Orientador: Marcos Antônio Machado / Coorientador: Carolina Munari Rodrigues / Banca: Chirlei Glienke / Banca: Paulo Martins Ribolla / Resumo: A Mancha Preta dos Citros (MPC), causada pelo fungo Phyllosticta citricarpa, é uma das mais importantes doenças da citricultura brasileira. No entanto, muito pouco se sabe sobre os mecanismos de patogenicidade deste patógeno na interação com seus hospedeiros. Além disso, P. citricarpa é morfologicamente muito semelhante a P. capitalensis, espécie endofítica também em citros, o que dificulta a diferenciação entre elas, gerando evidentes barreiras fitossanitárias à exportação de frutos in natura. Do mesmo modo, pouco ainda é conhecido sobre seus genomas, ainda não completamente sequenciados, assim como seus transcriptomas em diferentes condições. Assim, o objetivo geral desse trabalho foi avaliar e comparar os genomas e transcriptomas de P. citricarpa e P. capitalensis. O sequenciamento genômico com tecnologia Illumina gerou 179.880.616 reads para P. citricarpa que foram montados em 19.143 contigs, e 148.831.020 reads de P. capitalensis contidos em 11.080 contigs. Foram preditas 16.267 ORFs para a espécie patogênica e 14.813 para a espécie endofítica. Ambos os genomas são similares, com quantidades semelhantes de genes na maioria das categorias analisadas. Os transcriptomas por sua vez geraram em média 74 bilhões de reads por repetição biológica para ambas as espécies, com 3.074 transcritos diferencialmente expressos, sendo 2.637 mais expressos em P. citricarpa e 1.097 em P. capitalensis, com expressiva diferença qualitativa em ambas. P. citricarpa apresentou maior quantidade de genes expressos que P. capitalensis em quase todas as vias analisadas. A espécie endofítica apresentou maior número de genes expressos nas vias de sinalização e adesão. Além disso, os genes envolvidos na interação planta-patógeno foram também mais expressos na espécie endofítica. Os resultados obtidos dos genomas e transcriptomas de P. citricarpa e de P. capitalensis contribuem para maior compreensão da biologia dessas espécies / Abstract: Citrus black spot (CBP), caused by Phyllosticta citricarpa, is one of the most important citrus disease in the Brazilian citrus industry. However, the mechanisms of pathogenicity of this pathogen during the interactions with their hosts are poorly understood. P. citricarpa is frequently associated with P. capitalensis, which is morphologically similar to the endophytic specie. This feature difficults the differentiation of both species resulting in phytossanitary barriers for in natura fruit exportation. Moreover, their genomes were not fully sequenced yet and there is a lack of knowledge of their transcriptomes in different conditions. Thus, the overall objectives of this work were to evaluate and compare the genome and transcriptome of both species. The total genome sequence was 179,880,616 reads for P. citricarpa and 148,831,020 reads for P. capitalensis assembled in 19,143 and 11,080 contigs, respectively. There were predicted 16,267 ORFs for the pathogenic specie and 14,813 for the endophytic specie. P. citricarpa and P. capitalensis presented very similar amounts of genes. The transcriptomic sequence generated on average 74 billion of reads per biological repeat for each species. There were obtained 3,074 differential expressed transcripts, 2,637 were more expressed in P. citricarpa and 1,097 in P. capitalensis. Transcriptional differences between these species were observed. P. citricarpa showed more expressed genes than P. capitalensis in most analyzed categories. The endophytic specie presented more expressed genes on signaling pathway and adhesion than the pathogenic specie. Additionally, plant-pathogen interaction genes were expressed on P. capitalensis. Thus, the results of genomic and transcriptomic analyses of the P. citricarpa and P. capitalensis contribute to the biology comprehension of these species / Mestre

Orientador: Claudia Marcia Aparecida Carareto / Orientador: Alexandre de Kochko / Coorientador: Romain Guyot / Banca: Maura Helena Manfrin / Banca: Diana Fernandez / Banca: Gustavo Kuhn / Banca Maria Pilar Garcia Guerreiro / Resumo: A história evolutiva das angiospermas é marcada por rápida e ampla diversificação, cujo background deve-se à ação de numerosos fatores; dentre esses, os elementos de transposição (TEs) têm sido considerados como um dos agentes mais importantes. TEs podem compor grandes porções do genoma de plantas e, dessa forma, desempenhar um papel importante na promoção da diversidade genética. O objetivo deste estudo foi investigar a dinâmica evolutiva de TEs ativos em espécies do gênero Coffea. Uma ampla análise da distribuição e evolução de um retrotransposon com LTR (LTR-RT), o elemento Copia25, foi realizada em genomas de plantas. Copia25 é amplamente distribuído na família Rubiaceae, e, está presente em espécies distantemente relacionadas pertencentes às subclasses Asteridae e Rosidae, e à classe das monocotiledôneas. Em particular, foi observada uma incongruência envolvendo sequências Copia25 de espécies do gênero Musa, uma monocotiledônea, e do gênero Ixora, uma dicotiledônea (Rubiaceae), que seria devido a um evento de transferência horizontal (HT) entre essas espécies ou entre suas linhagens ancestrais. Copia25 apresenta dinâmica evolutiva complexa em angiospermas, cuja história incluiria conservação de sequências, perdas estocásticas e HT. Dez LTR-RTs foram anotados no genoma de C. canephora e tiveram seus perfis insercionais obtidos, usando os métodos de IRAP e REMAP, em genótipos das espécies progenitoras, C. canephora e C. eugenioides, e do alotetraploide, C. arabica. Perdas de inserções teriam ocorrido no alotetraploide, sendo essas mais significativas em cinco das dez famílias investigadas, e observou-se, ainda, a ocorrência de alterações direcionais nos subgenomas, sendo mais frequentes as ocorridas no subgenoma maternal, C. eugenioides. O presente trabalho contribui para o entendimento da evolução dos LTR-RTs nos genomas, da colonização de novos genomas por esses elementos,... / Abstract: The evolutionary history of the angiosperms is characterized by its rapid and broad diversification, whose background is due to the action of numerous factors; among them, the transposable elements (TEs) have been considered as one of the most important agents. TEs might compose large portions of the plant genomes, and play an important role in promoting genetic diversity. The aim of this study was to investigate the evolutionary dynamics of active TEs in the Coffea species. In the first chapter, are presented the results of an extensive analysis of the distribution and evolution in plant genomes of a retrotransposon with LTR (LTR-RT), the Copia25. Copia25 is widely distributed in the Rubiaceae family, and is present in distantly related species belonging to the Rosidae and Asteridae subclasses, and the class of monocotyledons. In particular, it was observed an incongruity involving Copia25 sequences of Musa species, a monocot, and Ixora species, a dicot (Rubiaceae), which could be due to horizontal transfer (HT) between these species or their ancestral lineages. Copia25 has a complex evolutionary dynamics in angiosperms, whose history could include conservation sequences, stochastic loss and HT. Ten LTR-RTs were annotated in C. canephora genome and had their insertional profiles obtained, using IRAP and REMAP methods, in genotypes of the parental species, C. canephora and C. eugenioides, and the allotetraploid, C. arabica. Losses of insertions could have occurred in the allotetraploid, these being more significant in five out of ten families studied, and also was observed the occurrence of directional changes in progenitors subgenomes, being more frequent those occurred in maternal subgenome, C. eugenioides. This study contributes to the understanding of the evolution of LTR-RTs within genomes, the colonization of new genomes for these elements as well as its evolutionary dynamics in a newly originated genome / Doutor

Submitted by Automa??o e Estat?stica (sst@bczm.ufrn.br) on 2016-08-09T23:35:51Z No. of bitstreams: 1 VirginiaPenellopeMacedoESilva_TESE.pdf: 2028754 bytes, checksum: 8e6e495b2056248d59d55bf24abbf089 (MD5) / Approved for entry into archive by Arlan Eloi Leite Silva (eloihistoriador@yahoo.com.br) on 2016-08-15T22:34:21Z (GMT) No. of bitstreams: 1 VirginiaPenellopeMacedoESilva_TESE.pdf: 2028754 bytes, checksum: 8e6e495b2056248d59d55bf24abbf089 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-08-15T22:34:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 VirginiaPenellopeMacedoESilva_TESE.pdf: 2028754 bytes, checksum: 8e6e495b2056248d59d55bf24abbf089 (MD5) Previous issue date: 2015-04-23 / Coordena??o de Aperfei?oamento de Pessoal de N?vel Superior (CAPES) / Nas Am?ricas, a infec??o por Leishmania tem como principal agente etiol?gico Leishmania infantum. Nos ?ltimos 30 anos o padr?o de distribui??o das leishmanioses tem mudado substancialmente e a doen?a tem apresentado um perfil emergente na periferia dos grandes centros urbanos. A infec??o por Leishmania pode evoluir com um amplo espectro cl?nico desde o acometimento da pele, mucosas e v?sceras. Dos indiv?duos infectados por L. infantum apenas 10% desenvolvem a doen?a, sabe-se que 90% da infec??o humana ? assintom?tica e diversos fatores est?o envolvidos no curso da infec??o. Os principais fatores envolvidos no desenvolvimento da doen?a s?o a resposta imune do hospedeiro, a esp?cie e o conte?do g?nico do parasita. O sequenciamento dos isolados de Leishmania poderia aumentar a compreens?o acerca da sintomatologia dos indiv?duos. Dessa forma, o objetivo desse estudo foi avaliar a diversidade gen?tica de cepas de Leishmania circulantes entre humanos, sintom?ticos e assintom?ticos e c?es de ?reas end?micas do Rio Grande do Norte. A variabilidade gen?tica de um grupo de amostras de humanos e caninos com a doen?a visceral, doen?a cut?nea e infec??o assintom?tica foi avaliado com os marcadores moleculares hsp70 e ITS1. O genoma completo de 20 isolados de Leishmania oriundos de humanos, sintom?ticos e assintom?ticos, e c?es foram sequenciados para avaliar a diversidade dessas amostras. Os fragmentos amplificados de hsp70 e ITS1 das amostras e foram analisados e montadas utilizando o pacote Phred/Phrap. Os dendogramas foram constru?dos aplicando o m?todo neighbor joining com 500 bootstraps, seguido das infer?ncias sobre as rela??es entre as variantes de Leishmania. As sequ?ncias dos 20 isolados brasileiros foram mapeadas com o genoma de refer?ncia Leishmania infantum JPCM5, usando o programa Bowtie2, com identifica??o de 36 contigs. As informa??es dos SNPs v?lidos foram utilizadas na PCA. Os SNPs foram visualizados pelo Geneious 7.1 e IGV. As anota??es do genoma foram ent?o transferidas para seus respectivos cromossomos e visualizadas utilizando o Geneious. As sequ?ncias consenso de todos os cromossomos (com m?nimo de 75% das reads com a mesma base) foram alinhadas usando Mauve. As ?rvores filogen?ticas foram calculadas de acordo com c?lculos de m?xima verossimilhan?a e modelos JTT. Como resultados obtivemos que hsp70 e ITS1 n?o foram capazes de definir variabilidade gen?tica entre os isolados de humanos e c?es; nem para os isolados de cultura e de sangue perif?rico, oriundos de um mesmo paciente.O sequenciamento gen?mico dos 20 isolados brasileiros revelou uma forte rela??o entre as cepas de Leishmania circulantes em no Rio Grande do Norte. Os isolados da Grande Natal de humanos e caninos permaneceram agrupados em todas as an?lises, sugerindo que existe proximidade genot?pica e geogr?fica entre os isolados. As amostras isoladas na d?cada de 1990 apresentaram uma maior diversidade genot?pica quando comparadas as amostras recentemente isoladas. De forma geral, n?o encontramos correla??o entre as formas cl?nicas sintom?ticas e assintom?ticas e o conte?do g?nico dos isolados brasileiros de Leishmania. / Leishmania infantum is the main etiologic agent of visceral leishmaniasis in the New World. The pattern of distribution of leishmaniasis has changed substantially and has presented an emerging profile within the periphery of the Large Urban Centers. Leishmania infection can compromise skin, mucosa and viscera. Only 10% of the individuals infected develop the disease and 90% of human infection is asymptomatic. The main factors involved in the development of the disease are the host immune response, the vector?s species and the parasite?s genetic content. The sequencing of Leishmania isolated seeks to increase the understanding of the symptoms of individuals. The aim of this study was to evaluate the genetic diversity of circulating Leishmania strains among humans, and symptomatic and asymptomatic, and dogs from endemic areas of Rio Grande do Norte State and analyze sandflies from endemic areas for cutaneous and visceral disease. The genetic variability was evaluated by the use of markers hsp70 , ITS1 and a whole genome sequencing was also carried out. The amplified hsp70 and ITS1 of samples were analyzed and assembled using a Phred / Phrap package. The dendograms were constructed using the same methodology, but adding 500 bootstraps, followed by inferences on the relationships between Leishmania variants. The sequences of the 20 Brazilian isolates were mapped to the reference genome L. infantum JPCM5, using the Bowtie2 program and the identification of 36 contigs. The information of the valid SNPs were used in the PCA. SNPs were visualized by Geneious 7.1 and IGV. The genome annotations were transferred to their respective chromosomes and displayed on Geneious. The matching sequences of all chromosomes were aligned using Mauve. The phylogenetic trees were calculated according to maximum likelihood and JTT models. Sandflies were analyzed by PCR for the identification of Leishmania infection, a blood meal source and GAPDH sand fly. As a result, hsp70 and ITS1 were not capable of identifying genetic variability among human isolates from symptomatic and asymptomatic, and dogs. The complete sequencing of the 20 Brazilian isolates revealed a strong similarity between the circulating Leishmania strains in Rio Grande do Norte. The isolates collected in the city of Natal from humans and canines remained grouped in all analyzes, suggesting that there is genotypic and geographic proximity among the isolates. The isolated samples in the 1990s had a higher genotypic diversity when compared to freshly isolated samples. All isolates presented 36 chromosomes with variable ploidy among them, no correlation was found between the number of amastina genes copies, gp63, A2 and SSG with such clinic forms. In general, we did not find correlation between symptomatic and asymptomatic clinical forms and the gene content of the Brazilian isolates of Leishmania. 34,28% of the sandflies collected in the upper west region were L. longipalpis and the main sources of blood meal were humans, dogs and chickens.

Até o momento nenhuma espécie daninha de importância agrícola tinha sido sequenciada no Brasil, dessa forma o arroz vermelho oferece uma oportunidade ímpar para isso, podendo levar a um melhor entendimento do seu genoma e facilitar o desenvolvimento de estratégias mais eficientes de controle destas plantas em condições de campo. Sendo assim, o objetivo deste trabalho foi sequenciar o genoma de dois genótipos de arroz vermelho coletados no estado do Rio Grande do Sul, e que possuem degrane elevado (AV60) intermediário (AV53), bem como realizar uma análise estrutural dos genes relacionados a este caráter. Vários programas montadores foram comparados e o Abbys foi o que gerou o maior número de scaffolds, totalizado um tamanho de genoma de 391,7 e 390,2 megabases, respectivamente para os genótipos AV53 e AV60, o que representa cerca de 90% do genoma referência do arroz. A cobertura do sequenciamento foi de 36.6 X e 32.1 X respectivamente para os mesmos genótipos. A análise estrutural de seis principais genes relacionados ao degrane relevou que a composição gênica é similar entre os genótipos analisados, corroborando com resultados de estudos anteriores. Um grande número de variantes genômicos foi descoberto (SNPs e INDELs). O alinhamento dos genótipos com o genoma de referênciaOryza sativa ssp. indica revelou relativamente menor número de variantes, com frequência de um SNP a cada 264 pb. Por outro lado, o alinhamento contra o genoma referência de Oryza sativa ssp. japonica gerou uma frequência média de 1 SNP a cada 154pb, sendo que a mesma tendência foi observada para os INDELs. A menor frequência de SNPs e INDELs no primeiro alinhamento sugere maior similaridade entre as espécies alinhadas, indicando que o arroz vermelho do sul do Brasil é provavelmente originário da espécieOryza sativa spp indica. / So far no weed species of agricultural importance had been sequenced in Brazil, thus weedy red rice provided a unique opportunity for it, leading to a better understanding of genomic and facilitating the development of more effective strategies to control these plants under field conditions. The objective of this study was sequencing the genome of two weedy red rice genotypes found in the Rio Grande do Sul state, which present high (AV60) and intermediate (AV53) degree of shattering,and perform a structural analysis of the genes related to this trait. Several genome assemblers programs were compared, and Abbys was the one that generated the highest number of scaffolds, totalizing a genome size of 391.7 and 390.2 Mb, respectively for AV53 and AV60 genotypes, which represent about 90% of the rice reference genome. The sequencing coverage was 32.1 and 36.6X respectively for the same genotypes. The structural analysis of 6 key genes related to seed shattering revealed that its genetic composition is similar among the genotypes analyzed, confirming results from previous studies. A large number of genomic variants (SNPs and INDELs) were discovered. The alignment of AV53, and AV60 with the Oryza sativa ssp. indica reference genome showed relatively lower number of variants, with a frequency of 1 SNP every 220 bp, whereas the alignment with the Oryza sativa spp. japonica yielded an average frequency of 1 SNP every 154pb; the same trend was observed for INDELS. The lower frequency of SNPs and INDELS in the first alignment suggests greater similarity between the aligned species, indicating that the origin of weedy red rice in southern Brazil is most likely from the Oryza sativa spp indica.

O alfaherpesvírus bubalino 1 (BuHV1) e os alfaherpesvírus bovinos 1 (BoHV1), 5 (BoHV5) e são membros da ordem Herpesvirales, família Herpesviridae, subfamília Alphaherpesvirinae, gênero Varicellovirus. O BoHV1 e o BoHV5 são subdivididos em subtipos (BoHV1.1, 1.2a, 1.2b; BoHV5a, b, c). No Brasil circulam BoHV1 e BoHV5 de todos os subtipos até o presente reconhecidos. Em vista dessa variedade de alfaherpesvírus potencialmente infecciosos para bovinos e bubalinos, o conhecimento sobre estes agentes é essencial para a implementação de medidas de controle ou erradicação. Com o objetivo de permitir algumas comparações entre estes agentes e as respostas por eles induzidas em seus hospedeiros, primeiramente foi realizado o sequenciamento do genoma completo de uma amostra de BuHV1 (b6), isolada a partir de prepúcio de búfalos (Bubalus bubalis) em 1972, na Austrália. O objetivo foi disponibilizar a primeira sequência completa de um alfaherpesvírus bubalino e avaliar o grau de similaridade entre o genoma desse vírus e os alfaherpesvírus de bovinos. O genoma sequenciado compreende 137.452 pares de bases (pb), com um nível de similaridade nucleotídica de 92,2% com BoHV5 (SV507/99) e 76,7% com BoHV1 (NVSL). Estes resultados permitirão estudos futuros buscando reconstruir a história evolutiva destes vírus, a importância de infecções interespécies na geração de variantes destes agentes e possíveis associações entre tais infecções e patogenicidade. Na segunda etapa dos estudos, foram realizados diversos testes sorológicos buscando definir uma metodologia de diagnóstico adequada para a identificação de anticorpos contra BuHV1 e todos os diferentes subtipos de BoHV1 e BoHV5. Inicialmente, 600 amostras de soros de bovinos de campo foram testadas através do teste de soroneutralização (SN), realizada frente aos sete alfaherpesvírus em estudo. Os resultados da SN foram influenciados pela escolha do vírus desafio utilizado no ensaio. Para obter a sensibilidade máxima do teste (259/600), foi necessário combinar resultados positivos frente a pelo menos cinco diferentes amostras virais. Em seguida, foram preparados ensaios do tipo “ELISA” para detecção de anticorpos utilizando antígenos preparados com cada um dos diferentes tipos/subtipos desses vírus (BuHV1; BoHV1.1, 1.2a, 1.2b; BoHV5a, b, c), individualmente (chamado “single ELISA” ou “sAgELISA”). Os resultados obtidos foram comparados com os resultados da soroneutralização (SN). A sensibilidade do sAgELISA variou significativamente conforme a amostra viral utilizada no preparo dos antígenos. Considerando os resultados frente a apenas um antígeno, a maior sensibilidade foi de 96,1% (249/259), obtida com apenas uma amostra de BoHV5c. Foram necessários pelo menos seis antígenos (BuHV1; BoHV1.2a, 1.2b; BoHV5a, b, c) para atingir a sensibilidade máxima do teste (263/259). Assim, foi desenvolvido um ELISA combinando vários antígenos em um mesmo teste (chamado “multiple ELISA” ou “mAgELISA”). O mAgELISA detectou 263 amostras positivas, resultando em uma concordância ótima entre sAgELISA e mAgELISA (κ=0,99). Frente a SN, o mAgELISA apresentou uma sensibilidade de 96,5% e especificidade de 96,1% (κ=0,93; VPP=95,0%; VPN=97,3%). Essas diferenças não foram estatisticamente significativas. Os resultados obtidos com a SN e mAgELISA foram comparados também a um ELISA comercial para a detecção de anticorpos contra BoHV1. O ELISA comercial utilizado nas comparações não apresentou resultados significativamente diferentes dos demais testes realizados, no entanto, revelou o maior número de resultados discrepantes em relação ao SN, considerado padrão-ouro. Estes resultados revelam que o mAgELISA aqui relatado é adequado para a detecção de anticorpos para BuHV1, BoHV1 e BoHV5, com sensibilidade e especificidade significativamente comparáveis às da SN. / Bubaline alphaherpesvirus 1 (BuHV1), Bovine alphaherpesviruses 1 (BoHV1) and 5 (BoHV5) are members of the order Herpesvirales family Herpesviridae, subfamily Alphaherpesvirinae, genus Varicellovirus. The BoHV1 and BoHV5 are divided into subtypes (BoHV1.1, 1.2a, 1.2b; BoHV5a, b, c). In Brazil, circulates BoHV 1 and BoHV 5 from all subtypes known to the present. In view of this variety of potentially infectious alphaherpesviruses for bovines and buffaloes, knowledge about these agents is essential for the implementation of control or eradication measures. In order to gain a deeper understanding about these agents and the responses induced by them in their hosts, initially, the complete genome sequence of BuHV1-b6, one of the first BuHV1 viruses isolated in Australia in 1972, is reported. The objective was to provide the first complete sequence of a buffalo alphaherpesvirus and to evaluate the degree of similarity between BuHV1 and bovine alphaherpesviruses genomes. The BuHV1-b6 genome is a linear double-stranded DNA molecule, 137,452 bp long, with overall sequence of the 92.2% similarity at the nucleotide level to the reference BoHV5 (SV507/99) strain and 76.7% with BoHV1 (NVSL) strain. These results are expected to be valuable for further studies involving evolutionary chain of these viruses, the interspecies infections importance in generation of variants and possible associations between such infections and pathogenicity. In the second stage of the study, several serological tests were performed in order to define a appropriate diagnostic methodology for the identification of antibodies against BuHV1 and all different subtypes of BoHV1 and BoHV5. Initially, 600 bovine field serum samples were screened in serum neutralization tests (SN) performed against all seven virus types/subtypes. The SN results were influenced by the choice of the challenge virus. The maximum number of positive sera (259/600) was detected by adding the positive results obtained with at least five different viruses. Seven enzyme linked immunoassays were prepared with each of the seven antigens (BuHV1; BoHV1.1, 1.2a, 1.2b; BoHV5a, b, c), individually (single antigen ELISAs; sAgELISAs). The results obtained were compared to the SN. The sensitivity of the sAgELISAs was also influenced by the choice of antigen. Considering the results against only one of them, the best sensitivity was 96.1% (249/259), obtained with BoHV5c. Maximum sAgELISA sensitivity (263/259) was achieved when positive results of at least six viruses (BuHV1; BoHV1.2a, 1.2b; BoHV5a, b, c) were combined. A multiple antigen ELISA (mAgELISA) was then prepared by combining of different viral antigens in the same test. The mAgELISA detected 263 positive samples, resulting an optimum concordance between sAgELISA and mAgELISA (κ=0.99). When compared to SN, the mAgELISA revealed 96.5% sensitivity and 96.1% specificity (κ=0.93; PPV=95.0%; NPV=97.3%). These differences were not statistically significant. The results of both SN and mAgELISA were compared to a commercially available (IBRgB) ELISA. The results of the commercial ELISA did not vary significantly in relation to others tests performed, however, revealed the highest number of discrepant results in relation to SN, taken as the gold standard. These results reveal that the mAgELISA reported here is suitable for the detection of antibodies to BuHV1, BoHV1 and BoHV5 with sensitivity and specificity significantly comparable to those of SN.

A tecnologia de sequenciamento de nova geração (next-generation sequencing – NGS) e suas aplicações tem sido cada vez mais utilizada na prática médica para elucidar a base molecular de doenças Mendelianas. Embora seja uma poderosa ferramenta de pesquisa, ainda existe uma importante transição quanto à análise dos dados entre as tecnologias tradicionais de sequenciamento e o NGS. A primeira parte deste trabalho aborda aspectos analíticos envolvidos nesta mudança, com foco na plataforma Ion Torrent Personal Genome Machine. Esta é uma plataforma amplamente utilizada para sequenciar painéis de genes, já que esta aplicação requer menor rendimento de dados. Este trabalho demonstra indicadores adequados para avaliar a qualidade de corridas de sequenciamento e também uma estratégia baseada em valores de profundidade de cobertura para avaliar a performance de amplicons em diferentes cenários. Por outro lado, o NGS permitiu a realização de estudos populacionais em larga escala que estão mudando nossa compreensão sobre as variações genéticas humanas. Um desses exemplos são as mutações até então chamadas de silenciosas, que estão sendo implicadas como causadoras de doenças humanas. A segunda parte deste trabalho investiga a patogenicidade de polimorfismos de núcleotídeo único sinônimos (synonymous single nucleotide polymorphisms – sSNP) baseado em dados públicos obtidos do Exome Aggregation Consortium (ExAC) (exac.broadinstitute.org/) utilizando o software Silent Variant Analysis (SilVA) (compbio.cs.toronto.edu/silva/) e outros recursos para reunir informações adicionais sobre consequências funcionais visando fornecer um panorama dos efeitos patogênicos de sSNP em mais de 60.000 exomas humanos. Nós demonstramos que de 1,691,045 variantes sinônimas, um total de 26,034 foram classificadas como patogênicas pelo SilVA, com frequência alélica menor que 0,05. Análises funcionais in silico revelaram que as variantes sinônimas patogênicas estão envolvidas em processos biológicos importantes, como regulação celular, metabolismo e transporte. Ao expor um cenário de variações sinônimas patogênicas em exomas humanos, nós concluímos que filtrar sSNP em workflows de priorização é razoável, no entanto em situações específicas os sSNP podem ser considerados. Pesquisas futuras neste campo poderão fornecer uma imagem clara do papel de tais variações em doenças genéticas. / Next-generation sequencing (NGS) technologies and its applications are increasingly used in medicine to elucidate the molecular basis of Mendelian diseases. Although it is a powerful research tool, there is still an important transition regarding data analysis between traditional sequencing techniques and NGS. The first part of this work addresses analytical aspects involved on this switch-over, focusing on the Ion Torrent Personal Genome Machine platform. This is a widely used platform for sequencing gene panels, as this application demands lower throughput of data. We present indicators suitable to evaluate quality of sequencing runs and also a strategy based on depth of coverage values to evaluate amplicon performance on different scenarios. On the other hand, NGS enabled large-scale population studies that are changing our understanding about human genetic variations. One of these examples are the so-called silent mutations, that are being implied as causative of human diseases. The second part of this work investigates the pathogenicity of synonymous single nucleotide polymorphisms (sSNP) based on public data obtained from the Exome Aggregation Consortium (ExAC) (exac.broadinstitute.org/) using the software Silent Variant Analysis (SilVA) (compbio.cs.toronto.edu/silva/) and other sources to gather additional information about affected protein domains, mRNA folding and functional consequences aiming to provide a landscape of harmfulness of sSNP on more than 60,000 human exomes. We show that from 1,691,045 synonymous variants a total of 26,034 were classified as pathogenic and by SilVA, with allele frequency lower than 0.05. In silico functional analysis revealed that pathogenic synonymous variants found are involved in important biological process, such as cellular regulation, metabolism and transport. By exposing a scenario of pathogenic synonymous variants on human exomes we conclude that filtering out sSNP on prioritization workflows is reasonable, although in some specific cases sSNP should be considered. Future research on this field will provide a clear picture of such variations on genetic diseases.

Nos Estados Unidos, aproximadamente 10% da população é exposta diariamente a níveis perigosos de ruído no ambiente de trabalho. Estudos com gêmeos estimam que a herdabilidade para a perda auditiva induzida por ruído (PAIR) é de aproximadamente 36%, e tem sido demonstrada variação da sensibilidade ao ruído em linhagens específicas de camundongos. Devido à dificuldade inerente do estudo da PAIR em humanos, optou-se por estudar esse traço complexo em camundongos. Camundongos do Hybrid Mouse Diversity Panel (HMDP) com 5 semanas de idade foram expostos a um ruído de banda na oitava de 10 kHz por 2 horas a 108 dB. A mudança permanente no limiar foi avaliada após 2 semanas da exposição ao ruído, através de estímulos com frequência-específica. Esses dados foram então aplicados em um estudo de associação do genoma inteiro através do Efficient Mixed Model Analysis (EMMA) a fim de controlar para estrutura populacional. Neste manuscrito será descrito o estudo de associação do genoma inteiro com ênfase num pico de associação significativo para susceptibilidade à PAIR. Esse pico está no cromossomo 17 e em um bloco de haplótipo contendo a NADPH oxidase-3 (Nox3). Esse pico foi detectado em um fenótipo com estímulo de 8 kHz (tone-burst). Os mutantes homozigotos e os heterozigotos Nox3 foram então testados para validar o achado identificado no estudo de associação do genoma inteiro. Os mutantes e heterozigotos demonstraram uma maior susceptibilidade à PAIR, especialmente em 8 kHz, tanto através das medidas de emissões otoacústicas por produto de distorção (EOAPD) quanto por potenciais evocados auditivos de tronco cerebral (PEATE). Foi demonstrado por imuno-histoquímica que essa sensibilidade reside nas bandas sinápticas cocleares dos animais mutantes, especialmente em 8 kHz. Os mutantes homozigotos e os heterozigotos Nox3 foram então testados para validar o achado identificado no estudo de associação do genoma inteiro. Os mutantes e heterozigotos demonstraram uma maior susceptibilidade à PAIR, especialmente em 8 kHz, tanto através das medidas de emissões otoacústicas por produto de distorção (EOAPD) quanto por potenciais evocados auditivos de tronco cerebral (PEATE). Foi demonstrado por imuno-histoquímica que essa sensibilidade reside nas bandas sinápticas cocleares dos animais mutantes, especialmente em 8 kHz. Este é o primeiro estudo de associação do genoma inteiro para PAIR em camundongos e demonstra o poder dessa estratégia em identificar, de forma tonotópica, a susceptibilidade genética à PAIR.

Nos Estados Unidos, aproximadamente 10% da população é exposta diariamente a níveis perigosos de ruído no ambiente de trabalho. Estudos com gêmeos estimam que a herdabilidade para a perda auditiva induzida por ruído (PAIR) é de aproximadamente 36%, e tem sido demonstrada variação da sensibilidade ao ruído em linhagens específicas de camundongos. Devido à dificuldade inerente do estudo da PAIR em humanos, optou-se por estudar esse traço complexo em camundongos. Camundongos do Hybrid Mouse Diversity Panel (HMDP) com 5 semanas de idade foram expostos a um ruído de banda na oitava de 10 kHz por 2 horas a 108 dB. A mudança permanente no limiar foi avaliada após 2 semanas da exposição ao ruído, através de estímulos com frequência-específica. Esses dados foram então aplicados em um estudo de associação do genoma inteiro através do Efficient Mixed Model Analysis (EMMA) a fim de controlar para estrutura populacional. Neste manuscrito será descrito o estudo de associação do genoma inteiro com ênfase num pico de associação significativo para susceptibilidade à PAIR. Esse pico está no cromossomo 17 e em um bloco de haplótipo contendo a NADPH oxidase-3 (Nox3). Esse pico foi detectado em um fenótipo com estímulo de 8 kHz (tone-burst). Os mutantes homozigotos e os heterozigotos Nox3 foram então testados para validar o achado identificado no estudo de associação do genoma inteiro. Os mutantes e heterozigotos demonstraram uma maior susceptibilidade à PAIR, especialmente em 8 kHz, tanto através das medidas de emissões otoacústicas por produto de distorção (EOAPD) quanto por potenciais evocados auditivos de tronco cerebral (PEATE). Foi demonstrado por imuno-histoquímica que essa sensibilidade reside nas bandas sinápticas cocleares dos animais mutantes, especialmente em 8 kHz. Os mutantes homozigotos e os heterozigotos Nox3 foram então testados para validar o achado identificado no estudo de associação do genoma inteiro. Os mutantes e heterozigotos demonstraram uma maior susceptibilidade à PAIR, especialmente em 8 kHz, tanto através das medidas de emissões otoacústicas por produto de distorção (EOAPD) quanto por potenciais evocados auditivos de tronco cerebral (PEATE). Foi demonstrado por imuno-histoquímica que essa sensibilidade reside nas bandas sinápticas cocleares dos animais mutantes, especialmente em 8 kHz. Este é o primeiro estudo de associação do genoma inteiro para PAIR em camundongos e demonstra o poder dessa estratégia em identificar, de forma tonotópica, a susceptibilidade genética à PAIR.

Submitted by Alisson Mota (alisson.davidbeckam@gmail.com) on 2015-07-13T19:18:49Z No. of bitstreams: 1 Tese - Marcicleide Lima do Espirito Santo.pdf: 7339955 bytes, checksum: 22519cc9c5e5f14e2991f1e20ddb938f (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2015-07-15T18:14:34Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Tese - Marcicleide Lima do Espirito Santo.pdf: 7339955 bytes, checksum: 22519cc9c5e5f14e2991f1e20ddb938f (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2015-07-15T18:19:56Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Tese - Marcicleide Lima do Espirito Santo.pdf: 7339955 bytes, checksum: 22519cc9c5e5f14e2991f1e20ddb938f (MD5) / Made available in DSpace on 2015-07-15T18:19:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese - Marcicleide Lima do Espirito Santo.pdf: 7339955 bytes, checksum: 22519cc9c5e5f14e2991f1e20ddb938f (MD5) Previous issue date: 2006-06-22 / CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / The camu-camu (Myrciaria dubia (H.B.K.) McVaugh) is a native sort of the Amazonian region, whose fruit presents elevated content of ascorbic acid (vitamin C). The study of the functional genome in camu-camu fruits has like base the expressed sequence tags sequencing - ESTs. Faced with the displayed the present thesis is going to analyze and identify express genes in camu-camu fruits by means of ESTs sequencing. The total RNA was extracted from the shell-pulp. The extremity 5’sequencing' of cDNA insert was carried out so much in the Technology of the DNA Laboratory (UFAM) and in the Sequencing Platform (EMBRAPA/CENARGEN). The ESTs sequences obtained were submitted to the System Genome, program of genomic annotation that integrates analysis management programs and viewing of nucleotides sequences. It developed an efficient procedure for total RNA extraction of camu-camu fruits that enabled the obtaining of mRNAs of quality, utilized in the making of cDNAs of sizes varied (500pb to 4Kb). From the sequencing were obtained 3196 ESTs valid, being formed 1546 singletons and 358 contigs, resulting of 2586 ESTs sequences in total with similarity the sequences found in the gene bank. The analysis library clusterization revealed an index of 81% novelty and 32,54% redundancy. Around 90% of the contigs presented decrease redundancy (2-4 reads by contigs). The facts of the categorization of the proteins identified detached the posttranslational modification, protein turnover, chaperones (13,2%) category. From the hoist of the species with bigger number of ESTs with similarity the camu-camu sequences detached itself Arabidopsis thaliana with 49%. Around 10 uniques presented very high similarity (and-value 0.0) to known genes. The ESTs more abundantly express in camu-camu fruits encode to gluthatione s-transferase. They were observed around 3% sequences (97 ESTs) with decrease similarity (e-value > e-10) and 15% did not they present similarity with no contained sequence in the gene bank. They were identified 138 ESTs sequences (4,3%) that they encode molecular chaperones with prevalence of the sHSP family that represents 33% of express chaperones. ESTs related to the ascorbic acid metabolism also were identified, being nine related the synthesis and six come back for ascorbic acid conversion and recycling. ESTs related to the ripening and mechanisms of defense of the fruit also were noticeable. / O camu-camu (Myrciaria dúbia (H.B.K.) McVaugh) é uma espécie nativa da região Amazônica, cujo fruto apresenta elevado teor de ácido ascórbico (vitamina C). O estudo do genoma funcional em frutos de camu-camu tem como base o seqüenciamento de fragmentos de seqüências expressas - ESTs (Expressed Sequence Tags). Diante do exposto a presente tese pretende analisar e identificar genes expressos em frutos de camu-camu por meio de seqüenciamento de ESTs. O RNA total foi extraído a partir da casca-polpa. O seqüenciamento da extremidade 5’ de insertos de cDNA foi realizado tanto no Laboratório de Tecnologia do DNA da UFAM e como na Plataforma de Seqüenciamento da EMBRAPA/CENARGEN. As seqüências ESTs obtidas foram submetidas ao Sistema Genoma, programa de anotação genômica que integra programas de gerenciamento de análise e visualização de seqüências nucleotídicas. Os resultados obtidos foram o desenvolvimento de um procedimento eficiente para extração de RNA total de frutos de camu-camu que possibilitou a obtenção de mRNAs de qualidade, utilizados na confecção de cDNAs de tamanhos variados (500pb a 4Kb). A partir do seqüenciamento foram obtidas 3196 ESTs válidas, sendo formados 1546 singletons e 358 contigs, resultando num total de 2586 seqüências ESTs com similaridade a seqüências encontradas no banco de genes. A análise da clusterização da biblioteca revelou um índice de 81% de novidade e 33% de redundância. Cerca de 90% dos contigs apresentaram baixa redundância (2-4 reads por contigs). Os dados da categorização das proteínas identificadas destacaram a categoria modificação pós-traducional, proteína turnover, chaperonas (13,2%). A partir do levantamento das espécies com maior número de ESTs com similaridade a seqüências de camu-camu destacou-se Arabidopsis thaliana com 49%. Cerca de 10 uniques apresentaram altíssima similaridade (e-value 0.0) a genes conhecidos. Os ESTs mais abundantemente expresso em frutos de camu-camu codificam a glutationa s-transferase. Foram observados cerca de 3% de seqüências (97 ESTs) com baixa similaridade (e-value > e-1010) e 15% não apresentaram similaridade com nenhuma seqüência contida no banco de genes. Foram identificadas 138 seqüências ESTs (4,3%) que codificam chaperonas moleculares com destaque à família sHSP que representa 33% das chaperonas expressas. ESTs relacionados ao metabolismo do ácido ascórbico também foram identificados, sendo nove relacionados a síntese e seis voltados para conversão e reciclagem do ácido ascórbico. ESTs relacionados ao amadurecimento e mecanismos de defesa do fruto também foram destacados.

O Brasil é responsável por 25% da produção mundial de cana-de-açúcar (Saccharum spp.), e a importância econômica desta cultura está relacionada ao seu crescente consumo como fonte de energia e açúcar. Os programas de melhoramento genético tradicionais esbarram na complexidade do seu genoma, conseqüência de sua origem multi-espécie e poliploidia. A disponibilidade de fósforo inorgânico (Pi) nos agroecossistemas é uma das maiores limitações para o crescimento e produção vegetal, pois a absorção de Pi pelas raízes ocorre em função das oscilações de fósforo lábil no solo e contra um gradiente elétrico e de concentração. Para a produção agrícola intensiva, usam-se largamente fontes inorgânicas e orgânicas de fósforo, mas parte desse Pi não é recuperado do solo, pois cerca de 80% torna-se adsorvido ou complexado na fração orgânica, junto com resíduos de metais pesados (ex: Zn, Cd, Ni ou Cu). Os genes transportadores de baixa afinidade são expressos constitutivamente e operam sob maiores concentrações de Pi disponível. As seqüências de genes transportadores de Pi (TP) de alta afinidade já descritos (PHO84 de S. cerevisiae; PHO-5 de N. crassa; GvPT de G. versiforme; AtPT1 e AtPT2 de A. thaliana; LePT1 e LePT2 de L. esculentum; StPT1 e StPT2 de S. tuberosum) codificam uma proteína transportadora de Pi com 12 domínios transmembrana conservados. A expressão em plantas ocorre preferencialmente no sistema radicular, sob deficiência de fósforo. Utilizando as seqüências desses genes de TP descritos, identificou-se no banco de dados do genoma de cana-de-açúcar seqüências ESTs destes transportadores, destacando-se o cluster SCEQRT1028B07.g, com o cDNA completo de transportadores de fosfato de alta afinidade, cuja seqüência deduzida produziu uma proteína de 541 aminoácidos, com 12 domínios trans-membrana, característicos destes transportadores de fosfato. / Brazil is rsponsible for 25% of the world production of sugarcane (Saccharum spp.), and the economic importance of this crop is related to its increasing use as energy source and sugar. Traditional genetic breeding programs are hamperd by the genomic complexity, derived from its multi-specific origing adn polyploidy. The availability of inorganic phosphorous (Pi) in agri-ecosystems is one of the largest limiation for plant growth and yield, because Pi uptake by the roots depends on the variation of the concentration of labile phosphorous in the soil and against an eletric and concentration gradient. For intensive agriculture, inorganic and organic sources of phosphorous are largely used, but part of this Pi is not recoverd from the soil, because around 80% becomes adsorbed or complexed to the organic fraction, together with heavy metals residues (ex: Zn, Cd, Ni or Cu). Genes of low affinity phosphate transporters are constitutively expressed and work under higher concentrations of available Pi. Sequences of high affinity phosphate transporters already described (PHO84 of Saccharomyces cerevisiae; PHO-5 of Neurospora crassa; GvPT of Glomus versiforme; AtPT1 and AtPT2 of Arabidopsis thaliana; LePT1 and LePT2 of Lycopersicum esculentum; StPT1 and StPT2 of Solanum tuberosum) encoded a Pi transporter protein with 12 conserve d transmembrane domains. Their expression in plants occur preferntially ion roots under phosphorous deficiency. Using the sequences of these high affinity phosphate transporter genes, ESTs sequences with high identity were identified in the sugarcane genome project, especially the cluster SCEQRT1028B07.g, with a complete cDNA, which deducted sequence coded for a protein with 541 amino acids, and 12 transmembrane domais, typical of these transporters.