BRAGA, Marcus Davis Machado. Avaliação dos efeitos renais e vasculares do veneno da Bothrops insularis e de frações isoladas. 2006. 240 f. Tese (Doutorado em Farmacologia) - Universidade Federal do Ceará. Faculdade de Medicina, Fortaleza, 2006. / Submitted by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2012-06-14T13:50:37Z No. of bitstreams: 1 2006_tese_mdmbraga.pdf: 4080070 bytes, checksum: 509ef8d3bd5cea21bb7e061583220e8c (MD5) / Approved for entry into archive by Eliene Nascimento(elienegvn@hotmail.com) on 2012-06-14T16:35:42Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2006_tese_mdmbraga.pdf: 4080070 bytes, checksum: 509ef8d3bd5cea21bb7e061583220e8c (MD5) / Made available in DSpace on 2012-06-14T16:35:42Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2006_tese_mdmbraga.pdf: 4080070 bytes, checksum: 509ef8d3bd5cea21bb7e061583220e8c (MD5) Previous issue date: 2006 / We investigated the biochemical and biological effects of the whole venom from Bothrops insularis (popularly known as “golden lancet”), and four of its fractions, a thrombin-like enzyme, a lectin-like substance, an L-amino acid oxidase and a phospholipase A2, in perfused rat kidneys and vascular sistem. The fractions were purified by a combination of Sephadex gel filtration in HPLC columns, and ion-exchange chromatography on DEAE-Sephadex in reverse phase, low-pressure affinity columns. We used a modified isolated perfused rat kidney assay, with Krebs-Henseleit solution as the perfusion fluid (Bowman, 1970; Fonteles et al., 1998). Selected parameters of renal function during stable experimental conditions were evaluated before and at 60, 90, and 120 minutes after infusion of venom and its fractions, with the first 30 minutes interval constituting the paired control. In the systemic vascular bed (Ferreira, 1965), the arterial pressure was evaluated by a manometer connected through a canule to carotid common artery and the venom was injected into the jugular vein, with registers made at every 10 minutes after administration in increasing doses, until an infusion of 300mcg was reached at 60 minutes. In the isolated rat mesenteric blood vessels method (McGregor, 1965), the perfusions were done with Krebs-Henseleit solution, at a constant flow rate of 4mL/minute. The perfusion pressure was measured manometrically. Statistical evaluations were performed by analysis of variance (ANOVA) and Bonferroni test, at the 5% significance level. In perfused kidney studies, the group treated with the whole venom showed a fall in all physiological parameters, except in potassium transport. With the lectin-like fraction, the perfusion pressure rose initially, followed by a fall, along with urinary flow and glomerular filtration rate. Sodium and potassium tubular reabsorption increased, with a fall in the osmotic clearance. The thrombin-like fraction promoted an initial rise followed by a fall in the end, in almost all parameters except in the renal vascular resistance. The sodium and chloride tubular reabsorption fell. There was an initial rise in the potassium transport, and an initial rise followed by a fall in the osmotic clearance. With the L-amino acid oxidase fraction, there was a fall in all the parameters studied. The Phospholipase A2 fraction induced a rise in the physiological and vascular parameters, as also in the potassium transport and osmotic clearance; accompanied by a fall in sodium and chloride reabsorption. With the exception of the thrombin-like fraction, all the substances tested induced acute tubular necrosis in perfused kidneys in the end. Protein extravasation into the Bowman space was evidenced in all perfused kidneys except in those treated with the whole venom; but was more intense with the thrombin-like fraction. In the systemic arterial bed, the whole venom raised arterial pressure in a dose-dependant manner, except at the concentration of 10mcg; in addition to causing intense pulmonary hemorrhage with neutrophils and alveolar lymphocyte proliferation, renal hemorrhage, and generalized vascular dilatation and congestion. In the isolated mesenteric artery, there was a marked fall in perfusion pressure when the whole venom was infused into the vessel pre-contracted with phenillephrine, as also in the isolated vessel without phenillephrine. We conclude that Bothrops insularis venom shows vasodilatation and hemorrhagic potential, like other venoms of the genus; but, different from other Bothrops venoms, it also reveals a significant necrotic activity when perfused into isolated rat kidney, causing acute tubular necrosis. / Foram investigados os efeitos do veneno da serpente Bothrops insularis e de suas frações, lectina, L-aminoácido oxidase, trombina símile e fosfolipase A2, no rim isolado e sistema vascular de rato. As frações foram purificadas a partir de uma combinação de procedimentos cromatográficos, usando colunas de HPLC de exclusão molecular, troca iônica, fase reversa e colunas de baixa pressão de afinidade. Foi utilizada a perfusão de rim isolado de rato e a solução de Krebs-Henseleit modificada (Bowman, 1970; Fonteles et al. 1998). Parâmetros selecionados da função renal foram avaliados durante as condições experimentais, com a infusão do veneno e suas frações, aos 60, 90, e 120 minutos. Os primeiros 30 minutos serviram de controle interno. No leito arterial sistêmico de rato (Ferreira, 1965) a pressão arterial foi avaliada por manômetro conectado por cânula à artéria carótida comum, e o veneno injetado na veia jugular. Os registros foram realizados a cada 10 minutos após a administração de doses crescentes do veneno, até a infusão da dose de 300mcg, aos 60 minutos. Na Perfusão do leito arterial mesentérico isolado de rato (McGregor, 1965), utilizou-se a solução de Krebs-Henseleit em fluxo constante de 4mL/minuto. A pressão de perfusão foi registrada manometricamente. A avaliação estatística foi determinada por análise de variância (ANOVA) e teste de Bonferroni, com nível de significância menor de 5%. No rim, o grupo tratado com o veneno apresentou redução em todos os parâmetros avaliados, com exceção da absorção de potássio. Com a lectina a pressão de perfusão aumentou inicialmente e caiu em seguida, juntamente com o fluxo urinário e o ritmo de filtração glomerular. Houve aumento na reabsorção de sódio e potássio, com redução no clearance osmótico. Com a trombina-símile, ocorreu aumento inicial seguido de queda no final em quase todos os parâmetros, com exceção da resistência vascular renal. A reabsorção tubular do sódio e do cloro caiu; houve elevação inicial do transporte de potássio; com aumento seguido de queda do clearance osmótico. Com a L-aminoacido oxidase houve queda em todos os parâmetros avaliados. Com a fosfolipase A2 houve elevação nos parâmetros fisiológicos e vasculares; no transporte tubular de potássio e no clearance osmótico; com queda na reabsorção de sódio e cloro. Todos os rins mostraram, no final, sinais de necrose tubular aguda, com exceção dos perfundidos com a trombina-símile. Excetuando os tratados com veneno, todos os rins apresentaram, ao final, extravasamento protéico para o espaço de Bowman. No leito arterial sistêmico o veneno produziu redução na pressão arterial sistêmica diretamente proporcional à quantidade de veneno administrada, excetuando a dose de 10mcg, além de intensa hemorragia pulmonar com proliferação de neutrófilos e linfócitos nos alvéolos, hemorragia no rim e congestão generalizada. No leito arterial mesentérico se observou uma redução na presão quando o veneno foi administrado em leito arterial pré-contraído com fenilefrina, como também isoladamente, na ausência de fenilefrina. O veneno da Bothrops insularis mostrou potencial hemorrágico e vasodilatador semelhante aos outros venenos de serpentes do gênero, com atividade necrotizante superior nos rins, onde provocou necrose tubular aguda, ao contrario do observado com outros venenos do mesmo gênero, em experimentos no rim isolado de rato.

LIMA JUNIOR, Roberto César Pereira. Estudo morfofuncional e dos mediadores inflamatórios envolvidos na patogênese da mucosite intestinal induzida por irinotecano (CPT-11) em camundongos : papel da caspase-1, interleucina-18 e óxido nitríco. 200 f. Tese (Doutorado em Farmacalologia) - Universidade Federal do Ceará. Faculdade de Medicina, Fortaleza, 2008. / Submitted by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2012-10-01T16:25:31Z No. of bitstreams: 1 2008_tese_rcplimajúnior.pdf: 6895218 bytes, checksum: c7ffed59590db9742738acc72b3fab61 (MD5) / Approved for entry into archive by Eliene Nascimento(elienegvn@hotmail.com) on 2012-10-01T16:30:37Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2008_tese_rcplimajúnior.pdf: 6895218 bytes, checksum: c7ffed59590db9742738acc72b3fab61 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-10-01T16:30:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2008_tese_rcplimajúnior.pdf: 6895218 bytes, checksum: c7ffed59590db9742738acc72b3fab61 (MD5) Previous issue date: 2008 / Severe Intestinal Mucositis (IM) and diarrhea are frequent and dose-limiting side-effects of colon cancer chemotherapy with irinotecan (CPT-11). At present, much of IM pathophysiology remains unknown. Aims: To study the mechanisms and inflammatory mediators involved in CPT-11-induced intestinal mucositis, verifying the role of the protease caspase-1, cytokines interleukin-1 (IL-1), interleukin-18 (IL-18) and interleukin-33 (IL-33), nitric oxide, 5-lipoxygenase and PAF as well as the sequence of activation of these mediators in the inflammatory response and morphofunctional contexts. Methods: Swiss, C57BL/6 (BL), BALB/c (BC) male mice or caspases-1(Casp-1-/-), IL-18 (IL-18-/-), inducible nitric oxide synthase (iNOS-/-), 5-Lipoxygenase (5-LOX-/-), PAF receptor (PAFr-/-) knockout mice, 22g, were divided into groups (n=4-5) and treated for 4 days with saline (5 mL/kg, i.p.) or CPT-11 (60 mg/kg, i.p.) or were given IL-18bp (IL-18 binding protein, 200 µg/animal/4 days, i.p.), aminoguanidine (AG, 50 mg/kg, s.c, 2x/day/4 days), IL-33 (1 µg/animal/4 days, i.v, 1h previously CPT-11) or loperamide ([4x3 mg/kg and 4x30 mg/kg]/animal, s.c.) co-administered with CPT-11. On day 5, diarrhea and leukocyte counts were assessed, and following sacrifice duodenal portions of the animal were collected to assess myeloperoxidase (MPO, neutrophils/mg tissue) and nitric oxide synthase (iNOS pM citruline /h/mg protein) activity, morphometric analysis, and in vitro contractility (%contraction in relation to KCl 60 mM). ANOVA/Newman Keuls or Kruskal Wallis/Dunn were used as statistical tests. P<0.05 was accepted. Results: IM was morphofunctionally similar in both BL and Swiss. CPT-11 induced leukopenia in all animal lineages despite the treatment given. Additionally, CPT-11 induced MPO, increased in vitro contractility and diarrheic events, and villi/crypt ratio reduction in BL and BC mice in comparison with saline treated mice (p<0.05). Despite the injection of CPT-11, Casp-1-/-, IL-18-/- or IL-18bp treated BC mice presented reduced MPO and iNOS activities and also increased villi/crypt ratio, reduced duodenal in vitro contractility and mild diarrhea similar to saline-treated mice (P>0.05), similar to the patterns seen in IL-33 treated mice. The reduced iNOS activity found in the earlier mice led us to investigate the CPT-11 effect on iNOS /- and aminoguanidine-treated mice. Lower IL-1beta and KC cytokine levels, as well as reduced MPO activity were found. Also, preserved villi/crypt ratio and muscle layer thickness, normal duodenal contractility and diarrheic events were seen similarly to saline-treated mice (p>0.05). However, CPT-11-treated PAFr-/- presented morphofunctional alterations and increased intestinal MPO activity. 5-LOX-/- or loperamide treated mice (positive control), both injected with CPT-11, exhibited increased MPO activity and morphometric alterations, but no exacerbation on in vitro contractility was observable. Conclusion: Taken together, these results suggest the role of caspase-1/Interleukin-18/nitric oxide cascade on pathogenesis of CPT-11-induced morphofunctional alteration and inflammatory response (IM). IL-33 seems to be a compensatory protective factor on this inflammatory cascade. 5-LOX and PAFr show a likely secondary role on IM pathophysiology. / A Mucosite Intestinal (MI) e a diarréia severas são efeitos colaterais freqüentes (15-25%) e limitantes da quimioterapia do câncer de cólon com Irinotecano (CPT-11). Até o presente momento, pouco se conhece sobre a fisiopatologia da MI. Objetivo: Estudar os mecanismos e mediadores envolvidos na mucosite intestinal induzida por CPT-11, verificando a participação da protease caspase-1, das citocinas interleucina-1 (IL-1), interleucina-18 (IL-18) e interleucina-33 (IL-33), do óxido nítrico, de mediadores 5-lipoxigenase e do PAF, assim como a seqüência de interação entre esses mediadores sob aspectos da resposta inflamatória e morfofuncionais. Métodos: Camundongos Swiss, C57BL/6 (BL), BALB/c (BC) ou knockout para Caspase-1 (Casp-/-), IL-18 (IL-18-/-), óxido nítrico sintase induzida (iNOS-/-), 5-Lipoxigenase (5-LOX-/-), receptor para PAF (PAFr-/-) machos, 22 g, foram divididos em grupos (n=4-5) e tratados por 4 dias com salina (5 mL/kg, i.p) ou CPT-11 (60 mg/kg, i.p) ou foram pré-tratados com IL-18bp (proteína ligante de IL18, 200 µg/animal/4 dias, i.p.), aminoguanidina (AG, 50 mg/kg, s.c, 2x/dia/4 dias), IL-33 (1 µg/animal/4 dias, i.v, 1h antes do CPT-11) ou loperamida ([4x3 mg/kg e 4x30 mg/kg]/animal, s.c.) em associação com CPT-11. No 5º dia, avaliou-se a diarréia por escores, o leucograma e, após sacrifício, coletou-se o duodeno para dosagem da atividade de mieloperoxidase (MPO, neutrófilos/mg tecido) e de óxido nítrico sintase induzida (iNOS pM citrulina/h/mg proteína), morfometria (razão vilo/cripta) e contratilidade in vitro à Acetilcolina (%contração em relação ao KCl60 mM). Para análise estatística utilizou-se ANOVA/Newman-Keuls ou Kruskal Wallis/Dunn. P<0,05 foi aceito. Resultados: Camundongos BL apresentaram um padrão de mucosite intestinal similar ao observado no camundongo Swiss sob aspectos morfofuncionais. O CPT-11 induziu leucopenia em todos os animais independentemente do tratamento aplicado. Adicionalmente, o CPT-11 induziu em animais BL e BC, não tratados, aumento de MPO intestinal, redução da relação vilo/cripta, amento da contratilidade in vitro e dos eventos de diarréia comparados com animais injetados somente com salina (p<0,05). A despeito da administração de CPT-11, animais Caspase-1-/-, IL-18-/- ou BC tratados com IL-18bp apresentaram atividade de MPO e de iNOS reduzidas, bem como aumento na relação vilo/cripta, menor contratilidade duodenal in vitro e eventos de diarréia atenuados em comparação aos respectivos controles tratados com salina (p>0,05). Dados idênticos também foram observados em camundongos injetados com IL-33 e que receberam CPT-11. A redução na atividade de iNOS naqueles animais motivou o estudo do efeito do CPT-11 em animais iNOS-/- ou tratados com aminoguanidina. Observaram-se menores níveis de citocinas IL-1beta e KC, bem como uma atividade de MPO reduzida no duodeno desses animais. Além disso, verificou-se preservação da relação vilo/cripta e da espessura da camada muscular, menor contratilidade duodenal in vitro e eventos de diarréia atenuados similar ao observado nos respectivos controles que receberam apenas salina (p>0,05). Porém, a administração de CPT-11 a animais PAFr-/- foi capaz de induzir alterações morfofuncionais e o aumento da atividade de MPO intestinal. Em camundongos 5-LOX /- ou tratados com loperamida (controle positivo), ambos os grupos injetados com CPT-11, observaram-se aumento da atividade de MPO e alterações morfométricas. Contudo, sobre aspectos funcionais de contratilidade in vitro, visualizou-se proteção. Conclusões: Esses resultados sugerem que a via caspase-1-IL-18 óxido nítrico contribui para o desenvolvimento da resposta inflamatória e alterações morfofuncionais na mucosite intestinal induzida por CPT-11. A IL-33 parece ser um fator protetor compensatório nessa cascata inflamatória. A 5-LOX e o PAFr parecem ter papel secundário na patogênese da mucosite intestinal por CPT-11.

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Um dos desafios recorrentes na prática clínica da Oncologia é o processo de repopulação, no qual células tumorais resistentes à terapia são capazes de proliferar e reconstituir o tumor. No entanto, os mecanismos envolvidos neste fenômeno ainda foram pouco explorados, sendo necessário melhor compreendê-los para evitar a falha terapêutica. Melanomas são bons modelos para estudar repopulação devido às baixas taxas de sobrevida livre de progressão e às altas taxas de resistência às terapias associadas a este tipo de tumor sólido. Sabe-se que a exposição de células tumorais a condições estressoras do microambiente, como hipóxia e hipóxia/reoxigenação, bem como ao próprio tratamento antitumoral, são pressões seletivas frequentemente encontradas em tumores sólidos que favorecem a resistência às terapias e a repopulação tumoral. Estudos prévios indicam que a sinalização mediada pelo Fator de Ativação de Plaquetas (PAF), um lipídio bioativo relacionado à diversas funções fisiológicas, e de seu receptor, PAFR, está associada com a resistência de células de melanoma aos tratamentos citotóxicos e com crescimento tumoral. Portanto, este trabalho teve como objetivo investigar o envolvimento da sinalização de PAFR frente às condições estressoras descritas acima no fenômeno de repopulação de melanomas. Os resultados de espectrometria de massa indicaram que hipóxia aumentou a geração de PAF nas linhagens de melanoma humano SKmel05 e A375, mas não na A375M, embora este aumento não tenha sido observado após a reoxigenação. Além disso, mostraram que SKmel37 exibiu os maiores níveis basais de PAF, aumentando substancialmente sua geração em diferentes tempos de exposição à hipóxia e hipóxia/reoxigenação. Investigamos também a geração de outros ligantes de PAFR, porém nenhum deles foi encontrado nas amostras. Os resultados de detecção de PAFR por Western Blot e/ou citometria de fluxo revelaram que os níveis proteicos não foram modulados por estas condições em nenhuma das linhagens e que, em termos basais, SKmel37 e SKmel05 apresentaram os maiores níveis. Estas linhagens foram, portanto, submetidas a ensaios de proliferação, os quais evidenciaram que frente ao tratamento com o antagonista de PAFR, WEB2086, em condições de hipóxia e hipóxia/reoxigenação, apenas as células SKmel37 tiveram sua proliferação reduzida e morfologia associada à morte. Ensaios de incorporação de iodeto de propídio indicaram que o tratamento destas células expostas à hipóxia/reoxigenação com WEB2086 levou a acúmulo em SG2M, morte celular e sensibilização à cisplatina. Além disso, imunofluorescência de cortes congelados de tumores induzidos com SKmel37 revelou que houve acúmulo de PAFR em áreas hipóxicas e em seu entorno. Em relação ao modelo de exposição à tratamentos antitumorais, por sua vez, curvas de concentração e tempo com Vemurafenib mostraram que SKmel37 e A375 foram resistentes à droga, ao passo que SKmel05 e UACC62 foram sensíveis. Além disso, WEB2086 potencializou o efeito de morte induzido por Vemurafenib nas linhagens sensíveis, mas não afetou as resistentes. Considerando os aspectos clínicos de resposta inicial com posterior desencadeamento de repopulação, seguimos com as linhagens sensíveis e verificamos por citometria que esta droga aumentou ROS em ambas as linhagens, mas só aumentou PAFR extracelular na SKmel05. O tratamento combinado potencializou a geração de ROS e levou a ativação de caspase3/7 apenas na SKmel05. Esta linhagem foi então submetida a ensaios clonogênicos cujos resultados mostraram que o tratamento com Vemurafenib reduziu o número de clones e que WEB2086 não potencializou este efeito. Assim, o conjunto de resultados apresentados evidencia que a sinalização de PAFR participa dos desfechos de sobrevivência frente à hipóxia/reoxigenação e/ou tratamentos antitumorais, podendo, de alguma forma, contribuir com a repopulação de melanomas / One of the recurrent challenges in the clinical practice of Oncology is the process of repopulation, in which therapy-resistant tumor cells can proliferate and reconstitute the tumor. However, the mechanisms involved in this phenomenon were still little explored. The understanding of these events is, therefore, needed to avoid therapeutic failure. Melanomas are good models for studying repopulation due to the low rates of progression-free survival and the high rates of resistance to therapies associated to this type of solid tumor. It is known that the exposure of tumor cells to microenvironmental stress conditions, such as hypoxia and hypoxia/reoxygenation, as well as the exposure to antitumor treatment itself, are selective pressures frequently found in solid tumors that favor therapy resistance and tumor repopulation. Previous studies have indicated that the signaling mediated by the Platelet Activation Factor (PAF), a bioactive lipid related to various physiological functions, and its receptor, PAFR, is associated with resistance of melanoma cells to cytotoxic treatments and with tumor growth. Therefore, the aim of this study was to investigate the involvement of PAFR signaling upon the adverse conditions described above in the phenomenon of melanoma repopulation. Mass spectrometry results indicated that hypoxia increased the generation of PAF in human melanoma cell lines SKmel05 and A375, but not in A375M, although this increase was not observed after reoxygenation. In addition, they showed that SKmel37 exhibited the highest PAF basal levels, whose generation increased substantially after different times of hypoxia and hypoxia/reoxygenation exposure. We also investigated the generation of other PAFR ligands, but none were found in the samples. The results of PAFR detection by Western Blot and/or flow cytometry revealed that protein levels were not modulated by these conditions in any of the cell lines and that, at baseline, SKmel37 and SKmel05 showed the highest levels. These lines were therefore submitted to proliferation assays, which showed that the treatment with the PAFR antagonist, WEB2086, under conditions of hypoxia and hypoxia/reoxygenation, led to proliferation reduction and death-associated morphology in SKmel37 cells only. Propidium iodide incorporation studies indicated that the treatment of these cells exposed to hypoxia/reoxygenation with WEB2086 led to accumulation in SG2M, cell death and cisplatin sensitization. In addition, immunofluorescence of frozen sections of SKmel37-induced tumors revealed that PAFR was found accumulated in hypoxic areas and its surroundings. Regarding the model of exposure to antitumor treatments, concentration and time curves with Vemurafenib showed that SKmel37 and A375 were resistant to the drug, whereas SKmel05 and UACC62 were sensitive. In addition, WEB2086 potentiated the effect of Vemurafenib-induced death on sensitive cell lines but did not affect the resistant ones. Considering the clinical aspects of initial response with subsequent repopulation triggering, we continued using the sensitive cell lines and we verified by cytometry that this drug increased ROS in both cell lines but only increased extracellular PAFR in SKmel05. The combined treatment potentiated the generation of ROS and led to the activation of caspase3/7 in SKmel05 only. This cell line was then submitted to clonogenic assays whose results showed that treatment with Vemurafenib reduced the number of clones and that WEB2086 did not potentiate this effect. Thus, the set of results presented highlights that PAFR signaling participates in the survival outcomes upon hypoxia/reoxygenation and/or antitumor treatments, and may, in some way, contribute to the repopulation of mel

Um dos desafios recorrentes na prática clínica da Oncologia é o processo de repopulação, no qual células tumorais resistentes à terapia são capazes de proliferar e reconstituir o tumor. No entanto, os mecanismos envolvidos neste fenômeno ainda foram pouco explorados, sendo necessário melhor compreendê-los para evitar a falha terapêutica. Melanomas são bons modelos para estudar repopulação devido às baixas taxas de sobrevida livre de progressão e às altas taxas de resistência às terapias associadas a este tipo de tumor sólido. Sabe-se que a exposição de células tumorais a condições estressoras do microambiente, como hipóxia e hipóxia/reoxigenação, bem como ao próprio tratamento antitumoral, são pressões seletivas frequentemente encontradas em tumores sólidos que favorecem a resistência às terapias e a repopulação tumoral. Estudos prévios indicam que a sinalização mediada pelo Fator de Ativação de Plaquetas (PAF), um lipídio bioativo relacionado à diversas funções fisiológicas, e de seu receptor, PAFR, está associada com a resistência de células de melanoma aos tratamentos citotóxicos e com crescimento tumoral. Portanto, este trabalho teve como objetivo investigar o envolvimento da sinalização de PAFR frente às condições estressoras descritas acima no fenômeno de repopulação de melanomas. Os resultados de espectrometria de massa indicaram que hipóxia aumentou a geração de PAF nas linhagens de melanoma humano SKmel05 e A375, mas não na A375M, embora este aumento não tenha sido observado após a reoxigenação. Além disso, mostraram que SKmel37 exibiu os maiores níveis basais de PAF, aumentando substancialmente sua geração em diferentes tempos de exposição à hipóxia e hipóxia/reoxigenação. Investigamos também a geração de outros ligantes de PAFR, porém nenhum deles foi encontrado nas amostras. Os resultados de detecção de PAFR por Western Blot e/ou citometria de fluxo revelaram que os níveis proteicos não foram modulados por estas condições em nenhuma das linhagens e que, em termos basais, SKmel37 e SKmel05 apresentaram os maiores níveis. Estas linhagens foram, portanto, submetidas a ensaios de proliferação, os quais evidenciaram que frente ao tratamento com o antagonista de PAFR, WEB2086, em condições de hipóxia e hipóxia/reoxigenação, apenas as células SKmel37 tiveram sua proliferação reduzida e morfologia associada à morte. Ensaios de incorporação de iodeto de propídio indicaram que o tratamento destas células expostas à hipóxia/reoxigenação com WEB2086 levou a acúmulo em SG2M, morte celular e sensibilização à cisplatina. Além disso, imunofluorescência de cortes congelados de tumores induzidos com SKmel37 revelou que houve acúmulo de PAFR em áreas hipóxicas e em seu entorno. Em relação ao modelo de exposição à tratamentos antitumorais, por sua vez, curvas de concentração e tempo com Vemurafenib mostraram que SKmel37 e A375 foram resistentes à droga, ao passo que SKmel05 e UACC62 foram sensíveis. Além disso, WEB2086 potencializou o efeito de morte induzido por Vemurafenib nas linhagens sensíveis, mas não afetou as resistentes. Considerando os aspectos clínicos de resposta inicial com posterior desencadeamento de repopulação, seguimos com as linhagens sensíveis e verificamos por citometria que esta droga aumentou ROS em ambas as linhagens, mas só aumentou PAFR extracelular na SKmel05. O tratamento combinado potencializou a geração de ROS e levou a ativação de caspase3/7 apenas na SKmel05. Esta linhagem foi então submetida a ensaios clonogênicos cujos resultados mostraram que o tratamento com Vemurafenib reduziu o número de clones e que WEB2086 não potencializou este efeito. Assim, o conjunto de resultados apresentados evidencia que a sinalização de PAFR participa dos desfechos de sobrevivência frente à hipóxia/reoxigenação e/ou tratamentos antitumorais, podendo, de alguma forma, contribuir com a repopulação de melanomas / One of the recurrent challenges in the clinical practice of Oncology is the process of repopulation, in which therapy-resistant tumor cells can proliferate and reconstitute the tumor. However, the mechanisms involved in this phenomenon were still little explored. The understanding of these events is, therefore, needed to avoid therapeutic failure. Melanomas are good models for studying repopulation due to the low rates of progression-free survival and the high rates of resistance to therapies associated to this type of solid tumor. It is known that the exposure of tumor cells to microenvironmental stress conditions, such as hypoxia and hypoxia/reoxygenation, as well as the exposure to antitumor treatment itself, are selective pressures frequently found in solid tumors that favor therapy resistance and tumor repopulation. Previous studies have indicated that the signaling mediated by the Platelet Activation Factor (PAF), a bioactive lipid related to various physiological functions, and its receptor, PAFR, is associated with resistance of melanoma cells to cytotoxic treatments and with tumor growth. Therefore, the aim of this study was to investigate the involvement of PAFR signaling upon the adverse conditions described above in the phenomenon of melanoma repopulation. Mass spectrometry results indicated that hypoxia increased the generation of PAF in human melanoma cell lines SKmel05 and A375, but not in A375M, although this increase was not observed after reoxygenation. In addition, they showed that SKmel37 exhibited the highest PAF basal levels, whose generation increased substantially after different times of hypoxia and hypoxia/reoxygenation exposure. We also investigated the generation of other PAFR ligands, but none were found in the samples. The results of PAFR detection by Western Blot and/or flow cytometry revealed that protein levels were not modulated by these conditions in any of the cell lines and that, at baseline, SKmel37 and SKmel05 showed the highest levels. These lines were therefore submitted to proliferation assays, which showed that the treatment with the PAFR antagonist, WEB2086, under conditions of hypoxia and hypoxia/reoxygenation, led to proliferation reduction and death-associated morphology in SKmel37 cells only. Propidium iodide incorporation studies indicated that the treatment of these cells exposed to hypoxia/reoxygenation with WEB2086 led to accumulation in SG2M, cell death and cisplatin sensitization. In addition, immunofluorescence of frozen sections of SKmel37-induced tumors revealed that PAFR was found accumulated in hypoxic areas and its surroundings. Regarding the model of exposure to antitumor treatments, concentration and time curves with Vemurafenib showed that SKmel37 and A375 were resistant to the drug, whereas SKmel05 and UACC62 were sensitive. In addition, WEB2086 potentiated the effect of Vemurafenib-induced death on sensitive cell lines but did not affect the resistant ones. Considering the clinical aspects of initial response with subsequent repopulation triggering, we continued using the sensitive cell lines and we verified by cytometry that this drug increased ROS in both cell lines but only increased extracellular PAFR in SKmel05. The combined treatment potentiated the generation of ROS and led to the activation of caspase3/7 in SKmel05 only. This cell line was then submitted to clonogenic assays whose results showed that treatment with Vemurafenib reduced the number of clones and that WEB2086 did not potentiate this effect. Thus, the set of results presented highlights that PAFR signaling participates in the survival outcomes upon hypoxia/reoxygenation and/or antitumor treatments, and may, in some way, contribute to the repopulation of mel

A lipoproteína de baixa densidade (LDL) pode sofrer modificações, oxidativas ou enzimáticas, gerando compostos, lipídicos e proteicos, capazes de interagir com macrófagos, contribuindo para a resposta inflamatória presente na aterosclerose. Os macrófagos interagem tanto com LDL contendo baixo ou alto grau de oxidação (LoxLDL e HoxLDL) e também com fragmentos proteicos provenientes da ApoB-100, os quais podem exercer efeitos biológicos em macrófagos, contribuindo para a formação de células espumosas. Neste trabalho demonstramos que formas modificadas da LDL interagem com monócitos e/ou macrófagos, dependendo do grau de oxidação. A expressão de FcgRII por HoxLDL em macrófagos é dependente de PPARg. Parte da expressão de CD36 induzida por LoxLDL e HoxLDL em macrófagos é dependente de PAF-R. A LoxLDL induz uma maior produção de IL-6 e IL-8. Já, a HoxLDL de TNF-a, IL-10 e TGF-b em macrófagos. Encontramos um peptídeo da ApoB-100 é capaz de aumentar o fluxo intracelular de cálcio, ativar a via das MAP quinases em monócitos humanos, induzindo a produção de IL-8. / The Low Density Lipoprotein (LDL) may undergo oxidative or enzymatic modifications, producing lipid or proteic compounds that interact with macrophages, contributing to inflammatory response in the atherosclerosis. Into the arterial intima, the macrophages interact with minimally modified LDL (LoxLDL) and with highly oxidized LDL (HoxLDL). Moreover, in the arterial intima, enzymes may induce cleavage of the apoB-100, releasing protein fragments, which may have biological effects on macrophages. In this study, we showed that modified forms of LDL interact with monocytes or macrophages, depending on oxidation degree. The expression of FcgRII-induced HoxLDL in macrophages is dependent on PPARg and part of the expression of CD36 induced by LoxLDL and HoxLDL in macrophages is dependent on PAF-R. In macrophages, LoxLDL induced higher production of IL-6 e IL-8, whereas HoxLDL induced TNF-a, IL-10 e TGF-b. Furthermore, we found one peptide from apoB-100 capable to increase calcium flux and activate MAP kinase pathway, inducing production of IL-8 in human monocytes.

A lipoproteína de baixa densidade (LDL) pode sofrer modificações, oxidativas ou enzimáticas, gerando compostos, lipídicos e proteicos, capazes de interagir com macrófagos, contribuindo para a resposta inflamatória presente na aterosclerose. Os macrófagos interagem tanto com LDL contendo baixo ou alto grau de oxidação (LoxLDL e HoxLDL) e também com fragmentos proteicos provenientes da ApoB-100, os quais podem exercer efeitos biológicos em macrófagos, contribuindo para a formação de células espumosas. Neste trabalho demonstramos que formas modificadas da LDL interagem com monócitos e/ou macrófagos, dependendo do grau de oxidação. A expressão de FcgRII por HoxLDL em macrófagos é dependente de PPARg. Parte da expressão de CD36 induzida por LoxLDL e HoxLDL em macrófagos é dependente de PAF-R. A LoxLDL induz uma maior produção de IL-6 e IL-8. Já, a HoxLDL de TNF-a, IL-10 e TGF-b em macrófagos. Encontramos um peptídeo da ApoB-100 é capaz de aumentar o fluxo intracelular de cálcio, ativar a via das MAP quinases em monócitos humanos, induzindo a produção de IL-8. / The Low Density Lipoprotein (LDL) may undergo oxidative or enzymatic modifications, producing lipid or proteic compounds that interact with macrophages, contributing to inflammatory response in the atherosclerosis. Into the arterial intima, the macrophages interact with minimally modified LDL (LoxLDL) and with highly oxidized LDL (HoxLDL). Moreover, in the arterial intima, enzymes may induce cleavage of the apoB-100, releasing protein fragments, which may have biological effects on macrophages. In this study, we showed that modified forms of LDL interact with monocytes or macrophages, depending on oxidation degree. The expression of FcgRII-induced HoxLDL in macrophages is dependent on PPARg and part of the expression of CD36 induced by LoxLDL and HoxLDL in macrophages is dependent on PAF-R. In macrophages, LoxLDL induced higher production of IL-6 e IL-8, whereas HoxLDL induced TNF-a, IL-10 e TGF-b. Furthermore, we found one peptide from apoB-100 capable to increase calcium flux and activate MAP kinase pathway, inducing production of IL-8 in human monocytes.