphoma (cHL) is a malignant lymphoid neoplasia that shows aberrant expression of cytokines, including IL-10 and TNF-a. Single nucleotide polymorphisms (SNPs) in genes encoding IL-10 and TNF-a or their regulatory proteins, such as NFkB, may impact cHL pathobiology. In this study, SNPs in the promoter regions of genes encoding for IL-10 (SNP/pIL-10 -592, rs1800872; and SNP/pIL-10 -1082, rs1800896), and TNF-a (SNP/pTNF-a -238, rs361525; and SNP/pTNF-a -862, rs1800630), as well as in the intronic region of the NFkB1 gene (SNP/iNFkB1, rs1585215) were genotyped in 73 patients with cHL and evaluated against clinical and laboratory prognostic parameters for the disease. SNPs/pIL-10 AA were significantly associated with higher leukocyte and lower lymphocyte counts at diagnosis. In case of TNF-a, SNP/pTNF-a -238 AG was associated with EBV infection while SNP/pTNF-a -862 CC presented more frequently with leukocytosis. SNP/iNFkB1AA generally had stage IV and extranodal disease at diagnosis. Nonetheless, none of the studied SNPs had effect on on treatment outcome. This study shows that some SNPs genotypes for IL-10 and TNF-a genes are associated with prognostic parameters in cHL; furthermore, this is the first time that the SNP/iNFkB1 (rs1585215) was implicated in clinical features of the disease

Made available in DSpace on 2016-09-27T13:39:58Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-03-17. Added 1 bitstream(s) on 2016-09-27T13:45:06Z : No. of bitstreams: 1 000864722.pdf: 2629115 bytes, checksum: 66c11f771d4567d46705749086273afb (MD5) / Os procedimentos durante a sexagem pelo citômetro de fluxo garantem a acuidade de 85%, mas causam danos na viabilidade espermática que levam a baixa taxa de prenhez após os 90 dias. Os objetivos dessa Dissertação foram: 1) caracterizar a expressão gênica diferencial em transcriptoma de espermatozoides congelados pelo método convencional, sexados por centrifugação em gradiente de densidade ou sexados por citometria de fluxo; 2) comparar as taxas de clivagem e de blastocistos produzidos in vitro de bovinos utilizando sêmen convencional, sexado por citometria de fluxo ou por centrifugação em gradiente de densidade. Os grupos experimentais para sêmen e embriões foram: 1) grupo controle: sêmen convencional submetido ao gradiente de PercollTM 45/90% e respectivos embriões produzidos com esse sêmen; 2) grupo gradiente: centrifugação em gradiente de densidade e respectivos embriões produzidos com esse sêmen; 3) grupo citometria: sêmen sexado pelo citometro de fluxo, submetido ao mini gradiente de PercollTM 45/90% e respectivos embriões produzidos com esse sêmen. O RNA total foi extraído dos espermatozoides (20 x 10 6 células) obtendo-se 400 ng RNA/ 20 x 10 6 células/ animal, ou seja, 20 fg RNA por espermatozoide. Entretanto, não foi posível a construção da biblioteca de cDNA, provavelmente, devido ao alto grau de degradação do RNA. Os Complexos cumulus oócito (COCs) classificados como graus 1, foram aspirados de folículos antrais de 3 a 8 mm de diâmetro a partir de ovários de abatedouros e maturados durante 18 horas em estufa a 38,5°C, 100% de umidade e atmosfera de 5% de CO2 em ar. Os oócitos maturados serão colocados em contato com os espermatozoides previamente preparados para fecundação e incubados por 20 horas em 5% de CO2, na temperatura de 38,5°C. Os prováveis zigotos serão lavados por três vezes em meio SOF (meio sintético de fluido de oviduto) sem SFB e sem glicose e cultivados e transferidos... / The procedures for sexing by flow cytometry guarantee the accuracy of 85%, but cause damage in sperm viability leading to lower pregnancy rate after 90 days of pregnancy. The objectives of this study were: 1) to characterize differential gene expression in transcriptome of spermatozoa frozen by conventional method, sexed by density gradient centrifugation, by flow cytometry. 2) Compare blastocyst and cleavageratesproduced in vitro by conventional semen sexed by flow cytometry and by density gradient centrifugation. The experimental groups for semen and embryos were: 1) control group: conventional semen subjected to PercollTM gradient of 45/90% and their embryos produced with this semen, 2) gradientgroup: centrifugation in density gradient and their embryos produced with this semen, 3) cytometry group: semen sexed by flow cytometer, subjected to PercollTMmini gradient 45/90% and their embryos produced with this semen. Total RNA was extracted from sperm (20 x 10 6 cells) and it was possible to extract 400 ngRNA/ 20x10 6 cells/animal or it means, 20 fg of RNA per spermatozoa. However cDNA libraries were not built, probably due a high RNA degradation. The cumulus oocyte complexes (COCs) were classified as grade 1, aspirated from antral follicles with 3-8 mm in diameter, ovariesfromslaughterhouse were used and matured for 18 hours in an incubator at 38.5°C, 100% humidity and atmosphere of 5% of CO2 in air. The matured oocytes are going to be placed in contact with the prepared spermatozoa for fertilization and incubated for 20 hours in 5% CO2 at a temperature of 38.5 °C. Presumptive zygotes are going to be washed three times in SOF (half synthetic oviduct fluid) without FBS and without glucose, cultivated and transferred to plates with four wells containing 500 ul of the same medium used for washing zygotes after fertilization. Embryonic development was evaluated 7-8 days after fertilization. The cleavage and blastocysts rates were ...