Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Botânica, Programa de Pós-Graduação em Botânica, 2017. / Submitted by Raquel Almeida (raquel.df13@gmail.com) on 2017-11-01T19:27:34Z No. of bitstreams: 1 2017_RenataCristinaCostaeSilva.pdf: 5493345 bytes, checksum: 8114a537dcfa7dc91ad7294757e02a4a (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana (raquelviana@bce.unb.br) on 2017-12-01T19:21:45Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2017_RenataCristinaCostaeSilva.pdf: 5493345 bytes, checksum: 8114a537dcfa7dc91ad7294757e02a4a (MD5) / Made available in DSpace on 2017-12-01T19:21:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2017_RenataCristinaCostaeSilva.pdf: 5493345 bytes, checksum: 8114a537dcfa7dc91ad7294757e02a4a (MD5) Previous issue date: 2017-12-01 / A toxicidade do alumínio (Al) é, atualmente, um dos principais fatores responsáveis por perdas na produção agrícola. Em plantas do Cerrado, devido ao alto teor de Al e acidez do solo, vários mecanismos são acionados para lidar com esse metal. Investigar os efeitos do Al no metabolismo vegetal, principalmente em nível de regulação gênica e produtos dos genes envolvidos, é essencial para se entender os processos fisiológicos associados a esse metal, e abrir a possibilidade de identificar genes que poderão resultar em novos produtos biotecnológicos visando a obtenção de cultivares mais resistentes às condições edáficas do Cerrado. É importante destacar que muitas espécies do Cerrado não só acumulam Al, mas o requerem para seu crescimento e desenvolvimento. Uma dessas plantas é Qualeagrandiflora, uma das oito espécies mais importantes na composição florística do Cerrado que acumula entre 3 e 5 g de Al.kg-1 em matéria seca. Estudos proteômicos em folhas dessa espécie mostraram que várias proteínas são diferencialmente expressas em resposta à presença ou ausência de Al. No presente estudo, foram avaliados os mecanismos moleculares, via análise transcritômica de folhas, e os fluxos metabólicos, via análise cromatográfica gasosa de raízes e folhas, buscando elucidar os mecanismos envolvidos no metabolismo do Al em Q. grandiflora. Os resultados aqui descritos serão utilizados para estudos de caracterização gênica, fundamentais para entender melhor a função fisiológica do Al em plantas acumuladoras. / The toxicity of aluminum (Al) is currently one of the main factors responsible for losses in agricultural production. In Cerrado plants, several metabolic mechanisms are triggered to deal Al due to the high metal content and acid soils. Investigating the effects of Al on plant metabolism, especially at the level of gene regulation and products of the genes involved, is essential to understand the physiological processes associated with this metal, and to open the possibility of identifying genes that may result in new biotechnological products aimed at cultivars that are more resistant to soil conditions in the Cerrado. It is important to note that many Cerrado species not only accumulate Al but require it for their growth and development. One of these plants is Qualea grandiflora, one of the eight most important species in the Cerrado floristic composition that accumulates between 3 and 5 g of Al.kg-1 in dry matter. Leaves proteomic studies of this species have shown several proteins differentially expressed in response to the presence or absence of Al. In the present study, the molecular mechanisms, via transcriptic analysis of leaves, and metabolic fluxes through gas chromatographic analysis of roots and shoots, seeking to elucidate the mechanisms involved in metabolism of Al in Q. grandiflora were performed. The results described here will be used for gene characterization studies, fundamental to better understand the physiological function of Al in accumulating plants.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Departamento de Biologia Celular, Instituto de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2017. / Submitted by Gabriela Lima (gabrieladaduch@gmail.com) on 2017-11-28T14:00:16Z No. of bitstreams: 1 2017_BrendaRabellodeCamargo.pdf: 4900807 bytes, checksum: c27bb67d00e82428ce979800193440bd (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana (raquelviana@bce.unb.br) on 2018-01-22T20:36:24Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2017_BrendaRabellodeCamargo.pdf: 4900807 bytes, checksum: c27bb67d00e82428ce979800193440bd (MD5) / Made available in DSpace on 2018-01-22T20:36:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2017_BrendaRabellodeCamargo.pdf: 4900807 bytes, checksum: c27bb67d00e82428ce979800193440bd (MD5) Previous issue date: 2018-01-22 / O Brasil possui biomassa de origem lignocelulósica, de abundância, como os resíduos da indústria da cana de açúcar que, podem ser convertidos em produtos de alto valor agregado. Clostridium thermocellum é um microrganismo com grande potencial para degradação de celulose e biomassa lignocelulósica, devido à capacidade dessa bactéria em secretar um complexo multi-enzimático (celulossoma), formado por um arsenal de enzimas entre glicosil hidrolases, carboidrato esterases, e polissacarídeo liases, considerado carboidrato-ativas. Além disso, essa bactéria fermenta hexoses (C6) e não pentoses (C5), produzindo principalmente etanol, acetato e lactato. A regulação da expressão de genes, regulados pela fonte de carbono, é uma temática de contínuo estudo. Assim, foi realizado o proteoma descritivo de Clostridium thermocellum quando crescido por 96 horas em diferentes fontes de carbono: celulose, bagaço e palha de cana. Foram analisadas diferentes frações de conteúdo de proteína; sobrenadante (FS), ligado ao substrato (FES), e parcialmente purificado em coluna de exclusão molecular (CPP). Em todas as frações foram encontradas proteínas relacionadas à degradação da biomassa, em maior número em amostras de CPP de celulose, seguido pela amostra FES de palha. As exoglucanases CelS, CelK, CbhA, e proteínas estruturais CipA e OlpB foram encontradas em todos os substratos. Na amostra de bagaço foram identificadas as endoglucanases CelN, CelA, CelB, CelR, CelJ, CelQ, CelW, CelG e hemicelulases, Xgh74A, XynC, XynZ, Cthe_0798, sendo a última, presente também em palha. O transcritoma (RNAseq) e análise diferencial dos genes nas mesmas condições, porém em 37 horas, foi realizado. Das proteínas encontradas no proteoma, os genes cthe_0798 e xgh74A foram encontrados diferencialmente expressos em bagaço quando comparado com celulose, seguido pelos genes codificadores de CelP, CtMan5A, CelC, XynA, ManA, Cthe_1257, Cthe_3163 e Orf2p. Genes envolvidos na mobilidade celular, incluindo proteínas de formação de flagelos, motor e regulação, foram encontrados como a categoria (COG N) de maior regulação positiva em bagaço e palha. Na mesma categoria estão genes envolvidos na quimiotaxia e quorum sensing. Durante as análises do transcritoma foi verificada a presença de outra bactéria, Moorella thermoacetica, conhecida por não ser celulolítica, porém com a habilidade de fermentar açúcares C5 e C6. A análise de expressão diferencial de genes nos diferentes tratamentos, mostrou moth_0612 e moth_0699 regulados positivamente em bagaço, ambos codificando transportadores de ribose (C5). A análise de proteínas ortólogas entre as duas bactérias revelou que M.thermoacética não possui ortólogos com potenciais de atuar como enzimas carboidrato ativas de C.thermocellum. Relativo à C.thermocellum, o gene cthe_2196, ausente de caracterização, contendo os domínios GH43, CBM6 e Doquerina tipo I, foi encontrado expresso em bagaço e palha, ausente em celulose, além de ser predito como fazendo parte de um operon juntamente com cthe_2195. Cthe_2196, foi clonado em sistema pET, expresso em E.coli, e a proteína denominada AxB8 foi caracterizada bioquimicamente. AxB8 possui habilidade de degradar arabinoxilana e substratos sintéticos pNP-α-Larabinofuranosidase, e pNP-α-L-arabinofuranosidase. AxB8 apresenta domínio Glicosil hidrolase família 43, subfamília 29, e sua sequência mostrou maior similaridade com outras proteínas de termófilos não caracterizadas. Concluindo, os resultados desse trabalho demonstraram proteínas que são essenciais à degradação de bagaço e palha de cana, além de revelar importantes mecanismos regulados nessas condições que facilitam a proximidade da bactéria com o substrato, como os genes envolvidos na motilidade da bactéria. Essas informações podem ser utilizadas para desenvolvimento de novas linhagens e enzimas que aumentem o processo de degradação de biomassas lignocelulósicas, com o concomitante uso de produtos formados na geração de novas tecnologias. / Lignocellulosic biomass is in abundance in Brazil, as the residues of the sugar cane industry, which can be converted into products with high aggregated value. Clostridium thermocellum is a microorganism with great potential for degradation of cellulose and lignocellulosic biomass due to its ability to secrete a multi-enzymatic complex (cellulosome), formed by an arsenal of enzymes between glycosyl hydrolases, carbohydrate esterases, and polysaccharide lyases, considered Carbohydrate-active. In addition, this bacterium ferments hexoses (C6) and not pentoses (C5), mainly producing ethanol, acetate, and lactate. Metabolism gene expression, regulated by the carbon source, is a subject of continuous study. Thus, the descriptive proteome of Clostridium thermocellum was carried out when grown for 96 hours in different carbon sources: cellulose, bagasse and cane straw. Different fractions of protein content were analyzed; Supernatant (FS), bound to the substrate (FES) and partially purified by size exclusion chromatography (CPP). In all the fractions were found proteins related to the degradation of the biomass, in greater number in samples of cellulose CPP, followed by straw FES. The exoglucanases CelS, CelK, CbhA, and structural proteins CipA and OlpB were found in all substrates. In the bagasse sample the endoglucanases CelN, CelA, CelB, CelR, CelJ, CelQ, CelW, CelW, CelG and hemicellulases, Xgh74A, XynC, XynZ, Cthe_0798 were identified, the latter being also present in straw. Transcriptomic (RNAseq) and differential analysis of the genes under the same conditions, but growth at 37 hours, was performed. From the proteins found in the proteome, the encoding genes cthe_0798 and xgh74A were differentially expressed as bagasse when compared to cellulose, followed by the genes encoding CelP, CtMan5A, CelC, XynA, ManA, Cthe_1257, Cthe_3163 and Orf2p. Genes involved in cell motility(COG N), including flagella, motor and regulation proteins, were found in the highest category of up-regulation in bagasse and straw. In the same category were genes involved in chemotaxis and quorum sensing. During ranscriptomic analysis, was detected the presence of another bacterium, Moorella thermoacetica, knowing to be not ellulolytic, but having the ability to ferment C5 and C6 sugars. Differential gene expression in different treatments showed moth_0612 and moth_0699 up-regulated in bagasse, both encoding ribose (C5) transporters. Orthologous proteins analysis between the two bacteria revealed that M.thermoacética did not have orthologs with the potential to act as active carbohydrate enzymes from C.thermocellum. Regarding C.thermocellum, the cthe_2196 gene, absent from characterization, containing the domains GH43, CBM6 and Dockerin type I, was found expressed in bagasse and straw, but absent in cellulose, besides being predicted as part of an operon together with cthe_2195. Cthe_2196 was cloned into pET system, further expressed in E. coli, and the protein named AxB8 was characterized biochemically. AxB8 has the ability to degrade arabinoxylan and synthetic substrates pNP-α-L-arabinofuranosidase, and pNP-α-Larabinofuranosidase. AxB8 contains Glycosyl hydrolase family domain 43, subfamily 29, and its sequence showed greater similarity with other non-characterized thermophilic proteins. In conclusion, the results of this work demonstrated proteins that are essential for the degradation of sugarcane bagasse and straw, besides revealing important regulated mechanisms due to these conditions that facilitate the proximity of the bacterium with the substrate, as the genes involved in the motility of the bacteria. This information can be used to develop new strains and enzymes that increase the degradation process of lignocellulosic biomasses, with the concomitant use of products formed in the generation of new technologies.

Introdução. O câncer de próstata (CaP) é o mais comum em homens nos Estados Unidos. Em 2010, formam estimados 192.280 novos casos de CaP e 27.360 mortes nos Estados Unidos. A incidência estimada de CaP no Brasil é de 52.350 novos casos em 2010, principalmente na região sul. A hiperplasia prostática benigna (HPB) é uma anormalidade proliferativa associada à idade em homens. A prevalência de HPB é em torno de 14% entre 40 e 50 anos e 43% acima de 60 anos. A patogênese do desenvolvimento tumoral tem sido associada com a ação dos hormônios esteróides. Os efeitos dos androgênios são mediados pela testosterona e pela dihidrotestosterona (DHT) nas células alvo. Suas ações têm sido demonstradas na morfogênese, diferenciação, proliferação e secreção da glândula prostática. A ligação do androgênio promove a ativação do receptor de androgênio (AR), recrutamento de cofatores, promovendo a transcrição dos genes alvos hormônio-dependentes. Numerosos correguladores do AR têm sido descritos como sendo essenciais para a ativação do AR durante a progressão da doença. SHP, FHL2 e o complexo P160 (SRC1, GRIP1 e AIB1) parecem ser importantes correguladores do AR. O polimorfismo CAG e GGC do AR pode alterar a transcrição dos genes responsivos aos androgênios e, potencialmente, atuar no desenvolvimento da HPB e do CaP. Objetivo. 1. Investigar a associação entre o número de repetições CAG e GGC do AR, os níveis de testosterona e a chance de desenvolver CaP ou HPB em nossa população. 2. Investigar a expressão de SHP, FHL2, do complexo P160 e do AR em tecidos HPB, CaP e ZPU (zona periuretral proveniente das amostras CaP). Materiais e Métodos. Foram analisados 344 pacientes oriundos do Hospital de Clínicas de Porto Alegre, sendo 130 CaP, 126 HPB e 88 controles, para analisar o polimorfismo CAG e GGC. O DNA foi extraído a partir do sangue periférico e o gene do AR foi analisado através de análise de fragmento. Cento e dois pacientes submetidos à cirurgia foram utilizados para avaliar as expressões gênicas. Foram avaliados 36 HPB, 66 CaP e 33 ZPU. O RNA foi extraído e as expressões gênicas foram analisadas por PCR em tempo real. Os protocolos e os termos de consentimento foram aprovados pelo comitê de ética local e nacional. Resultados. As médias do número de repetições CAG e GGC foram semelhantes entre os grupos CaP, HPB e controles. A chance de desenvolver CaP nos indivíduos que possuem um longo alelo para o polimorfismo GGC (GGC > 18 e GGC >19) é de 1,96 e 3,30 vezes maior do que o alelo curto (GGC ≤ 18 e GGC ≤ 19) (p=0,035 e p=0,007), respectivamente. A chance de desenvolver HPB em indivíduos que possuem o alelo longo para o polimorfismo GGC (GGC > 18) é 2,33 vezes maior (p=0,008) do que o alelo curto (GGC ≤ 18). O risco de desenvolver CaP e HPB em pacientes com a testosterona total < 4ng/mL foram de 2,80 (P=0,005) e 2,78 vezes maior (P=0,002), respectivamente, comparado com os pacientes com testosterona total > 4ng/mL. Os níveis séricos de testosterona total em pacientes com GGC > 19 foram significativamente menor comparados com pacientes com GGC ≤ 19 (P=0,001). A expressão gênica de AR foi maior no grupo ZPU e CaP em relação ao grupo HPB (P=0,033 e P<0.001, respectivamente). A expressão de SHP foi maior no grupo CaP comparado com o HPB (P=0,039). A expressão de FHL2 foi maior no grupo ZPU comparado com o CaP e HPB (P<0.001 e P=0.007, respectivamente). Dos genes que formam o complexo P160, a expressão de SRC1 foi maior no grupo ZPU comparado com o CaP (P<0.001) e HPB (P=0,005). GRIP1 foi mais expresso nos grupos CaP e ZPU em relação ao grupo HPB (P<0,001 e P=0.006, respectivamente) e a expressão de AIB1 foi maior nos grupos CaP e ZPU comparados ao grupo HPB (P=0,030 e P=0.001, respectivamente). A expressão protéica de FHL2 foi maior no grupo CaP comparado com o grupo HPB (P=0.023). As análises moleculares de AR, GRIP1 e AIB1, monstraram melhores parâmetros diagnósticos do que a análise dos níveis séricos de PSA. Conclusões. A presença de um número de repetições GGC>18 e GGC>19 do AR foi associada com o aumento da chance de desenvolver CaP. As repetições de GGC>18 também foram associadas com a chance de desenvolver HPB. Níveis baixos de testosterona sérica foram encontrados nos grupos CaP e HPB comparados com os controles. Baixos níveis de testosterona podem aumentar a chance de desenvolver CaP e HPB. Este estudo demonstra a participação dos genes AR, SHP, FHL2 e do complexo P160 no aumento de proliferação da glândula prostática. AR, FHL2, SRC1, GRIP1 e AIB1 poderão ser uma boa alternativa para acompanhar os pacientes que possuem níveis elevados de PSA, toque alterado e biópsia negativa. / Introduction. Prostate cancer (PCa) is the most common cancer in men within the U.S. In 2010, 192,280 new cases were estimated in the U.S., and 27,360 deaths were due to this disease. The estimated incidence of prostate cancer in Brazil is of 52,350 new cases in 2010, mainly in southern regions. Benign Prostatic Hyperplasia (BPH) is a very frequent age-related proliferative abnormality in men. The prevalence of BPH is around 14 % at the age of 40 to 50 years, and 43% among those 60+. The pathogenesis of tumor development has been closely associated to the action of steroid hormones. The androgenic effects are mediated by testosterone and dihydrotestosterone (DHT) in the target cells and their action have been demonstrated in morphogenesis, differentiation, cell proliferation and secretions of the prostate gland. The androgen binding promotes the activation of the androgen receptor, recruitment of co-factors, promoting the transcription of hormone-dependent target genes. Several AR-associated coregulators have been shown to be essential for AR activation during disease progression. SHP, FHL2 and P160 complex (SRC1, GRIP1 and AIB1) has been shown as important AR coregulators. Polymorphic CAG and GGC repeats in the androgen receptor (AR) can alter transactivation of androgen-responsive genes and, potentially, act over BPH and PCa risks. Purposes. 1. To investigate the association between CAG and GGC repeat length, testosterone levels and the risks of PCa and BPH in a case-control study from a Brazilian population. 2. To investigate the SHP, FHL2, P160 and AR expressions in BPH, PCa and PUZ (periurethral zone tissue from PCa sample) tissues. Material and Methods. At Hospital de Clínicas de Porto Alegre, 344 patients were evaluated; 130 PCa, 126 BPH and 88 healthy controls, to analyze CAG and GGC polymorphisms. DNA was extracted from peripheral leukocytes and the AR gene was analyzed by fragment analysis. Hazard Ratio (HR) and 95% confidence limits were estimated. 102 men undergoing surgical removal were evaluated to analyze gene expressions; 36 BPH, 66 PCa and 33 PUZ. RNA was extracted and gene expression was analyzed by real time RT-PCR. Protocols and informed consent were approved by the local and national ethics committee. Results. CAG and GGC mean lengths were not different between PCa, BPH and controls. The risk of developing PCa in individuals who have the long allele for GGC polymorphism (GGC > 18 and GGC >19) was 1.96 and 3.30 times higher compared to the short allele (GGC ≤ 18 and GGC ≤ 19) (P=0.035 and P=0.007), respectively. The risk of developing BPH in individuals who have the long allele for GGC polymorphism (GGC > 18) was 2.33 times higher compared to the short allele (GGC ≤ 18) (P=0.008). The risk of developing PCa and BPH in individuals who have the total testosterone < 4ng/mL were 2.80 (P=0.005) and 2.78 times higher (P=0.002), respectively, compared to individuals with testosterone levels > 4ng/mL. The total testosterone level in patients with GGC >19 was significantly lower in comparison to patients with GGC ≤ 19 (P=0.001). AR mRNA level was higher in PCa and PUZ group than BPH (P=0.033 and P<0.001, respectively). SHP level was higher in PCa group compared to BPH (P=0.039). FHL2 level was higher in PUZ group compared to PCa and HPB (P<0.001 and P=0.007, respectively). SRC1 showed no difference between PCa and BPH, but PUZ group SRC1 levels was higher compared to PCa (P<0.001) and BPH (P=0,005). GRIP1 levels were higher in PCa and PUZ group than BPH (P<0.001 and P=0.006, respectively). AIB1 level was higher in PCa and PUZ group compared to BPH (P=0.030 and P=0.001, respectively). FHL2 protein expression was higher in PCa group compared to HPB (P=0.023). Molecular analysis of AR, GRIP1 and AIB1 demonstrated better diagnosis parameters compared to serum PSA levels. Conclusions. Our data suggest that the presence of a long number of GGC polymorphic repeats in the androgen receptor gene is associated with the increased risk of developing PCa and BPH. Serum testosterone levels were lower in PCA and BPH groups when compared to control groups. Low levels of testosterone can increase the risk of PCa and BPH. This study indicates a larger participation of AR, SHP, FHL2 and P160 genes in the prostate proliferation. AR, FHL2, SRC1, GRIP1 and AIB1 might be analyzed on the future to accomplish some patients who have higher PSA levels, altered digital rectal examination, and negative biopsy.

A síndrome dos ovários policísticos (polycystic ovary syndrome – PCOS) constitui o distúrbio endócrino mais comum em mulheres em idade reprodutiva, afetando cerca de 5 a 10% das mulheres em todo o mundo. Caracteriza-se por hiperandrogenismo e disfunção ovariana, incluindo oligo-anovulação e/ou ovários policísticos na ausência de outras doenças que causem hiperandrogenismo. Também importante é o reconhecimento da PCOS como uma disfunção metabólica, manifestada por obesidade abdominal, resistência à insulina, dislipidemia e hipertensão. Estes fatores aumentam o risco para diabetes tipo 2 e, provavelmente, doença cardiovascular. O tecido adiposo secreta adipocinas e pode mediar inúmeros processos fisiológicos. Entre as adipocinas, a leptina e a adiponectina têm sido associadas com índice de massa corporal (IMC), ação da insulina e metabolismo da glicose. Além disso, o tecido adiposo armazena, mobiliza e forma esteróides a partir de interconversões de vários metabólitos hormonais. A aromatase é a enzima-chave para a síntese de estrogênios a partir de androgênios e está presente no tecido adiposo. Evidências indicam associações entre hormônios sexuais e hipertensão arterial sistêmica. Nas mulheres com PCOS, a hipertensão tem sido relacionada ao excesso de androgênios e à resistência à insulina. No presente estudo, avaliamos os níveis séricos de leptina e adiponectina, calculamos a relação leptina/adiponectina (L/A), bem como determinamos a expressão gênica de leptina, adiponectina e aromatase no tecido adiposo subcutâneo de mulheres com PCOS e de mulheres controles não hirsutas, com ciclos ovulatórios e pareadas para IMC. Encontramos níveis mais elevados de leptina sérica nas pacientes PCOS com sobrepeso/obesidade em relação com mulheres de peso normal, enquanto que as concentrações de adiponectina foram semelhantes em todos os subgrupos. A relação L/A foi maior nos subgrupos sobrepeso/obesidade quando comparados com o grupo controle de peso normal. A expressão gênica de leptina no tecido adiposo subcutâneo foi maior nas mulheres PCOS com sobrepeso/obesidade em relação às controles de peso normal, enquanto que a expressão gênica de adiponectina foi semelhantes entre os grupos. Na análise de regressão múltipla, o percentual de gordura corporal contribuiu significativamente para a relação L/A em PCOS, independentemente do IMC e do índice de androgênios livres. O RNAm da aromatase no tecido adiposo foi significativamente mais elevado no grupo de PCOS hipertensas (NCEP/ATP III 2001) quando comparado com as PCOS normotensas e com o grupo controle. Uma correlação positiva entre a expressão gênica de aromatase e a pressão arterial sistólica e diastólica foi observada nas pacientes com PCOS. Em conclusão, os dados do presente estudo sugerem que as alterações observadas na secreção de adipocinas parecem estar mais relacionadas à adiposidade do que ao excesso de androgênios na PCOS. Além disso, o excesso de androgênios e a hiperinsulinemia podem ter algum papel nos mecanismos moleculares que ativam a transcrição do RNAm da aromatase no tecido adiposo de mulheres com PCOS. / Polycystic ovary syndrome (PCOS), the most prevalent endocrine disorder in women of reproductive age, affects 5 to 10% of women worldwide. It is characterized by hyperandrogenism and ovarian dysfunction, including oligo-anovulation and/or polycystic ovaries in the absence of other diseases affecting pituitary and/or adrenal glands. Also important is the recognition of PCOS as a metabolic disorder, manifested by abdominal obesity, insulin resistance, dyslipidemia and hypertension. These factors increase the risk for type 2 diabetes and probably for cardiovascular disease. Adipose tissue has been recognized as an active endocrine organ and a secretory mediator of numerous physiological processes. The adipokines leptin and adiponectin have been associated with body mass index (BMI), insulin action, and glucose metabolism. In addition, adipose tissue is a reservoir of steroids, a center of sexual hormone conversion and a source of estrogen. Aromatase is the key enzyme for estrogen synthesis from androgens and is present in adipose tissue. Evidences indicate there are associations between sex hormones and arterial hypertension. In women with PCOS, hypertension has been linked to androgen excess and insulin resistance. In the present study, we assessed leptin and adiponectin serum levels and the leptin to adiponectin (L/A) ratio and evaluated the gene expression of leptin, adiponectin and aromatase in subcutaneous adipose tissue from PCOS and BMI-matched non-hirsute, ovulatory control women. We found higher leptin serum levels in overweight/obese PCOS patients than in normoweight women, while adiponectin concentrations were similar in all subgroups. L/A ratio was higher in overweight/obese subgroups than in normoweight controls. Subcutaneous leptin gene expression was higher in overweight/obese PCOS women than in normoweight controls, while the adiponectin gene expression was similar in all groups. On multiple regression analysis, percentage of body fat contributed significantly to L/A ratio in PCOS, independently of BMI and free androgen index. Subcutaneous aromatase mRNA was significantly higher in the hypertensive (NCEP/ATP III 2001) PCOS than in normotensive PCOS and control groups. A positive correlation between aromatase gene expression in subcutaneous fat with systolic and diastolic blood pressure was observed in PCOS patients. In conclusion, results from our study suggest that altered adipocyte secretion seems to relate to adiposity rather than to androgen excess in PCOS. In addition, our data suggest that androgen excess and hyperinsulinemia may play a role on the molecular mechanisms that activate aromatase mRNA transcription in abdominal fat tissue in women with PCOS.

A endometriose caracteriza-se pela presença de tecido endometriótico – glândulas e estroma – fora da cavidade uterina. A doença acomete superfícies peritoniais da pélvis, ovários e septo rectovaginal, sendo mais comum a endometriose pélvica. Embora os dados sobre a prevalência exata de endometriose sejam incertos, as evidências indicam uma prevalência em torno de 5 a 10% das mulheres em idade reprodutiva. Dor, dismenorréia, dispareunia e infertilidade são sintomas freqüentes da doença. Além de apresentar dependência aos hormônios sexuais, a endometriose está associada a um conjunto de desordens de diferentes etiologias, sendo considerada uma doença multifatorial de caráter genético e imune. Neste sentido, a carência de respostas imunológicas adequadas, aliada a um provável desequilíbrio entre os processos de proliferação e apoptose celular, pode ter um papel importante na instalação e manutenção das lesões endometrióticas. O objetivo deste trabalho foi caracterizar a expressão de genes relacionados aos processos de proliferação e diferenciação celular em implantes endometrióticos e endométrio eutópico de mulheres inférteis sem e com endometriose, através da análise semiquantitativa por RT-PCR. Foram estudadas 34 pacientes consultando por infertilidade e submetidas à laparoscopia diagnóstica. Quinze pacientes (31,7 ± 1,5 anos) apresentavam endometriose e 19 (32,9 ± 0,9 anos) foram consideradas controles inférteis sem endometriose. Os dois grupos apresentaram IMC e SHBG similares. As biópsias de endométrio foram realizadas, em fase folicular, nas pacientes do grupo controle (C) e nas pacientes com endometriose (endométrio eutópico (EUT) e ectópico (ECT)). A presença do mRNA para os receptores de estrogênio e progesterona detectada nos 3 grupos estudados, sustenta a existência de sensibilidade tecidual local aos hormônios sexuais. Nas condições experimentais do presente estudo não foi observada diferença estatística na expressão gênica de bcl2 entre os grupos. A expressão do gene do ER endometrial também foi similar entre os grupos controle, eutópico e ectópico. Contudo, o endométrio ectópico apresentou níveis de mRNA mais elevados para PR-A (0,84  0,02 UA) em relação aos grupos controle e eutópico (0,60  0,04 UA e 0,63  0,04 UA; p < 0,05). A expressão gênica do PR-B não foi estatisticamente diferente entre os grupos do presente trabalho. Porém, houve forte correlação negativa entre a expressão dos genes bcl2 e PR-B nas amostras de endométrio sem e com endometriose (r = - 0,795 e p = 0,018), sugerindo que um papel anti-proliferativo do PR-B possa ser operativo neste modelo de estudo. / Endometriosis is characterized as the presence of endometrial glands and stroma outside of the uterine cavity. The disorder attacks the surfaces on the pelvic peritoneum, ovaries and rectovaginal septum, been commonly the pelvic endometriosis. Although the exact prevalence remains uncertain, 5 to 10% of women of reproductive age are estimated to have endometriosis. Pain, dysmenorrhea, dyspareunia and infertility are frequent symptoms of the disorder. Endometriosis is a hormonal-dependent disease and has been considered as a multifactorial disorder with genetic and immune characteristics. Thus, changes on immunologic responses associated to a potential disequilibrium between proliferative and apoptotic process, seems to play a main role in the development and maintenance of the endometriotic lesions. The aim of this study was to characterize the expression of genes related to cellular proliferation and differentiation in endometriotic lesions and eutopic endometrium from infertile women with and without endometriosis by RT-PCR semiquantitative analysis. Thirty four patients consulting for infertility and submitted to diagnostic laparoscopy were studied. Fifteen patients (31.7 ± 1.5 years old) presented endometriosis and 19 (32.9 ± 0.9 years old) were considered as control, free from the disease. Both groups presented similar BMI and SHBG. Endometrial biopsies were collected during the follicular phase, from patients of the control group (C) and those from the endometriosis group (eutopic (EUT) and ectopic (ECT) endometrium). Estrogen and progesterone receptor gene expression was detected in the 3 groups, supporting the existence of a local sensitivity to sexual hormones. No statistical differences were observed in bcl2 gene expression between the groups. The gene expression of ERα was also similar among control, eutopic and ectopic groups. In turn, ectopic endometrium showed higher PR-A gene expression (0.84 ± 0.02 AU) than control and eutopic groups (0.60 ± 0.04 AU e 0.63 ± 0.04 AU; p < 0.05). The PR-B gene expression did not differ among the groups. However, a strong and significant negative correlation between bcl2 and PR-B levels was demonstrated in the endometrial samples from patients presenting or not endometriosis (r = - 0.795 and p = 0.018), suggesting that an anti-proliferative role of PR-B could be operating trough this model of study.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Departamento de Botânica, Programa de Pós-Graduação em Botânica, 2016. / Submitted by Nayara Silva (nayarasilva@bce.unb.br) on 2016-06-23T19:35:47Z No. of bitstreams: 1 2016_DéboraAlmeidaAlcantaradaSilva.pdf: 1806060 bytes, checksum: b0722b82676b47c15af2547143ca743a (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2016-06-23T21:09:56Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_DéboraAlmeidaAlcantaradaSilva.pdf: 1806060 bytes, checksum: b0722b82676b47c15af2547143ca743a (MD5) / Made available in DSpace on 2016-06-23T21:09:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_DéboraAlmeidaAlcantaradaSilva.pdf: 1806060 bytes, checksum: b0722b82676b47c15af2547143ca743a (MD5) / A planta modelo, Arabidopsis thaliana, produz uma diversidade de metabólitos secundários. Dentre os metabólitos secundários, os terpenos formam a maior e mais diversa classe. Os terpenos estão envolvidos em várias funções fisiológicas importantes nos vegetais, entre as quais têm sido associados a compostos alelopáticos O geranil geranil difosfato (GGPP) é o precursor para a biossíntese de terpenos. Estudos anteriores estabeleceram uma associação entre plantas transgênica que supostamente superexpressavam os genes GGR, GGPPS2 e GGPPS6, envolvidos na síntese de terpenos, com efeitos alelopáticos. Para contribuir na elucidação desta associação, o primeiro capítulo deste estudo teve como objetivo estudar o efeito do silenciamento dos genes GGR, GGPS2 e GGPPS6 em A. thaliana e resposta alelopática de Arabidopsis. Assim, vetores de RNAi para GGR, GGPS2 e GGPPS6 foram sintetizados e transferidos para Agrobacterium tumefaciens e em seguida as plantas de Arabidopsis foram transformadas para o silenciamento desses genes. As plântulas transformadas foram selecionadas em meio MS contendo glufosinato de amônio como composto seletivo. Foi possível selecionar três plantas da geração T1 e duas plantas da geração T2, transformadas com o vetor de silenciamento para o gene GGPPS2. Entretanto, as plantas transformadas não sobreviveram. Além disso, não foi possível selecionar plantas com vetores de silenciamento para os genes GGR e GGPPS6. No segundo capítulo, o objetivo foi avaliar a expressão relativa do gene GGR em plantas selvagens e transgênicas de Arabidopsis thaliana que que supostamente superexpressam esse gene. Adicionalmente, objetivou-se verificar a associação entre os níveis de expressão de GGR e respostas alelopáticas em A. thaliana. Assim, uma serie de PCR em Tempo Real, utilizando sondas TaqMan® para GGR tendo como genes de referência: ACT2 e RAD23C. Ao contrário do esperado, as plantas selvagens expressaram mais o gene GGR que todas as linhagens que supostamente superexpressavam esse gene. Esse dado pode indicar que um processo de cossupressão de GGR pode ter ocorrido nas plantas transgênicas. Estudos prévios sobre as respostas alelopáticas mostram que extratos foliares de plantas transgênicas de Arabidopsis com GGR têm efeito alelopático mais acentuados que os extratos de plantas selvagens. Assim, pelo menos para o gene GGR, quanto menor o seu nível de expressão maior a resposta alelopática da planta. Uma possível explicação para isso se baseia no fato de que a menor expressão de GGR disponibilizaria mais substrato para a enzima GGPP sintase e consequentemente, maior produção de terpenos. Outra possibilidade é que a redução da expressão de GGR poderia induzir outras vias metabólicas que aumentam a produção de compostos alelopáticos. _________________________________________________________________________________________________ ABSTRACT / The model plant, Arabidopsis thaliana, produces a variety of secondary metabolites. Among the secondary metabolites, terpenes are the largest and most diverse class. Terpenes are involved in several important physiological functions in plants, among which they have been associated with allelopathic compounds. Geranyl geranyl diphosphate (GGPP) is the precursor for the biosynthesis of terpenes. Previous studies established a positive association between transgenic plants that supposedly overexpressed GGR, GGPPS2 and GGPPS6 genes, which are involved in terpene synthesis, and allelopathic response. Therefore, the first part of this research focused on investigating the effect GGR, GGPS2 and GGPPS6 silencing on A. thaliana allelopathic response. Furthermore, GGR, GGPS2 and GGPPS6 RNAi vectors were transferred to Agrobacterium tumefaciens and then used to transform Arabidopsis plants with the purpose of silencing these genes. Transformed Arabidopsis seedlings were selected on MS medium containing glufosinate-ammonium as selective compound. It was possible to select three T1 generation plants and two T2 generation plants containing the silencing vector for GGPPS2 silencing. However, the transformed plants did not survive. Moreover, it was not possible to select plants containing GGR and GGPPS6 silencing vectors. In the second chapter, the objective was to evaluate the expression of GGR gene in wild type and transgenic A. thaliana transgenic plants that supposedly overexpressed this gene. In addition, the association between GGR expression levels and allelopathic responses in A. thaliana was investigated. Thus, a series of RT-PCR using TaqMan probes for GGR and the following reference genes: RAD23C and ACT2 were performed. Contrary to expectations, wild plants expressed the GGR gene at higher level than all lineages of GGR transformed plants. This data indicates that a cosuppression of GGR may have taken place in the transgenic plants. Previous studies on allelopathic responses of Arabidopsis showed that leaf extracts of GGR transformed Arabidopsis plants have stronger allelopathic effect than those from wild type plants. Thus, at least with respect to GGR gene, the lower the level of GGR expression the higher the allelopathic response of Arabidopsis plant. One possible explanation for this phenomenon is based on the fact that a low expression of GGR would provide more substrate for GGPP synthase, which consequently would increase terpene production. Another possibility links the reduction of GGR expression with the induction of other metabolic pathways associated with an increase of allelopathic compound production.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Ciências Médicas, 2016. / Submitted by Fernanda Percia França (fernandafranca@bce.unb.br) on 2017-02-08T16:44:15Z No. of bitstreams: 1 2016_PatriciaMariaFritsch_Parcial.pdf: 434999 bytes, checksum: d804f99dc14943754f9ab44bbad28e70 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2017-03-20T21:45:41Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_PatriciaMariaFritsch_Parcial.pdf: 434999 bytes, checksum: d804f99dc14943754f9ab44bbad28e70 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-03-20T21:45:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_PatriciaMariaFritsch_Parcial.pdf: 434999 bytes, checksum: d804f99dc14943754f9ab44bbad28e70 (MD5) / A Doença Celíaca (DC) é uma desordem sistêmica, imunomediada, desencadeada pelo consumo do glúten e suas prolaminas relacionadas (gliadina e glutenina) em indivíduos geneticamente predispostos. A doença combina fatores genéticos e ambientais para promover inflamação, dano na mucosa intestinal e o quadro clínico observado no doente celíaco. Uma vez presente na dieta do doente celíaco, a gliadina e seus fragmentos peptídicos entram em contato com as células da barreira epitelial intestinal e desencadeiam a resposta inflamatória antes mesmo que esses peptídeos atinjam a lâmina própria para iniciarem a resposta mediada pelo reconhecimento via MHC de classe II e seus alelos predisponentes HLA-DQ2 e DQ8. O tratamento baseado na dieta livre de glúten e o diagnóstico da DC estão bem estabelecidos. Entretanto o evento inicial da resposta inflamatória, a patogênese iniciada na barreira epitelial imediatamente após a interação com a gliadina e seus peptídeos ainda precisam ser elucidadas. Na tentativa de contribuir para a entendimento dos mecanismos de disparo da patogênese da DC, o presente trabalho propõe analisar a interação inicial da gliadina e seus peptídeos em células epiteliais Caco-2 e observar a modulação gênica, a produção de citocinas pró-inflamatórias e o estresse oxidativo mediados por essa interação. Nesse sentido, células Caco-2 foram cultivadas e estimuladas com LPS, gliadina e peptídeos imunogênicos e tóxicos da gliadina p56-88, p57-68, p69-82, p31-49, p57-68E65 e p69-82E72 por 6, 24 e 48 horas. O produto dessa interação e a modulação gênica produzida foram avaliados por qPCR e por dosagens do óxido nítrico e das citocinas pró-inflamatórias produzidas em cada tempo analisado. A gliadina e seus peptídeos imunogênicos foram tão eficientes quanto LPS em produzir inflamação nas células Caco-2, modulando a expressão de transcritos gênicos das citocinas pró-inflamatórias, principalmente de IL-1, IL-6, IL-8 e IL-15 especialmente nos tempos de 24 e 48 horas de interação, além de modularem a expressão do gene TLR-4. Para confirmar estes dados, a dosagem elevada de óxido nítrico e das citocinas IL-6, IL-21, IL-2, IL-8 e TNF-α evidenciou a presença de uma resposta inflamatória induzida pelas interações estudadas. Após análise dos dados, podemos inferir que a gliadina intacta ou seus peptídeos modularam a resposta inflamatória em células Caco-2, tal como observado in vivo no doente celíaco. Observamos que o receptor TLR-4 pode apresentar um papel importante na patogênese da DC, principalmente no reconhecimento da gliadina e seus peptídeos no evento inicial da resposta imunológica desencadeada pela célula epitelial intestinal. Os resultados sugerem que TLR-4 poderá representar uma nova rota de entrada da gliadina e seus derivados para a lâmina própria intestinal, contribuindo para o entendimento desta lacuna na patogênese da doença. / Celiac disease is a systemic, immunomomediated disorder, triggered by the ingestion of gluten and its related prolamins (gliadin and glutenin) in genetically predisposed individuals. In celiac disease, genetic and environmental factors are combined to promote inflammation, damage of the intestinal mucosa and the characteristic clinical manifestations of celiac patients. Once present in the celiac patient´s dietary gliadin and its fragments interact with cells from the epithelial intestinal barrier, and initiate an inflammatory response even before reaching the lamina propria. This process is mediated by specific MHC-II molecules’ recognition, HLADQ2/ DQ8. Both the treatment, based on a gluten free diet, and the diagnosis of celiac disease are well established. However, the initial inflammatory response which takes place in the epithelial intestinal barrier immediately after the interaction between the intestinal cells, gliadin, and its peptides, still need to be elucidated. To contribute to the understanding of this mechanisms, this work intends to analyse the initial interaction between gliadin, its immunogenic peptides, and Caco-2 cells, by studying the differences in gene expression, inflammatory cytokines production and the oxidant stress. Caco-2 cells were cultured and exposed to LPS, gliadin and its immunogenic peptides P56-88, P57-68, P69-82, P31-49, P57- 68E65 and P69-82E72 for 6, 24 and 48 hours. The products of these interactions were evaluated using qPCR, to analyze the differential expression of target mRNAs, and by dosing the production of Nitric oxide and pro-inflammatory cytokines at the stipulated times. Our results showed that gliadin and its immunogenic peptides were as efficient as LPS in activating an immune response in Caco-2 cells. They all promoted oxidative stress, transcription of IL-1, IL-6, IL-8 e IL-15 and production of the cytokines IL-6, IL-21, IL-2 e IL-8, mainly after 24 and 48 hours of challenge. We could also observe high levels of TNF- α cytokine and TLR4 transcripts. After analyzing our data, we could infer that both gliadin and its peptides could modulate the inflammatory response in Caco-2 cells, which is consistent with what is observed in vivo in celiac patients. We noticed that TLR-4 receptor can have an important role in the pathogenesis of celiac disease, mainly during the initial phase of the inflammatory response when gliadin and its peptides are recognized after the interaction with epithelial intestinal cells. This receptor could also be involved in the interiorization of gliadin and its peptides, contributing to the understanding of this gap in the pathogenesis of celiac disease.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde, 2015. / Submitted by Fernanda Percia França (fernandafranca@bce.unb.br) on 2015-11-25T14:47:40Z No. of bitstreams: 1 2015_FlaviaZattarPiazera.pdf: 5140389 bytes, checksum: 90224636e1ced48a74926f8c49f65060 (MD5) / Approved for entry into archive by Patrícia Nunes da Silva(patricia@bce.unb.br) on 2016-05-27T14:32:09Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2015_FlaviaZattarPiazera.pdf: 5140389 bytes, checksum: 90224636e1ced48a74926f8c49f65060 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-05-27T14:32:09Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2015_FlaviaZattarPiazera.pdf: 5140389 bytes, checksum: 90224636e1ced48a74926f8c49f65060 (MD5) / A Leucemia Linfocítica Crônica (LLC) é a neoplasia linfoide crônica mais comum na população ocidental. Assim, várias pesquisas têm sido desenvolvidas para elucidação dos fatores genéticos envolvidos na biologia e progressão da LLC. Alterações epigenéticas têm se mostrado cada vez mais relevantes na gênese de vários tumores e em especial nas neoplasias linfóides agudas e crônicas, e tem como características básicas não causar modificações na sequência do DNA. A metilação de histonas é um dos principais e mais estudados eventos epigenéticos. A família SETD é composta por 10 genes que codificam proteínas com domínio SET. Este domínio está envolvido na metilação de resíduos de lisina em histonas e proteínas não histonas. Até o momento, desconhece-se a relação de genes da família SETD com a leucemogênese da LLC. No presente estudo, foi realizada a avaliação de expressão relativa dos genes da família SETD em 59 amostras de sangue periférico de pacientes portadores de LLC e 10 controles normais através da técnica de PCR em tempo real. O perfil de expressão comparativa dessa família de genes foi correlacionado com as informações clínicas, citogenéticas, imunofenotípicas e hematológicas de maior relevância prognóstica dos pacientes. Notamos que a hipoexpressão do geneSETD1Aapresenta-se correlacionado com instabilidade cromossômica. O gene SETD2 apresentou elevada contagem de leucócitos no grupo de alta expressão, inferindo elevada massa tumoral. A superexpressão do gene SETD5 define um marcador de progressão da doença devido a elevada contagem de leucócitos nos pacientes do grupo de baixa expressão associado a anormalidades citogenéticas. O gene SETD6 apresentou hipoexpressão nos portadores de LLC em relação aos controles. O gene SETMAR apresentou-se hiperexpresso nos portadores de LLC em relação aos controles. Entretanto, no grupo de pacientes com baixa expressão a contagem leucocitária mostrou-se elevada estando associado a predominância de anormalidades citogenéticas e baixa contagem plaquetária. Sugerimos que nos portadores de LLC, a hipoexpressão do gene SETMAR esteja associada com instabilidade cromossômica e progressão da massa tumoral (aumento da leucocitose). Concluímos que os genes da família SETD possam futuramente ser considerados marcadores evolutivos da LLC. / The Chronic lymphocytic leukemia (CLL) is the most common chronic lymphoid malignancy in the western population. Thus, several studies have been developed to elucidate the genetic factors involved in biology and progression of CLL. Epigenetic changes have been shown to be increasingly important in the genesis of various tumors and especially in acute and chronic lymphoid malignancies, and its basic features do not cause changes in the DNA sequence. The histone methylation is one of the leading and most studied epigenetic events. The SETD family consists of 10 genes encoding proteins with SET domain. This domain is involved in methylation of lysine residues on histones and non-histone proteins. So far, unknown whether the genes ratio SETD family with the leukemogenesis LLC. In the present study, we evaluatedthe expression of all SETD family genes in peripheral blood from 59 CLL patients and 10 healthy donors by real time PCR. The expression profile of this gene family was correlated with the most relevant clinical, cytogenetic, immunophenotypic and hematologic prognostic factors of CLL patients. We note that hipoexpressionofSETD1A gene correlated with chromosomal instability.SETD2 gene expression was associated with a high white blood cell count in a dicotomized group of patients with high expression this gene, implying high tumor mass formation when SETD2 is over-expressed. In addition, overexpression of the gene SETD5 sets a marker of disease progression due to higher leukocyte count in patients in the low expression group associated with cytogenetic abnormalities. In the other hand, gene SETD6 was significantely downregulated in patients with CLL compared to controls. Finally, SETMAR gene was found to be upregulated in patients with CLL compared to controls. However, in patients with low expression of SETMAR, we found an increase in leukocyte count as well as in the predominance of cytogenetic abnormalities and low platelet count. We suggest that in patients with CLL, the low expression of SETMAR is associated with chromosomal instability and progression of the tumor mass (increased leukocytosis). We conclude that SETD family genes can be considered future evolutionary markers for CLL.

Submitted by Automação e Estatística (sst@bczm.ufrn.br) on 2018-07-03T15:32:36Z No. of bitstreams: 1 ThaisDeAlmeidaRatisRamos_DISSERT.pdf: 5907109 bytes, checksum: 89a190289f7aa32aedb29f2dff662907 (MD5) / Approved for entry into archive by Arlan Eloi Leite Silva (eloihistoriador@yahoo.com.br) on 2018-07-11T13:58:20Z (GMT) No. of bitstreams: 1 ThaisDeAlmeidaRatisRamos_DISSERT.pdf: 5907109 bytes, checksum: 89a190289f7aa32aedb29f2dff662907 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-07-11T13:58:20Z (GMT). No. of bitstreams: 1 ThaisDeAlmeidaRatisRamos_DISSERT.pdf: 5907109 bytes, checksum: 89a190289f7aa32aedb29f2dff662907 (MD5) Previous issue date: 2018-05-11 / A criação de enciclopédias de expressão gênica possibilita a compreensão de grupos de genes que são co-expressos em diferentes tecidos e o entendimento de grupos gênicos conforme suas funções e origem. Devido à enorme quantidade de dados em larga escala, gerados em projetos de transcriptômica, houve uma demanda intensa em usar técnicas fornecidas pela inteligência artificial, que tornou-se amplamente utilizada na bioinformática. A aprendizagem não supervisionada é a tarefa de aprendizagem de máquina que analisa os dados fornecidos e determina os objetos que podem ser agrupados. Foi construída uma ferramenta amigável chamada CORAZON (Correlation Analyses Zipper Online), que implementa 3 algoritmos de aprendizagem de máquina não supervisionada (mean shift, k-means e hierárquico), 6 metodologias de normalização (Fragments Per Kilobase Million (FPKM), Transcripts Per Million (TPM), Counts Per Million (CPM), log base-2, normalização pela soma dos valores da instância e normalização pelo maior valor de atributo para cada instância) e uma estratégia para observar a influência dos atributos, para agrupamento de dados de expressão gênica. Os desempenhos dos algoritmos foram avaliados através de 5 modelos comumente usados para validar metodologias de agrupamento, cada um composto por 50 conjuntos de dados gerados aleatoriamente. Os algoritmos apresentaram acurácia variando entre 92-100%. Em seguida, a ferramenta foi aplicada para agrupar tecidos, obter conhecimentos evolutivos e funcionais dos genes, com base no enriquecimento de processos biológicos, e associar com fatores de transcrição. Para selecionar o melhor número de clusters para o k-means e o hierárquico, foram utilizados o critério de informação bayesiana (BIC), seguido da derivada da função discreta e a Silhueta. No hierárquico foi adotado o método do Ward. No total, 3 bases de dados (Uhlen, Encode e Fantom) foram analisadas e, em relação aos tecidos, foram observados grupos relacionados a glândulas, tecidos cardíacos, musculares, relacionados ao sistema reprodutivo e grupos com um único tecido, como testículo, cérebro e medula óssea. Em relação aos grupos de genes, foram obtidos vários grupos com especificidades em suas funções: detecção de estímulos envolvidos na percepção sensorial, reprodução, sinalização sináptica, sistema nervoso, sistema imunológico, desenvolvimento de sistemas e metabólicos. Também foi observado que geralmente grupos com mais de 80% de genes não codificantes, mais de 40% dos seus genes codificantes são recentes, originados em Mammalia e a minoria é do clado Eukaryota. Por outro lado, grupos com mais de 90% de genes codificantes, mais de 40% deles apareceram em Eukaryota e a minoria em Mammalia. Estes resultados mostram o potencial dos métodos do CORAZON, que podem ajudar na análise de grande quantidade de dados genômicos, possibilitando associações dos processos biológicos com RNAs não codificantes e codificantes agrupados juntos, bem como a possibilidade do estudo da história evolutiva. CORAZON está disponível gratuitamente em http://biodados.icb.ufmg.br/corazon ou http://corazon.integrativebioinformatics.me. / The creation of gene expression encyclopedias possibilities the understanding of gene groups that are co-expressed in different tissues and comprehend gene clusters according to their functions and origin. Due to the huge amount of data generated in large-scale transcriptomics projects, an intense demand to use techniques provided by artificial intelligence became widely used in bioinformatics. Unsupervised learning is the machine learning task that analyzes the data provided and tries to determine if some objects can be grouped in some way, forming clusters. We developed an online tool called CORAZON (Correlation Analyses Zipper Online), which implements three unsupervised machine learning algorithms (mean shift, k-means and hierarchical) to cluster gene expression datasets, six normalization methodologies (Fragments Per Kilobase Million (FPKM), Transcripts Per Million (TPM), Counts per million (CPM), base-2 log, normalization by the sum of the instance's values and normalization by the highest attribute value for each instance), and a strategy to observe the attributes influence, all in a friendly environment. The algorithms performances were evaluated through five models commonly used to validate clustering methodologies, each one composed by fifty randomly generated datasets. The algorithms presented accuracies ranging between 92-100%. Next, we applied our tool to cluster tissues, obtain gene’s evolutionarily knowledgement and functional insights, based on the Gene Ontology enrichment, and connect with transcription factors. To select the best number of clusters for k-means and hierarchical algorithms we used Bayesian information criterion (BIC), followed by the derivative of the discrete function and Silhouette. In the hierarchical, we adopted the Ward’s method. In total, we analyzed three databases (Uhlen, Encode and Fantom) and in relation to tissues we can observe groups related to glands, cardiac tissues, muscular tissues, tissues related to the reproductive system and in all three groups are observed with a single tissue, such as testis, brain and bone-narrow. In relation to the genes clusters, we obtained several clusters that have specificities in their functions: detection of stimulus involved in sensory perception, reproduction, synaptic signaling, nervous system, immunological system, system development, and metabolics. We also observed that clusters with more than 80% of noncodings, more than 40% of their coding genes are recents appearing in mammalian class and the minority are from eukaryota class. Otherwise, clusters with more than 90% of coding genes, have more than 40% of them appeared in eukaryota and the minority from mammalian. These results illustrate the potential of the methods in CORAZON tool, which can help in the large quantities analysis of genomic data, possibiliting the potential associations analyzes between non-coding RNAs and the biological processes of clustered together coding genes, as well as the possibility of evolutionary history study. CORAZON is freely available at http://biodados.icb.ufmg.br/corazon or http://corazon.integrativebioinformatics.me.

Made available in DSpace on 2018-07-27T18:26:07Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2015-09-30. Added 1 bitstream(s) on 2018-07-27T18:30:18Z : No. of bitstreams: 1 000866601.pdf: 1192960 bytes, checksum: b230a294adc85fc16f62c1b42c3673a6 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / O objetivo deste estudo foi verificar o efeito de diferentes meios e tempos de refrigeração sobre o desenvolvimento e expressão gênica de embriões bovinos produzidos in vitro. Para tanto, blastocistos D7 foram divididos em três grupos: controle, embriões mantidos em meio SOFaa, em incubadora de CO2, por 6 e 48h; refrigerados, embriões mantidos a 5 °C, em Meio 199, por 24 (M199-24h) e 48h (M199-48h) ou em meio BotuEmbryo®, por 24 (BE-24h) e 48h (BE-48h). Após a refrigeração, os embriões foram cultivados sob as mesmas condições do grupo controle para avaliação da viabilidade embrionária às 6 e 48h, e das taxas de reexpansão e eclosão, às 24 e 48h, respectivamente. Às 6h de cultivo parte dos embriões foi retirada e armazenada para posterior análise de qPCR e TUNEL. Menor porcentagem (P<0,05) de blastocistos viáveis, às 6 e 48h, foi observada no grupo M199-48 em relação ao grupo controle. A taxa de reexpansão não diferiu entre os embriões refrigerados e o grupo controle, porém, menor (P<0,05) taxa de eclosão foi observada nos grupos M199-48h e BE-48h do que no grupo controle. Maior (P<0,05) porcentagem de células apoptóticas foi observada no grupo BE-48h do que nos grupos controle e BE-24h. Os meios e tempos utilizados não alteraram a expressão dos genes HSPA1A, PRDX1, SOD1 e SLC2A1. Portanto, de modo geral, o meio e o tempo de refrigeração não promoveram efeito potencial adverso sobre a viabilidade embrionária, taxa de reexpansão e eclosão, número de células apoptóticas e expressão gênica, sugerindo o emprego do meio BotuEmbryo®, o qual é disponível comercialmente / This study was carried out to investigate the effects of different media and cooling times on the development and gene expression of in vitro-derived bovine embryos. Therefore, blastocysts D7 were divided into three groups: control, embryos kept in SOFaa medium, under CO2 incubation, for 6, 24 and 48 hours; cooled embryos, kept in Medium 199, for 24 (M199-24h) and 48 hours (M199-48h) or in BotuEmbryo® medium, for 24 (BE-24h) and 48 hours (M199-48h). After cooling, the embryos were cultured under the same conditions used for the control group for evaluation of embryo viability at 6 and 48 hours, and of re-expansion and hatching rates, at 24 and 48 hours, respectively. At 6h of culture part of the embryos was removed and stored for later analysis of qPCR and TUNEL. Low percentage (P<0.05) of viable blastocysts, at 6 and 48 hours, was observed in group M199-48h than for control group. Re-expansion rate did not differ between cooled embryos and control group, however, lower (P<0.05) hatching rate was observed in M199-48h and BE-48h groups than for control group. Higher (P<0.05) percentage of apoptotic cells was found in BE-48h compared with control and BE-24h groups. Media and cooling times used did not alter the expression of genes HSPA1A, PRDX1, SOD1 and SLC2A1. Thus, overall, medium and cooling time did not promoted potential adverse effect on the embryonic viability, re-expansion and hatching rate, number of apoptotic cells and gene expression, suggesting the use of BotuEmbryo® medium, which is commercially available / FAPESP: 13/15905-9