Este trabalho tem como finalidade estudar e estabelecer alguns parâmetros no processo fermentativo descontínuo alimentado de uma levedura recombinante Saccharomyces cerevisiae W303-181, visando aumentar a obtenção da enzima glicose-6-fosfato desidrogenase (G6PDH). Foram feitas a padronização e otimização do preparo de inóculo de S. cerevisiae recombinante. Foram três as condições estudadas. Reduziu-se o tempo de preparo do inóculo de 114 h, da primeira condição, para e 64 e 48 h para a segunda e terceira condições, respectivamente. Essas duas últimas condições mostraram-se adequados para dar continuidade com os processos fermentativos. Foi feito um estudo de otimização da concentração de micronutrientes (adenina, histidina, triptofano e uracila) no meio de cultivo usando a metodologia de superfície de resposta. Concluiu-se que, ao empregar o meio de cultivo cujas concentrações dos micronutrientes tenham sido otimizadas, a atividade específica de G6PDH atingiu 7927 U/L, 3,2 vezes maior que para o meio controle. Estudou-se a influência da constante de tempo (K), na síntese de G6PDH em processo descontínuo alimentado com vazão de alimentação exponencialmente crescente e decrescente, utilizando meio de cultivo otimizado e não otimizado. Os valores estudados de K para vazão de alimentação exponencialmente crescente foram 0,2, 0,3, 0,5, 0,7 e 0,8 h-1 e, para a decrescente, foram 0,2, 0,5 e 0,8 h-1. Dentre os cultivos com vazão exponencialmente crescente e com meio de cultivo não otimizado, encontrou-se para K=0,2 h-1 uma atividade enzimática (558 U/L) 4,1 vezes maior que para a levedura selvagem. Dentre os cultivos nas vazões exponencialmente crescente e decrescente, encontrou-se para a vazão crescente e K=0,2 h-1 os maiores níveis de produção de G6PDH (847 U/L). Foram estudados a influência da concentração inicial de glicose e o tempo de alimentação do processo descontínuo alimentado com vazão de alimentação exponencialmente crescente e K=0,2h-1. Verificou-se que a concentração inicial de glicose não favoreceu a formação de biomassa ou a produção de enzimas. Contudo, determina e as máximas velocidades específicas de crescimento celular e de produção de G6PDH, com as maiores velocidades correspondendo às menores concentrações iniciais. Por fim, foi estudada a influência da concentração de leucina na síntese da G6PDH e verificou-se que teores de leucina entre 0-240 mg/L não influenciaram o crescimento celular ou a produção de enzima nos cultivos estudados. / The purpose of this work is to study and to establish some parameters in the fed-batch process of a recombinant strain of Saccharomyces cerevisiae, aiming to increase the production the enzyme glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PDH). The recombinant S. cerevisiae inoculum preparation was standardized and optimized. Tree methods were studied. The inoculum preparation time was reduced to 114 h, from first method, to 64 and 48 h to second and third methods, respectively. These two last methods were adequate in order to proceed with the fermentation process. It was evaluated the best micronutrients (adenine, histidine, tryptophan and uracil) concentration in the cultivation medium to produce G6PDH, using a response surface methodology. We concluded that using cultivation medium witch optimized micronutrients concentration, the G6PDH activity reach 7927 U/L, 3.2 fold higher than to not optimized medium. The influence of time constant (K) on the G6PDH synthesis was studied at fed-batch bioreactor under exponentially increasing and decreasing feeding rates, using optimized medium cultivation and not optimized medium. The values for K at increasing rates were 0.2, 0.3, 0.5, 0.7 and 0.8 h-1, and for decreasing rates were 0.2, 0.5 and 0.8 h-1. Among K values for exponentially increasing rates with not optimized cultivation medium, K=02 h-1 shows higher G6PDH production (558U/L), 4.1 fold higher than wild yeast. Among cultivations proceeded with exponentially increasing and decreasing feeding rates and using a optimized medium, increasing rate and k=0.2 h-1 shows the higher G6PDH production (847 U/L) too. The initial glucose concentration and feeding time was studied at fed-batch bioreactor under exponentially increasing feeding rate with K=0.2 h-1. It was verified that initial glucose concentration do not favored mass or G6PDH production. Although, it determines the maximum G6PDH production and the maximum growth rates, with higher rates at lowest initial glucose concentration. At the end, the influence of leucin at G6PDH production was evaluated. It was verified that concentrations values between 0-240 mg/L did not showed influence at cell growth or G6PDH production, at the studied cultivations.

A Arthrospira (Spirulina) platensis, cianobactéria fotoautotrófica, tem sido cultivada para a produção de biomassa, apresentando em sua constituição proteínas, ácidos graxos poliinsaturados, pigmentos, minerais, vitaminas e aminoácidos. O uso de fontes de nitrogênio de baixo custo, como o sulfato de amônio, pode contribuir para a viabilização da produção de A. platensis. Neste trabalho foram verificados a influência de diferentes intensidades luminosas e protocolos de alimentação utilizando o sulfato de amônio, em cultivos realizados com reatores tubulares por processo descontínuo alimentado. As variáveis dependentes selecionadas foram concentração celular máxima (Xm), produtividade em células (Px), fator de conversão de nitrogênio em células (YX/N), bem como teores de proteínas e lipídios da biomassa. Foram obtidos excelentes resultados em cultivos realizados aplicando-se um protocolo de alimentação de sulfato de amônio, considerando biomassa seca de A. platensis com teor de 7 % de nitrogênio, com valor médio de Xm igual a 11414 mg.L-1. Este protocolo de adição de sulfato de amônio com intensidade luminosa de 240 µmol fótons. m-2.s-1 levou à melhor combinação de obtenção de Xm e Px, com valores finais de 12200 mg.L-1 e 1686 mg.L-1.d-1, respectivamente. Adicionalmente, nesse protocolo de adição de sulfato de amônio, os valores de concentração celular máxima foram da mesma ordem de grandeza que aqueles onde se utilizou nitrato de sódio, evidenciando, assim, a possibilidade do uso do sulfato de amônio como uma fonte de nitrogênio alternativa para o cultivo da A. platensis. / Arthrospira (Spirulina) platensis, a photoautotrophic cyanobacterium, has been cultivated for the production of biomass, and it is constituted by proteins, polyunsaturated fatty acids, chlorophyll, minerals, vitamins and amino acids. The use of low cost nitrogen sources, such as ammonium sulphate can contribute to the A. platensis production viability. It was verified in this work the influence of different light intensities and nutrient feeding protocols in fed-batch cultures developed in tubular reactors, where ammonium sulphate was used as a nitrogen source. The dependent variables were the maximum cell concentration (Xm), cell productivity (Px), nitrogen-to-cell conversion factor (YX/N), as well as proteins and lipids contents of the biomass. Excellent results were obtained when ammonium sulphate protocols were studied, considering A. platensis dry-weight with nitrogen levels of 7%, obtaining an average value of Xm corresponding to 11414 mg L-1. It was also obtained with this protocol, with light intensity of 240 µmol photons. m-2.s-1, the best combination to high values of Xm and Px, corresponding to 12200 mg.L-1 e 1686 mg.L-1.d-1, respectively. Moreover, in this protocol of ammonium sulphate addition, it was obtained values of the maximum cell concentration as high as the ones obtained with sodium nitrate as nitrogen source. This fact highlighted the possibility of using this alternative nitrogen source for the A. platensis cultivation.

A produção da cianobactéria Arthrospira (Spirulina) platensis é considerada de interesse nas indústrias de alimentos, farmacêuticas e químicas. Diferentes fontes de nitrogênio alternativas têm sido sugeridas na literatura para seu cultivo, incluindo uréia e sais de amônio, visando à diminuição no custo do meio de cultivo. A perda de amônia por degasificação ocorre quando utilizados tanques abertos, justificando dessa forma o uso da associação de fontes de nitrato e de amônia em fotobiorreatores fechados. O nitrato de amônio (NH4NO3) contorna estas condições, proporcionando ao cultivo uma fonte de nitrogênio prontamente assimilável (amônio) e outra de reserva (nitrato), no mesmo composto. Neste trabalho verificou-se, pelo uso de um planejamento fatorial 22 com configuração de estrela, a influência da intensidade luminosa (I) e da adição de diferentes concentrações de NH4NO3 (mM), no crescimento e composição da biomassa de A. platensis em cultivos realizados em fotobiorreator tubular por processo descontínuo alimentado, utilizando um tempo de 6 dias alimentação para a fonte de nitrogênio. Parâmetros cinéticos de crescimento, como concentração celular máxima (Xm), produtividade em células (PX) e o fator de conversão de nitrogênio em células (YX/N), bem como o teor de proteínas e lipídios na biomassa foram avaliados. Através do uso da regressão multivariável para a otimização das condições experimentais, foram obtidos valores de Xm e de PX correspondentes a 4710 mg L-1 e 478,9 mg L-1d-1, respectivamente, pelo emprego de I = 148 µmol fótons m-2 s-1 e a adição de 9,7 mM de NH4NO3. O maior valor de YX/N registrado foi 8,1 mg mg-1, sendo superior aos obtidos com nitrato de sódio (0,80 mg mg-1). Os teores de proteína e de lipídios alcançaram valores de até 63,2 e 17,3 %, respectivamente. O emprego de NH4NO3 conduziu à redução dos custos de produção, sendo gastos em média R$ 15,97 da fonte de nitrogênio por quilograma de células, valor inferior se comparado com outras fontes usadas no cultivo de A. platensis como NaNO3 (R$ 59,10 por quilograma de células). O uso do NH4NO3 em fotobiorreator tubular mostrou-se promissor para o cultivo de A. platensis, ao proporcionar um aumento na produção de biomassa e diminuir a perda de amônia por degasificação. / The production of the cyanobacterium Arthrospira (Spirulina) platensis is considered of interest to the food, pharmaceutical and chemical industries. Alternative nitrogen sources have been suggested in literature, including urea and ammonium salts, in order to reduce the cost of cultivation medium. Ammonia off-gassing occurs when open ponds are used, thus justifying the utilization of nitrate and ammonia sources association. Ammonium nitrate (NH4NO3) attend this condition, providing the cultivation with a nitrogen source readily assimilated (ammonium) and with one of reserve (nitrate), in the same molecule. In this work, it was verified, using a 22 factorial design with star configuration, the influence of light intensity (I) and the addition of different concentrations of NH4NO3 (mM) on the growth and biomass composition of S. platensis in cultures carried out in tubular photobioreactor by fed-batch process, using a 6-day feeding time of the nitrogen source. Kinetic growth parameters, such as maximum cell concentration (Xm), cell productivity (Px) and yield of nitrogen to biomass (YX/N), as well the biomass content of protein and lipids, were evaluated. Through the use of regression analysis for the optimization of experimental conditions, values of Xm and PX such as 4710 mg L-1 and 478.9 mg L-1d-1, respectively, were obtained by the use of I = 148 µmol photons m-2 s-1 and the addition of 9.7 mM of NH4NO3. The highest value of YX/N obtained was 8.1 mg mg-1, higher than that provided by the use of sodium nitrate (0.80 mg mg-1). The levels of protein and lipid achieved up to 63.2 and 17.3 %, respectively. The use of NH4NO3 led to the reduction of culture medium costs, in which R$ 15.97 (Real/Brazil) were spent on nitrogen source per kilogram of cells, value that is lower if compared to other common sources used for A. platensis growth, such as NaNO3 (R$ 59.10 per kilogram of cells, Real/Brazil). The use of NH4NO3 in tubular photobioreactor proved to be promising for the cultivation of A. platensis, leading to an increase in biomass production and diminishing the ammonia lost by off-gassing.

Ce travail s’intéresse essentiellement au développement et à l’application d’une méthodologie pour l’optimisation dynamique multicritère d’un procédé discontinu alimenté de production bactérienne d’arômes laitiers. L’étude réalisée comprend principalement quatre parties ; la première décrit l'utilisation des plans d’expériences multicritère, couvrant un large domaine expérimental (pH, température et oxygénation), afin de collecter le maximum d'information sur le comportement physiologique de Lactococcus lactis. La deuxième concerne l'analyse cinétique détaillée de l’effet des combinaisons des facteurs opératoires sur la croissance et l'orientation du métabolisme. La troisième, traite de la construction d'un modèle cinétique en mode discontinu et discontinu alimenté. Dans la dernière, l’outil d’optimisation dynamique multicritère a été validé et appliqué au problème de production d’arômes étudié. Les résultats obtenus pour l’optimisation multicritère sont satisfaisants / The aim of the present work is to develop and apply an innovative approach for multicriteria and dynamic optimization of fed-batch fermentation for the production of lactic aroma. This study is mainly divided in four parts: the first one describes the use of multicriteria experimental design, covering an extended operating conditions domain (pH, temperature and oxygenation), in order to collect large experimental information in batch culture of Lactococcus lactis. The second part involves detailed kinetic analysis of operating factor effect combinations on growth and metabolism orientation. The third part deals with the development of a model to predict the kinetic behaviour of this strain in batch and fed-batch cultures. In the last part, the tool for multicriteria and dynamic optimization was validated and applied to the studied problem of lactic aroma production. The results obtained for multicriteria and dynamic optimization are satisfactory

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This study aimed to evaluate the influence of concentrations of sugars in the must, on the performance of ethanol fermentation conducted in fed batch with variable flow of power to define the best concentrations of ART in the must (juice, molasses and mixed) that lead to improved efficiencies and productivity in ethanol fermentation.In the preparation of mash mix were used the following proportions (20% molasses + 80% broth, 40% molasses + 60% broth, 50% molasses + 50% broth, 60% molasses + 40% broth, 80% molasses + 20% broth ). The profile power was declining, varying the flow rate from 0.75 to 0.25 Lh-1, with time filling the fermenter 3 hours for all tests, ranging from 30 to 30 minutes to feed flow wort in fermenter 4L workload (3 liters of wine and 1 liter of inoculum), evaluating diferente concentrations of ART in three types of wine studied. We evaluated performance parameters such as fermentation and process efficiencies and productivity in ethanol. Musts were quantified in pH, sulfuric acid, Brix and ART.In the middle fermented (wine), pH, acidity, residual sugar and ethanol content and quantity of cells. The kinetic profile was defined by quantifying the concentrations of cells, substrate and ethanol (in 1 hour). The figures in this study as a starting point for industrial use are 16 to 18 Brix (ART 114.25 to 125.86 g / L), 16 to 18 ° Brix (ART 127.70 to 141.24 g / L) and around 16 ° Brix (ART 113.68 g / L to 123.30), respectively, for juice of molasses, juice and mix (juice + molasses).The fermentation efficiencies were 77.17 to 90.30% for grape juice, from 74.4 to 86.51% for wine and mixed wine from 61.84 to 84.06 for molasses. Yields were obtained from 6.85 to 8.21 g / Lh for wine broth, 5.90 to 7.77 g / Lh for wine mixed and 4.04 to 6.72 g / Lh for grape molasses. These tracks serve to subsidize recommended as a starting point, the conduct of industrial ethanol fermentation conducted in fed batch with variable flow supply, since the conditions for conducting the tests, as well as the raw materials used in the preparation of musts were similar to those used industrially. / Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Alagoas / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Este estudo objetivou avaliar a influência das concentrações de açúcares nos mostos, sobre o desempenho da fermentação etanólica conduzida em batelada alimentada com vazão variável de alimentação, para a definição das melhores concentrações de ART nos mostos (de caldo, de melaço e misto) que conduzam a melhores eficiências de fermentação e produtividade em etanol. Na preparação do mosto misto foram utilizadas as seguintes proporções (20% melaço + 80% caldo, 40% melaço + 60% caldo, 50% melaço + 50% caldo, 60% melaço + 40% caldo, 80% melaço + 20% caldo). O perfil de alimentação foi decrescente, variando-se a vazão de 0,75 a 0,25 L.h-1, com tempo de enchimento do fermentador de 3 horas para todos os ensaios, variando-se de 30 em 30 minutos a vazão de alimentação de mosto, em fermentador de 4L de volume de trabalho (3 litros de mosto e 1 litro de inoculo), avaliando-se diferentes concentrações de ART nos 3 tipos de mosto estudados. Foram avaliados parâmetros de desempenho, como eficiências fermentativa e de processo e produtividade em etanol. Nos mostos foram quantificados pH, acidez sulfúrica, Brix e ART. No meio fermentado (vinho), pH, acidez, Açúcares Residuais e teor de etanol e quantidade de células. O perfil cinético foi definido, quantificando-se as concentrações de células, substrato e etanol (em intervalos de 1 hora). Os valores indicados neste estudo, como ponto de partida para utilização industrial, são Brix de 16 a 18 (ART 114,25 a 125,86 g/L), de 14 a 18 °Brix (ART de 112,90 a 141,24 g/L) e próximo de 16 °Brix (ART de 113,68 g/L a 123,30), respectivamente para mostos de melaço, caldo e misto (caldo + melaço). As eficiências de fermentação foram: 77,17 a 90,30%, para mosto de caldo, 74,4 a 86,51% para mosto misto e 61,84 a 84,06 para mosto de melaço. As produtividades obtidas foram 6,85 a 8,21g/L.h, para mosto de caldo, 5,90 a 7,77g/L.h para mosto misto e 4,04 a 6,72g/L.h para mosto d melaço. Estas faixas recomendadas servem para subsidiar, como ponto de partida, a condução da fermentação etanólica industrial conduzida em batelada alimentada com vazão variável de alimentação, visto que as condições de condução dos ensaios, assim como as matérias-primas utilizadas na preparação dos mostos, foram semelhantes às utilizadas industrialmente.

Made available in DSpace on 2016-06-02T19:55:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 5536.pdf: 2735660 bytes, checksum: 14dceb0da38443c19f1b8c8410041cad (MD5) Previous issue date: 2013-09-20 / Universidade Federal de Minas Gerais / The use of fossil fuels has a significant impact on the environment, making biofuels a renewable and friendly alternative. Brazil, as one of the leading producers of sugar and ethanol, generates as main residue sugar cane bagasse, which is usually burned for power generation. However, this biomass can be reused as raw material for the production of second generation bioethanol (2G). The consolidation of the industrial production of second-generation (2G) bioethanol relies on the improvement of the economics of the process. Thus, it is important the use of both the fermentable fractions present in sugarcane bagasse, cellulose (C6) and hemicellulose (C5), for the economically feasible process. Within this general scope, the second chapter of this thesis addresses one aspect that impacts the costs of the biochemical route for producing 2G bioethanol: defining optimal operational policies for the reactor running the enzymatic hydrolysis of the C6 biomass fraction. A simple Michaelis Menten pseudo-homogeneous kinetic model with product inhibition was used in the dynamic modeling of a fed-bath reactor, and two feeding policies were implemented and validated in bench-scale reactors processing pre-treated sugarcane bagasse. The first policy was defined with the purpose of sustaining high rates of glucose production, adding enzyme (Accellerase® 1500) and substrate simultaneously during the reaction course. The second approach applied classical optimal control theory, for determining optimal substrate feeding profiles, in order to maximize the performance index proposed. Economical criteria were used for comparing the reactor performance operating in successive batches and in fed-batch modes. Fed-batch mode was less sensitive to enzyme prices than successive batches. Process intensification in the fed-batch reactor led to final glucose concentrations around 200 g/L. The third chapter, in turn, focuses on the xylose utilization, the main sugar found in the C5 fraction, for fermentation to ethanol by yeast Saccharomyces cerevisiae. Although this yeast is not capable of fermenting xylose, it is able to ferment D-xylulose obtained by isomerisation of xylose by glucose isomerase enzyme, generating ethanol and/or xylitol as the main products. The optimization of ethanol production requires the analysis of the metabolism of xylulose. In this context, the genome-scale metabolic model iND750 was adjusted. In silico experiments were carried out using the software OptFlux and compared with experimental data of batch cultivation of S. cerevisiae, in order to validate the model and establishing relationships between fluxes of assimilating xylulose and oxygen and selectivity in the production of ethanol compared to xylitol. Experiments of simultaneous isomerization and fermentation (SIF) of xylose were carried out in a continuous bioreactor containing alginate pellets as biocatalyst with enzyme glucose isomerase and S. cerevisiae coimobilizated. Final concentrations of 6 g/L of ethanol and 5 g/L of xylitol were achieved in continuous cultivation. / A utilização de combustíveis fósseis tem um significativo impacto no meio ambiente, tornando os biocombustíveis uma alternativa renovável e ambientalmente amigável. O Brasil, por ser um dos principais produtores de açúcar e etanol, gera como principal subproduto dessa indústria, o bagaço de cana de açúcar, que é geralmente queimado para geração de energia. Entretanto, esta biomassa pode ser reaproveitada como matéria-prima para produção de bioetanol de segunda geração (2G). A consolidação da produção industrial de bioetanol 2G baseia-se na melhoria econômica do processo. É importante, assim, o uso de ambas as frações fermentáveis presentes no bagaço de cana, de celulose (C6) e de hemicelulose (C5), para viabilizar economicamente o processo. Neste âmbito geral, o segundo capítulo desta tese de doutorado aborda um aspecto que impacta os custos da rota bioquímica para a produção de bioetanol 2G: definição de políticas operacionais ótimas para um reator de hidrólise enzimática da fração C6 do bagaço de cana de açúcar. Foi utilizado um modelo cinético de Michaelis-Menten pseudohomogêneo, com inibição pelo produto, na modelagem dinâmica de um reator em batelada alimentada e duas políticas de alimentação foram implementadas e validadas em reatores de escala de bancada processando bagaço de cana pré-tratado. A primeira política de alimentação foi definida com a finalidade de sustentar elevadas taxas de produção de glicose, adicionando enzima (Accellerase® 1500) e substrato simultaneamente durante o curso da reação. A segunda política aplica a teoria clássica de controle ótimo, para determinação de perfis ótimos de alimentação de substrato, a fim de maximizar o índice de desempenho proposto. Foram usados critérios econômicos para comparar o desempenho do reator operando em bateladas sucessivas e em modos de batelada alimentada. O modo batelada alimentada foi menos sensível a alterações no preço da enzima do que bateladas sucessivas. Intensificação do processo em batelada alimentada conduziu a concentrações finais de glicose de cerca de 200 g/L. Já o terceiro capítulo foca na utilização da xilose, principal açúcar encontrado na fração C5, para fermentação a etanol pela levedura Saccharomyces cerevisiae. Embora esta levedura seja incapaz de fermentar xilose, pode fermentar a D-xilulose obtida pela isomerização de xilose pela enzima glicose isomerase, gerando etanol e/ou xilitol como produtos principais. A otimização da produção de etanol requer a análise do metabolismo da xilulose. Neste contexto, o modelo metabólico em escala genômica iND750 foi utilizado e ajustado. Experiências in silico usando o software OptFlux foram realizadas e comparadas com dados experimentais de cultivos em batelada de S. cerevisiae, com o propósito de validar o modelo e estabelecer relações entre os fluxos de assimilação de xilulose e de oxigênio e a seletividade na produção de etanol em relação a xilitol. Experimentos de isomerização e fermentação simultâneas da xilose (SIF) foram realizados em reator contínuo de leito fixo, contendo como biocatalisador pellets de alginato com enzima glicose isomerase e S. cerevisiae coimobilizadas. Concentrações finais de 6 g/L de etanol e 5 g/L de xilitol foram alcançadas em cultivo contínuo.

Made available in DSpace on 2016-06-02T19:55:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 5990.pdf: 3991723 bytes, checksum: 8f7428459353354f21c1db08bd391507 (MD5) Previous issue date: 2014-02-27 / Universidade Federal de Sao Carlos / The industrial production of fuel ethanol and sugar generates the main byproduct of sugarcane bagasse, which is burned in boilers for power generation. However, as a lignocellulosic material (consisting basically of three polymers: cellulose, hemicellulose and lignin), bagasse can be reused for the production of second generation bioethanol (2G), which is a renewable and environmentally friendly biofuel. For industrial 2G bioethanol production becomes economically feasible, the use of all fermentable fractions present in the bagasse is required: C6 fraction (cellulose) and C5 fraction (hemicellulose). These fractions are subjected to hydrolysis processes that generate as main sugars glucose and xylose respectively. It is important, therefore, that the microorganism employed for the production of ethanol 2G is able to utilize all the sugars generated during the hydrolysis process. In this work we chose the yeast Saccharomyces cerevisiae to be the main microorganism used in the industrial production of ethanol, although unfortunately, this yeast is unable to ferment xylose. However, while S. cerevisiae does not use xylose, can ferment xylulose obtained by isomerization of xylose by the enzyme glucose isomerase. The objective of this study was to develop and evaluate technological alternatives for the production of ethanol 2G from hexoses and pentoses using wild S. cerevisiae. In relation to the C6 fraction, in this work two important aspects have been addressed: i) study of the operation regime of a fed-batch reactor enzymatic hydrolysis of the C6 fraction of bagasse from sugarcane, yielding values of final glucose concentration of 200 g.L-1, higher than 45 g.L-1 achieved in batch reactor; ii) kinetic modeling of complex systems (enzymatic hydrolysis of lignocellulosic substrates), in which an interpolator was developed using fuzzy logic as an important tool to represent the processes of enzymatic hydrolysis of lignocellulosic materials for rugged and reliable manner. Now, in relation to the C5 fraction initially applied simple techniques of Evolutionary Engineering, leading to the selection of a different strain of S. cerevisiae, adapted to assimilate xylulose in minimal medium and characterized by reduced formation of xylitol, which demonstrated a selectivity of ~7 getanol.gxilitol -1, significantly higher than the selectivity achieved by the wild strain of ~2 getanol.gxilitol -1. The selected strain was studied in batch cultures conducted in bench scale reactor under different conditions of oxygen limitation. It was found that the production of ethanol is favored over the formation of xylitol, keeping the flow of consumed xylulose above 0,5 mmol.gMS -1.h-1 for flow of oxygen consumption of 0.1 mmol.gMS -1.h-1, reaching in this condition selectivities around 4 getanol.gxilitol -1. For zero flow of oxygen (anaerobic culture) or above 0,3 mmol.gMS -1.h-1, ethanol production is drastically reduced , regardless of the flow xylulose assimilated by the cells. / A produção industrial de etanol combustível e de açúcar gera como principal subproduto o bagaço de cana de açúcar, que é queimado nas caldeiras para geração de energia. Entretanto, por ser um material lignocelulósico (constituído basicamente por três polímeros: celulose, hemicelulose e lignina), o bagaço pode ser reaproveitado para a produção de bioetanol de segunda geração (2G), que é um biocombustível renovável e ambientalmente amigável. Para que a produção industrial de etanol 2G se torne economicamente viável, é necessário o aproveitamento de todas as frações fermentescíveis presentes no bagaço de cana: fração C6 (celulose) e fração C5 (hemicelulose). Estas frações são submetidas a processos de hidrólise que geram como principais açúcares glicose e xilose respetivamente. É importante, portanto, que o microrganismo empregado para a produção de etanol 2G seja capaz de utilizar todos os açúcares gerados no processo de hidrólise. Neste trabalho foi escolhida a levedura Saccharomyces cerevisiae por ser o principal microrganismo utilizado na produção industrial de álcool combustível, embora, infelizmente, esta levedura seja incapaz de fermentar xilose. No entanto, embora S. cerevisiae não utilize xilose, pode fermentar a xilulose obtida pela isomerização de xilose pela enzima xilose isomerase conhecida industrialmente como glicose isomerase. Assim, o objetivo do presente trabalho foi desenvolver e avaliar alternativas tecnológicas para a produção de etanol 2G a partir de hexoses e pentoses, utilizando S. cerevisiae selvagem. Em relação à Fração C6, neste trabalho foram abordados dois aspectos importantes: i) estudo da operação em regime de batelada alimentada de um reator de hidrólise enzimática da fração C6 do bagaço de cana de açúcar, obtendo-se valores de concentração final de glicose de cerca de 200 g.L-1, superiores aos 45 g.L-1 alcançados em reator operado em bateladas simples; ii) modelagem cinética de sistemas complexos (hidrólise enzimática de substratos lignocelulósicos), no qual foi desenvolvido um interpolador utilizando a lógica fuzzy como uma ferramenta importante para representar os processos de hidrólise enzimática de materiais lignocelulósicos de forma robusta e confiável. Já em relação à Fração C5, inicialmente aplicou-se técnicas simples de Engenharia Evolutiva, levando à seleção de uma linhagem diferenciada de S. cerevisiae, adaptada à assimilação de xilulose em meio mínimo e caracterizada por reduzida formação de xilitol, a qual apresentou uma seletividade de ~7 getanol.gxilitol -1, valor significativamente superior à seletividade alcançada pela linhagem selvagem, de ~2 getanol.gxilitol -1. A linhagem selecionada foi então estudada em cultivos em batelada conduzidos em biorreator de bancada, sob diferentes condições de limitação por oxigênio. Verificou-se que a produção de etanol é favorecida, em detrimento da formação de xilitol, mantendo-se o fluxo de xilulose consumida acima de 0,5 mmol.gMS -1.h-1, para fluxo de oxigênio consumido de 0,1 mmol.gMS -1.h-1, alcançando-se nessa condição seletividades em torno de 4 getanol.gxilitol -1. Para fluxos de oxigênio nulo (cultivo anaeróbio) ou acima de 0,3 mmol.gMS -1.h-1, a produção de etanol é drasticamente reduzida, independentemente do fluxo de xilulose assimilado pelas células.

Abstract Efficient production of biologically functional recombinant proteins is a cornerstone of modern biotechnological research. Laboratory-scale protein production is most commonly accomplished in simple shaking bioreactors such as shake flasks. However, productivity of these cultures is often severely limited by low biomass yield and non-optimal growth conditions regarding medium composition, pH and oxygen supply. In many cases, poor culture performance can constitute a major research bottleneck. This study aims to improve recombinant protein production in shaking Escherichia coli cultures by use of enzyme-controlled, fed-batch-like glucose feeding in a rich medium, and by investigating the effects of culture aeration on different aspects of protein production. The results show that the enzymatic fed-batch medium can provide higher cell densities, volumetric protein yields and, in some cases, improved product solubility or activity compared to traditionally used media. While these improvements could be obtained in ordinary shaking vessels, the results also demonstrate that cultivation in shake flasks with elevated aeration capacity can further improve cell density and volumetric productivity in the fed-batch medium. However, enhanced aeration may also have an adverse effect on the expression of certain proteins such as Fab antibody fragments. Maximum volumetric Fab yield was achieved under reduced aeration rates, and lower oxygen availability also contributed to substantially increased accumulation of periplasmically produced Fab fragments into extracellular medium. Hence modification of aeration conditions and medium composition can be used to control periplasmic/extracellular product localization as outlined in this study. Moreover, high aeration was detrimental to expression in a glycerol-based lactose autoinduction medium, but this strict dependency on aeration level could be mitigated and robustness of expression improved by an autoinduction medium based on the enzymatic glucose feeding as the supporting carbon source instead of glycerol. The results of this study can be utilized to improve volumetric productivity, protein solubility and control of product localization in small-scale protein production, as well as to facilitate robust and efficient high-throughput protein expression for such applications as structural and functional characterization. / Tiivistelmä Biologisesti aktiivisten vierasproteiinien tehokas tuottaminen on yksi bioteknologisen tutkimuksen kulmakivistä. Laboratoriomittakaavan proteiinituotto toteutetaan yleisimmin yksinkertaisissa ravistelubioreaktoreissa, kuten ravistelupulloissa. Näiden viljelmien tuottavuutta rajoittaa kuitenkin usein biomassan matala saanto sekä epäoptimaaliset olosuhteet kasvualustan koostumuksen, pH:n ja hapen suhteen. Monissa tapauksissa viljelmän heikko tuottavuus muodostaa tutkimukselle merkittävän pullonkaulan. Tämän tutkimuksen tavoite on parantaa vierasproteiinien tuottoa Escherichia coli –ravisteluviljelmissä hyödyntäen entsymaattisesti kontrolloitua, panossyöttökasvatusta jäljittelevää glukoosisyöttöä rikkaassa kasvualustassa, sekä selvittää ilmastuksen vaikutusta proteiinituoton eri osatekijöihin. Tulosten mukaan glukoosisyöttöön perustuva kasvualusta mahdollistaa korkeamman solutiheyden sekä proteiinituoton verrattuna tavallisimmin käytettyihin kasvualustoihin. Joissain tapauksissa myös proteiinin liukoisuus tai aktiivisuus voi parantua. Vaikka nämä edut pystyttiin saavuttamaan myös tavanomaisissa ravistelupulloissa, voidaan panossyöttökasvualustan solutiheyttä ja tuottoa tilavuutta kohti edelleen lisätä käyttämällä korkeamman ilmastustehokkuuden ravistelupulloja. Toisaalta tehostetun ilmastuksen havaittiin olevan mahdollisesti haitallista tiettyjen proteiinien, kuten Fab-vasta-ainefragmenttien, tuotolle. Fab-fragmenttien maksimaalinen tuotto saavutettiin ilmastustehokkuutta laskemalla. Lisäksi matalampi hapen saatavuus edisti periplasmaan ohjattujen Fab-fragmenttien kerääntymistä solunulkoiseen kasvualustaan. Näin ollen ilmastusolosuhteita ja kasvualustan koostumusta muokkaamalla voidaan vaikuttaa tuotteen lopulliseen sijoittumiseen. Korkean ilmastustehokkuuden havaittiin myös olevan haitallista proteiinituotolle glyserolipohjaisessa autoinduktiokasvualustassa. Tätä riippuvuutta ilmastuksen tasosta pystyttiin vähentämään ja autoinduktion luotettavuutta parantamaan käyttämällä kasvualustaa jossa hiililähteenä toimii glyserolin sijaan entsymaattinen glukoosisyöttö. Tutkimuksen tuloksia hyödyntäen voidaan parantaa vierasproteiinien saantoa, liukoisuutta ja periplasmisen/solunulkoisen kerääntymisen säätelyä, sekä mahdollistaa luotettava ja tehokas proteiinituotto viljelmien suurta lukumäärää vaativiin sovelluksiin, kuten proteiinien rakenteen ja toiminnan tutkimukseen.

AD is regarded as a sustainable technology that could assist the UK Government meet internationally agreed GHG emission targets by 2050. However, the mature status of the technology is based on expensive systems that rely on high energy feedstock to be profitable. Meanwhile, the natural biodegradation of cow slurry is a recognised contributor to climate change despite having a relatively low CH4 potential because of the large volumes produced. Economic mixing is essential to the cost-effectiveness of farm AD but techniques applied are not always appropriate as slurry is a shear thinning thixotropic Herschel-Bulkley fluid and therefore challenging to mix. The apparent viscosity of slurry and the shear stress induced was most influenced by solids content (exponential change) followed by temperature (linear). Most shear thinning occurred before a rising shear rate of 20s-1 was achieved with the fluid acting near-Newtonian above. Thixotropic recovery occurred within 1 hour of resting. Rheological values were also much higher than previously reported. Highest CH4 production occurred in the first 10 days of the batch process using a range of mixing regimes with different shear rates and rest periods. During fed-batch operations, changing shear rate had a minimal effect on CH4 production using a 30-day HRT whereas shorter rest periods increased production. Specific CH4 production rate was highest when feeding and mixing coincided. However, when HRT was reduced (OLR increased) the CH4 produced by all mixed regimes significantly increased with highest values being achieved using high intensity mixing rested for short periods. Lower HRTs also requires smaller digesters. Parasitic mixing energy invariably had the most influence on net energy production. Signs of instability were evident after 20 days using the low HRT. Significant microbial adaptation was also observed as the experiments progressed. The research outcomes demonstrate that mixing regime and HRT can be managed to maximise net energy production whilst reducing capital expenditure.