Made available in DSpace on 2016-03-15T19:40:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ana Cristina Silva Araujo.pdf: 523045 bytes, checksum: 16d7e21650b3e9b5165a5dc2c0d09f29 (MD5) Previous issue date: 2007-03-01 / Fundo Mackenzie de Pesquisa / The frequency of the manifestation of autistic phenotype in children and young with congenital blindness has been subject of great interest in the last decades. In this study 29 children and young between four and 15 years old with congenital blindness had been investigated regarding the frequency of manifestation of the signals and symptoms of autistic phenotype, from the application of a suitable version of Autism Screening Questionnaire (ASQ) in interview with the parents. The results had identified that of the 29 children and young, 13 scored above of the cut off for the Pervasive Development Disorders (PDD). Considering the three areas that the instrument encloses, the communication area was the biggest concentration of points for each subject. These findings are in accordance with international literature, however a better inquiry of this sample becomes necessary to verify if the identified characteristics are part of the consequences of the blindness or if they demonstrate the comorbidity with the PDD. / A freqüência da manifestação do fenótipo autista em crianças e jovens com cegueira congênita têm sido assunto de grande interesse nas ultimas décadas. Neste estudo 29 crianças e jovens entre quatro e 15 anos com cegueira congênita foram investigados a respeito da freqüência de manifestação dos sinais e sintomas do fenótipo autista, a partir da aplicação de uma versão adaptada do Autism Screening Questionnaire (ASQ) em entrevista com os pais. Os resultados identificaram que das 29 crianças e jovens, 13 pontuaram acima da nota de corte para os Transtornos Invasivos do Desenvolvimento (TID). Sendo que das três áreas que o instrumento abrange, a área de comunicação foi onde existiu a maior concentração de pontos por sujeito. Estes achados estão de acordo com a literatura internacional, entretanto se faz necessário uma melhor investigação desta amostra para verificar se as características identificadas fazem parte das conseqüências da cegueira ou se demonstram a comorbidade com os TID.

Rearranjos cromossômicos envolvendo a presença de cromossomos marcadores extranumerário são achados citogenéticos freqüentes em pacientes que apresentam deficiência mental, alterações de crescimento, dismorfias e/ou malformações. A presença desse material é responsável por trissomia ou tetrassomia parcial de determinadas regiões cromossômicas, causando quadros clínicos distintos e inespecíficos. A variabilidade fenotípica está relacionada principalmente com os diferentes graus de mosaicismo, os genes presentes na região adicional, o cromossomo de origem, entre outros fatores. Sendo assim, a caracterização desse material cromossômico é de importância fundamental para a determinação do prognóstico e do aconselhamento genético dos pacientes e suas famílias. O presente estudo teve como objetivo a análise de cromossomos marcadores extranumerários por meio de técnicas de citogenética convencional e molecular. Foram selecionados onze pacientes que são acompanhados pelo o Serviço de Genética Médica do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto USP, todos com diagnóstico citogenético convencional por bandeamentos GTG de cromossomo marcador extranumerário. Para determinação da origem e caracterização dos cromossomos marcadores foram aplicadas as técnicas de Cariótipo Espectral (SKY) e de Hibridação in situ Fluorescente (FISH). Em dez pacientes foi possível determinar a origem e composição dos marcadores. Dois pacientes apresentam cromossomos marcadores identificados como duplicações invertidas do cromossomo 15, com cariótipos definidos, respectivamente, como 47,XY,+idic(15)(pterq15::q15pter) e 47,XX,+idic(15)(pterq21::q21p11.2), um paciente possui cromossomo marcador derivativo do cromossomo 15, com cariótipo 47,XX,+der(15)(pterq21) e dois pacientes, sendo uma menina e seu pai, possuem cromossomos marcadores derivativos do cromossomo 15 com cariótipos, respectivamente, 48,XX,+2der(15)(pterq12) e 48,XY,+2der(15)(pterq12). Dois pacientes possuem cromossomos marcadores derivativos do cromossomo 9, com cariótipos definidos, respectivamente, como 47,XX,+der(9)(pterq21) e 47,XX,+der(9)(pterq32) e um paciente apresenta cromossomo derivativo do cromossomo 4 [47,XX,+der(4)(p16q21)[9]/48,XX,+der(4)(p16q21),+mar[91]]. Um paciente possui um cromossomo marcador translocado derivativo do cromossomo 22 [47,XY,+der(22)t(11;22)(q25:q11.2)] e outro paciente, um cromossomo translocado derivativo do cromossomo 15 [47,XY,+der(15)t(15;16)(q13;q13)], ambos herdados de mães portadoras de translocações aparente balanceadas. Em um caso, não foi possível a caracterização dos cromossomos marcadores por meio das técnicas aplicadas. Há uma grande variação fenotípica associada à presença de cromossomos marcadores e muitas vezes o prognóstico e o aconselhamento genético são difíceis de determinar. As técnicas de citogenética molecular são ferramentas importantes para a caracterização dos cromossomos marcadores, tanto durante o pré-natal, como para uma família que já possui um membro afetado, auxiliando no mapeamento gênico de cada região envolvida para futura correlação cariótipo-genótipo-fenótipo. / Chromosomal rearrangements involving supernumerary marker chromosomes are frequently found in patients with mental retardation, growth defects and malformations. The genetic materials presented in trisomy/tetrasomy are responsible by distinct and unspecific clinical symptoms. The phenotypic variation is related mainly to different mosaicismo degrees, genetic content and chromosomal origin. Thus, the characterization of marker chromosomes is important to determine the prognosis and genetic counseling to the patients and their families. The aim of this study was to analyze supernumerary marker chromosomes using conventional and molecular cytogenetic techniques. Eleven patients were included in this study, all assisted in Medical Genetic Division of Clinical Hospital of School of Medicine of Ribeirao Preto USP. They all presented supernumerary marker chromosomes detected by GTG band. The origin and composition were determined using Spectral Karyotype (SKY) and Fluorescence in situ Hybridization (FISH) techniques. To ten patients, the origin and composition were determined. Two patients presented inverted duplications of chromosome 15, and their karyotype were defined as 47,XY,+idic(15)(pterq15::q15pter) and 47,XX,+idic(15)(pterq21::q21p11.2), one patient had a derivative chromosome 15, with karyotype 47,XX,+der(15)(pterq21), and two patients, a girl and her father, had two derivatives chromosomes 15, with karyotypes 48,XX,+2der(15)(pterq12) e 48,XY,+2der(15)(pterq12), respectively. Two patients presented derivative chromosomes 9 and their karyotype were defined as 47,XX,+der(9)(pterq21) and 47,XX,+der(9)(pterq32), and one patient had a derivative chromosome 4, with karyotype 47,XX,+der(4)(p16q21)[9]/48,XX,+der(4)(p16q21),+mar[91]. One patient had a translocated marker chromosome, derivative 22, [47,XY,+der(22)t(11;22)(q25:q11.2)] and another patient had a translocated marker chromosome, derivative 15 [47,XY,+der(15)t(15;16)(q13;q13)]. In one case, was not possible to define the origin and composition of the marker chromosome using SKY and FISH techniques. A large phenotypic variation is associated with supernumerary marker chromosomes and many times, the prognosis and genetic counseling is difficult to determine. The molecular cytogenetic techniques are important tools to its characterization, during prenatal diagnosis or to a family with an affected person, helping the genetic mapping of each region to a future correlation karyotype-genotype-phenotype.

Existe um relevante interesse em pesquisar a ocorrência de polimorfismos no genoma bovino por diferentes motivos, e mais recentemente, com a finalidade de agregar mais informações ao estudo de características quantitativas visando selecionar animais geneticamente superiores com considerável valor comercial. Os polimorfismos de base única (SNPs) neste estudo foram identificados como RFLP/MboII e RFLP/HpaII sendo que o polimorfismo RFLP/MboII está situado no exon 6 do gene IGF2 (insulin-like growth factor 2), localizado no cromossomo 29 em bovinos, e desempenha um papel importante na proliferação e diferenciação celular para o crescimento e desenvolvimento dos mamíferos. O polimorfismo RFLP/HpaII encontra-se no elemento Bov-A2 (considerado um elemento SINE - Short Interspersed Nucleotide Element) presente na região promotora do gene CYP21 (Steroid 21-hydroxylase gene) no cromossomo 23 em bovinos. Para avaliar a ocorrência dos SNPs utilizou-se a técnica de PCR-RFLP em amostras de DNA a partir de sangue/sêmen de cerca de 300 animais bovinos das raças zebuínas Gir, Guzerá e Nelore. As frequências alélicas mostraram maior incidência do alelo T quando comparado ao C enquanto que as frequências genotípicas apresentaram alta ocorrência do heterozigoto TC em comparação aos homozigotos CC e TT para o polimorfismo IGF2 - RFLP/MboII. Com relação ao polimorfismo CYP21 RFLP/HpaII, a frequência alélica revelou alto valor do alelo T. A população encontrou-se em equilíbrio de Hardy-Weinberg para os SNPs estudados. Ferramentas de bioinformática foram utilizadas para investigações in silico revelando que os sítios polimórficos estão em regiões com potencial regulatório. A associação desses polimorfismos com DEPs das características reprodutivas e produtivas foram investigadas, entretanto mostrou-se significativas apenas para DP550 (IGF2 - RFLP/MboII) e DP450 (CYP21 - RFLP/HpaII). Os resultados obtidos sugerem que protocolos de Biologia Molecular in vitro podem ser usados para identificar novos marcadores moleculares, como SNPs funcionais adicionando informações que certamente contribuirão para estratégias de melhoramento dessas raças bovinas de grande importância para a produção de carne e leite em nosso país. Este foi o primeiro estudo sobre a ocorrência desses polimorfismos em raças zebuínas criadas no Brasil. / There is a considerable interest in researching the occurrence of polymorphisms in the bovine genome for different reasons, and more recently, in order to add more information to the study of quantitative traits to select genetically superior animals with considerable commercial value. The single nucleotide polymorphisms (SNPs) in this study were identified as RFLP/MboII and RFLP/HpaII polymorphisms being the RFLP/MboII is situated in exon 6 of the IGF2 gene (insulin-like growth factor 2), located on chromosome 29 in cattle, perform an important role in cell proliferation, differentiation for growth and in the development of mammals. Polymorphism RFLP/HpaII is the element Bov-A2 (considered an element SINE - Short Interspersed Nucleotide Element) present in the promoter region of CYP21 gene (Steroid 21-hydroxylase gene) on chromosome 23 in cattle. To evaluate the occurrence of SNPs, we used the PCR-RFLP method on DNA samples from blood/semen of about 300 cattle breeds from Zebu Gyr, Guzerat and Nellore. The allele frequencies showed a higher incidence of T allele compared to C while the genotype frequencies showed high incidence of heterozygous CT compared to CC and TT homozygous for the IGF2 polymorphism - RFLP/MboII. On the subject of the CYP21 polymorphism - RFLP/HpaII, the allele frequency showed high value T. The population was found in Hardy-Weinberg equilibrium for the SNPs studied. Bioinformatics tools, used for in silico investigations, revealed that the polymorphic sites are in regions with regulatory potential. The association of these polymorphisms with EPDs of reproductive and productive traits were investigated, but proved to be significant only for DP550 (IGF2 - RFLP/MboII) and DP450 (CYP21 - RFLP/HpaII). The results suggest that protocols of molecular biology in vitro can be used to identify new molecular markers, such as functional SNPs adding information that certainly will contribute to the improvement strategies of these breeds of great importance for the production of meat and milk in our country. It has been the first study on the occurrence of these polymorphisms in Zebu breeds raised in Brazil.

Orientador: Antonio Fernando Ribeiro / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-19T10:15:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Marsom_FernandoAugustodeLima_M.pdf: 12182231 bytes, checksum: e98655cb1347b5ba1ffbceac13daebb0 (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: Introdução: A fibrose cística (FC) se manifesta clinicamente com várias formas de gravidade, moduladas por diferentes genótipos e o meio ambiente. Enquanto as classes das mutações no gene CFTR ("Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator") estão bem definidas, como moduladores de gravidade da FC, os polimorfismos continuam controversos. Objetivo: Verificar se polimorfismos em genes modificadores estão associados com a gravidade da FC. Método: Estudo de corte transversal, entre 2009 a 2010. Todos pacientes foram submetidos à análise das principais mutações no gene CFTR, presença dos polimorfismos (por meio de diferentes técnicas moleculares - "nested" PCR, digestão enzimática, PCR "multiplex", genotipagem em sequenciador automático e PCR ARMS) e características clínicas de gravidade da FC. Resultado: As mutações identificadas no gene CFTR foram associadas com variáveis que descrevem o início da doença, atuando como fator de proteção a clínica de maior gravidade [idade (p?0,0001), 1ª manifestação clínica (1MC) (p?0,0001), diagnóstico (p?0,0001), início dos sintomas pulmonares (ISP) (p?0,0001) e digestivos (ISD) (p?0,0001), 1ª bactéria Pseudomonas aeruginosa isolada (1PA) (p?0,0001), insuficiência pancreática (IP) (p?0,0001), P. aeruginosa mucóide (PAM) (p?0,0001), P. aeruginosa não mucóide (PANM) (p?0,0001)]. O gene ACE foi associado a 1MC (p:0,038), ao escore de Bhalla (EB) (p:0,049) e a presença de Bulkolderia cepacia (BC) (p:0,038). O polimorfismo GCLC129C>T foi associado à PAM (p:0,037). O polimorfismo GCLC350 foi associado a 1PA (p:0,049), Achromobacter xylosoxidans (p:0,044) e Staphylococcus aureus (SA) (p:0,037). O gene GSTM1 foi associado ao diagnóstico (p:0,014), índice de massa corpórea (IMC) (0,045), escore de Kanga (EK) (p:0,046), capacidade vital forçada [CVF(%)] (p:0,004) e volume expiratório forçado no primeiro segundo [VEF1(%)] (p:0,004). O gene GSTT1 foi associado ao ISD (p:0.033), osteoporose (p:0.021), EB (p:0,026), escore de Shwachman Kulczycki (SC) (p:0,009), CVF(%) (p:0,015), VEF1(%) (p:0,005), razão entre o VEF1 e a CVF [TIF(%)] (p:0,033), fluxo expiratório forçado entre 25 e 75% da CVF [FEF25- 75%(%)] (p:0,005) e PAM (p:0,038). O agrupamento genotípico dos genes GSTM1 e GSTT1 foi associado com o diagnóstico (p:0,014), BC (p:0,042) e SA (p:0,032). O gene GSTP1 foi associado com o ISP (p:0,026), IP (p:0,011), EB (p:0,015), EK (p:0,028), SC (p:0,039), CVF(%) (p:0,021), VEF1(%) (p:0,021), FEF25-75% (p:0,02) e 1PA (p:0,022). O alelo 1 para o polimorfismo de repetição AAT no gene NOS-1 foi associado com a idade (p:0,009) e com o ISD (p:0,001). O alelo 2 com ISP (p:0,031), ISD (p:0,001) e EB (p:0,046). O alelo 1 para o polimorfismo GT-1 no gene NOS-1 não apresentou associação com as variáveis clínicas. O alelo 2 apresentou associação com a saturação de oxigênio transcutânea (p:0,012), EB (p:0,013), CVF(%) (p:0,038), VEF1(%) (p:0,007), TIF(%) (p:0,036) e FEF25-75(%) (p:0,007). O alelo 1 para o polimorfismo de repetição GT-2 no gene NOS1 apresentou associação com a CVF(%) (p:0,032). O alelo 2 apresentou associação com o TIF(%) (p:0,009). O polimorfismo Arg>Gly no gene ADRB2R apresentou associação com a IP (p:0,009), EB (p:0,039), VEF1(%) (p:0,003), FEF25-75(%) (p:0,008), 1PA (p:0,012), PAM (p:0,023) e PANM (p:0,024). O polimorfismo Gln>Glu no gene ADRB2R apresentou associação com o EB (p:0,019) e TIF(%) (p:0,047). A resposta ao broncodilatador inalatório na prova de espirometria apresentou associação com os marcadores de gravidade clínica VEF1(%) (p:0,011) e FEF25-75(%) (p:0,019) apenas para o polimorfismo Arg>Gly no gene ADRB2R. Conclusão: Houve associação entre os polimorfismos analisados e as mutações no gene CFTR com a gravidade clínica da FC / Abstract: Introduction: Cystic fibrosis (CF) is clinically manifested in various forms of gravity, modulated by different genotypes and environment. While the classes of mutations in the CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator) gene are well defined as modulators of severity in CF, polymorphisms remain controversial. Objective: To determine whether polymorphisms in modifier genes are associated with the severity in the CF. Method: Cross-sectional study, between 2009 to 2010. All patients were subjected to analysis of major mutations in CFTR gene, presence of polymorphisms (using different molecular techniques - Nested PCR, enzyme digestion, multiplex PCR, genotyping in automatic sequencer and ARMS PCR) and clinical severity in CF. Results: Mutations were identified in CFTR gene associated with variables that describe the onset of the disease, acting as a protective factor for the clinical severity [age (p?0.0001), first clinical manifestation (1CM) (p?0.0001), diagnosis (p?0.0001) , onset of pulmonary symptoms (OPS) (p?0.0001) and digestive (ODS) (p?0.0001), 1st isolated bacterium Pseudomonas aeruginosa (1PA) (p?0.0001), pancreatic insufficiency (PI) ( p?0.0001), P. aeruginosa mucoid (PAM) (p?0.0001) and P. aeruginosa no mucoid (PANM) (p?0.0001)]. ACE gene was associated with 1CM (p:0.038), Bhalla score (BS) (p:0.049) and presence of Bulkolderia cepacia (BC) (p:0.038). Polymorphism GCLC129C>T was associated with PAM (p:0.037). Polymorphism GCLC350 was associated with 1PA (p:0.049), Achromobacter xylosoxidans (p:0.044) and Staphylococcus aureus (SA) (p:0.037). GSTM1 gene was associated with diagnosis (p:0.014), body mass index (BMI) (0.045), Kanga score (KS) (p:0.046), forced vital capacity [FVC(%)] (p:0.004) and forced expiratory volume in one second [FEV1(%)] (p:0.004). GSTT1 gene was associated with ODS (p:0033), osteoporosis (p:0.021), BS (p:0.026), Shwachman-Kulczycki score (SS) (p:0.009), FVC(%) (p:0.015) , FEV1(%) (p:0.005), ratio between FEV1 and FVC [TIF(%)] (p:0.033), forced expiratory flow between 25 and 75% of FVC [FEF25-75%(%)] (p:0.005) and PAM (p:0.038). The genotypic groupings of genes GSTM1 and GSTT1 was associated with diagnosis (p:0.014), BC (p:0.042) and SA (p:0.032). GSTP1 gene was associated with the OPS (p:0.026), PI (p:0.011), BS (p:0.015), KS (p:0.028), SS (p:0.039), FVC(%) (p:0.021 ), FEV1(%) (p:0.021), FEF25-75% (p:0.02) and 1PA (p:0.022). Allele 1 for AAT repeat polymorphism in NOS-1 gene was associated with age (p:0.009) and ODS (p:0.001). Allele 2 with OPS (p:0.031), ODS (p:0.001) and BS (p:0.046). Allele 1 for repeat polymorphism GT-1 in NOS-1 gene was not associated with clinical variables. Allele 2 was associated with transcutaneous oxygen saturation (p:0.012), BS (p:0.013), FVC(%) (p:0.038), FEV1(%) (p:0.007), TIF(%) (p:0.036) and FEF25-75(%) (p:0.007). The allele 1 for repeat polymorphism GT-2 in NOS1 gene was associated with FVC(%) (p:0.032). The allele 2 was associated with the TIF(%) (p:0.009). Polymorphism Arg>Gly in ADRB2R gene was associated with PI (p:0.009), BS (p:0.039), FEV1(%) (p:0.003), FEF25-75(%) (p:0.008), 1PA ( p:0.012), PAM (p:0.023) and PANM (p:0.024). Polymorphism Gln>Glu in ADRB2R gene was associated with BS (p:0.019) and TIF(%) (p:0.047). The response to inhaled bronchodilator in the spirometry test presented association for the markers of clinical severity FEV1(%) (p:0.011) and FEF25-75(%) (p:0.019) only for the polymorphism Arg>Gly in ADRB2R gene. Conclusion: There was association between the polymorphisms studied and CFTR mutations with the clinical severity in CF / Mestrado / Saude da Criança e do Adolescente / Mestre em Saude da Criança e do Adolescente

Orientador: André Santanchè / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Computação / Made available in DSpace on 2018-08-24T12:38:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Miranda_EduardodePaula_M.pdf: 3021722 bytes, checksum: 93a67943f673753c003a021060a55b6c (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: Um grande número de estudos em biologia, incluindo os que envolvem a reconstrução de árvores filogenéticas, resultam na produção de uma enorme quantidade de dados -- por exemplo, descrições fenotípicas , matrizes de dados morfológicos , árvores filogenéticas, etc. Biólogos enfrentam cada vez mais o desafio e a oportunidade de efetivamente descobrir conhecimento a partir do cruzamento e comparação de vários conjuntos de dados, nem sempre conectados e integrados. Neste trabalho, estamos interessados em um contexto específico da biologia em que biólogos aplicam ferramentas computacionais para construir e compartilhar descrições digitais dos seres vivos. Nós propomos um processo que parte de fontes de dados fragmentadas, que nós mapeamos para grafos, em direção a uma plena integração das descrições através de ontologias. Os bancos de dados de grafos intermediam o processo de evolução. Eles são menos dependentes de esquema e, uma vez que ontologias também são grafos, o processo de mapeamento do grafo inicial para uma ontologia torna-se uma sequência de transformações no grafo. Nossa motivação parte da ideia de que a conversão de descrições fenotípicas em uma rede de relações e a busca de conexões entre elementos relacionados irá aumentar a capacidade de resolver problemas mais complexos suportados por computadores. Este trabalho detalha os princípios de concepção por trás do nosso processo e duas implementações práticas como prova de conceito / Abstract: A large number of studies in biology, including those involving phylogenetic trees reconstruction, result in the production of a huge amount of data -- e.g., phenotype descriptions, morphological data matrices, phylogenetic trees, etc. Biologists increasingly face a challenge and opportunity of effectively discovering useful knowledge crossing and comparing several pieces of information, not always linked and integrated. In this work, we are interested in a specific biology context, in which biologists apply computational tools to build and share digital descriptions of living beings. We propose a process that departs from fragmentary data sources, which we map to graphs, towards a full integration of descriptions through ontologies. Graph databases mediate this evolvement process. They are less schema dependent and, since an ontology is also a graph, the mapping process from the initial graph towards an ontology becomes a sequence of graph transformations. Our motivation stems from the idea that transforming phenotypical descriptions in a network of relationships and looking for links among related elements will enhance the ability of solving more complex problems supported by machines. This work details the design principles behind our process and two practical implementations as proof of concept / Mestrado / Ciência da Computação / Mestre em Ciência da Computação

A Síndrome de Marfan (SMF) é uma doença de caráter autossômico dominante que acomete o tecido conjuntivo. As principais manifestações clínicas afetam o sistema cardiovascular, ótico e ósseo. A SMF é causada por mutações no gene FBN1, que codifica a proteína extracelular fibrilina-1, componente principal das microfibrilas, que formam as fibras elásticas. Estudos mostraram que mutações no gene da fibrilina-1 levam a um aumento indiscriminado do TGF-Β ativo na matriz, que resulta nos principais fenótipos da doença. O Sistema Renina Angiotensina (RAS) tem como produto principal a Angiotensina II (Ang-II), envolvida na regulação da massa óssea e da atividade do TGF-Β. Estratégias terapêuticas para a SMF utilizando fármacos que agem no RAS têm sido alvos de estudos em modelos animais. Em camundongos, Ramipril, inibidor da ACE (Angiotensin-converting enzyme inhibitor, ACEi), aumenta a transcrição do gene Fbn1 em 35% e melhora a cifose, característica do fenótipo ósseo no modelo animal mgΔloxPneo. O mecanismo de ação do Ramipril no sistema ósseo ainda não está totalmente elucidado, sendo que pode agir por diminuição na produção de Ang-II e consequente diminuição nos níveis de TGF-Β, ou pela inibição de degradação da bradicinina (BK) pela Ang-II. A bradicinina ativa diretamente seu receptor B2R, que induz ações fisiológicas opostas às da Ang-II. O objetivo deste trabalho foi avaliar e compreender os mecanismos gerais da patogênese óssea do modelo murino mgΔloxPneo para a SMF. Para tanto, foi analisado o fenótipo ósseo dos animais mgΔloxPneo e selvagens controle e tratados com Ramipril. Foi verificado que, além da cifose, os animais mutantes apresentaram pior estrutura óssea. O tratamento melhorou a cifose, porém não alterou a qualidade óssea dos animais mutantes. Portanto, o efeito benéfico do Ramipril na cifose dos animais mgΔloxPneo não se deve a uma melhora da estrutura óssea, e pode estar relacionado à integridade do ligamento que sustenta a coluna vertebral. Com o intuito de testar a hipótese de que a sinalização pelo receptor B2R da BK possa estar envolvida no desenvolvimento do fenótipo ósseo dos animais mgΔloxPneo, foram gerados animais mgΔloxPneo e knockout para o receptor B2R. Os resultados mostram que o receptor B2R não interfere no desenvolvimento da cifose, sendo apenas o genótipo para Fbn1 o fator determinante para a manifestação desse fenótipo. Foi realizada a análise de RNA-seq para verificar genes e vias diferencialmente expressas que possam explicar o mecanismo de desenvolvimento do fenótipo ósseo dos animais mgΔloxPneo. Foram encontradas vias como da adesão focal, interação receptor-meio extracelular (MEC), junção ocludente, reparação por excisão de nucleotídeo e de reparação missmatch, que podem explicar alterações no metabolismo de células ósseas. Além disso, foram encontradas diferenças de expressão de genes relacionados ao metabolismo muscular esquelético, o que está de acordo com a hipótese de regulação parácrina entre o tecido muscular e ósseo, levando a uma pior estrutura óssea / Marfan syndrome (MFS) is an autosomal dominant disease that affects the connective tissue. The main clinical manifestations affect the cardiovascular, optical and bone systems. MFS is caused by mutations in the FBN1 gene, that encodes the extracellular protein fibrillin-1, a major component of microfibrils, which form elastic fibers. Studies have shown that mutations in the fibrillin-1 gene lead to an indiscriminate increase in active TGF-Β in the matrix, which results in the major phenotypes of the disease. The Renin Angiotensin System (RAS) has as its main product Angiotensin II (Ang-II), involved in bone mass regulation and TGF-Β activity. Therapeutic strategies using drugs targeting the RAS have been studied in animal models. Ramipril, an ACE inhibitor (Angiotensin-converting enzyme inhibitor, ACEi), increase Fbn1 gene expression in 35% and improve kyphosis index in the mgΔloxPneo mouse model for SMF. Its mechanism of action in bone tissue is not completely elucidated, and it may act by decreasing Ang-II production and consequent reduction in TGF-Β levels, or by inhibiting degradation of bradykinin (BK) by Ang II. BK directly activates its B2R receptor, which induces opposite physiological actions to Ang-II. This study aims to evaluate and understand the general mechanisms of bone pathogenesis in the mgΔloxPneo mouse model. We analyzed the bone phenotype of mgΔloxPneo and wildtype animals treated, or not, with Ramipril by measuring the kyphosis index (KI), micro computed tomography (μCT) and Real-time PCR (RT-PCR). We found that mutant animals showed a greater degree of kyphosis and an altered bone structure. Ramipril improved kyphosis but did not alter bone quality of mutant animals, while in wild type animals Ramipril decreased bone structure without altering KI. Therefore, the beneficial effect of Ramipril on mgΔloxPneo animals\' kyphosis is not due to an improvement in bone structure. In order to test the hypothesis where signaling through BK B2R receptor may be involved in the development of bone phenotype of mgΔloxPneo animals, a mouse model with the mgΔloxPneo mutation and knockout for B2R receptor was generated. The analysis of these animals show that the B2R receptor does not interfere with the development of kyphosis, with Fbn1 genotype as sole determinant for this phenotype manifestation. RNA-seq analysis was performed to verify differential expression of genes and altered cellular pathways, which could reveal mechanisms of bone phenotype development in mgΔloxPneo animals. Altered pathways found included focal adhesion, receptor- extracellular matrix (ECM) interaction, tight junction, nucleotide excision repair and missmatch repair, which may explain changes in bone cells metabolism. In addition, there were differences in gene expression related to skeletal muscle metabolism, which is in agreement with the paracrine regulation of bone and muscle tissue, leading to worst bone structure

A Síndrome de Marfan (MFS) é uma doença autossômica dominante do tecido conjuntivo, que acomete principalmente os sistemas esquelético, ocular e cardiovascular. O fenótipo cardiovascular, em especial o aneurisma de aorta, é responsável pela maior parte da morbi-mortalidade. MFS é resultante da mutação da fibrilina-1, uma glicoproteína que além de ser um dos principais componentes estruturais da matriz extracelular, tem como função a regulação da atividade do TGF-Beta, por meio de seu sequestro mecânico na matriz extracelular. No entanto, os mecanismos pelos quais a mutação da fibrilina-1 determina aneurismas de aorta torácica com elevada variabilidade fenotípica são ainda pouco elucidados. Um alvo central na fisiopatologia do aneurisma são células musculares lisas vasculares (VSMC), que constituem a maior porção da camada média da aorta. Por meio do controle do tônus contrátil da aorta, da estrutura do citoesqueleto e da interação com a matriz extracelular controlam a estrutura da aorta e a resposta a estímulos patológicos. Mutações que geram perda de função no aparato contrátil de VSMCs prejudicam força contrátil e respostas mecanoadaptativas. No entanto, o papel da VSMC na MFS foi pouco estudado. Neste estudo, investigamos se alterações do fenótipo de VSMCs correlacionam-se a prejuízos na geração de força e alterações em respostas biomecânicas em VSMC cultivadas a partir de aortas obtidas de camundongos com ou sem a mutação mgDeltalpn para MFS na fase inicial (3 meses) e tardia (6 meses). Aos 3 meses de evolução, detectamos importantes alterações fenotípicas nas MFS-VSMC, com maior proliferação celular e redução de alguns marcadores de diferenciação (calponina-1), porém aumento de outros (alfa-actina e SM22). Ao mesmo tempo, ocorreu mudança morfológica, com aumento da área da célula e perda do formato fusiforme. Tais alterações foram consistentes com transição para fenótipo mesenquimal, que foi confirmada pela expressão de vários marcadores. Marcadores de estresse do retículo endoplasmático (RE) aumentaram em MFS-VSMC vs. WT (wild-type) -VSMC condição basal, sem aumento pós estiramento mecânico. Correção da matriz de fibrilina-1 defeituosa em MFS-VSMC promoveu reversão de alguns aspectos do fenótipo, mas não do estresse do RE. MFS-VSMC mostra perfil protêomico divergente de WT-VSMC, em particular menor expressão de proteínas regulatórias do citoesqueleto. Importante, MFSVSMC têm reduzida capacidade de gerar força de tração quando semeadas em substrato com rigidez fisiológica e geram momento contrátil in vitro, no entanto, sem perda na capacidade de adesão. Importante, MFS-VSMC têm forte atenuação da resposta de tração a aumentos da rigidez do substrato. Em paralelo, MFS-VSMC exibem menor densidade em fibras de estresse de actina em relação às WT-VSMC. A maioria destas alterações não foram observadas aos 6 meses de evolução da doença. Os dados indicam que na fase precoce da doença, MSF-VSMC exibem mudanças fenotípicas que vão além de uma simples modulação fenotípica, com aspectos de transição mesenquimal e reduzida capacidade de geração de força tensional associada não à adesão celular, porém à menor capacidade de geração de fibras de estresse de actina. Estes mecanismos, descritos pela primeira vez, contribuir para elucidar a fisiopatologia da MFS, com alguns aspectos comuns, porém outros distintos de outras modalidades de aneurisma de aorta / Marfan Syndrome (MFS) is an autosomal dominant connective tissue disease affecting to variable extents the musculoskeletal, ocular and cardiovascular systems. Cardiovascular phenotype and in particular thoracic aorta aneurysm/dissection (TAAD), is responsible for the bulk of disease morbimortality. MFS is due to mutations in fibrillin-1, one of the main structural proteins of the extracellular matrix (ECM), which in addition regulates TGF-Beta activity by means of its physical retention in the ECM. However, mechanisms by which fibrillin-1 mutation determines TAAD with elevated phenotypic variability are yet poorly understood. Vascular smooth muscle cells (VSMC), the main component of aortic medial layer, are central targets of aneurysm pathophysiology in general. By exerting regulation of contractile tone, cytoskeletal structure and ECM interaction, VSMC control aortic structure and response to pathologic stimuli. Mutations that promote loss of VSMC contractile apparatus impair contractile function and mechanoadaptative responses and associate with distinct types of TAAD. However, the role of VSMC mechanobiology in MFS pathophysiology is poorly known. In this study, we investigated whether VSMC loss of force-generating capacity occurs in MFS and whether it associates with specific changes in cell phenotype. Biomechanical VSMC responses were assessed in cells cultured from aortas collected from mice with the mgDeltalpn MFS mutation at early (3-monthold mice, the main focus of our study) and advanced (6-month-old mice) stages of disease evolution. At 3 months of disease evolution, we detected important phenotypic alterations in MFS-VSMC, with enhanced expression of markers for cellular proliferation and lower expression of some differentiation markers (calponin-1), but, increase in others (SM alfaactin and SM22). In parallel, there were important morphologic changes, with increased VSMC area and loss of its fusiform shape. Such alterations are consistent with a transition towards a mesenchymal-like phenotype, which was confirmed through the expression of several markers. Endoplasmic reticulum (ER) stress markers increased in MFS-VSMC vs. WT (wild-type)-VSMC in basal condition, without augmentation after cyclic mechanical stretching. Replacement of defective fibrillin-1 ECM from MFS-VSMC with a normal fibroblast-derived ECM promoted reversion of some aspects of the phenotype but not of ER stress. MFS-VSMC exhibited a proteomic profile divergent from that of WT-VSMC, particularly with respect to the lower expression of cytoskeleton regulatory proteins. Importantly, MFS-VSMC displayed a lower traction force-generating capacity when seeded in ECM under physiological stiffness and generated an impaired contractile moment in this situation. In particular, MFS-VSMC depicted a strong attenuation of the traction force response to enhanced ECM stiffening. These defects did not occur as a result of lower adhesion structure and decreased adhesion capacity of MFS-VSMC. In parallel, MFS-VSMC exhibited lower density of actin stress fiber vs. WT-VSMC. With 6 months of disease evolution, several of these alterations were not detectable. Both WTVSMC and MFS-VSMC showed reduced capacity of force generation, without evidence of cell senescence. In summary, starting already in the early stages of disease evolution, MSF-VSMC display important phenotypic changes which go beyond a simple reversible phenotypic modulation, with some aspects suggesting a transition mesenchymal-like phenotype, accompanied by reduced force-generating capacity not linked to loss of cell adhesion properties but rather to impaired organization of action stress fibers. These mechanisms, described for the first time, contribute to elucidate MFS pathophysiology, depicting both some aspects in common with the pathophysiology of other types of aortic aneurysm and some aspects peculiar to MFS

INTRODUÇÃO: A imensa maioria dos casos com Neoplasia Endócrina Múltipla Tipo 2 (NEM2) é causada por uma única mutação germinativa no proto-oncogene RET. Entretanto, há alguns poucos casos descritos na literatura (~16) que apresentam duplas mutações/polimorfismos no gene RET, geralmente associados a fenótipos atípicos. OBJETIVOS: Os objetivos deste projeto são: a) caracterizar os aspectos clínicos de pacientes advindos de cinco famílias não relacionadas com diagnóstico de NEM2A, nas quais se documentou a presença de uma nova dupla mutação germinativa RET nos códons 634 e 791 e b) realizar rastreamento gênico familiar dos casos sob-risco com a finalidade de identificarmos possíveis casos com esta nova mutação. PACIENTES: Cinco casos-índice foram recentemente descobertos albergando a dupla mutação germinativa RET C634Y/Y791F. Nestas famílias há relato de 208 parentes, potencialmente, sob-risco (~50%) de serem portadores desta mutação. Dentre estes 208 indivíduos, 81 (38,9%) aceitaram participar do rastreamento gênico. MÉTODOS: O estudo foi realizado na Disciplina de Endocrinologia, Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo. O DNA do sangue periférico dos pacientes e de seus parentes sob- risco foi obtido após a obtenção do consentimento livre e esclarecido. Após PCR, foi realizado o sequenciamento gênico direto (ABI 3130x/l Sequencer, Applied Biosystems), abrangendo todos os 20 éxons do RET. Foram investigados potenciais polimorfismos e mutações no RET. Os tumores NEM2-relacionados (carcinoma medular de tireoide, CMT; feocromocitoma, FEO; hiperparatireoidismo primário, HPT) foram estudados quanto a vários parâmetros clínicos, como: sinais/sintomas; dimensão, penetrância e agressividade dos tumores; porcentagem de remissão bioquímica do CMT, e recidiva ou persistência dos tumores. RESULTADOS: Dentre os 81 indivíduos que participaram do rastreamento gênico, documentamos 28 casos (34,5%) como portadores da dupla mutação RET C634Y/Y791F. Além disso, as mutações foram testadas in vitro e um gene de efeito fundador foi descartado. Observou-se que: a) os cinco casos-índice (100%) com mutação germinativa RET C634Y/Y791F apresentaram FEO com características tais como, tumores medindo acima de 5,0 cm, e quatro dentre os cinco casos (80%) tiveram o diagnóstico com idades inferiores a 35 anos. A frequência de FEO nos parentes adultos (a partir da terceira década) foi de 73% e eram bilaterais em 80%; b) as características do CMT nos afetados albergando a mutação RET 634/791 eram similares às que ocorrem em pacientes com a mutação 634 isolada. Adicionalmente, estudo in vitro desta dupla mutação revelou que o grau de fosforilação das células com a dupla mutação celular 634/791 era significativamente maior (p=0,04), quando comparada com a capacidade fosforilativa das mutações 634 e 791 avaliadas individualmente. CONCLUSÃO: Diante dos presentes achados, conclui-se que os pacientes com esta nova dupla mutação tenderam a apresentar FEO de maior agressividade (precocidade, tumores volumosos e bilaterais), enquanto que o CMT, nestes casos, apresentava características usuais aos portadores de mutação RET no códon 634. A nossa hipótese é que os achados relativos ao FEO, nos presentes pacientes, foram influenciados pela presença da segunda mutação RET Y791F, a qual teria atuado como fator modulador do fenótipo. Esta hipótese foi suportada pelos estudos in vitro. Além disso, a ausência de um efeito fundador levou-nos a prever que esta dupla mutação RET pode não ser rara, na área geográfica estudada. Ainda que estes achados devam ser validados, os presentes dados podem ser úteis no diagnóstico genético e no manejo clínico e terapêutico dos pacientes com NEM2A / INTRODUCTION: The vast majority of cases with multiple endocrine neoplasia type 2A (MEN2A) is caused by a single germline mutation in the RET proto-oncogene. However, some instances (~16) of double germline RET mutations have been reported, most frequently associated with atypical phenotypes. OBJECTIVES: The main goals of this project were: a) to characterize the phenotype of patients from five unrelated MEN2A families harboring a new RET double germline in codons 634 and 791; b) perform the genetic screening in at-risk family members attempting to search for new similarly affected cases. PATIENTS: Five affected index-cases were recently found with this new double RET mutation C634Y/Y791F. In these five families, 208 first-degree relatives were reported and they were at-risk (~50%) to develop this mutation. Eighty-one individuals out of the 208 at-risk relatives (38.9%) were available and signed the informed consent. METHODS: The present investigation was performed at the Department of Endocrinology, School of Medicine, University of São Paulo. DNA was obtained from the peripheral blood of patients and at-risk relatives, after obtaining the informed consent of all individuals. After PCR, the direct genetic sequence was performed (ABI 3130x/l Sequencer, Applied Biosystems), involving all 20 exons of the RET proto-oncogene. Potential mutations and polymorphisms were investigated. In addition, the mutations were tested in vitro and a potential founder effect was evaluated. The MEN2A- related tumors (medullary thyroid carcinoma, MTC; pheochromocytoma, PHEO; and primary hyperparathyroidism, HPT) were approached using several clinical parameters, as: signs and symptoms; age at the diagnosis; tumor size and aggressiveness; biochemical remission of MTC; tumor relapse or persistence; RESULTS: Within the 81 genetically screened individuals, 28 cases (34.5%) were documented harboring the RET C634Y/Y791F germline mutation. It was observed that: a) the five affected index-cases (100%) were presented with PHEOs with features such as tumors measuring more than 5.0cm, and four out of the five cases (80%) had this diagnosis under the age of 35 years old. The frequency of PHEO in the adult affected relatives was also high (73%), from the third decade on, and were bilateral in 80%; b) the features and outcome of MTC in the affected C634Y/Y791F cases were similar to those MEN2A cases harboring the RET 634 mutation only. In addition, in vitro studies verified that cells with the 634/791 mutation had a significantly higher capacity of phosphorylation than cells harboring each individual mutation (p=0.04). Also, a founding gene was ruled out in these families. CONCLUSION: Our present data indicated that the earlier and more aggressive PHEOs seen in the present cases were most probably due to a phenotype modulation of the second RET 791 mutation. This hypothesis was supported by data from in vitro studies. Also, the absence of a founding couple led us to predict that this double RET mutation may not be rare, in the studied geographic area. Although these findings need to be validated, the present data may be useful in the genetic diagnosis as well as in the clinical and therapeutic management of MEN2A

Introdução: O Índice de Massa Corporal (IMC) possui limitações para avaliação dos riscos à saúde; a literatura propõe que este índice seja utilizado associado a medidas metabólicas, recomendando-se a classificação em fenótipos antropométrico-metabólicos. A avaliação da resistência à insulina periférica tem sido apontada como fator importante para identificar os fenótipos metabólicos desfavoráveis, porém este marcador não é comumente considerado nas definições do fenótipo de obesidade metabolicamente benigna. Estudos de prevalência deste fenótipo relatam estimativas heterogêneas dependendo dos critérios de definição. Estes estudos trazem contribuições relevantes para a compreensão das repercussões desse fenótipo no tratamento, no planejamento de serviços de saúde e no entendimento da epidemiologia da obesidade e suas diferentes manifestações. Objetivo: Investigar o impacto da resistência à insulina nas estimativas de prevalência do fenótipo obesidade metabolicamente benigna em adolescentes obesos que buscaram tratamento. Metodologia: Estudo transversal com base em dados secundários sobre 418 adolescentes obesos que foram atendidos na Liga de Obesidade Infantil do Hospital das Clínicas da Universidade de São Paulo entre janeiro de 2009 e dezembro de 2013. Duas definições foram adotadas para classificar os adolescentes nos fenótipos \"metabolicamente benigno\" e \"metabolicamente adverso\". A primeira se baseou nos valores propostos pelo International Diabetes Federation para diagnosticar síndrome metabólica em crianças e adolescentes. Na segunda acrescentou-se medida de resistência à insulina determinada pelo Homeostasic Model Assessment of Insulin Resistance (HOMA-IR). O valor de corte adotado para o HOMA-IR foi de 3,16. A análise descritiva incluiu a distribuição das frequências absoluta e relativa das variáveis independentes sexo, idade, cor de pele, estadio puberal e escore Z para IMC (Z-IMC). A prevalência de obesidade metabolicamente benigna foi calculada com intervalo de 95% de confiança (IC 95%) e o teste X², com nível de significância de 5%, foi utilizado para avaliar as associações entre as variáveis de exposição e o desfecho. As mesmas análises foram feitas para ambas definições. Aprovação do Comitê de Ética em Pesquisa do Hospital das Clínicas (Número do Processo: 1.230.024). Resultados: Dos 418 participantes, 217 (52%) eram do sexo feminino. A média de idade foi de 13 anos (± 2) e de Z-IMC 3,2 (± 0,5). Metade dos participantes estavam em fase puberal e 39% pós-puberal segundo a escala de Tanner. A prevalência do fenótipo metabolicamente benigno foi de 43% (IC 95%, 38 - 48%) pela definição I e 13% (IC 95%, 9 - 16%) pela definição II. Nas análises multivariadas segundo a definição I, o sexo masculino [razão de prevalência (RP) ajustada 0,32 IC 95% 0,16 - 0,62], o estadio púbere (RP ajustada, 0,24; IC 95%, 0,14 - 0,43) e obesidade severa (RP ajustada, 0,40; IC 95%, 0,16 - 0,62), foram associados de forma independente e significativa com a menor prevalência de OMB. Quando a definição II foi aplicada, foram observados resultados semelhantes de estadio púbere (RP ajustada, 0,34; IC 95%, 0,19 - 0,59) e obesidade severa (RP ajustada, 0,39; IC 95%, 0,20 - 0,79), mas sexo masculino (RP ajustada, 0,63; IC 95%, 0,32 - 1,23) não se mostrou significante na associação com a menor prevalência de OMB. Nenhuma associação entre o fenótipo OMB e a variável cor de pele foi encontrada. Conclusão: Inclusão de medida de resistência à insulina nos critérios de definição da obesidade metabolicamente benigna nessa população levou à expressiva diminuição da prevalência deste fenótipo. Resistência à insulina pode ser um importante marcador da repercussão negativa da obesidade na saúde desses adolescentes / Introduction: The Body Mass Index (BMI) has limitations for assessment of health risks; the literature suggests that this index be used in association with metabolic measures, recommending classification in anthropometric-metabolic phenotypes. The evaluation of insulin resistance has been identified as an important factor to identify unfavorable metabolic phenotypes, but this marker is not commonly considered in the definitions of metabolically healthy obesity phenotype. Prevalence studies report that heterogeneous estimates depending on the criteria of the definition. These studies bring relevant contributions to the understanding of this phenotype in the treatment, planning of health services and understanding of the epidemiology of obesity and its different manifestations. Objective: To investigate the impact of insulin resistance on the estimated prevalence of metabolically healthy obesity phenotype in obese adolescents seeking treatment. Methodology: This is a cross-sectional study based on secondary data, on 418 obese adolescents, who were treated at Childhood Obesity League of Hospital das Clínicas, University of São Paulo between January 2009 and December 2013. Two definitions were used to classify adolescents into \"metabolically healthy\" and \"metabolically unhealthy\" phenotypes. The first one was based on the values proposed by the International Diabetes Federation to diagnose metabolic syndrome in children and adolescents. The second one, the measure of insulin resistance determined by the Homeostasis Model Assessment of Insulin Resistance (HOMA-IR) was added. The cut-off value for HOMA-IR was 3.16. The descriptive analysis included the distribution of the absolute and relative frequencies of the independent variables sex, age, pubertal stage and z-score for Body Mass Index (Z-BMI). The prevalence of metabolically healthy obesity was calculated with intervals of 95% of confidence and the X² test at 5% significance level was applied to associations between exposure variables and outcome. The same analyzes was performed for both settings. Approval of the Research Ethics Committee of the Hospital das Clínicas (Process Number: 1.230.024). Results: Of the 418 participants, 217 (52%) were female. The mean age was 13 years (± 2) and Z-BMI 3.2 (± 0.5). Half of the participants were pubertal and 39% post-pubertal according to the Tanner scale. The prevalence of the metabolically healthy phenotype was 43% (CI 95%: 38-48) by definition I and 13% (CI 95%: 9-16) by definition II. In the multivariate analysis using definition I, male gender [prevalence ratio (PR), 0.32; 95% CI, 0.16-0.62], pubertal stage (PR, 0.24; 95% CI, 0.14-0.43) and severe obesity (PR, 0.40; 95% CI, 0.16-0.62) were independently and significantly associated with lower MHO prevalence. When definition II was used, similar results were observed for pubertal stage (PR, 0.34; 95% CI, 0.19-0.59) and severe obesity (PR, 0.39; 95% CI, 0.20-0.79), but male gender (PR, 0.63; 95% CI, 0.32-1.23) was not significantly associated with lower MHO prevalence. No association was found between MHO phenotype and skin color. Conclusion: The inclusion of insulin resistance in the definition criteria of metabolically healthy obesity in this population, led to a significant decrease in the prevalence of this phenotype. Insulin resistance may be an important marker of the negative repercussion of obesity in the health of these adolescents

Avanços na identificação e caracterização de diferentes populações de célulastronco tem melhorado as perspectivas do seu uso clínico. A maioria dos estudos obtêm as células-tronco com base na expressão de marcadores de superfície celular e testa as suas propriedades por meio de ensaios funcionais in vitro e in vivo. Na presente pesquisa foram isoladas diferentes populações de células epiteliais com base na expressão de dois marcadores de células-tronco epiteliais descritos pela literatura, o receptor de neurotrofina p75 (p75NTR) e o receptor de transferrina 1 (CD71). Uma vez isso feito, foi avaliado a co-expressão de outros marcadores de células-tronco epiteliais, como as integrinas 6 e 1, e realizado ensaios de eficiência de formação de colônias, potencial de crescimento celular, capacidade de reconstrução epitelial in vitro, análise da resposta ao trauma e avaliação da capacidade de auto renovação. Os resultados mostram que as células p75NTR+ tem um desempenho funcional melhor do que as p75NTR- na maioria dos ensaios funcionais realizados, exceto pela capacidade de responder ao trauma e de se autorenovar. Ademais, comprovou-se que células p75NTR+ expressam em maior proporção as integrinas 6 e 1 e que o isolamento de células por dupla marcação (p75NTR+CD71-) possibilita a obtenção de uma população de células epiteliais ainda mais enriquecida com estes marcadores. No entanto, foi observado também que independentemente da população celular estudada e do tempo em cultivo, as populações de células epiteliais alteraram drasticamente o seu fenótipo quando de tal forma que as populações celulares inicialmente positivas se tornaram majoritariamente negativas e que as populações celulares inicialmente negativas passaram a ter células positivas em seu meio. / Recent advances in cell sorting and characterization technics of stem cells have provided new insights and perspectives for clinical applications of this particular cell population. Most of the studies isolat stem cells based on the expression of cell surface markers and evaluate their stem cells-like proprieties by performing in vitro and in vivo assays. Here we isolated different populations of keratinocytes based on the expression of the epithelial stem cell markers neurotrophin receptor p75 (p75NTR) and transferrin receptor 1 (CD71). The co-expression of other epithelial stem markers such as integrins 6 and 1 was also assessed and in vitro functional assays such as colony-forming efficiency; long-term growth potential, in vitro epithelial reconstruction-capacity and response to damage and self-renew capacity. Our results showed that p75NTR+ve cells have better functional proprieties in most of the assays however they did not respond to damage nether presented self-renew capacity. Additionally, p75NTR-ve cells express higher percentage of other epithelial stem cell markers such as integrins 6 and 1 when compared to p75NTR-ve cells and the double staining (p75NTR+veCD71-ve) contributes to isolate a more enriched cell population based on the expression of the integrins. Nevertheless, independently of the cell population or of the amount of time in culture, cells have changed dramatically their phenotype in a way that the cell population initially p75NTR+ve lost the expression of the p75NTR and the negative population have gained it.