La signalisation cellulaire regroupe l'ensemble des mécanismes biologiques permettant à une cellule de répondre de façon adaptée à son microenvironnement. Pour ce faire, de nombreuses réactions biologiques entrent en jeux avec un important enchevêtrement, créant ainsi un réseau dont le comportement s'apparente à un système complexe. Le compréhension de la réponse cellulaire à une stimulation passe par le développement conjoint des techniques d'acquisition de données, et des méthodes permettant de formaliser ces données dans un modèle. C'est sur ce dernier point que s'inscrivent les travaux exposés dans cette thèse. Nous présentons ici deux approches visant à répondre à des questions de natures différentes sur la signalisation cellulaire. Dans la première nous utilisons un modèle différentiel pour étudier le rôle d'un nouvel interactant dans la voie canonique du TGF-β. Dans la seconde nous avons exploré la combinatoire de la signalisation cellulaire en développant un formalisme discret basé sur les transitions gardées. Cette approche regroupe l'interprétation de la base de données Pathway Interaction Database dans un unique modèle dynamique de propagation du signal. Des méthodes de simulations et d'analyses inspirées des techniques de vérification de modèles telles que l'atteignabilité et l'invariance ont été développées. En outre, nous avons étudié la régulation du cycle cellulaire en réponse à la signalisation, ainsi que la régulation des gènes de notre modèle en comparaison avec des données d'expressions. / Cell signaling contains the whole biological mecanisms allowing the response of a cell to its microenvironnement in an adapted way. Many extremely intertwinned biological reactions are involved in a network that behaves as a complex system. The understanding of cell response requires the development of data acquisition technics and methods to formalize data into models. This point is the main drive of this thesis. We present here two approaches in order to analyse different granularities of cell signaling. In the first one, we used differential model to study the role of a new component of \tgf\ canonical pathway. In the second one, we explored the combinatorial complexity of cell signaling, developing a discrete formalism based on guarded transitions. In this approach, we interpreted the whole database Pathway Interaction Database into a single unified model of signal transduction. Simulation and analysis methods, such as reachability and invariance research, have been developed. The interests are presented through an application on cell cycle regulation by cell signaling, and a global analysis on the regulation of genes compared to experimental data.

Le cancer est une maladie caractérisée par la prolifération anarchique et incontrôlée de certaines cellules de l'organisme ayant échappé aux mécanismes normaux de contrôle de leur régulation et de leur différenciation. De nombreuses thérapies visant principalement les cellules tumorales sont utilisées pour limiter ce processus pathologique. Les agents chimiques sont capables d'interagir sur plusieurs cibles pharmacologiques comme l'ADN, l'ARN ou les protéines de ces cellules anormales. Parmi ces entités chimiques, l'hétérocycle quinazoline est représenté dans de nombreux de médicaments cytostatiques (gefitinib, erlotinib). Nos travaux portent essentiellement sur plusieurs cibles thérapeutiques qui sont des récepteurs membranaires à activité tyrosine kinase, intermédiaires essentiels dans la croissance tumorale. La surexpression des récepteurs aux facteurs de croissance de l'épiderme (EGFR) et des cellules vasculaires endothéliales (VEGFR-2) a été identifiée dans un certain nombre de lignées cellulaires cancéreuses. Elle est associée à la cancérogenèse et à la tumorogenèse par l'implication de nombreux processus biologiques cellulaires notamment le phénomène de l'angiogenèse qui provoque la formation de nouveaux réseaux vasculaires irriguant la tumeur. L'inhibition simultanée de l'activité tyrosine kinase de ces deux récepteurs est considérée comme une cible thérapeutique potentielle pour la conception de nouveaux anticancéreux.<br />A partir de l'hétérocycle quinazoline, différents composés se différenciant par leur motif anilino et phénoxy (substituée par des halogènes, des urées, des carbamates ou des amides) et par leurs chaînes éther latérales, ont été synthétisés et évalués pharmacologiquement.<br />Parmi ces produits, les dérivés quinazolinocarbamate ont la particularité d'inhiber simultanément les deux sites actifs EGFR/VEGFR-2 et représentent une nouvelle classe d'anticancéreux très prometteuse.<br />Parallèlement à ces travaux, nous avons conçu une nouvelle série d'agents de type anilinoquinazoline substitués par une N-alkylamine présentant un pouvoir anticancéreux intéressant en s'intercalant entre les paires de bases de l'ADN et empêchant ainsi sa réplication.<br />Ceci nous a permis de dégager plusieurs relations structure-activité des dérivés quinazolinique qui sont des composés actifs sur différentes cibles thérapeutiques

Le myélome multiple (MM) est caractérisé par une accumulation de plasmocytes tumoraux dans la moelle osseuse. Les cellules de MM (MMC) présentent de nombreuses anomalies cytogénétiques qui ne sont pas suffisantes pour induire la survie et la croissance de ces cellules qui sont dépendantes de l'environnement médullaire. Ce microenvironnement expriment des molécules d'adhésion et synthétisent des cytokines indispensables à la croissance du clone myélomateux. Dix principales familles de facteurs de croissance sont identifiées dans le MM (MGF) mais leur rôle respectif dans cette pathologie n'est pas établi. Ces facteurs de croissance sont produits soit par l'environnement tumoral ou soit par les cellules elle-même. La multiplicité de ces facteurs de croissance rend difficile la compréhension de la biologie du MM et l'émergence du clone tumoral in vivo. L'étude sur la coopération des 5 MGF les plus documentés nous a permis d'identifier l'IGF-1 comme un facteur de croissance majeur du MM : un inhibiteur d'IGF-1R bloque la croissance de 7/8 lignées de MM (HMCL) et la boucle autocrine de l'IGF-1 essentielle à l'activité de croissance de l'IL-6, d'HB-EGF et d'HGF. De plus, nous avons identifié que la présence d'IGF-1R (présent dans 44% des MMC) était un facteur de mauvais pronostic. L'IL-6 qui est le deuxième MGF majeur induit la croissance de 7/8 lignées. L'IL-6R, exprimé dans toutes les MMC, est aussi un facteur de mauvais pronostic quand il a une fortement exprimé dans les MMC de patients. Par la suite, nous avons étudié l'effet de l'insuline, cytokine de forte homologie avec l'IGF-1. Nous avons montré que l'insuline avait le même effet que l'IGF-1. Son activité nécessite l'activation d'IGF-1R qui est transduit par la présence du récepteur hétérodimère IGF-1R/INSR (hybrid-R) à la surface des MMC. L'insuline ne pouvant pas activer l'homodimère IGF-1R à des concentrations physiologiques, ce qui montre que l'hybrid-R confère à l'insuline la capacité à activer l'IGF-1R donc de devenir un MGF. Un inhibiteur ciblant l'IGF-1R mais également l'Hybrid-R en association avec un anti-IL-6 semblerait donc être un traitement prometteur dans la pathologie du MM pour les 44% des patients exprimant l'IGF-1R.

Bien que l’environnement intra-utérin défavorable soit associé à des conditions pathologiques à l’âge adulte, les mécanismes mis en place in utero ne sont pas encore élucidés. Nous avons établi un modèle de restriction de croissance intra-utérine (RCIU) en donnant une diète faible en sodium à la rate pendant la dernière semaine de gestation. Ce modèle se caractérise par une diminution de perfusion placentaire et une redistribution du flot sanguin, favorisant l’irrigation des organes nobles (cœur et cerveau) au détriment du rein fœtal. De plus, l’expression rénale du facteur de croissance endothéliale vasculaire (VEGF) est diminuée chez le fœtus. L’hypothèse de travail est que la néoglucogenèse hépatique et rénale augmente chez les fœtus RCIU afin de compenser la diminution de perfusion placentaire, et que l’expression rénale des récepteurs de VEGF (Flt-1 et Flk-1) est altérée à la suite de la redistribution du flot sanguin. Nos objectifs étaient de comparer l’expression protéique des enzymes de la néoglucogenèse et des récepteurs de VEGF entre les fœtus témoins et RCIU. L’aldolase B, la fructose-1,6-biphosphatase et la glucose-6-phosphatase augmentent dans les reins de fœtus RCIU par rapport aux témoins alors qu’aucun changement n’est observé dans le foie. De plus, l’expression de ces enzymes est différente selon le sexe du fœtus. Une diminution de Flt-1 est notée dans les reins de fœtus RCIU. Nos résultats démontrent que des adaptations surviennent chez le fœtus à la suite d’une insulte intra-utérine favorisant sa survie mais ayant des conséquences telles que la dysfonction rénale observée chez les adultes de ce modèle animal. À long terme, ces travaux pourront permettre d’entrevoir des avenues pour mieux identifier les approches de prévention lors de naissance à la suite d’une RCIU. / An adverse intrauterine environment is associated with several pathological conditions at adult age, however, the mechanisms underlying such a link remain to be elucidated. Feeding a low-sodium diet to dams during the last week of gestation consistently resulted in giving birth to intrauterine growth restriction (IUGR) offsprings. The present model is characterized by a reduced placental perfusion and a redistribution of a preferential blood flow to the brain and heart at the expense of the kidney. Moreover, renal expression of the vascular endothelial growth factor (VEGF) is decreased in the IUGR fetuses. In this view, we hypothesize that the hepatic and renal gluconeogenesis is increased in the IUGR fetus in order to compensate the diminished placental perfusion, and the renal expression of VEGF receptors (Flt-1 and Flk-1) is altered in response to the redistribution of the blood flow. The specific aim of this study was to compare the protein expression of gluconeogenic enzymes and VEGF receptors between IUGR and control fetuses. Aldolase B, fructose-1,6- biphosphatase and glucose-6-phosphatase were significantly increased in the IUGR fetal kidneys compared to controls. However, gluconeogenic enzymes did not show any significant change in the IUGR liver. The fetal sex had an impact on the enzymes expression. A decreased expression of Flt-1 was also noted in the kidneys of the IUGR fetuses. Our results pointed out alterations in the fetal life that may be, in a way, essentiel for the survival of the fetus, but somehow, responsible for many pathological consequences at adult age, as the renal dysfunction observed in the present model. For the long term, this work may lead to many future perspectives helping to prevent several diseases, such as hypertension or diabetes for an IUGR case.

L'hypothalamus médiobasal contient de nombreux noyaux régulant l'homéostasie énergétique en réponse aux variations des signaux métaboliques périphériques, telles que les nutriments et les hormones, l'informant de l'état énergétique de l'individu. Parmi ces noyaux, le noyau arqué hypothalamique (NA) est considéré comme le noyau clé de la régulation de la prise alimentaire. En effet, il est capable de recevoir et d'intégrer les informations métaboliques périphériques, pour ensuite les relayer vers les autres noyaux hypothalamiques régulant la prise alimentaire. Dans ce contexte, l'accès des molécules périphériques au NA est une étape importante dans la régulation de la prise alimentaire. L'organisation des interfaces sang/cerveau à ce niveau est d'ailleurs très particulière, suggérant une régulation spécifique de l'accès des molécules périphériques vers le NA. En effet, deux types de vaisseaux sont retrouvés dans cette région cérébrale : 1- les vaisseaux de la barrière hématoencéphalique (BHE) dans le NA et 2- les vaisseaux fenêtrés dans l'éminence médiane (EM), un organe circumventriculaire (OCV) adjacent au NA. Alors que les vaisseaux de la BHE présentent des propriétés de barrière et régulent les échanges sang/NA, les vaisseaux de l'EM possèdent de nombreuses fenestrations facilitant les échanges sang/EM. Ces deux types de vaisseaux ont la particularité d'être contactés par des cellules épendymaires hautement spécialisées formant le bas du 3ème ventricule. Ces cellules, appelées " tanycytes ", expriment des protéines de jonctions serrées suggérant leur participation à la régulation des échanges sang/cerveau dans cette région cérébrale. En effet, des études menées au sein du laboratoire ont montré que les tanycytes de l'EM, contactant les vaisseaux fenêtrés, expriment des protéines de jonctions serrées (JS) organisées en ceinture continue autour de leur pôle apical. Ces JS créent ainsi un épendyme étanche qui limite les échanges EM/LCR. A l'inverse, les tanycytes du NA, contactant les vaisseaux de la BHE, expriment des protéines de JS non organisées en leur pôle apical. L'épendyme du NA est ainsi perméable et favorise les échanges LCR/NA. Le but de mon travail de thèse a donc été de comprendre, en prenant en compte tous ces éléments -c'est-à-dire la présence de vaisseaux fenêtrés, de vaisseaux de la BHE et des tanycytes -, comment est organisé l'accès des signaux métaboliques périphériques vers le NA et si cet accès pouvait être modulé afin de contrôler l'homéostasie énergétique. Nos expériences ont montré que, chez la souris mâle adulte, une glucopénie induite par le jeûne ou par le 2-desoxyglucose induisait une réorganisation structurale des vaisseaux et de l'épendyme au niveau de l'EM et du NA, modifiant ainsi les échanges sang/cerveau. En effet, chez ces souris, nous avons observé une augmentation du nombre de vaisseaux fenêtrés au niveau de l'EM et du NA, ainsi qu'une réorganisation fonctionnelle des protéines de JS au niveau du ventricule : les tanycytes du NA, contactant des vaisseaux fenêtrés à présent, réorganisent leurs protéines de jonctions serrées (JS) afin d'assurer l'homéostasie cérébrale. Ces réorganisations induisent alors un meilleur accès des molécules périphériques vers le NA. De plus, nos résultats ont montré que cette plasticité est induite par le VEGF-A, produit localement par les tanycytes. En effet, la neutralisation du VEGF-A bloque la plasticité de l'EM/NA induite par l'hypoglycémie et perturbent la réponse physiologique hyperphagique lors de la réalimentation. Enfin, nos données supplémentaires indiquent que cette plasticité de l'EM/NA est conservée dans différents modèles alimentaires et se produit également au cours de la journée, suggérant son implication dans le contrôle circadien du comportement alimentaire.

Les nanomatériaux combinant des fonctions de ciblage, d'imagerie, de thérapie et de détection font l'objet de nombreuses recherches dans le domaine de la santé. Les travaux présentés dans cette thèse concernent la multi‐fonctionnalisation de nanoparticules (NPs) par un procédé de synthèse supportée. Le support solide développé dans cette étude est constitué d'un matériau poreux en verre sur lequel sont greffées de manière temporaire des nanoparticules de silice. La fonctionnalisation de la surface des nanoparticules a été réalisée de façon automatisée par une chimie de synthèse dite aux phosphoramidites. Dans un premier temps, cette technique a permis d'obtenir des densités de greffage de l'ordre de 5000 à 7000 oligonucléotides par nanoparticule, ce qui représente une fonctionnalisation 10 à 20 fois supérieure à celles obtenues par des méthodes de greffage en solution. Les brins d'ADN synthétisés sur les NPs ont montré une bonne accessibilité pour l'hybridation avec un brin d'ADN complémentaire, ouvrant la voie à des applications thérapeutiques ou à l'intégration de ces objets dans des systèmes de détection. La deuxième partie de ces travaux est consacrée à la vectorisation d'une protéine thérapeutique, le G‐CSF (facteur de croissance de colonies de granulocytes), par des nanoparticules présentant également des propriétés d'imagerie. Ces nanovecteurs thérapeutiques ont montré des propriétés de stimulation cellulaire in vitro et de ciblage de la rate, organe réservoir de neutrophiles, in vivo. Enfin il a été démontré que la modification de NPs sur support ouvre des perspectives intéressantes pour la préparation d'assemblages complexes de nanoparticules (dimères et NPs dissymétriques) / Nanomaterials combining targeting, imaging, therapy and sensing properties are of growing interest for biomedical applications. The work reported in this thesis concerns nanoparticle (NP) multifunctionalization by solid phase synthesis. The solid support developed in this study is composed of a porous glass material on which silica NPs are temporarily grafted. Nanoparticle surface functionalization was performed by automated synthesis using phosphoramidite chemistry. Firstly, high surface loadings from 5000 to 7000 oligonucleotides per NP were achieved, representing a functionalization 10 to 20‐fold greater than those obtained by coupling methods in solution. DNA strands synthesized on NPs showed a good accessibility for hybridization with a complementary DNA strand, paving the way for therapeutic applications or integration of these objects in detection systems. The second part of this work was devoted to the vectorization of a therapeutic protein, GCSF (Granulocyte‐Colony Stimulating Factor) by nanoparticles that also exhibited imaging properties. These therapeutic nanocarriers showed cell stimulating properties in vitro and spleen targeting, which is a reservoir of neutrophils, in vivo. Finally, it was demonstrated that the solid phase modification of NPs opens interesting perspectives for the production of complex nanoparticle assemblies (dimers and asymmetric NPs)

La dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) est une maladie liée à l'X caractérisée par la détérioration progressive des muscles en raison de l'absence de la protéine dystrophine. Les muscles atteints chez l'homme ou dans des modèles animaux (souris mdx) présentent une fibrose, accumulation excessive de protéines de la matrice extracellulaire. Parmi les facteurs induisant la fibrose se trouvent le Facteur de Croissance de Transformation de type β (TGF-β) et le Facteur de Croissance du Tissu Conjonctif (CTGF). Ce dernier est une cible de la voie de signalisation médiée par TGF-β/SMAD et est responsable des effets profibrotiques de TGF-β. La régulation de l'expression de CTGF médiée par TGF-β dans les cellules musculaires est peu connue. Nous décrivons ici un nouvel élément de liaison SMAD situé dans la région 5’UTR du gène de CTGF, important pour l'expression de CTGF médiée par le TGF-β dans des myoblastes. De plus, nos résultats suggèrent que d'autres sites de liaison du facteur de transcription présents dans le 5’UTR du gène de CTGF sont importants pour cette expression.Par ailleurs, le Facteur de Nécrose Tumorale (TNF) est une cytokine inflammatoire présente dans les muscles atteints de DMD et est responsable de la nécrose du muscle et de l'infiltration de cellules inflammatoires. Nous montrons que l’expression du récepteur soluble TNFRI par électrotransfert (ET) dans le muscle tibialis anterior de la souris atténue l'inflammation, les dommages et la fibrose dans le muscle squelettique des souris mdx, et provoque une augmentation de la force musculaire. Par conséquent, nous proposons l'ET comme thérapie efficace anti-TNF pour le traitement de dystrophies musculaires. / The Duchenne Muscular Dystrophy (DMD) is an X-linked disease characterized by progressive damage in the muscle due to the absence of the dystrophin protein. Fibrosis, the excessive accumulation of extracellular matrix (ECM) proteins, is also present in the muscle of DMD patients and several animal models (such as the mdx mice). Among the factors that induce fibrosis are Transforming Growth Factor type β (TGF-β) and Connective Tissue Growth Factor (CTGF), the latter being a target of the TGF-β/SMAD signaling pathway and is the responsible for the profibrotic effects of TGF-β and are augmented in fibrosis tissues. Little is known about the regulation of the expression of CTGF mediated by TGF-β in muscle cells. In here, we described a novel SMAD Binding Element (SBE) located in the 5’ UTR region of the CTGF gene important for the TGF-β mediated expression of CTGF in myoblasts. In addition, our results suggest that additional transcription factor binding sites present in the 5’ UTR of the CTGF gene are important for this expression. On the other hand, the Tumor Necrosis Factor (TNF) is an inflammatory cytokine that is present in DMD muscles and is responsible for muscle necrosis and inflammatory cell infiltration. In this study, we show that the increased expression of the soluble TNF Receptor I by electrotransfer (ET) in the tibialis anterior muscle attenuates inflammation, damage and fibrosis in the skeletal muscle of the mdx mice. In addition, we found increased muscle strength in the mdx mice. Therefore, we propose that ET could be used as an efficient anti-TNF therapy for treating muscle dystrophies.

Ribosomal transcription produces RNAs essential for the structure and function of the ribosomes. The up-regulation of this transcription during growth is known to address the increased needs of the cell for proteins and thus for ribosomes. However, the mechanisms involved in this regulation are not well characterized. Our laboratory was the first to demonstrate a direct link between growth and ribosomal transcription. Stimulation of mammalian cells with serum or EGF causes an immediate increase in ribosomal RNA synthesis. This activation is dependant on the ERK pathway and on the phosphorylation of the architectural factor UBF by ERK. However, the increase of transcription resulting from this stimulation is not correlated with an increase in RNA polymerase I loading on the ribosomal genes but is rather explained by a higher elongation rate of the polymerase. We also showed that UBF blocks elongation when it is not phosphorylated and is permissive to it when it is phosphorylated by ERK. These results argue against the actual model suggesting that regulation occurs only at initiation level and demonstrate for the first time the existence of a regulation at the elongation level. Theoretically, ribosomal transcription could also be regulated at the level of gene activation since more than half of the ribosomal genes are silenced at ail times. According to the current view, DNA methylation is involved in the silencing process, but we have found that, at least in human cells, it is only important to silence a certain portion of the ribosomal genes. Loss of methylation following genetic inactivation of both DNA methyltransferase 1 and 3b in human colorectal carcinoma cell line results in a decrease in both ribosomal transcription and proliferation rates and in defects in ribosomal RNA processing and nucleolar structure. Moreover, loss of DNA methylation leads to an ingression of RNA polymerase II in the ribosomal locus thus probably causing the problems observed in these cells. We suggest that both DNA methylation and regulation of the elongation rates are essential mechanisms to maintain a high density of RNA polymerase I elongating complexes on the ribosomal genes in order to exclude RNA polymerase II and ensure an efficient ribosome biogenesis. / La transcription ribosomale synthétise les ARN qui sont au coeur de la fonction et de la structure des ribosomes. L'augmentation de cette transcription en condition de croissance est connue et répond aux besoins accrus de la cellule en protéines et donc en ribosomes. Toutefois, les mécanismes impliqués dans cette régulation étaient inconnus. Notre laboratoire a montré l'existence d'un lien direct entre la croissance et la transcription ribosomale. Nous avons montré que la stimulation de cellules de mammifères par le facteur EGF ou l'ajout de sérum cause une augmentation rapide de la transcription ribosomale. Cette activation est dépendante de la voie ERK qui cible le facteur architectural UBF. Nous avons aussi montré que cette stimulation n'entraîne pas de recrutement massif d'ARN polymérases 1 aux gènes ribosomaux, et ce malgré l'augmentation de la synthèse d'ARN ribosomaux. Par contre, la vitesse d'élongation de la polymérase explique quantitativement cette augmentation et celle-ci est régulée par l'état de phosphorylation d'UBF par ERK. Ces résultats remettent en question le modèle actuel de régulation unique au niveau de l'initiation des transcrits et démontrent pour la première fois l'existence d'une régulation au niveau de l'élongation. La proportion élevée de gènes ribosomaux silencieux suggère que ceux-ci puissent être activés et constituer un troisième niveau de régulation de la transcription ribosomale. La méthylation de l'ADN est suggérée comme étant importante pour l'établissement et le maintien de ces gènes dans un état silencieux. Or, nous avons montré que la méthylation de l'ADN explique l'état silencieux d'une partie et non de la totalité de ces gènes dans des cellules humaines en culture. De plus, nous avons montré que la perte de méthylation, suite à l'inactivation génique de DNMTl et 3b, entraîne une diminution de la transcription ribosomale et de la vitesse de prolifération ainsi que des défauts dans la transformation de TARN précurseur et dans la structure nucléolaire. De plus, la perte de méthylation entraîne une incursion de TARN polymérase II dans le locus ribosomal ce qui cause vraisemblablement les problèmes observés. Nous suggérons que la méthylation de l'ADN et la régulation de l'élongation des transcrits sont des mécanismes essentiels pour le maintien d'une forte densité de complexes en élongation sur les gènes ribosomaux de façon à exclure TARN polymérase II pour ainsi assurer une biogenèse efficace des ribosomes.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal. / Caractérisée surtout par une dégradation du cartilage, l'arthrose est une maladie articulaire qui montre également une sclérose de l'os sous-chondral et une formation d'ostéophytes. Au stade clinique, cette pathologie progressive atteint environ 60% des personnes âgées de 65 ans et plus. La dégradation du cartilage qui accompagne cette maladie est la manifestation clinique la plus importante et la plus étudiée au niveau moléculaire. Par contre, la sclérose de l'os sous-chondral était toujours considérée comme secondaire ou comme un phénomène de compensation suite à l'érosion du cartilage. Cependant, la recherche fondamentale intensive sur le cartilage n'a toujours pas réussi à identifier le(s) mécanisme(s) responsable(s) de la dégradation du cartilage. Ainsi, le traitement qui existe présentement se limite à calmer la douleur des patients. Par ailleurs, les études visant à comprendre le rôle de l'os sous-chondral, qui fait partie des tissus touchés par cette maladie, ont été toujours marginales. Notre hypothèse générale est qu'un défaut dans le métabolisme de l'os sous-chondral pourrait contribuer au déclenchement et/ou à la progression de l'arthrose. Ce défaut expliquerait la sclérose osseuse de l'os sous-chondral observée chez ces patients, situation qui serait alors responsable de la détérioration du cartilage via soit; i) un (des) messager(s) chimique(s), ii) l'imposition d'une contrainte mécanique sur le cartilage, ou iii) les deux précédents. De manière à démontrer notre hypothèse générale, nous avons utilisé des extraits d'expiants ex vivo et nous avons mis au point une technique pour cultiver les ostéoblastes provenant du plateau tibial medial de patients arthrosiques ou d'individus normaux. Au tout début de nos travaux nous avons démontré que, grâce à la mesure de marqueurs spécifiques, les ostéoblastes provenants de patients arthrosiques auraient un phénotype altéré lorsque comparé aux normaux. Ainsi, au niveau des expiants d'os sous-chondral, nos données montrent que l'activité de la phosphatase alcaline était augmentée dans les ostéoblastes arthrosiques avant et après une stimulation avec la 1,25 (OH)2 D3 (métabolite actif de la vitamine Ds). La même observation a été notée pour l'ostéocalcine suite à une stimulation à la 1,25 (OH)2 D3 chez les ostéoblastes arthrosiques. Par ailleurs, les ostéoblastes arthrosiques ont montré une résistance à la stimulation par la PTH et la prostaglandine E2 (PGE2), leur taux de synthèse de l'AMPc (Adénosine 3', 5' monophosphate cyclique) étant 50% et 100% inhibé versus les ostéoblastes normaux. Une altération dans la voie de signalisation de la PTH pourrait être la cause de cette inhibition de synthèse d'AMPc chez les ostéoblastes arthrosiques. Toutefois, une stimulation directe de l'adénylate cyclase avec de la foskoline, produit qui court-circuite le récepteur à la PTH et la protéine Gs, a ramené le niveau de l'AMPc à la normale, démontrant que l'activité de l'adénylate cyclase est intacte dans les ostéoblastes arthrosiques. Un traitement à la toxine de choléra qui ribosyle la protéine Gs n'a toutefois pas réussi à augmenter le niveau de l'AMPc après stimulation avec la PTH, ce qui signifie que l'activité de la protéine Gs est partiellement et/ou totalement inhibée. Au contraire, la stimulation de la protéine Gi (la protéine G inhibitrice) par la toxine de Pertussis a complètement inhibé la formation de l'AMPc après stimulation avec la PTH indiquant que la protéine Gi est intacte. Par la suite, la protéine Gs fût l'objet d'une quantification par western blot qui n'a révélé aucun changement au niveau de la quantité de cette protéine versus les ostéoblastes normaux. La quantification du récepteur de la PTH à l'aide d'une étude de liaison avec du I-PTH a montré une diminution de 50% du niveau de récepteurs à la PTH. Cette diminution pourrait être causée par une désensibilisation hétérologue par la PGE2. En effet, les ostéoblastes arthrosiques synthétisent plus de PGE2 que les ostéoblastes normaux et l'inhibition de la synthèse de la prostaglandine par le Naproxen a ramené à la normale le niveau de formation de l'AMPc après stimulation avec la PTH. Par ailleurs, le niveau d'ARNm du récepteur à la PTH évalué par RT-PCR semi-quantitatif était diminué. Le ratio avec le glycéraldehyde phosphate déshydrogénase (GAPDH) dans les ostéoblastes arthrosiques était de 25 à 65 % plus faible que pour les ostéoblastes normaux, le niveau d'inhibition variant en parallèle avec la sévérité de la maladie. Ceci indique que l'expression du récepteur à la PTH était diminuée dans les cellules arthrosiques. Nos résultats ont également montré que l'activité du système PA/Plasmine, le premier système à initier la résorption osseuse, est inhibé dans l'os sous-chondral arthrosique ce qui pourrait entraîner une diminution de la résorption osseuse. Le niveau protéique et l'activité de l'activateur du plasminogène de type urokinase (uPA) et du facteur de croissance de type insulinique-1 (IGF-1) sont tous les deux augmentés dans les expiants arthrosiques comparativement aux expiants normaux, tandis que le niveau de la protéine inhibitrice du plasminogène (PAI-1) pour sa part était inchangée. Afin de vérifier si les modifications observées avec les expiants arthrosiques étaient vraiment dues à un défaut dans les ostéoblastes arthrosiques eux-mêmes, nous avons repris ces expériences avec ces cellules. Les niveaux d'uPA (activité et protéine) et d'IGF-1, dans les surnageants des ostéoblastes arthrosiques ont montré une augmentation significative comparativement aux ostéoblastes normaux. Par contre, le niveau de l'inhibiteur du PA (PAI-1) était similaire entre arthrose et normal. Puisque les systèmes d'uPA/plasmine et d'IGF1/IGFBP sont tous deux impliqués dans la résorption et/ou la formation osseuse, et que des travaux récents démontraient une interrelation possible de ces deux systèmes, nous avons étudié cette question chez les ostéoblastes arthrosiques. L'ajout d'IGF-1 diminua significativement P<0.05) le niveau d'uPA seulement dans les ostéoblastes arthrosiques. Au contraire, l'uPA n'a pas modifié le niveau de l'IGF-1 dans les ostéoblastes normaux ni dans les ostéoblastes arthrosiques. Suite à une stimulation avec l'IGF-1, l'activité basale de l'uPA fut augmentée dans les ostéoblastes arthrosiques, tandis qu'aucun changement n'était observé dans les ostéoblastes normaux. L'ajout de plasminogène a fortement augmenté l'activité de l'uPA via un phénomène de rétro-action positive causée par la génération de la plasmine qui peut à son tour activer l'uPA latent en uPA actif. Le mécanisme de rétroaction positive fut inhibé par le PAI-1 et l'a2-antiplasmine. Le traitement des ostéoblastes arthrosiques avec l'IGF-1 a inhibé le phénomène de rétroaction positive et ceci d'une façon dose-dépendante, ce facteur de croissance n'ayant aucun effet chez les ostéoblastes normaux. Cette inhibition ne peut être due à une modification du niveau de PAI-1 parce que le niveau de cette protéine n'a révélé aucun changement après le traitement avec l'IGF-1. L'ajout d'IGF-1 a aussi diminué l'activité de la plasmine, dosée par l'hydrolyse d'un substrat spécifique, dans les ostéoblastes arthrosiques mais pas dans les ostéoblastes normaux. En résumé nos travaux ont montré que les ostéoblastes arthrosiques avaient un métabolisme altéré. En plus de montrer des changements à la réponse de marqueurs spécifiques, ces cellules pathologiques présentaient une diminution au niveau des récepteurs à la PTH et une réponse anormale au système uPA/plasmine à leur traitement avec l'IGF-1. Cette observation est appuyée par la diminution du nombre de récepteurs à la PTH dans les ostéoblastes, une situation qui est aussi en accord avec une diminution possible de la résorption osseuse. Si ces observations in vitro se transposent in vivo, ceci signifie que la sclérose de l'os sous-chondral pourrait être due en partie à la diminution de la résorption osseuse. Par ailleurs, l'augmentation du niveau d'IGF-1 et son rôle dans le contrôle négatif de la rétroaction positive du système uPA/Plasmine pourrait aussi contribuer à augmenter la formation osseuse et réduire la résorption osseuse respectivement. La sclérose de l'os sous-chondral pourrait alors jouer un rôle clef dans le déclenchement et la progression de l'arthrose.

La capacité des cellules à être invasives et métastasiques est une caractéristique fondamentale de la malignité tumorale. Nous avons récemment montré que le facteur d’ADP-ribosylation 1 (ARF1) est surexprimé dans les lignées cellulaires hautement invasives du cancer du sein et que la stimulation du récepteur au facteur de croissance épidermique (EGFR) peut activer cette isoforme pour contrôler la migration ainsi que la prolifération. Cependant, le rôle de cette GTPase dans la régulation du processus d’invasion cellulaire et les mécanismes moléculaires associés demeure inconnu. Nous avions comme objectifs dans cette thèse, de définir les voies de signalisation sous le contrôle d’ARF1 dans les cellules de cancer du sein et démontrer que l’expression et l’activation de cette GTPase est associée à un phénotype hautement invasif. Nos études démontrent que la modulation de l'expression et l'activité d’ARF1 affecte la capacité des cellules MDA-MB-231 (pour M. D. Anderson-metastatic breast-231), une ligne hautement invasive, à dégrader la matrice extracellulaire via l'activité de la métalloprotéinase MMP-9. ARF1 contrôle les deux principales structures impliquées dans l'invasion, en jouant sur la maturation d’invadopodes ainsi que la relâche de microvésicules membranaires. D’un point de vue mécanistique, l'axe de signalisation ARF1, RhoA-RhoC et la chaine légère de la myosine (MLC) explique ces phénomènes. De plus, nous démontrons que l'un des mécanismes par lequel ARF1 régule la migration est en contrôlant l'assemblage des points adhésions focaux et ce, dans plusieurs types de cellules cancéreuses du sein. ARF1, en étant un membre du complexe d’adhésion, réglemente le recrutement et l’activité de protéines clés à la β1-intégrine tels que la paxilline, la talin et la kinase d’adhésion focale (FAK). Pour finir, nous rapportons que ARF1 et ARF6 ont un rôle majeur dans la transition épithélio-mésenchymateuse. ARF1 est retrouvé fortement exprimé dans les tissus de sous-types les plus agressifs et les plus avancés de cancer du sein. Dans un modèle murin, la modulation à la baisse de l’expression d’ARF1 dans les cellules MDA-MB-231 corrèle avec la diminution de croissance des tumeurs primaires et l’installation des métastases pulmonaires. De plus, nous rapportons que la surexpression des ARF dans des cellules non invasives, les MCF7 (pour Michigan Cancer Foundation-7), permet la nidification de métastases. En effet, dans les MCF7, ARF1 contrôle l’adhésion intercellulaire via la β-caténine et l’E-cadhérine, promeut l’activation de l’oncogène Ras (pour Rat Sarcoma/ Rat Fibrosarcoma virus) et l’expression de plusieurs inducteurs de transition épithélio-mésenchymateuse comme snail et slug. De plus, ARF1 contrôle l’invasion, la prolifération cellulaire et même la résistance à certains agents chimio-thérapeutiques. Globalement, nos études identifient ARF1 comme un interrupteur moléculaire de la progression tumorale et suggèrent que la limitation de son expression/activité pourrait améliorer le devenir des patients atteints du cancer du sein. / Invasive and metastatic chapacities are fundamental features for tumor malignancy. We have recently shown that the ADP-ribosylation factor 1 (ARF1) is over-expressed in highly invasive breast cancer cell lines and stimulation of the epidermal growth factor receptor (EGFR) may activate this isoform to regulate migration and proliferation. However, the role of this GTPase in regulating cell invasion process and related molecular mechanisms remain unknown. In this thesis, we had as objectives, to define the signaling pathways under the control ARF1 in breast cancer cells and show that the expression and activation of the GTPase is associated with highly invasive phenotype. Our studies show that the modulation of the expression and activity of ARF1 affect the ability of MDA-MB-231 cells (M. D. Anderson-metastatic breast-231), a highly invasive line, to degrade the extracellular matrix via the activity of the metalloproteinase MMP-9. ARF1 controls the two main structures involved in the invasion, playing on invadopodia maturation and shedding of membrane microvesicles. The molecular mechanisms involve the regulation of RhoA and RhoC activity by ARF1 and the following downtream events associated with and the myosin light chain (MLC) phosphorylation. Furthermore, we demonstrate that ARF1 also regulates migration by controlling the assembly of focal adhesion complexes in many types of breast cancer cells. ARF1, also prensent in adhesion complexes, regulates the recruitment and activity of key proteins such as paxillin, talin and focal adhesion kinase (FAK) to β1 integrin. Finally, we report that ARF1 and ARF6 play a major role in the epithelial-mesenchymal transition (EMT). ARF1 is found highly expressed in tumor tissue of the most aggressive and advanced subtypes of breast cancer. Lowered expression of ARF1 in vivo in the MDA-MB-231 cells impars tumor growth in primary tumors and inhibits lung metastasis. We report that upregulation of the ARF in non-invasive cells, MCF7 (Michigan Cancer Foundation-7) induce metastasis nidification. Indeed, we show in MCF7 that ARF1 controls intercellular adhesion via the β-catenin and E-cadherin, promotes Ras (Rat Sarcoma/ Rat Fibrosarcoma virus) oncogene activation, and conrols expression of several epithelial-mesenchymal transition markers such as snail and slug. Moreover, we demonstrate that ARF1 controls invasion, proliferation and even resistance to certain chemo-therapeutic agents, in MCF7 cells. Overall, our studies identify ARF1, as a molecular switch of tumor progression and suggest that limiting its expression / activity could improve the outcome of breast cancer patients.