Dados recentes apontam para a participação do sistema renina-angiotensina (SRA) em processos metabólicos, devido a sua presença local em tecidos metabolicamente ativos, como o tecido adiposo, e sugerem que tais tecidos também poderiam ser alvos dos bloqueadores do SRA. Por isso, investigamos possíveis efeitos diretos de bloqueadores do SRA no metabolismo celular de adipócitos isolados. Para isso, adipócitos isolados foram tratados com doses não tóxicas de Alisquireno ou Captopril ou Losartan. Após 24 horas, as capacidades lipolíticas, lipogênicas e oxidativas foram. Como resultados, o fármaco Alisquireno, aumentou a relação entre oxidação de glicose e incorporação desse substrato em lipídeos, enquanto o Captopril diminuiu a incorporação de glicose em lipídeos, particularmente na fração glicerol do TAG mediante estímulo com insulina, bem como diminuiu a expressão gênica de receptor de (pró) renina. Como conclusão, os fármacos Captopril e Alisquireno podem modular o metabolismo lipogênico e oxidativo de adipócitos isolados, mas de maneiras diferentes. / Recent data indicate a participation of the renina-angiotensin system (RAS) in metabolic process, due its local presence in tissues, like the adipose tissue, and suggests that these tissues could be targets of RAS blockers. Therefore, we have studied the possible effects of pharmacological RAS blockers in isolated fat cells. Therefore, fat cells were isolated of epididymal fat pad and treated with non toxic doses of Aliskiren or Captopril or Losartan. After 24 hours, the lipolytic, lipogenic and oxidative capacity were tested in their respective spontaneous and stimulated states. Also, gene expression of PPARg and RAS components were verified. The results showed Aliskiren increases the relation between oxidation and lipogenesis from glucose, whereas Captopril decreased glucose lipid incorporation, especially in glicerol fraction of triglyceride when insulin stimulus exist, and the Renin receptor gene expression. As a conclusion, Captopril and Aliskiren can directly modulate lipogenic and oxidative metabolism of isolated fat cells, but in a different way.

Este trabalho descreve a preparação, a caracterização e o uso de um biossensor bienzimático confeccionado com as enzimas glicose oxidase e frutose dehidrogenase imobilizadas em camadas auto-organizadas ou self-assembled monolayers (SAMs) de cistamina para a quantificação de açúcares em alimentos. Após o preparo do eletrodo de ouro com a SAM de cistamina, biossensores foram construídos e para obtenção de melhores respostas, condições foram otimizadas, tais como: concentração do mediador tetratiafulvaleno (TTF), porcentagem de glutaraldeído, temperatura e tempo de vida do biossensor. Com as condições estabelecidas, fez-se então, a determinação analítica da D-glicose e da D-frutose em eletrólito puro pelo método da adição de padrão e os resultados foram obtidos por voltametria cíclica e cronoamperometria. A corrente de pico de oxidação do mediador de elétrons (TTF) aumentou proporcionalmente com o aumento da concentração e não ocorreram deslocamentos nos potenciais de pico. Os limites de detecção (LD) foram encontrados por meio do desvio padrão da média aritmética de dez amperogramas do branco no potencial equivalente aos dos picos de oxidação do mediador de elétrons TTF, juntamente com o valor do coeficiente angular da curva analítica. Após a obtenção da curva analítica o biossensor foi aplicado diretamente em amostras de refrigerante dietético e não dietético, bem como em amostras de adoçantes comerciais, onde foram realizados testes comparativos da resposta dos biossensores. Para o eletrólito puro e amostras de refrigerante dietético e de adoçantes, ou seja, onde não há presença de D-glicose e D-frutose, notou-se a ausência de corrente de pico, enquanto que para as amostras de refrigerante não dietético, houve um valor significativo de resposta de corrente, indicando a presença dos açúcares em estudo. Com o propósito de verificar a influência de interferentes e o efeito de matriz, foi construída uma curva analítica para a D-glicose e para a D-frutose, em amostras de refrigerante dietético e adoçantes, onde foram obtidas as menores quantidade destes açúcares. Para o refrigerante não dietético, foi determinado o valor inicial dos açúcares presentes nas amostras. Pode-se afirmar que a utilização dos biossensores baseados nas enzimas GOx e FDH mostraram-se eficientes para a determinação dos açúcares D-glicose e D-frutose nas amostras analisadas (com diferença significativa nos valores de corrente), apresentando uma resposta rápida, além da eliminação do efeito da matriz. A utilização do mediador de elétrons (TTF) possibilitou a reação em potencial próximo de zero, diminuindo o efeito de interferentes e evitando a desnaturação das enzimas. / This work describes the preparation, characterization and application of a bienzymatic biosensor based in the glucose oxidaze and fructose dehydrogenase immobilized on self-assembled monolayer of cystamine for sugar quantification in foodstuff. After the modification of the gold electrode with cystamine, the biosensors were developed and optimized for best responses. Optimization parameters were: mediator tetrathiafulvalene (TTF) concentration, glutaraldehyde percentage, temperature and life time of the biosensor. With the best conditions established, the analytical determinations of d-glucose and d-fructose in pure phosphate buffer were conducted by the standard additions method and the results obtained by cyclic voltammetry and chronoamperometry. The oxidation peak current related to the TTF voltammetric behavior raised proportionally to the increasing concentration of d-glucose or d-fructose, in a given and constant peak potential. The methodology detection limits were found using the standard deviation of ten chronoamperograms of the blank solution, in the potential value corresponding to that of TTF oxidation, and the slope of the analytical curve. After the analytical curve acquirement the biosensor was directly applied in samples of diet or non-diet softdrinks, as well as in commercial sweeteners samples, with comparative tests of the biosensor responses. For pure electrolyte and for diet foodstuff samples, i.e., were there is not expectation for d-glucose or d-fructose existence, it was detected the lack of the voltammetric peak associated with the mediator oxidation. In non-diet samples, a pronounced voltammetric peak was obtained, testifying the presence of sugar in the electrolytes under study. The matrix effect was verified by means of an analytical curve obtained for both analytes (d-glucose and d-fructose), in diet and sweeteners samples, properly spiked with known amounts of each analyte. It can be concluded that the utilization of the biosensor based in GOx and FDH showed to be efficient for d-glucose and d-fructose determinations in the analysed samples, with a fast response time and elimination of the matrix effect. The mediator promoted the electrochemical reaction to occur in potentials very close to zero, minimizing the interferences or the enzyme denaturation.

O diestro é a fase luteínica na cadela caracterizada pelo aumento de progesterona (P4) sérica na primeira metade e por flutuações de 17&#946;-estradiol (E2) na segunda metade. O corpo lúteo (CL) é uma glândula endócrina temporária, que passa por um processo de desenvolvimento, manutenção e regressão, atingindo atividade secretória plena quando sua formação está completa. A insulina é o hormônio anabólico essencial para a manutenção da homeostase de glicose e do crescimento e diferenciação celular, sendo secretado pelas células &#946; pancreáticas. A sinalização intracelular da insulina começa com a sua ligação a um receptor de membrana específico, o que desencadeia uma série de ações metabólicas. Sabe-se que uma das consequências desta ligação é a translocação de transportadores de glicose 4 (GLUT4; gene SLC2A4) para que ocorra a captação de glicose. Nosso grupo demonstrou a expressão de GLUT4 no corpo lúteo de cadelas, expressão esta regulada diferencialmente ao longo do diestro. A presença deste transportador levou-nos a hipotetizar que a insulina seja importante para regulação da função luteínica. Para testar tal hipótese, utilizamos imuno-histoquímica para localizar o receptor de insulina (RI) e outros fatores regulatórios (NFKB e IL6) de GLUT4 no CL canino durante o diestro (dias 10 a >70 pós-ovulação, po) e western blotting para quantificar estas proteínas; investigamos a expressão gênica dos fatores acima mencionados por PCR em tempo real; e por fim, analisamos os efeitos da insulina sobre a expressão gênica de RI e SLC2A4 em células luteínicas nos dias 20 e 40 po e também sobre a captação de glicose destas células. No presente estudo, observou-se que o corpo lúteo canino expressa as proteínas do RI, NFKB e IL6 de maneira distinta ao longo do diestro. A expressão do RNAm do RI apresentou maior expressão nos dias 20 e 70, e diminuição no dia 40. O NFKB apresentou maior expressão no dia 40, enquanto o IL6 apresentou maior expressão do dia 10 ao 40. Observou-se correlação negativa entre o gene RI e os níveis de insulina (r = -0,69; P = 0,006) e positiva com SLC2A4 (r = 0,89; P = 0,01) em todo o diestro, enquanto o IL6 correlacionou-se de maneira positiva com o RI apenas na primeira metade (r = 0,96; P <0,0001) e o NFKB, negativamente com o RI nos dias 30, 40 e 50 (r = -0,57 P <0,05). Após a adição de insulina no meio de cultivo, observou-se que as expressões gênicas de RI e SLC2A4 se comportaram de maneira oposta de acordo com a fase do diestro estudada: células do dia 20 po apresentaram um aumento desta expressão e do dia 40 um declínio. Por fim, através da 12 captação de glicose, observou-se que as células luteínicas caninas são capazes de responder à insulina, aumentando a captação na ordem de 4 vezes (basal: 2,05 ± 0,8; insulina: 5,73 ± 0,5; valor de P <0,01 em cpm/ug proteína; basal: 79,6 ± 35,3; insulina: 212,5 ± 34,5, valor de P <0,05 em cpm/106 células). Esses resultados apontam a insulina, bem como o IL6 e o NFKB como fatores importantes que desempenham um papel na função do CL canino e trazem o CL para o grupo de tecidos que respondem ao estímulo insulínico aumentando a expressão de GLUT4 e consequentemente a captação de glicose. Além disso, estes eventos parecem sofrer controle adicional pelos hormônios esteróides. / Diestrus is the luteal phase in dogs characterized by an increase in progesterone (P4) levels in the first half and fluctuations of 17&#946;-estradiol (E2) in the second half. The corpus luteum (CL) is a temporary endocrine gland, which undergoes a process of development, maintenance and regression, reaching full secretory activity when its formation is complete. Insulin is an anabolic hormone essential for the maintenance of glucose homeostasis, cell growth and differentiation, and is secreted by pancreatic beta cells. Intracellular signaling of insulin begins with its binding to a specific membrane receptor, which triggers a series of metabolic actions. It is known that one consequence of this connection is the translocation of glucose transporters 4 (GLUT4; gene SLC2A4) for glucose uptake. Our group demonstrated the expression of GLUT4 in the canine corpus luteum in a time-related manner throughout diestrus. The presence of this transporter led us to hypothesize that insulin is important for the regulation of luteal function. To test this hypothesis, we used immunohistochemistry to detect the insulin receptor (IR) and possible regulatory factors (IL6 and NFKB) of GLUT4 in canine CL during diestrus (days 10 to > 70 after ovulation, po) and western blotting to quantify these proteins. In addition, we investigated the gene expression of the above mentioned factors by real-time PCR and analyzed the effects of insulin on IR and SLC2A4 gene expression in canine luteal cells at days 20 and 40 po and also on glucose uptake by these cells. Canine CL differentialy expressed RI, NFKB and IL6 during diestrus. The IR expression was higher on days 20 and 70, with and decreased at day 40. NFKB expression was higher on day 40 and IL6 increased on days 10 to 40 po. It was observed a negative correlation between IR expression and insulin levels (r = -0.69 P = 0.006) and positive with SLC2A4 (r = 0.89, P = 0.01) throughout diestrus. IR was positively correlated with IL6 only in the first half of diestrus (r = 0.96, P <0.0001), while it was negatively correlated with NFKB on days 30, 40 and 50 (r = -0.57 P <0.05). After insulin treatment, RI and SLC2A4 expressions behave differently according to the diestrus phase: on day 20, they increased and on day 40 they declined. Finally, we could observe through glucose uptake method that canine luteal cells are able to respond to insulin stimuli, increasing glucose uptake by approximately four folds (basal: 2.05 ± 0.8; insulin: 5.73 ± 0.5 cpm / ug protein, P < 0.01; basal: 79.6 ± 35.3; insulin: 212.5 ± 34.5 cpm/106 cells, P < 0.05). These results point towards a regulatory function 14 exerted by insulin, IL6 and NFKB in the canine CL and place this organ among the insulin sensitive ones, which respond to insulin stimuli increasing GLUT4 expression and glucose uptake. Moreover, these events seems to undergo a further control by steroid hormones.

O hormônio tireoidiano (HT) participa do controle de funções essenciais do organismo. A maioriados seus efeitos é mediada pela modulação da transcrição gênica e se manifesta em um período longo o suficiente para permitir a transcrição de genes específicos. Por outro lado, são crescentes na literatura as evidências de que o HT também promove efeitos que ocorrem em um curto espaço de tempo e que se manifestam mesmo na presença de inibidores da transcrição gênica. O GLUT4 é o principal transportador de glicose presente no músculo esquelético, no cardíaco e no tecido adiposo. O seu processo de translocação e inserção na membrana plasmática resulta da ativação de vias de sinalização que ocorre a partir da interação da insulina com seus receptores de membrana. No músculo esquelético e cardíaco, uma segunda via que aciona o mecanismo de translocação do GLUT4 envolve a ativação da AMPK, processo desencadeado pela contração muscular. O presente estudo teve como objetivo avaliar: (i) no modelo in vivo (ratos Wistar), se o T3 e o T4 provocam agudamente a translocação do GLUT4 para a membrana plasmática; (ii) no modelo in vitro (células musculares L6 e adipócitos 3T3-L1), se o T3 e o T4 provocam o efeito descrito acima; e (iii) se esse efeito ocorre por ativação das vias de sinalização da insulina e/ou da contração muscular. Nossos estudos in vivo demonstram que a administração de T3 rapidamente aumentou o conteúdo de GLUT4 na fração correspondente à membrana plasmática no músculo esquelético e no tecido adiposo. No entanto, essa ação foi independente da ativação da PI3-K e da AMPK. Os estudos in vitro, mostraram que o T3 promove, rapidamente, um aumento na captação de glicose nas células L6 sem, contudo, alterar o conteúdo de GLUT4 presente na membrana. Esses resultados sugerem que essa ação do T3 ocorra devido a ativação do GLUT4 já presente na membrana ou devido a algum processo independente dessa proteína. Nossos resultados demonstram que ao lado das suas reconhecidas ações genômicas, o HT atua por mecanismos não genômicos regulando a translocação do GLUT4. Além disso, sugerem fortemente que o T3 participe, também por mecanismos não genômicos, do processo de ativação do GLUT4 já inserido na membrana. / The thyroid hormone (TH) participates in the control of essential functions of the organism. Most of its effects are mediated by modulation of gene transcription and take place over a long enough period of time to allow the transcription of specific genes. On the other hand, evidence that TH also promotes the effects that occur in a short period of time and which manifest even in the presence of inhibitors of gene transcription have been increasingly found in literature. GLUT4 is the main transporter of glucose in skeletal muscle, the heart and adipose tissue. Its translocation and insertion in the plasma membrane result from the activation of signaling pathways triggered by the interaction of insulin with membrane receptors. In skeletal muscle and the heart, a second pathway that activates the mechanism of GLUT4 translocation involves the activation of AMPK, a process triggered by muscle contraction. This study aimed at evaluating: (i) in the in vivo model (Wistar rats), if T3 and T4 acutely cause translocation of GLUT4 to the plasma membrane, (ii) in the in vitro model (L6 muscle cells and adipocytes 3T3 -L1), if T3 and T4 cause the effect described above; and (iii) whether this effect occurs by activation of the signaling pathways of insulin and/or muscle contraction. Our in vivo studies demonstrate that administration of T3 rapidly increased the amount of GLUT4 in the fraction corresponding to the plasma membrane in skeletal muscle and adipose tissue. However, this action did not depend on the activation of PI3-K and AMPK. In vitro studies showed that T3 quickly increases the glucose uptake in L6 cells, but without changing the amount of GLUT4 present in the membrane. These results suggest that this action of T3 occurs due to activation of GLUT4 already present in the membrane or due to some process which does not depend on this protein. Our results demonstrate that other than its known genomic actions, TH acts through nongenomic mechanisms regulating GLUT4 translocation. In addition, they strongly suggest that T3 participates, also through non-genomic mechanisms, in the activation process of GLUT4 already inserted in the membrane.

O tecido adiposo, através da leptina, desempenha um papel permissivo sobre a maturação sexual do indivíduo. Apesar da importância do tecido adiposo para a puberdade, pouco se sabe a respeito do processo de formação deste tecido neste período da vida. Estudos em humanos têm descrito a presença de resistência à insulina puberal. Assim, frente à importância do tecido adiposo para a puberdade, o objetivo do trabalho foi investigar a resposta do tecido adiposo à insulina no período puberal. Foram utilizados os coxins adiposos subcutâneo e periepididimal. Na puberdade, paralelamente à intolerância à glicose transitória que ocorreu nas semanas iniciais, e, portanto, prejuízo da utilização da glicose pelos tecidos insulino-dependentes, o tecido adiposo (SC e PE) teve sua responsividade normal à insulina e uma melhor capacidade de incorporação de glicose em lipídeos o que leva a crer que há um desvio da utilização deste substrato energético, a glicose, para a formação do tecido adiposo. / The adipose tissue is critical to puberty. Leptin exerts a permissive role to hypothalamic-hypophysial-gonadal maturation and, thereby, adipose tissue is necessary to pubertal development. Despite its importance to puberty, little is known about the process of adipose tissue formation during this period of life. Researches have described insulin resistance at pubertal period in humans. The adipose tissue importance to puberty added to pubertal insulin resistance described in humans lead us to investigate how the adipose tissue responds to insulin at this period since it is essential at this time. We assessed two distinct fat pads: the subcutaneous fat pad and the epididymal one. At the puberty, despite the temporary glucose intolerance and the constraint for glucose utilization by insulin-dependent tissues, the adipose tissue had normal insulin responsiveness plus an improved capacity to synthesize lipids from glucose which led us to hypothesize that glucose could have been deviated towards the adipose tissue.

O objetivo do presente estudo foi avaliar a inclusão de duas fontes energéticas (alto açúcar e alto amido (AA), alta fibra e alto óleo (FO)) na dieta de asininos e equinos, através de ensaios de digestibilidade aparente dos nutrientes, características físico-químicas das fezes e parâmetros sanguíneos, vinculados ao metabolismo energético dos equídeos. Foram utilizados 20 equídeos, dez equinos da raça Quarto de Milha e dez asininos da raça Pêga, distribuídos no delineamento alternado do tipo Cross-Over, com duas fontes energéticas e duas espécies. As dietas experimentais foram compostas de 50% da energia proveniente do Feno Tifton 85 (Cynodon spp.) e 50% proveniente do concentrado, formulados a base amido e açúcar, e fibra e óleo. Foi observado efeito de dieta (p&lt;0,05) sobre os coeficientes de digestibilidade do extrato etéreo e fibra em detergente ácido, capacidade tamponante a pH 5 e pH 6 (maiores valores para dieta Fibra óleo) e sobre as concentrações sanguíneas de glicose (maiores valores para dietas açúcar amido. Observou-se efeito de espécie (p&lt;0,05) sobre o coeficiente de digestibilidade aparente de proteína bruta, sobre a capacidades tamponante à pH 5 e sobre as concentrações sanguíneas de glicose (maiores níveis glicêmicos observados para equinos). Houve efeito de tempo de coleta (p&lt;0,05) sobre as concentrações plasmáticas de acetato. Para as concentrações sanguíneas e fecais de ácidos graxos de cadeia curta totais, propionato não houve efeito (p&gt;0,05) de dieta ou de espécie. Dietas composta por predominância de volumoso acrescido de concentrado a base de amido e açúcar e fibra e óleo são igualmente aproveitadas pelos equídeos com destaque para a dieta fibra e óleo no aproveitamento de lipídios, sem causar efeito deletério sobre as características físico-químicas, o pH e a capacidade tamponante das fezes. Asininos são mais eficientes no tamponamento de ácidos intestinais. Os asininos apresentam maiores concentrações sanguíneas de AGCC totais e acetato nas fezes, porém não no sangue nas dietas a base de FO. A glicemia e insulinêmica de asininos é menor do que a de equinos. Dietas com açúcar e amido apresentam maiores níveis glicêmicos e insulinêmicos para ambas as espécies. Dietas a base de fibra e óleo se mostraram promissoras para ambas as espécies, em especial para os asininos. / The aim of the present study was to evaluate the inclusion of two energy sources (high sugar and high starch (AA), high fiber and high oil (FO)) in the diet of asinines and equines, through the trials of apparent digestibility of nutrients, physico-chemical characteristics of feaces and blood parameters, related to equine energy metabolism. Twenty equids, 10 Quarter Horse horses and 10 Pêga breed donkeys were used, distributed in an alternate Cross-Over type design, with two energetic sources and two species. Experimental diets were composed of 50% of the energy from the Tifton 85 (Cynodon spp.) and 50% from the concentrate, based on starch and sugar, and fiber and oil. It was observed effect of diet (p&lt;0.05) on the digestibility coefficients of ether extract and acid detergent fiber, buffer capacity at pH 5 and pH 6 (higher values for fiber and oil diet) and on blood concentrations of glucose (higher values for sugar and starch diet). It was observed effect of specie (p&lt;0.05) on the digestibility coefficient of crude protein, on buffering capacities at pH 5 and on blood concentrations of glucose (higher glycemic levels observed for equines). There was effect of the collection time (p&lt;0.05) on the plasmatic concentrations of acetate. For blood and fecal concentrations of short chain fatty acids, there was no effect for propionate (p&lt;0.05) of diet or specie. Diets composed by predominance of forage plus concentrate based on starch and sugar, and fiber and oil are equally used by the equids with emphasis of the fiber and oil diet in the use of lipids, without causing deleterious effect on the physico-chemical characteristics, pH and buffer capacity of feaces. Donkeys are more effective in buffering intestinal acids and also have higher blood concentrations of total SCFA and acetate in faeces, but not in blood in FO-based diets.

O presente trabalho teve como principal objetivo estudar o desempenho fermentativo da levedura Kluyveromyces marxianus NRRL Y-6860 em meio semissintético, contendo glicose como fonte de carbono. Numa primeira etapa, avaliou-se o efeito de diferentes temperaturas (35, 40, 43 e 45ºC), assim como o efeito inibitório do etanol adicionado ao meio (0, 15, 30, 45, 60g/L) sobre os parâmetros do bioprocesso. A partir da temperatura de cultivo selecionada foi então avaliado o efeito da suplementação nutricional e da concentração de inóculo sobre o perfil fermentativo desta linhagem. Os ensaios foram realizados em frascos Erlenmeyer de 125 mL, contendo 50 mL de meio, 120 g/L de glicose, agitados a 100 rpm. Dentre as temperaturas avaliadas, os melhores resultados (consumo de 70% de glicose, produção de etanol de 38 g/L) foram obtidos a 43ºC, o que correspondeu a uma produtividade volumétrica em etanol (QP) de 3,2 g/L. h e eficiência de 80%. Nesta temperatura, os resultados da adição de etanol em diferentes concentraçõe sno inídio da fermentação revelaram qu eo aumento na concentração do álcool afetou negativamente a fermentabilidade de K. marxianus, constatando-se completa inibição quando foi adicionado 45 g/L de etanol. Posteriormente, avaliou-se o efeito dos nutrientes (KH2PO4 de 0,5 a 1,5 g/L; (NH4)2SO4 de 1,0 a 3,0 g/L; MgSO4 de 0,1 a 0,5 g/L e extrato de levedura de 3,0 a 7,0 g/L) e da concentração inicial de células (de 1,0 a 5,0 g/L) sobre a produção de etanol pela levedura. Os ensaios foram realizados de acordo com um planejamento fatorial fracionado 25-1, visando identificar e quantificar o efeito individual das variáveis experimentais e de suas interações sobre o bioprocesso, sendo avaliadas as respostas: máxima concentração de etanol e glicose consumida. Os resultados da análise estatística mostraram que a concentração inicial de células exerceu um efeito positivo sobre ambas as respostas, já o extrato de levedura apresentou um efeito negativo, enquanto que o KH2PO4 proporcionou um efeito positivo somente sobre a concentração máxima de etanol, ao nível de 90% de confiança. A análise estatística também revelou que os efeitos de interação entre as variáveis não foram significativas. Com base nestes resultados, concluiu-se que o desempenho fermentativo de K. marxianus NRRL Y-6860, a 43ºC, foi favorecido após estudo da composição nutricional e da concentração de inóculo, com aumento de 19, 24, 25 e 16% sobre o consumo de glicose, produção de etanol, QP e eficiência do processo, respectivamente, quando comparados aos resultados obtidos na primeira etapa do trabalho. Além disso, com os ensaios do planejamento foi possível reduzir o nível de (NH4)2SO4, MgSO4 e extrato de levedura. / In the present work the fermentation perfomance of the yeast Kluyveromyces marxianus NRRL Y-6860 in semi-synthetic medium containing glucose as carbon source was investigated. Initially, it was assessed the effect of different temperatures (35, 40, 43 and 45ºC) and the degree of ethanol toxicity (0, 15, 30, 45, 60 g/L) on the bioprocess parameters. From the selected temperature, it was then evaluated the effect of nutritional supplementation and inoculum concentration on the fermentation profile of this yeast. Fermentations assays were conducted in 125 mL Erlenmeyer flasks containing 50 mL of medium, 120 g/L glucose, at 100 rpm agitation speed. Among all temperatures evaluated the best results (70% consumption of glucose, 40 g/L of ethanol) were obtained at 43ºC, corresponding to volumetric ethanol productivity (QP) of 3.2 g/L.h and 80% efficiency. The results of ethanol toxicity in the fermentation at 43ºC, showed that increasing alcohol concentration decreased the fermentability of K. marxianus, being observed a complete inhibitiion when 45 g/L of ethanol was added in the medium. Afterward, the effect of nutrients (KH2PO4 0.5 to 1.5 g/L, (NH4)2SO4 from 1.0 to 3.0 g/L, MgSO4 from 0.1 to 0.5 g/L yeast extract and 3.0 to 7.0 g/L) and the initial concentration of cells (1.0 to 5.0 g/L) on the ethanol production by K. marxianus was investigated. The assays were perfomed according to a fractional factorial design 25-1, to identify and quantify the individual variables effects and their interactions on the bioprocess. The satistical analysis results showed that the initial cell concentrations ahd a positive effect on maximum ethanol concentration and consumed glucose. On the other hand, yeast extract had negative effect, while KH2PO4 concentration provided a positive effect only on the ethanol maximum concentration, at 90% confidence level. Statistical analysis also revealed that the interaction effects between variables were not significant. Based on these results, it was concluded the fermentation perfomance of K. marxianus NRRL Y-6860, at 43ºC, was favored after study the nutritional composition and inoculum concentration, since increased 19, 24, 25 and 16% of glucose consumption, ethanol production, QP and process efficiency, respectively, when compared to results obtained in the first phase of the present work. Furthermore, with the experimental design was possible to reduce th elevel of (NH4)2SO4, MgSO4 and yeast extract.

A inibição de mTOR com rapamicina exacerba a intolerância glicose associada a obesidade, um efeito que pode estar associado ao desenvolvimento de processo pró-inflamatório no tecido adiposo. O tratamento de camundongos com rapamicina exacerbou a intolerância a glicose e inflamação do tecido adiposo induzida por dieta hiperlipídica. In vitro, a inibição dos complexos 1 e 2 da mTOR com rapamicina e torina induziu polarização espontânea de macrófagos para o fenótipo M1 e aumentou a atividade fagocítica de macrófagos M0. Camundongos com ativação constitutiva de mTORC1 exclusivamente em células mielóides foram protegidos do ganho de peso, adiposidade, intolerância a glicose e a insulina induzidos pela ingestão de dieta hiperlipídica e apresentaram um aumento da polarização de macrófagos para o fenótipo M2. Em conjunto, nossos dados indicam que a atividade do complexo 1 da mTOR atenua o desenvolvimento da inflamação do tecido adiposo associada a obesidade por um mecanismo que envolve a polarização de macrófagos para o fenótipo M2. / Pharmacological mTOR inhibition with rapamycin exacerbates the glucose intolerance associated with obesity, such an effect that may be associated to the development of inflammatory process in adipose tissue. Rapamycin treatment exacerbates the glucose intolerance and adipose tissue inflammation induced by high fat diet feeding. In vitro, inhibition of mTOR complexes 1 and 2 with rapamycin and torin induced spontaneous macrophage polarization into a pro-inflammatory M1 phenotype and increased M0 macrophage phagocytosis. Mice with constitutive activation of mTOR complex 1 in myeloid cells were protected from body weight gain, fat accretion, glucose and insulin tolerance induced by the intake of high fat diet and displayed a significant increase in macrophage polarization to a M2 phenotype. Altogether, our findings indicate that the activity of mTOR complex 1 attenuates the development of adipose tissue inflammation induced by high fat feeding, through a mechanism that involves a higher polarization of macrophages to anti-inflammatory M2 phenotype.

Aumento nos níveis circulantes de alguns ácidos graxos (AGs) está relacionado com o quadro de resistência à insulina em músculo esquelético. Os mecanismos pelos quais os AGs diminuem a ação da insulina não estão elucidados, entretanto a participação destas biomoléculas no controle do NF-kB, SREBP-1c, HIF-1<font face=\"Symbol\">&#945;, LXR<font face=\"Symbol\">&#945; e PPARg considerados reguladores do Slc2a4, já foi sugerida. O objetivo deste estudo foi investigar a ação dos ácidos graxos, oléico (OFA) e linoléico (LFA), em células musculares L6, na regulação do Slc2a4. Redução no conteúdo protéico e de mRNA GLUT4 foi verificada na presença de ambos AGs. Esta redução foi relacionada com aumento na expressão e na atividade de ligação do NF-kB e diminuição na expressão e na atividade de ligação do SREBP-1 ao gene Slc2a4, na presença de OFA e LFA. Ambos AGs aumentaram a expressão do mRNA de LXR<font face=\"Symbol\">&#945;, PPARg and HIF-1<font face=\"Symbol\">&#945;, todavia apenas na presença de LFA foi detectada uma diminuição na ligação de PPARg ao Slc2a4. Ambos AGs reduzem a expressão do GLUT4 devido modulação da ligação do NF-kB e SREBP-1 ao gene Slc2a4. / High elevated levels of some free fatty acids (FFAs) are associated with insulin resistance in skeletal muscle. The mechanisms by which FFAs impair this hormone sensitivity need to be clarified; nevertheless, its effects in the modulation of NF-kB, SREBP-1c, HIF-1<font face=\"Symbol\">&#945;, LXR<font face=\"Symbol\">&#945; and PPARg which are related with Slc2a4 gene regulation have been suggested. The goal of this study was to investigate the action of oleic (OFA) and linoleic (LFA) fatty acids, in L6 muscle cells, in Slc2a4 regulation. The GLUT4 protein and mRNA expression decreased in the presence of OFA and LFA. The reduced GLUT4 expression was related to a significative enhancement of the NFkappaB mRNA expression and binding activity in presence of both FFAs and a decrease of SREBP-1 mRNA and binding activity in the Slc2a4. OFA and LFA increase LXR<font face=\"Symbol\">&#945;, PPARg and HIF-1<font face=\"Symbol\">&#945; mRNA expression, but only a reduction in PPARg binding activity was verified in presence of the LFA. A reduction in GLUT4 expression in the presence of OFA and LFA was detected and related with NF-kB and SREBP-1 binding activity in the Slc2a4 gene.

O trabalho realizado como parte do programa de mestrado em física aplicada sub-área biomolecular, teve como objeto de estudo a enzima glicose-6-fosfato isomerase de humanas (PGI-hum). Este trabalho envolveu principalmente três áreas de estudos: biologia molecular, bioquímica e cristalografia. A parte de biologia molecular refere-se a sub-clonagem do gene da PGI-hum a partir de uma biblioteca de cDNA de cérebro de feto humano - capítulo 2 - e a expressão deste gene em bactérias Escherichia coli - capítulo 3. A parte de bioquímica envolve a purificação e caracterização de parâmetros cinéticos da enzima PGI-hum recombinante. Além dos parâmetros cinéticos, foram realizados ensaios de eficiência inibitória para quatro compostos similares ao substrato, cedidos em colaboração com o pesquisador Dr. Laurent Salmon (Lab. De Química Biorgânica e Bioinorgânica de Universidade de Paris-XI). Esta etapa encontra-se descrita nos capítulos 3 e 4. Uma vez definido o protocolo de purificação e confirmada a atividade enzimática para a PGI-hum recombinante, iniciou-se a terceira etapa do projeto: cristalização e determinação da estrutura por difração de raios-X. O primeiro passo, nesta Ultima fase do trabalho, foi determinar as condições de cristalização da PGI-hum - capítulo 5. Depois de obtidos os cristais, foram coletados dois conjuntos de dados de difração de raios-X, sendo o primeiro coletado em uma fonte convencional de raios-X e o segundo com um feixe proveniente de luz sincrotron - capítulo 6. A análise da qualidade e comparação dos conjuntos de dados - capítulo 7 - indicou qual conjunto seria utilizado nas etapas seguintes da determinação da estrutura da PGI-hum. Para resolução da estrutura cristalográfica da PGI-hum foi utilizado o método de substituição molecular com base na estrutura homóloga da PGI de coelho - capítulo 8. O refinamento estrutural da PGI resultou em uma estrutura com 2.1Å de resolução e fatores R e R free satisfatórios - capítulo 9. Uma análise estrutural preliminar é apresentada indicando uma geometria adequada para a proteína e descrevendo as principais características estruturais desta enzima em comparação com a PGI de coelho. / This work is presented as part of the Master degree requirements of the Applied Physics program, Biomolecular Physics area. The purpose of this work is the structural study by of the human glucose-6-phosphate isomerase (PGI-hum). This work has involved mainly three areas: Molecular Biology, Biochemistry and Crystallography. The Molecular Biology work was intended for the cloning of the human open reading frame of PGI-hum from a fetal human brain cDNA library - Chapter 2 - and its expression in Escherichia coli - Chapter 3. The biochemistry work has involved the PGI-hum purification and the determination of its kinetic parameters of the recombinant protein. Inhibitory efficiency measurements where made with four compounds kindly provided by Dr. Laurent Salmon (Laboratoire de Chimie Bioorganique et Bioinorganique - Universite Paris-XI - France). This work is described in Chapters 3 and 4. Once defined the expression and purification protocols and confirmed its enzymatic activity for the recombinant PGI-hum, a third phase was initiated in the project: The crystallization and structure determination by X-ray diffraction. The first step in this last phase of the project was determining the conditions for crystallization of the PGI-hum - Chapter 5. Once obtained the crystals, two data set were collected. One data set was collected \"in house\" X-ray source and a second data set was collected at the Synchrotron beam line (Laboratório Nacional de Luz Sincrotron - LNLS - Campinas) - Chapter 6. The analysis of the quality and the comparison of the two data sets, presented in Chapter 7, indicated that second data set was the best to be used at the following steps. For the resolution of the atomic structure oh the PGL-hum the method of molecular substitution based on the structure of the rabbit homologue enzyme was employed - Chapter 8. The refinement of the PGI-hum structure at 2.1Å resolution and satisfactory R and R free factors is presented in Chapter 9 of this dissertation. A preliminary structural analysis is presented indicating an adequate geometry of the protein and describing the most important structural features of the PGI-hum compared to its homologue, the rabbit PGI.