O hormônio folículo estimulante (FSH) desempenha um papel central no desenvolvimento da célula de Sertoli até a puberdade, e na sinalização desta célula em relação à série espermatogênica, após a puberdade. Na fase proliferativa, FSH atua estimulando a captação de Ca2+ e o transporte de aminoácidos neutros nas células de Sertoli, além de ativar a via adenilil ciclase-AMPc. Neste período, que em ratos compreende do 5º dia ao 25º após o nascimento, FSH atua aumentando o número e o tamanho das células de Sertoli, sendo esta ação fundamental para que se processe uma espermatogênese normal no indivíduo adulto. A sinalização estimulada por FSH nestas células varia com idade, reduzindo seu estímulo sobre o transporte de Aminoácidos neutros (via sistema A) no período pós- púbere. Adicionalmente, FSH estimula uma resposta eletrofisiológica bifásica, representada por uma hiperpolarização rápida, seguida de uma despolarização prolongada. O objetivo desta tese foi analisar o envolvimento de vias sinalizadas pela gonadotrofina na fase pré-puberal da célula de Sertoli de ratos. Para tanto, foram utilizadas as técnicas de captação de 45Ca2+, de transporte de [14C]MeAIB e de registro eletrofisiológico intracelular, para a verificação da ação do FSH através de proteína Gs e proteína Gi, bem como de suas vias subseqüentes. Foi observado que FSH estimula a captação de 45Ca2+ e o transporte de [14C]MeAIB via proteína Gi, ação esta independente do aumento de AMPc, pois foram bloqueadas por Toxina Pertussis (PTX) e não foram mimetizadas por forscolina. Da mesma forma, a despolarização estimulada por FSH foi inibida por PTX. Subseqüente a ativação de Gi, PI3K é estimulada por FSH, em células de Sertoli imaturas. Esta via foi bloqueada por wortmannin, o que inibiu a ação de FSH nos parâmetros analisados. Também foi estudada a ação de IGF-I sobre a captação de 45Ca2+, sobre o transporte de [14C]MeAIB e foi observada sua resposta eletrofisiológica. Verificou-se ação de IGF-I nos transportes de 45Ca2+ e [14C]MeAIB de maneira significativa, e observou-se uma despolarização como resposta eletrofisiológica à sua aplicação tópica, em células de Sertoli de ratos imaturos. Sabe-se que FSH e IGF-I agem de maneira sinérgica no desenvolvimento das células de Sertoli, e que FSH estimula a síntese e a secreção de IGF-I, nestas células durante o período pré-púbere. Então foi verificada se a ação de FSH ocorre via IGF-I ou através de mecanismos paralelos. Para esta verificação utilizou-se o bloqueador de receptor de IGF-I, JB1, o qual bloqueia o acesso do fator de crescimento ao seu receptor tirosina cinase. Como resultado foi observado que o bloqueador JB1, inibe as ações estimuladas por IGF-I, entretanto sem alterar a resposta de FSH sobre os parâmetros analisados. E com o intuito de verificar o envolvimento de Cav1 (canais de cálcio dependentes de voltagem do tipo L), foi utilizado verapamil, o qual bloqueou a ação de FSH sobre a captação de 45Ca2+. A partir destes resultados, é possível sugerir que FSH estimula a captação de 45Ca2+, o transporte de [14C]MeAIB, bem como apresenta uma resposta eletrofisiológica vinculada a via GPCR/Gi/Gßy/PI3K/Akt-PKB/Cav1, em células de Sertoli de ratos imaturos durante sua fase proliferativa. / FSH plays a central role on Sertoli cell proliferation in development during puberty, and after this period is related to spermatogenic progression. FSH increase Sertoli cells number and size from the 5º to 15º day after birth, in the same period the FSH strongly stimulates neutral amino acid transport, also, FSH plays a biphasic electrophysiology response characterized by a rapid hyperpolarization following to a prolonged depolarizing. The aim of this work was study the pathways stimulated by FSH in Sertoli cells of rats during the pre pubertal phase. As markers we use 45Ca2+ uptake, [14C]MeAIB transport and the membrane potential (MP) to verify the action of FSH on Gi and Gs protein pathways. It was observed that FSH enhanced 45Ca2+ uptake through Gi protein pathway, independently of cAMP, this action was bloked by PTX (250ng/mL) independent of adenil ciclase action. Also 45Ca2+ uptake, [14C]MeAIB transport and MP response were blocked by wortmannin (100nM). The action IGF-1 in these parameters was also analyzed, the growth factor stimulates 45Ca2+ uptake and [14C]MeAIB transport and induce a prolonged depolarization on the MP. The use of an inactive analog of the IGF-1(JB1 1μg/ml) blocked the IGF-1 action but not the effects of FSH. The utilization of Verapamil (100 μM) blocker of the Cav1 (L type VDCC) inhibited the stimulation of FSH on 45Ca2+ uptake and [14C]MeAIB transport. These results suggest that the FSH action during proliferative stage of Sertoli cells on 45Ca2+ uptake, [14C]MeAIB transport and MP modification related to the GPCR/Gi/Gßy/PI3K/Akt-PKB/Cav1 pathway.

A cartilagem do processo condilar (PC) e a sincondrose basiesfenoidal (SB) participam do processo de crescimento e desenvolvimento craniofacial que são determinados pelo aporte protéico, pela ação hormonal e por fatores de crescimento, sendo o IGF-I o principal deles. Objetivou-se correlacionar as alterações morfológicas no PC e na SB provenientes da subnutrição protéica. Os grupos experimentais foram formados por animais heterogêneos (n=5) com 60 dias de vida, de acordo com o teor de caseína contida nas rações, protéica (20%) ou hipoprotéica (5%), formando, respectivamente, os grupos nutrido (N) e subnutrido (S). Na microscopia de luz foi observado que a subnutrição não alterou as espessuras das camadas do PC e da SB, enquanto que através da imunohistoquímica o número de IGF-I e IGF-IR diminuiu em ambos os tecidos (N&ne;S; p<0,05). No PC, o colágeno do tipo I passou a ser do tipo II no grupo S, enquanto que na SB, o do tipo II foi destacado em ambos os grupos. A matriz extracelular do PC apresentou-se densa e com coloração homogênea nos nutridos, contrastando com o aspecto difuso dos subnutridos. Na SB, tanto no grupo N quanto no S, a MEC manteve-se com aspecto uniforme na distribuição e na homogeneidade da coloração. / The cartilage of the condylar process (CP) and the basiesfenoidal synchondrosis (BS) participate in the process of craniofacial growth and development that are determined by the protein content, the hormonal and growth factors, being the IGF-I main one. This study aimed to correlate the morphological changes in PC and SB from protein malnutrition. The experimental groups were formed by heterogeneous animals (n = 5) at 60 days of life, according to the casein contained in the feed, proteic (20%) or hypoproteic (5%), constituting respectively the nourished (N) and undernourished (U) groups. Under light microscopy it was observed that undernourished did not change the thickness of the layers of CP and BS by immunohistochemical while the number of IGFI and IGF-IR decreased in both tissues (N&ne;S; p<0,05). On the PC, the type I collagen became type II at the U group, while in the SB the type II was noted in both groups. The extracellular matrix (ECM) of the PC presented dense and homogenous coloration in the nourished, contrasting with the diffuse aspect of the undernourished. In SB, both in the N group as U, the ECM remained uniform in appearance and the distribution and uniformity of staining.

Um dos grupos de doenças mais importante que acomete o desenvolvimento da caixa craniana humana é o das craniossinostoses, caracterizado pelo fechamento prematuro de uma ou mais suturas cranianas. Entre as formas mendelianas das craniossinostoses sindrômicas, mutações dominantes em FGFR2 são uma das causas mais frequentes e estão associadas às síndromes de Apert, de Crouzon e de Pfeiffer. A sinalização intracelular subseqüente à ativação de FGFR2, tanto selvagem quanto mutante, é bastante intrincada e pode sofrer inúmeras bifurcações. As porções iniciais destas vias, imediatamente subsequentes à ativação do receptor, são relativamente bem compreendidas. Grande parte, porém, do controle dessas vias, principalmente no que tange a regulação transcricional e sua associação com alterações em comportamentos celulares, não é entendido. Assim sendo, os objetivos gerais deste trabalho foram: 1) estudar o potencial de diferenciação e o perfil diferencial de transcrição gênica de culturas primárias de células fibroblastóides isoladas a partir do periósteo das suturas coronais de pacientes acometidos por síndrome de Apert (heterozigotos para a mutação de ganho de função p.Ser252Trp em FGFR2, a mutação mais comum em pacientes com esta síndrome) e 2) estudar o potencial de diferenciação osteogênico e o perfil transcricional respectivamente de células mesenquimais e de tecido provenientes de sutura coronal de um modelo murino para Síndromes de Crouzon/Pfeiffer (heterozigotos para a mutação p.Cys342Tyr em Fgfr2, a mutação mais comum associada a estas síndromes). Certificamo-nos da expressão gênica e proteica de FGFR2 nas células fibroblastóides humanas e de Fgfr2 nas células mesenquimais murinas. Em seguida, testamos o potencial osteogênico (in vitro e in vivo ) e adipogênico (in vitro ) das células de pacientes com Síndrome de Apert, comparadas a células do mesmo tecido mas de indivíduos sem esta mutação e o potencial osteogênico (in vitro ) das células mesenquimais de camundongos portadores da mutação p.Cys342Tyr em Fgfr2, comparadas a células também das suturas coronais mas de animais selvagens. O potencial de diferenciação das células mutantes, nos dois grupos de experimentos, foi muito aumentado em relação ao potencial das células livres destas mutações. Conduzimos experimentos de microarrays de expressão gênica (sistema CodeLink) com 7 amostras de culturas primárias de células de pacientes com S. de Apert e as comparamos com 7 amostras de culturas primárias controles. Identificamos 263 genes com valores de expressão estatisticamente diferentes (SNR &#8805; |0.4|, P &#8804; 0,05) nas amostras de pacientes com S. de Apert quando comparadas às controles (118 superexpressos, 145 subexpressos). Categorias funcionais enriquecidas foram regulação de proliferação celular, metabolismo de nucleotídeos, regulação de expressão gênica, adesão celular, organização de matriz extracelular e cascata PI3K MAPK. Para a validação deste experimento constatamos superexpressão, por PCR em tempo real, de genes identificados como superexpressos na assinatura de expressão associada às células mutadas, além de verificarmos o mesmo comportamento destes genes em células controles tratadas com FGF2 exógeno para superativação do receptor. Os experimentos de expressão gênica com os tecidos de suturas coronais do modelo murino foram feitos com 15 amostras de tecidos de animais mutantes em 3 grupos de 5 e comparadas a amostras de mesmo tecido de animais selvagens agrupadas da mesma forma. Identificamos três listas de genes diferencialmente expressos: a primeira contendo 188 transcritos (P &#8804;0,05, FC &#8805; 1,5,sendo 91 superexpressos e 97 subexpressos), e as outras duas filtradas previamente para coeficiente de variação &lt; 50% dentro de cada grupo, contendo 488 transcritos (P &#8804;0,05, FC &#8805; 1,2, sendo 183 superexpressos e 305 subexpressos) e 31 transcritos (P &#8804;0,05, FC &#8805; 1,5, sendo 11 superexpressos e 20 subexpressos). Categorias funcionais mais enriquecidas foram crescimento, proliferação e ciclo celular, diferenciação celular, sinalização célula-célula, resposta imune mediada por células e sinalização por receptor Wnt. Estes resultados nos permitiram: a) demonstrar que células fibroblastóides de periósteo craniano de paciente portadores de S. de Apert (mutação p.Ser252Trp em FGFR2) e células mesenquimais do modelo murino para S. de Crouzon e Pfeiffer, portador da mutação p.Cys342Tyr em Fgfr2, apresentam potencial osteogênico aumentado, agregando evidências que sugerem que esta alteração de comportamento celular tem função fundamental no desencadeamento das craniossinostoses nestas síndromes; b) revelar assinaturas de expressão gênicas associadas a estas mutações nas condições estudadas, que podem reger este comportamento celular anormal; c) identificar um novo grupo de genes associados à patofisiologia da Síndrome de Apert ou às características fenotípicas do modelo murino investigado, podendo também ser genes candidatos a outras craniossinostoses de causa desconhecida. / Craniosynostosis is one of the most important group of diseases linked to the development of the human skull and is characterized by the premature fusion of one or more cranial sutures. Dominant mutations in FGFR2 are frequent molecular causes amongst the mendelian inherited forms of the syndromic craniosynostosis and are associated to Apert, Crouzon and Pfeiffer syndromes. The intracellular signaling pathways following the activation of wild type or mutant FGFR2 are very complex due to several possible bifurcations. The initial portions of these pathways, immediately following the receptor activation, are relatively well delineated. However the great majority of the events related to the control of these pathways is still not well understood, mainly concerning its transcriptional regulation and its association to other cell behavior anomalies. Therefore the key scopes of this work were: 1) to study the differentiation potential and the differential gene expression profile of primary fibroblastoid cell cultures isolated from the periosteum of the coronal sutures of Apert Syndrome patients (heterozygous for the mutation p.Ser252Trp in FGFR2, the most common cause of the Apert Syndrome condition) and 2) to study the osteogenic differentiation potential and the transcriptional profile of mesenchymal cells and tissue isolated from the coronal sutures of a mouse model for the Crouzon and Pfeiffer Syndromes (heterozygous for the p.Cys342Tyr mutation in Fgfr2, the mutation most commonly associated to these syndromes). We assured the FGFR2 /FGFR2 gene and the protein expression in human fibroblastoid cells and Fgfr2 /Fgfr2 expression in the mesenchymal murine cells. We tested the (in vitro and in vivo ) osteogenic and the (in vitro ) adipogenic potentials of the Apert Syndrome patients cells compared to cells from the same tissue but from subjects without this mutation and the (in vitro ) osteogenic potential of mesenchymal cells from mice bearing the p.Cys342Tyr mutation in Fgfr2 compared to coronal suture cells but from wild type mice. On both experiments the differentiation potential of the mutant cells were very increased when compared to the potential of the wild type cells. We conducted gene expression microarray experiments (CodeLink system) using 7 samples from primary cultures of cells from Apert Syndrome patients compared to 7 samples from primary control cultures. We identified 263 genes with significantly different expression (SNR &#8805; |0.4|, P &#8804; 0,05) associated to the Apert Syndrome profile (118 upregulated, 145 downregulated). Enriched functional cathegories were regulation of cell proliferation, nucleotide metabolism, gene expression regulation, cell adhesion, extracellular matrix organization and PI3K MAPK cascades. In order to validate this gene expression signature we confirmed through Real-Time PCR the upregulation of genes identified as upregulated in the Apert cell profile in samples from the microarray experiment and in control cells treated with exogenous overactivate the receptor. The gene expression experiments with the coronal suture tissues from the mouse model were performed with 15 samples of mutant animal tissue in 3 groups of 5 and compared to samples from the same tissue of wild type animals, with identical grouping. We identified three sets of differentially expressed genes: the first set containing 188 transcripts (P &#8804;0,05, FC &#8805; 1,5, 91 upregulated e 97 downregulated), and the other two filtered for coeficient of variation &lt; 50% in each group, containing 488 transcripts (P &#8804;0,05, FC &#8805; 1,2, sendo 183 upregulated and 305downregulated) e 31 transcripts (P &#8804;0,05, FC &#8805; 1,5, 11 upregulated and 20 downregulated). The most enriched functional categories were growth, proliferation and cell cycle, cell differentiation, cell-to-cell signaling, cell mediated immune response and Wnt receptor signaling. These results allowed us: a) to demonstrate that fibroblastoid cells from coronal periosteum PF Apert Syndrome patients (p.Ser252Trp mutation in FGFR2) and mesenchymal cells from the coronal tissue of the mouse model for Crouzon and Pfeiffer syndromes (bearing the p.Cys342Tyr in Fgfr2) have enhanced osteogenic potential, summoning evidences suggesting that this cell behavior alteration have a fundamental role to the craniosynostotic process in these syndromes; b) to unravel gene expression signatures linked to these mutations in the studied conditions, that could orchestrate this abnormal cell behavior; c) to identify a ser of genes associated to the pathophysiology of Apert Syndrome and to the phenotypic characteristics of the animal model investigated, which might be candidate genes to other craniosynostosis of unknown cause.

As pesquisas em lesão medular tiveram um avanço significativo nas últimas duas décadas. Várias substâncias têm sido testadas, dentre elas, os fatores neurotróficos que são proteínas que auxiliam na maturação e desenvolvimento do sistema nervoso. O objetivo deste estudo foi conduzir testes que propiciem a análise dos efeitos da recuperação funcional locomotora e regeneração axonal em ratos submetidos a testes experimentais com a utilização da substância neurotropina-4. O estudo consistiu de 30 ratos adultos jovens, da raça Wistar, que foram submetidos à lesão medular ao nível de TX, provocado por um aparelho denominado NYU impactor. Os ratos foram divididos em dois grupos de 15 ratos cada, denominados de grupo controle e grupo tratamento, que receberam aplicação de água destilada e 1g de neurotropina-4, respectivamente. Estes foram avaliados funcionalmente pela escala BBB e submetidos à análise histológica. Concluiu-se que a neurotropina-4 promove a recuperação locomotora funcional e diminui os efeitos secundários da lesão medular, comparativamente ao grupo controle / Research into spinal cord injury has advanced significantly over the past two decades. Many substances have been tested, including the neurotrophics factors, which are proteins that aid in the maturation and development of the nervous system. The objective of this study was to conduct tests that provide the analysis of the effects of the locomotor functional recovery and axonal regeneration in rats subjected to experimental tests with the use of the substance neurotrophin-4. The study consisted of thirty young adult rats, Wistar race, which received TX level of spinal cord injury through a device called NYU impactor. The rats were divided into two groups of fifteen rats each, called the control group and treatment group, which received application of distilled water and 1 g Neurotrophin-4, respectively. They were evaluated functionally by the BBB scale and submitted to the histological analysis. It was concluded that the Nt-4 promotes the recuperation of the locomotor function and reduces the side effects of spinal cord injury, compared to the control group

Orientadores: Lília Freire Rodrigues de Souza Li, Marcelo Ananias Teocchi / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-26T06:18:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ferreira_AnaErikaDias_M.pdf: 2703005 bytes, checksum: 3e71e1e36f3b90f6651557533137b593 (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: Epilepsia do lobo temporal (ELT) é a forma mais comum de epilepsia em adultos. O processo de epileptogênese inclui a morte neuronal, brotamento axonal, inflamação, neurogênese, estresse oxidativo e gliose. No entanto, os mecanismos moleculares subjacentes não são totalmente compreendidos. Os fatores de crescimento de fibroblastos (FGFs) são uma família de proteínas com várias funções no organismo, especialmente no sistema nervoso central. No entanto, o funcionamento dos FGFs no cérebro humano não é totalmente compreendido. O FGF2 é o membro mais estudado dessa família e seu papel na fisiopatologia da epilepsia é controversa. Na tentativa de esclarecer o envolvimento da via de FGF na ELT, nós quantificamos a expressão hipocampal dos seguintes genes: FGF2, FGF8, FGF22, FGFR1, FGFR2, FGFR3, ITPR3, PIK3R3 e PIK3R5 em 10 pacientes resistentes a fármacos e quatro controles post mortem. Além disso, avaliamos a expressão da proteína de FGF2 por imunofluorescência indireta. Apenas para o FGF2, houve aumento do RNAm no hipocampo dos pacientes para os dois genes de referência testados, HPRT1 e ENO2 + TBP em combinação (P = 0,002 e P = 0,036; respectivamente). A porcentagem de células imunomarcadas para FGF2 no giro dentado foi maior nos pacientes do que nos controles (P <0,05), mas nenhuma alteração significativa foi encontrada no Corno de Ammon. O FGF2 pode preservar os neurônios após lesão e atua como um poderoso fator para a proliferação de células-tronco neurais. Assim, o FGF2 poderia aliviar os danos induzidos pelas crises, intensificar a reparação e reduzir a epileptogênese no hipocampo. Por outro lado, evidências têm demonstrado o envolvimento do FGF2 em mecanismos epileptogênicos, como brotamento de fibras musgosas e neurogênese. Nossos resultados sugerem a participação do FGF2 na fisiopatologia da ELT e o indica como um importante alvo para estudos farmacológicos / Abstract: Temporal lobe epilepsy (TLE) is the most common form of epilepsy in adults. The process of epileptogenesis includes neuronal death, axonal sprouting, inflammation, neurogenesis, oxidative stress and gliosis. However, the molecular mechanisms behind them are not fully understood. Fibroblast growth factor (FGF) gene family encodes proteins with several functions in the organism, especially in the central nervous system. FGF family member functions in the human brain are unclear. To shed light on the involvement of the FGF pathway in TLE, we quantified the hippocampal expression of the following genes: FGF2, FGF8, FGF22, FGFR1, FGFR2, FGFR3, ITPR3, PIK3R3 and PIK3R5 in 10 pharmacoresistant patients and four post mortem controls. We also assessed the FGF2 protein expression by indirect immunofluorescence. Only for FGF2, was the mRNA level markedly increased in patients¿ hippocampi for the two reference genes tested, HPRT1 and ENO2+TBP in combination (P = 0.002 and P = 0.036, respectively). The percentage of FGF2 immunostained cells in the dentate gyrus was higher in patients than in the controls (P <0.05), but no significant alteration was found in the Ammon¿s horn. FGF2 preserves neurons from ongoing injury and acts as a powerful proliferation factor for neural stem cells. It could potentially alleviate seizure-induced damage and intensify repair and reduce epileptogenesis in the hippocampus. On the other hand, evidence has shown FGF2¿s involvement in epileptogenic mechanisms, such as axonal sprouting and neurogenesis. Our results clearly suggest the FGF2 participation in TLE physiopathology and point it out as an important target for pharmacological studies / Mestrado / Saude da Criança e do Adolescente / Mestra em Ciências

O estabelecimento e perfeito funcionamento da placenta são fatores dependentes da intensa vascularização ocorrida no órgão. Os processos de vasculogênese e angiogênese placentária são modulados por diversos fatores, incluindo o VEGF (fator de crescimento vascular endotelial) e bFGF (fator de crescimento fibroblástico básico). Apesar da importância do VEGF e bFGF durante a vascularização estar estabelecida, vários estudos indicam a participação desses fatores de crescimento como moduladores locais em outras funções fisiológicas, como por exemplo o controle da produção hormonal em tecidos esteroidogênicos. Animais clonados podem apresentar alterações na expressão de determinados genes durante seu desenvolvimento, o que pode alterar a função placentária. Os objetivos deste estudo são determinar a localização tecidual do VEGF, bFGF e seus receptores na placenta bovina e avaliar a influência destes fatores de crescimento sobre a produção de progesterona placentária em bovinos não clonados e clonados. Placentomas de 90, 150 e 210 dias de gestação foram obtidos em abatedouro e placentônios de gestações aos 270 dias provenientes de bovinos clonados e não clonados foram coletados após cesarianas. As amostras foram fixadas em formol tamponado 4%, desidratadas e incluídas em parafina. Cortes foram submetidos a imuno-histoquímica para posterior localização das proteínas do VEGF, bFGF e seus receptores. Sob condições assépticas, as células foram mecanicamente dispersas e cultivadas em placas de 96 cavidades. Os fatores foram adicionados em concentrações de 10 e 50 &#951;g/ml de bFGF e VEGF, respectivamente. Amostras de meio de cultura e as células dos grupos controle, bFGF, VEGF e VEGF mais bFGF foram coletadas 24, 48 e 96 horas após a adição dos fatores. A progesterona foi dosada por radioimunoensaio e o conteúdo protéico pelo método de Lowry. Os dados foram analisados utilizando-se o programa estatístico SAS (Statistical Analysis System), as diferenças estatísticas encontradas foram comparadas pelo teste de variação múltipla de Duncan. O VEGF, bFGF e seus receptores foram localizados em células do epitélio e estroma maternos e fetais e células endoteliais vasculares em bovinos não clonados e clonados. As células placentárias apresentaram diferentes capacidades de síntese de progesterona ao longo da gestação. Aos 90 e 210 dias de gestação o VEGF estimulou a produção de progesterona, enquanto aos 270 dias de gestação o fator inibiu a produção deste hormônio. O bFGF estimulou a produção de progesterona pelas células placentárias aos 90 dias de gestação. A adição dos dois fatores de crescimento conjuntamente determinou um estímulo na produção de progesterona aos 210 dias de gestação. A produção de progesterona pelas células de bovinos clonados foi semelhante àquela observada em células de bovinos não clonados na mesma idade gestacional e os fatores de crescimento não influenciaram essa produção. Conclui-se que o VEGF e bFGF, atuando localmente no tecido placentário, funcionam como moduladores do processo de esteroidogênese, influenciando de maneira tempo-dependente a produção de progesterona deste órgão. / Placental establishment and function are dependent on intense vascularization. Placental vasculogenesis and angiogenesis are modulated by several factors, including VEGF (vascular endothelial growth factor) and bFGF (basic fibroblast growth factor). Although the role of VEGF and bFGF during vascularization is already well established, some studies have indicated the participation of these growth factors as local modulators in other physiological functions, such as control of hormonal production in steroidogenic tissues. Cloned animals may exhibit alterations in gene expression during development modifying placental function. The aims of this study are to determine the tissue localization of VEGF, bFGF and their receptors in the bovine placenta and to evaluate the influence of bFGF and VEGF on placental progesterone production in non-cloned and cloned bovines. Placentomes from days 90, 150 and 210 of pregnancy were obtained at local slaughterhouse and placentomes from cloned and non-cloned gestations at 270 days were obtained after cesarean sections. Samples were fixed in 4% buffered formol solution, dehydrated and included in paraffin. Sections were subimitted to immunohistochemistry for subsequent localization of VEGF, bFGF and their receptors proteins. Under aseptic conditions, cells were mechanically dispersed and then cultivated in a 96-well plate. Growth factors were added at concentrations of 10 and 50 &#951;g/ml for bFGF and VEGF, respectively. Samples of culture medium and cells from control, bFGF, VEGF and bFGF plus VEGF groups were collected 24, 48 and 96 hours after growth factor addition. Progesterone concentrations were assessed by radioimmunoassay and protein content was measured by Lowry?s method. Data were analyzed by SAS (Statistical Analysis System) program, significant differences were compared by Duncan?s range multiple test. VEGF, bFGF and their receptors were localized in maternal and fetal epithelial and stromal cells and vascular endothelial cells during pregnancy in non-cloned animals and in cloned bovine placenta at 270 days of pregnancy. Bovine placental cells were able to produce different amounts of progesterone during pregnancy. Growth factors were able to influence progesterone production in placental cells only after 24 hours in culture. At 90 and 210 days of pregnancy VEGF stimulated progesterone production, while at 270 days of pregnancy the growth factor inhibited production of this hormone. bFGF stimulated progesterone production in placental cells from 90 days of pregnancy. Both growth factors together determined an increase in progesterone production in placental cells from 210 days of pregnancy. Progesterone production in placental cells from cloned cattle is similar when compared with non-cloned placental cells at the same gestational age and growth factors did not influence progesterone production in these cells. VEGF and bFGF, acting locally in the placental tissue, are modulators of the steroidogenic process, influencing in a time-dependent manner the progesterone production in this organ.

O uso de biotecnologias pode ser um método eficaz para melhorar a eficiência da reprodução e aumentar a produção de animais geneticamente superiores. O tratamento superovulatório é uma técnica comum utilizada com o objetivo de difundir o material genético desejado, embora seu uso em búfalos ainda apresente limitações, principalmente relacionada à baixa taxa de recuperação de embriões. O corpo lúteo (CL) é uma glândula reprodutiva transitória que produz progesterona, requerida para o estabelecimento e manutenção da prenhez e regulação do ciclo reprodutivo. O desenvolvimento e as funções do corpo lúteo são afetados pela hiperestimulação ovariana. As células luteínicas de animais superovulados apresentam características compatíveis com alta síntese de proteína. O fator de crescimento vascular endotelial (VEGF) e o fator de crescimento fibroblástico básico (bFGF) são reguladores importantes do desenvolvimento e função do CL, e também são afetados pelo tratamento superovulatorio. Vários estudos sugerem que o LH (hormônio luteinizante) e hCG (gonadotrofina coriônica humana) modulam a expressão dos fatores de crescimento. Este trabalho teve como objetivo avaliar a expressão gênica e protéica dos sistemas VEGF e bFGF em corpo lúteo cíclico de búfalas não tratadas e superovuladas. Foram utilizados vinte corporea lutea (CLL) divididos em 5 grupos de acordo com o estágio do ciclo estral (2, 6, 12, 17 e 26 dias após ovulação p.o.) e o grupo 6 era composto de CLL de animais superovulados no dia 6 p.o. Os CLL foram coletados em abatedouro, dissecados e congelados imediatamente em nitrogênio líquido para posterior extração de proteína e de mRNA. A análise protéica do VEGF, KDR, bFGF, FGFR-2 e FGFR-3 foi determinada por western blotting, enquanto a análise da expressão gênica de VEGF, KDR, Flt-1, bFGF, FGFR-1 a 4, por RT-PCR em tempo real. No CL de búfalas superovuladas observou-se maior expressão protéica dos sistemas VEGF e bFGF, em relação aos animais não tratados (p<0,05). Por outro lado, a expressão do mRNA de todos os genes estudados decresceu (sistema VEGF-A p<0.001, bFGF, FGFR-1 e FGFR-3, p<0.05) ou apresentou tendência a decrescer (FGFR-2 e FGFR-4, p<0.1) nos animais superovulados. Durante o ciclo estral, a expressão protéica do VEGF não variou, apesar da expressão de todas as outras proteínas e mRNA estudados apresetarem variações de acordo com a fase do ciclo estral. Os resultados obtidos sugerem que o tratamento superovulatório aumenta a taxa de tradução dos fatores angiogênicos no CL de búfalas, e que a expressão dos sistemas VEGF e bFGF ao longo do ciclo estral é tempo-dependente, indicando um papel importante destes fatores na regulação das funções do CL. / Biotechniques can be an effective way of improving reproduction efficiency and enhancing the production of genetically superior animals. The superovulatory treatment is a common technique aiming to spread desired genetical material, although its use in buffalos still presents limitations, mainly the low embryo recovery rate. The corpus luteum (CL) is a temporary endocrine gland that produces progesterone (P), which is required to the establishment and maintenance of pregnancy and regulation of reproductive cycle. CL development and function are affected by ovarian hyperestimulation. The luteal cells of superovulated animals are described to show characteristics compatible with higher protein synthesis. The vascular endothelial growth factor (VEGF) and basic fibroblast growth factor (bFGF) are important regulators of CL and are also affected by superovulatory treatment. Several studies suggest that LH (luteinizing hormone) and hCG (human chorionic gonadotropin) modulate expression of growth factors. The aim of this work was to access gene and protein expression of VEGF and bFGF systems in cyclic CL of nontreated and superovulated water buffalos. Twenty water buffaloes corpora lutea (CLL) were divided in five groups according to estrous cycle stage (days 2, 6, 12, 17 and 26 after ovulation - p.o.) and the sixth group was composed by superovulated CLL from day 6 p.o. The CLL were collected at the slaughterhouse, dissected and frozen immediately in liquid nitrogen for posterior protein and mRNA extraction. Protein expression of VEGF and its receptors KDR and Flt-1 as well as bFGF and its receptors FGFR-2 and FGFR-3 was measured by western blotting (WB). For the relative gene expression of VEGF, KDR, Flt-1, bFGF, FGFR-1 to 4, we used real time RT-PCR. VEGF and bFGF systems protein expression showed an increase (p <0.05) in superovulated CLL compared to non-treated CLL on day 6 after p.o. On the other hand, mRNA expression from all studied genes was decreased (VEGF-A system p<0.001, bFGF, FGFR-1 and FGFR-3, p<0.05) or tended to decrease (FGFR-2 and FGFR-4, p<0.1) in superovulated CLL. In estrous cycle CLL VEGF protein did not show a time dependent expression although all other proteins and mRNAs expression were dependent on estrous cycle stage. These results indicate that the superovulatory treatment increased transduction rate of angiogenic factors in CL and that VEGF and bFGF systems are expressed in a time-dependent manner during the estrous cycle, indicating that these growth factors are important regulators of CL function.

Os fatores de crescimento vascular endotelial (VEGF) e o fibroblástico básico (bFGF) são reguladores importantes do desenvolvimento e função placentária. Os efeitos destes na expressão da enzima esteroidogênica aromatase P450 (P450arom) na placenta bovina em diferentes estágios gestacionais (90 a 270 dias) foram avaliados através de imunocitoquímica. Além disso, comparou-se a influência destes entre células placentárias de bovinos clonados e não clonados aos 270 dias. A aromatase P450 foi localizada exclusivamente no citoplasma das células trofoblásticas gigantes e sua expressão foi menor aos 150 dias de gestação, em relação às demais idades (p<0,05). O VEGF (50 ng/ml) influenciou significativamente a expressão da P450arom aos 150 e 270 dias, enquanto o bFGF (10 ng/ml) foi efetivo em estimular essa expressão particularmente no final da gestação (270 dias). Os dois fatores combinados (bFGF+VEGF) inibiram a expressão da P450arom no terço inicial (90 dias), mas, por outro lado, estimularam-na aos 150 e 270 dias (p<0,05). Nos clones, a expressão da P450arom, nos grupos controle e VEGF, foi semelhante a dos animais não clonados aos 270 dias de gestação, porém, o bFGF e os dois fatores combinados inibiram-na significativamente (p<0,05). Em todos os grupos analisados, a expressão da P450arom apresentou característica ascendente em função dos dias de cultivo, atingindo concentração máxima após 96 horas de incubação. Assim, o presente estudo demonstrou efeitos distintos e estágio-específicos dos fatores de crescimento bFGF e VEGF na secreção de estrógenos na placenta bovina via modulação da expressão da aromatase P450 in vitro. Conclui-se que estes fatores de crescimento agem como potentes moduladores de enzimas esteroidogênicas e que, sob as condições de cultivo estabelecidas, as células placentárias de bovinos clonados apresentam padrão de resposta distinto quando comparadas com células de bovinos não clonados de mesma idade gestacional. / Vascular endothelial growth factor (VEGF) and basic fibroblast growth factor (bFGF) are important regulators of placental development and function. Their effects on the steroidogenic enzyme aromatase P450 (P450arom) expression from bovine placenta at different gestational stages (90 - 270 days) were evaluated by immunocytochemistry. Moreover, we compared the effects of these growth factors on P450arom expression between cloned and non cloned bovine placental cells. P450arom was localized exclusively in trophoblast giant cells cytoplasm, and its expression reached lowest levels at day 150 of gestation in comparison to the remaining evaluated gestational stages. VEGF (50 ng/mL) influenced significantly P450arom expression at days 150 and 270, whereas bFGF (10 ng/mL) was effective in stimulating P450arom expression particularly during late gestation (day 270). The two factors combined (bFGF+VEGF) inhibited P450arom expression during early gestation (day 90), but, in contrast, stimulated it at days 150 and 270 of pregnancy (P<0.05). In cloned bovine placental cells, P450arom expression was similar to non-cloned cells in the control and VEGF groups, however, bFGF and both factors together inhibited it significantly (P<0.05). In all groups analyzed, P450arom expression presented rising pattern over the duration of the culture, reaching maximal values at 96 hours of incubation. Thus, the present study demonstrated distinct and stage-specific effects of these growth factors on bovine placenta P450arom expression in vitro. We concluded that these growth factors act as potent steroidogenic enzymes regulators, and, under the established culture conditions, placental cells from cloned bovines presented distinct answer pattern compared to non cloned placental cells at the same gestational stage.

Orientador: Valeria Helena Alves Cagnon Quitete / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-22T09:05:18Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Hetzl_AmandaCia_D.pdf: 39910159 bytes, checksum: 9f69d8623d48f1fccdc9aebc181573a3 (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: A senescência é fator determinante para a ocorrência de alterações morfofuncionais da próstata. O objetivo desse estudo foi caracterizar e correlacionar as interações entre os receptores dos fatores de crescimento fibroblásticos (FGFR2, FGFR7, FGFR8), fator de crescimento epidermal (EGFR), ?-actina e vimentina e os receptores androgênicos (AR), estrogênicos ? e ? (ER?, ER?) e de prolactina (PR) nos compartimentos epiteliais e estromal frente à condição de senilidade e variações hormonais. Além disso, caracterizar e correlacionar o AR, ER?, ER? e PR com os FGFs nos compartimentos epitelial e estromal de amostras humanas com adenocarcinoma de alto grau e baixo grau. 50 ratos machos senis (10 meses de idade) e 10 ratos machos jovens (4 meses de idade) foram divididos em grupos: Jovem (JOV) e Senil (SE): óleo de amendoim por 30 dias; Castrado (CAS): castração cirúrgica e química; Tamoxifeno-Letrozol (TAM): tamoxifeno e de letrozol por 30 dias; Castrado+estrógeno (REEST): tratamento similar ao CAS, e posteriormente recebeu injeções de 17?-estradiol por 30 dias; Tamoxifeno-Letrozol+Andrógeno (RETEST): após tratamento similar ao grupo TAM, os animais receberam injeções de Cipionato de Testosterona por 30 dias. Os animais foram sacrificados e amostras do lobo ventral foram coletadas e submetidas às análises de Microscopia de Luz, imunohistoquímicas, western blotting e dosagem hormonal. 30 amostras prostáticas humanas foram divididas em grupos: Adenocarcinoma de alto grau e Adenocarcinoma de baixo grau. As amostras foram submetidas às análises de Microscopia de luz e imunohistoquímicas. Após a administração estrogênica, presença de microácinos, células inflamatórias e hipertrofia do estroma prostático foram observados. A hiperandrogenização levou à recuperação epitelial. No SE houve aumento de vimentina, ER? e PR em relação ao JOV. No CAS observou-se localização diferencial da prolactina e ?-actina em relação ao SE. No RETEST, observou-se recuperação do padrão de distribuição de reatividade da ?-actina e da prolactina em relação ao SE. No REEST foi observado aumento de ER? e ER? e localização diferencial destes, somando-se a diminuição da ?-actina e vimentina em relação ao SE. No TAM foi observada diminuição de ER? e ?-actina, e aumento de prolactina no compartimento estromal, em relação ao SE. Em humanos, os FGFR2 e FGFR8 apresentaram-se aumentados no estágio inicial do câncer prostático, sugerindo essas moléculas como bons alvos terapêuticos. Pode-se concluir que o envolvimento do ER? na ativação do estroma reativo tornou o microambiente favorável à progressão do câncer, devido à potencialização do desequilíbrio estromal, e o ER? contribuíram para a inibição das lesões précancerosas em homens na senescência. Já, o desequilíbrio causado pela ablação e/ou reposição hormonal não somente alterou o feedback entre os hormônios esteróides como modificou a localização da reatividade das moléculas nos compartimentos prostáticos, provavelmente interferindo nas sinalizações autócrinas e parácrinas dos estrógenos, EGF e prolactina, apontando esses como deflagradores da formação do estroma reativo. A ablação hormonal nos animais senis levou ao aumento da reatividade dos FGFs, sugerindo interações entre os hormônios e suas vias de sinalização e o microambiente prostático senil. As vias dos FGFs podem ser ativadas também de maneira andrógeno-independente, uma vez que os FGFs apresentaram níveis de detecção aumentados mesmo diante da intensa depleção androgênica imposta pela castração / Abstract: Senescence is a determining factor for morphological and functional prostatic alterations. The objective of this study was to characterize and correlate the interactions among fibroblast growth factor receptors (FGFR2, FGFR7, FGFR8), epidermal growth factor (EGFR), ?-actin and vimentin and the androgen receptor (AR), estrogen ? and ? (ER?, ER?) and prolactin (PR) in epithelial and stromal prostatic compartments in elderly rats on hormonal variation. Also, the objective was to characterize and correlate the AR, ER?, ER? and PR with the FGFs in the human prostatic samples, presenting high grade and low grade adenocarcinoma. Fifty male rats (10 months old) and 10 young male rats (4 months old) were divided into groups: Young (JOV) and Senile Groups (SE)- peanut oil injections for 30 days, Castrated Group (CAS)- surgical and chemical castration; Tamoxifen-Letrozole Group (TAM)- tamoxifen and letrozole injections in period of 48 hours for 30 days; Castrated + estrogen Group (REEST)- surgical and chemical castration and subsequently the animals received 17?-estradiol injections for 30 days; Tamoxifen- Letrozole + Androgen Group (RETEST): after treatment similar to the TAM group, the animals received testosterone cypionate injections for 30 days. After the treatment, the animals were sacrificed and the ventral lobe samples were collected and analyzed for the Light Microscopy, immunohistochemistry and Western blotting. Thirty human prostatic samples were collected from elderly men and divided into High-grade and Low-grade Adenocarcinoma Groups. The samples were submitted to light microscopy and immunohistochemical analyses. After estrogen administration, epithelial atrophy, microacini, inflammatory cells and stromal hypertrophy were observed. The hyperandrogenization led to the recovery of epithelium. The vimentin, ER? and PR increase was verified in the SE group in relation to JOV one. Differential localization of PR and ?-actin was seen in the CAS group in relation to SE one. Recovery of the distribution pattern of ?-actin and prolactin reactivities was observed in the RETEST group in relation to SE. In the REEST group, it was observed the ER? and ER? increase and differential localization of these receptors, and the ?-actin and vimentin decrease in relation to SE. In the group TAM, it was observed the ER? and ?-actin decrease and the prolactin increase in the stromal compartment in relation to SE group. Regarding to human samples, increased FGFR2 and FGFR8 were observed in the early stages of prostate cancer, suggesting these molecules as good therapeutic targets. Thus, it can be concluded that the involvement of ER? in activation of reactive stromal led to the favorable microenvironment to cancer progression considering the strong stromal imbalance, and the ER? contributed to the inhibition of precancerous lesions in elderly men. The imbalance caused by ablation and/or hormone therapy not only changed the feedback between steroid hormones but also changed the reactivity localization of molecules in prostatic compartments, probably interfering in the autocrine and paracrine signaling of estrogen, prolactin and EGF, and pointing these molecules as possible triggers of the formation of reactive stroma. The present results demonstrated that hormone ablation in senile rats led to increased reactivities of the FGFs, suggesting interactions among hormones and their signaling pathways and senile prostatic microenvironment. Furthermore, it can be concluded that the ways of FGFs can be activated also androgen-independent manner, considering that the FGFs showed increased levels in the severe androgen depletion characterized by castration / Doutorado / Anatomia / Doutora em Biologia Celular e Estrutural

A resposta da produção in vitro de embriões (PIVE) é reduzida quando comparada à in vivo. O aprimoramento do conhecimento dos mecanismos de maturação de oócitos bovinos permite fornecer embasamento para incrementar os sistemas in vitro, aproximando-os do ideal fisiológico. O presente estudo visou investigar os efeitos da suplementação dos meios de maturação com FGF16 (10 ng/ml), BMP15 (100 ng/ml) e a interação de ambos sobre parâmetros relevantes ao desenvolvimento do complexo cumulus oócito (COC), tais como: expansão as células do cumulus (CC), fragmentação de DNA em CC e oócito, maturação nuclear oocitária, metabolismo energético e produção de progesterona. Os COC foram maturados em meios de tratamento (controle, FGF16, BMP15 e FGF16+BMP15) e avaliados em diferentes momentos da MIV (0 e 22 horas). A análise da expansão das CC demonstrou efeito positivo (p=0,0071) da BMP15 (11,34&plusmn;1,09 unidade arbitrária/UA) e da combinação FGF16&#43;BMP15 (11,34&plusmn;0,61 UA) em relação ao grupo controle (8,73&plusmn;0,44 UA) e ao suplementado com FGF16 (9,42&plusmn;0,65 UA). A presença de fragmentação de DNA em CC (p=0,0015) e oócitos (p=0,036) foi significativamente menor em COC tratados com BMP15 (11,73&plusmn;1,24 % e 3,81&plusmn;2,76 %, respectivamente) em comparação ao grupo FGF16 (22,54&plusmn;2,80 % e 31,13&plusmn;7,81 %, respectivamente). Ainda, o FGF16 causou aumento na incidência de fragmentação de DNA em CC, quando relacionado ao controle (16,04&plusmn;1,45 %). A taxa de maturação nuclear oocitária foi superior (p=0,014) no grupo suplementado com BMP15 (93,60&plusmn;4,03 %) em comparação aos grupos controle (80,80&plusmn;2,49 %) e FGF16 (76,75&plusmn;2,28 %), aproximando-se da totalidade. De forma inédita, descrevemos ação da BMP15 (10,79&plusmn;0,72 ng/ml) no incremento da produção de progesterona, sendo maior (p=0,0113) do que a produzida nos grupos controle (8,38&plusmn;0,39 ng/ml) e FGF16 (8,84&plusmn;0,45 ng/ml). Não foi evidenciado efeito dos tratamentos sobre o consumo de glicose e a produção de lactato. O presente estudo reforça o envolvimento da BMP15 na foliculogênese e na diferenciação do COC. Deste modo, a adição da BMP15 (100ng/ml) aos convencionais protocolos de PIVE pode ser de grande valia para elevar a efetividade desta biotecnologia. A suplementação de FGF16 (10ng/ml) se mostrou indiferente ao processo de maturação, permitindo inferir que o FGF16 não tenha envolvimento nas etapas da maturação compreendidas pelo presente estudo in vitro. Não foi observada ação sinérgica entre o FGF16 e a BMP15. / In vitro embryo production (IVEP) efficiency is reduced when compared to in vivo. Gaining knowledge of bovine oocyte maturation mechanisms will provide bases to improve in vitro systems. The present study assessed the in vitro effects of fibroblast growth factor 16 (FGF16), bone morphogenetic protein 15 (BMP15) and their interaction on relevant parameters to cumulus oocyte complex (COC) development, such as: cumulus cells (CC) expansion, oocyte and CC DNA fragmentation, nuclear maturation, energetic metabolism and progesterone production. COCs were matured in control or supplemented media containing, FGF16 (10ng/ml), BMP15 (100ng/ml), FGF16&plusmn;BMP15 and analyzed at different times of IVM (0 and 22 hours). CC expansion evaluation demonstrated a positive effect (p=0.0071) of BMP15 (11.34&plusmn;1.09 arbitrary unit/AU) and FGF16+BMP15 (11.34&plusmn;0,61 AU) when compared to control (8.73&plusmn;0.44 AU) and FGF16 groups (9.42&plusmn;0.65 UA). The presence of DNA fragmentation in CC (p=0.0015) and oocytes (p=0.036) were lower in COCs treated in media supplemented with BMP15 (11.73&plusmn;1.24 % and 3.81&plusmn2.76 %, respectively) in comparison to FGF16 group (22.54&plusmn;2.80 % and 31.13&plusmn;7.81 %, respectively). Moreover, FGF16 caused an increase in CC DNA fragmentation, when related to control (16.04&plusmn;1.45 %). Oocyte nuclear maturation rate was higher (p=0.014) in groups supplemented with BMP15 (93.60&plusmn;4.03 %) compared to control (80.80&plusmn;2.49 %) and FGF16 treatments (76.75&plusmn;2.28 %), almost reaching the totality of COCs. In an unprecedented way, we described the BMP15 increasing action on progesterone production (10.79&plusmn;0,72 ng/ml; p=0.0113) when compared to control (8.38&plusmn;0.39 ng/ml) and FGF16 groups (8.84&plusmn;0.45 ng/ml). There were no differences in glucose consumption and lactate production. The present study reinforces BMP15 involvement in folliculogenesis and COC differentiation. FGF16 (10 ng/ml) media supplementation did not improve any of the outcomes measured, suggesting that FGF16 is not involved in the maturation steps analyzed in the present in vitro study. Thus, the inclusion of BMP15 (100 ng/ml) to conventional IVEP protocols can be valuable to increase the effectiveness of this biotechnology. Synergistic action between FGF16 and BMP15 was not observed.