Orientador: Roberto Carvalheiro / Banca: Ricardo Vieira Ventura / Banca: Danísio Prado Munari / Abstract: The complexity of the traits that can present different genetic structures, such as polygenic or affected by genes of major effect, in addition to different heritabilities, among other factors, make the detection of QTLs challenging. Several methods have been employed with the purpose of performing genome wide association studies (GWAS), aiming the mapping of QTL. The single-step weighted GBLUP (wssGBLUP) method, for example, is an alternative to GWAS, which allows the simultaneous use of genotypic, pedigree and phenotypic information, even from non-genotyped animals. Bayesian methods are also used to perform GWAS, starting from the basic premise that the observed variance can vary at each locus with a specific priori distribution. The objective of the present study was to evaluate, through simulation, which methods, among the evaluated ones, more assist in the identification of QTLs for polygenic and major gene affected traits, presenting different heritabilities. We used the following methods: wssGBLUP, with or without additional phenotypic information from non-genotyped animals and two different weights for markers, where w1 represented the same weight (w1=1) and w2 the weight calculated according to the previous iteration process (w1); Bayes C, assuming two values for π (π = 0.99 and π = 0.999), where π is the proportion of SNPs not included in the model, and Bayesian LASSO. The results showed that for polygenic scenarios the detection power is lower and the additional us... (Complete abstract click electronic access below) / Resumo: A complexidade das características que podem apresentar diferentes estruturas de ação gênica como, por exemplo, poligênicas ou afetadas por genes de efeito maior, aliado a diferentes herdabilidades, entre outros fatores, tornam a detecção de QTLs desafiadora. Diversos métodos têm sido empregados com o intuito de realizar estudos de associação ampla do genoma (GWAS), objetivando o mapeamento de QTL. A metodologia weighted single-step GBLUP (wssGBLUP), por exemplo, é uma alternativa para a realização de GWAS, que permite o uso simultâneo de informações genotípicas, de pedigree e fenotípicas, mesmo de animais não genotipados. Métodos Bayesianos também são utilizados para a realização de GWAS, partindo da premissa básica de que a variância observada pode variar em cada locus em uma distribuição a priori específica. O objetivo do presente estudo foi avaliar, por meio de simulações, quais métodos, dentre os avaliados, mais auxiliaria na identificação de QTLs para características poligênicas e afetadas por genes de efeito maior, apresentando diferentes herdabilidades. Utilizamos os métodos: wssGBLUP, com a inclusão ou não de informação adicional fenotípica de animais não genotipados e dois distintos ponderadores para os marcadores, onde w1 representou a mesma ponderação (w1=1) e w2 a ponderação calculada de acordo com o processo de iteração anterior (w1) ; Bayes C, assumindo dois valores para π (π=0.99 and π=0.999), onde π é a proporção de SNPs não incluída no modelo, além do LASSO ... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Mestre

Diversos processos envolvidos no crescimento, desenvolvimento e adaptação a variações ambientais são regulados por vias de transdução de sinal. O projeto SUCAST (Sugarcane Signal Transduction Project) tem como objetivos a identificação e caracterização funcional dos componentes de transdução de sinais da cana-de-açúcar (Souza et al., 2001). O presente trabalho insere-se dentro do Projeto SUCAST e teve como foco a identificação de componentes de transdução de sinais, a categorização desses elementos utilizando-se ferramentas de bioinformática e a avaliação de seus perfis de expressão pela tecnologia de microarranjos de cDNA. Genes relacionados à transdução de sinais foram buscados entre as seqüências armazenadas no banco de dados SUCEST - The Sugar Cane EST Project (Vettore et al., 2003) - pela ferramenta de BLAST, o que permitiu a categorização de mais de 3.500 genes relacionados a vias de sinalização em cana-de-açúcar. A categoria de proteínas quinases foi também analisada quanto à presença de domínios conservados e classificada por agrupamento filogenético do domínio catalítico predito. Com a análise filogenética, foram obtidos seis grupos característicos para proteínas quinases e quatro grupos principais de receptores do tipo Ser/Thr quinases. Um total de 527 genes do quinoma de cana foi analisado. Os padrões de expressão de componentes do catálogo SUCAST foram avaliados em seis órgãos (raiz, flor, folha, gema lateral, primeiro e quarto entrenós), em resposta a diferentes estímulos (tratamentos com os fitormônios ácido abscísico e metiljasmonato, seca, interação com bactérias diazotróficas endofíticas, ataque por Diatraea saccharalis e deficiência em fosfato) e em populações contrastantes para acúmulo de sacarose. As análises dos dados de microarranjos mostraram 217 genes diferencialmente expressos em pelo menos um dos órgãos analisados e 153 genes considerados de expressão ubíqua. Para os experimentos de respostas a tratamentos com fitormônios e estímulos ambientais, 179 genes diferencialmente expressos em pelo menos uma das condições analisadas foram identificados. Cinqüenta e um genes mostraram-se diferencialmente expressos ao se comparar amostras (folhas +1 e entrenós em diferentes fases de maturação) de duas populações contrastantes para acúmulo de sacarose. Os perfis de expressão foram também analisados ao longo do tempo para os experimentos de deficiência em fosfato, seca e tratamentos com fitormônios, através de agrupamentos por Self-Organizing Maps (SOM). Resultados de PCR em tempo real confirmaram os dados de expressão para 72% de 25 genes selecionados para comparações entre diferentes órgãos, e 80,5% de 36 perfis de expressão selecionados para experimentos de resposta a tratamentos com hormônios e a estímulos ambientais. Adicionalmente, reações de PCR em tempo real foram realizadas para se avaliar os níveis de expressão de cinco genes selecionados em indivíduos contrastantes para acúmulo de sacarose e 57% dos resultados obtidos mostraram-se de acordo com os dados de microarranjos. Todos os dados obtidos foram integrados e compilados no banco de dados SUCAST (http://www.sucest-fun.org). O conhecimento gerado com o projeto representa um progresso significativo na compreensão da função de alguns dos genes identificados no projeto SUCEST, indicando alvos a serem explorados no programa de melhoramento da cana-de-açúcar. / A diversity of processes related to growth, development and adaptation to environmental conditions are regulated by signal transduction pathways. The SUCAST Project (Sugarcane Signal Transduction) (Souza et al., 2001) aims to identify, characterize and associate putative functions to sugarcane signal transduction components using bioinformatic tools and to evaluate their expression profiles using cDNA microarrays. BLAST searches conducted on sequences stored in the SUCEST databank - The Sugar Cane EST Project (Vettore et al., 2003) - revealed more than 3,500 putative genes related to signaling in sugarcane. The protein kinases were anaçyzed for the presence of conserved domains and classified according to a phylogenetic analysis of the predicted catalytic domain. The phylogenetic approach indicated six characteristic groups for protein kinases and four mains groups for receptor-like kinases. The expression patterns of SUCAST components were evaluated in six organs (root, flower, leaf, lateral bud, first and fourth internodes), in response to different stimuli (treatment with the phytohormones abscisic acid and methyljasmonate, drought, endophytic bacteria interaction, attack by Diatraea saccharalis and phosphate deficiency) and in sugarcane cultivars contrasting for sucrose accumulation. The tissue profiling experimenta showed 217 differentially expressed genes in at least one of the six organs analyzed and 153 genes of ubiquitous expression. A total of 179 differentially expressed genes were obtained in response to phytohormones and environmental stimuli, in at least one of the conditions analyzed were obtained. Comparisons between high and low sucrose (brix) cultivars led to the detection of 51 differentially expressed genes in at least one of the samples analyzed (leaves +1 and internodes at different maturing stages). The expression patterns were also analyzed in time-course experiments of phosphate deficiency, drought and phytohormone treatments by Self-Organizing Maps (SOM) clusterization. Quantitative PCR results confirmed 72% of the microarray expression data in sugarcane organs for 25 selected genes and 80.5% of the 36 expression profiles selected in response to phytohormones and environmental stimuli. Additionally, real-time PCR reactions were carried out to evaluate the expression levels of five genes in individuals contrasting for sucrose accumulation and 57% of the results obtained were in agreement with the microarray data. All data generated were integrated and compiled into the SUCAST databank (http://www.sucest-fun.org). The knowledge generated adds to the comprehension of the function of SUCAST components, indicating targets to be explored in the improvement of sugarcane cultivars.

O câncer colorretal é um dos tipos de tumores mais frequentes no mundo. A atual dificuldade na avaliação correta da resposta ao tratamento torna necessário o desenvolvimento de novas abordagens de detecção tumoral. Atualmente, o sequenciamento genômico em larga escala permite um estudo mais compreensivo das alterações estruturais e de sequência presentes no tumor. A aplicação destas abordagens de maneira personalizada permite o desenvolvimento de biomarcadores tumor específicos que podem facilitar a avaliação de resposta ao tratamento e a presença de doença residual, bem como revelar alterações de sequência em genes capazes de servir de novos alvos terapêuticos. Neste estudo foi desenvolvida uma metodologia eficiente para a identificação de biomarcadores baseados na existência de variações estruturais em genomas de tumores de reto, eliminando a necessidade de sequenciamento do genoma normal do mesmo paciente e diminuindo portanto o custo da abordagem. Os biomarcadores encontrados para cada um dos seis pacientes foram utilizados para avaliar a presença de doença residual após o tratamento através da detecção de DNA tumoral circulante nas amostras de plasma coletadas em momentos diferentes do tratamento. O sequenciamento em baixa cobertura personalizado é portanto uma alternativa viável e promissora para avaliar a resposta ao tratamento em pacientes com tumores de reto. Na segunda parte do estudo, a análise de linhagens celulares de tumores colorretais revelou uma grande quantidade de mutações pontuais somáticas (SNVs e InDels) em genes codificadores para proteínas de superfície celular (surfaceoma). Estas alterações no surfaceoma indicam potenciais novos alvos para drogas e vias regulatórias alteradas neste tipo de tumor. Além disso, estas mutações pontuais também são responsáveis pela geração de epítopos com potencial imunogênico e estes novos epítopos podem ser aplicados como vacinas antitumorais personalizadas e já haviam sido propostos como uma alternativa terapêutica. A presença de novos epítopos, principalmente nas linhagens com elevadas taxas de mutação (resultante da instabilidade de microssatélites e mutações em genes de reparo de DNA tipo mismatch ou POLE), sugerem também um potencial uso de drogas moduladoras do sistema imune em pacientes com tumores que apresentam estas mesmas características. Portanto, o estudo de alterações genômicas em tumores primários e linhagens de câncer colorretal permitiu a detecção de variações estruturais que foram utilizadas como biomarcadores personalizados em pacientes com tumores de reto assim como a identificação de genes contendo mutações pontuais em linhagens celulares de câncer colorretal, que revelam potenciais novos alvos terapêuticos a serem explorados na clínica / Colorectal cancer is one of the more frequent tumor types in the world. To select the appropriate treatment course, it is necessary to develop more precise diagnostic approaches. The current availability of high throughput genome sequencing methods allows for a comprehensive characterization of the structural and sequence alterations present in each tumor. The use of tumor genome sequencing in a personalized setting can result in tumor specific biomarkers that help evaluate response to treatment and the presence of residual disease, improving the clinical management of these patients, and also reveal sequence alterations in genes capable of serving as new therapeutic targets. In this study we developed an efficient bioinformatics pipeline to identify biomarkers based on the existing structural alterations in rectal tumor genomes, eliminating the need to sequence the matched normal genome and therefore reducing the cost for this approach. The biomarkers found for each of the six patients were used to evaluate the presence of residual disease after treatment through the detection of circulating tumor DNA in plasma samples collected at different points during the treatment. Sequencing tumor genomes with low coverage is therefore a viable and promising alternative to follow up rectal cancer patient\'s response to treatment. In the second part of this study, the analysis of colorectal cancer cell lines revealed a large quantity of point mutations (SNVs and InDels) in genes coding for proteins located in the cell surface (surfaceome). These alterations in the surfaceome indicate potential new drug targets and altered pathways in this type of tumor. Furthermore, these point mutations are also responsible for the generation of new epitopes with immunogenic potential and these new epitopes can be applied as personalized tumor vaccines and had previously been proposed as a therapeutic alternative. The presence of new epitopes, especially in the cell lines with elevated mutation rates (resulting from MSI and mutations in DNA mismatch-repair genes or POLE), suggests a potential use of immune checkpoint target drugs in patients with tumors that share these genetic characteristics. With a large-scale bioinformatics approach, we detected new tumor epitopes resulting from point mutations, present in most of the cell lines used. The analysis of gene expression data puts into perspective both the somatic mutations found and which targets are promising as well as the development of therapies based on vaccines derived from tumor epitopes. In conclusion, the study of genomic alterations in primary tumors and colorectal cancer cell lines allowed the detection of structural variations that were used as personalized biomarkers in patients with rectal tumors as well as the identification of genes containing point mutations in colorectal cancer cell lines, that reveal potential new therapeutic targets to be explored in the clinical setting.

Made available in DSpace on 2015-03-04T18:57:57Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao_Nayra.pdf: 2967499 bytes, checksum: a3fbc3f85195a8b2ca04057e9efda7af (MD5) Previous issue date: 2013-06-14 / The study of the diversity and microbial taxonomy is very important to better understand of the micro-organisms ecology. The microbial taxonomy has undergone important changes with the advent of genomic. Until recently the taxonomy exclusively depended of the DNA-DNA hybridization for define species and to describe new species. From the analysis of the genomic signatures (Average Amino Acid Identity (AAI) e Karlin signature) is possible to determine the similarity between microbial genomes. However, the calculations of those signatures requires time. The automation those calculations using a software was the objective of this dissertation. For develop the software was chosen, for its multiplatform characteristics, the Java language, which allows the use of the software in operational systems Windows, Linux and iOS. For develop was used Eclipse VE and batch files for integrate with Blast 2.2.25+ used for comparison of the identity between genomes. The new software performs calculations AAI and Karlin signature for multiple genomes and metagenomes in real time. It s allowed studies about the genus Mycoplasma and the species Phrochlorococcus marinus. This species comprises 10 species according to the analysis of Karlin and AAI and indicates the need for taxonomy review. The Mycoplasma genus is polyphyletic and possibly comprises different genera. This study advances the taxonomic knowledge about relevant groups in marine habitats, besides create a useful tool for analyses of genome and metagenome. / O estudo da diversidade e taxonomia microbiana é de suma importância para o melhor entendimento da ecologia de microrganismos. A taxonomia microbiana tem passado por importantes transformações com o advento da genômica. Até recentemente a taxonomia dependia exclusivamente da hibridização de DNA-DNA para determinação de espécies e descrição de espécies novas. A partir da análise de assinaturas genômicas (Identidade Média de Aminoácidos (AAI) e Assinatura de Karlin) é possível agora determinar a similaridade entre genomas microbianos. Porém, o cálculo destas assinaturas também consome tempo. A automatização destes cálculos por meio de um software foi o objetivo desta dissertação de mestrado. Para a construção do software foi escolhida a linguagem Java por sua característica multiplataforma, que permite utilização em sistemas operacionais Windows, Linux e iOS. Para o desenvolvimento foi utilizado o software Eclipse VE e arquivos batch para integração com o Blast versão 2.2.25+ utilizado para comparação de identidade entre genomas. O novo software realiza os cálculos de AAI e assinatura de Karlin para múltiplos genomas e metagenomas em tempo real. O novo software permitiu o estudo da taxonomia do gênero Mycoplasma e da espécie Phrochlorococcus marinus. De acordo com as análises da assinatura e AAI esta espécie compreenderia 10 outras espécies, o que indica a necessidade de revisão taxonômica. Já o gênero Mycoplasma é polifilético e compreende possivelmente diferentes gêneros. O presente estudo avança o conhecimento taxonômico de grupos relevantes no meio marinho, além de criar uma ferramenta útil para análise de genomas e metagenomas.

Submitted by Leticia Alvarenga (leticiaalvarenga@fdv.br) on 2018-08-30T19:09:21Z No. of bitstreams: 1 ANA PAULA RODRIGUES LUZ FARIA.pdf: 2502894 bytes, checksum: bf494b3ffb5cb0fae9332bfa03343843 (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Paula Galdino (repositorio@fdv.br) on 2018-08-31T18:36:10Z (GMT) No. of bitstreams: 1 ANA PAULA RODRIGUES LUZ FARIA.pdf: 2502894 bytes, checksum: bf494b3ffb5cb0fae9332bfa03343843 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-08-31T18:36:10Z (GMT). No. of bitstreams: 1 ANA PAULA RODRIGUES LUZ FARIA.pdf: 2502894 bytes, checksum: bf494b3ffb5cb0fae9332bfa03343843 (MD5) Previous issue date: 2015-12-18 / No campo da saúde do trabalhador, é crescente o interesse na adoção de testes genéticos preditivos. Concomitantemente, resultados de exames genéticos têm sido utilizados com finalidades discriminatórias, práticas que muitas vezes surgem encobertas e justificadas pelo discurso da prevenção de riscos e da segurança. Tendo como referencial teórico a Bioética da Libertação na perspectiva de Enrique Dussel, o estudo introduz criticamente o cenário dos paradoxos produzidos pela Genética, do benefício/malefício de seus possíveis impactos nas relações de trabalho. Através da Ética da Libertação dusseliana, evidencia-se como o meio ambiente do trabalho se vê imerso numa produção discursiva colonial, que é constantemente mobilizada para produção de subjetividades visando encobrir processos de exploração do corpo do trabalhador, voltada à obtenção da maior produtividade e do maior lucro. Esses interesses que sempre estiveram presentes no ambiente laboral e que vão se remodelando e adequando a cada contexto sócioeconômico surgem potencializados, na era da Genética, diante da possibilidade de instituição de uma nova categoria de indivíduos: a categoria dos “excluídos genéticos”, dos “incontratáveis”. O que se vê é que a proibição total, sem qualquer exceção, ou a regra da permissão total dos testes genéticos preditivos são dois caminhos dicotômicos que não atendem aos legítimos anseios e interesses dos envolvidos, não respeitam o direito humano ao desenvolvimento e à pesquisa científica, tampouco são condizentes com o dever de promoção e proteção da saúde do trabalhador. No desenvolvimento do estudo, em que foram apresentados os principais marcos regulatórios bioéticos e jurídicos sobre a temática, a partir da análise crítica situada da potencialidade de utilização do mapeamento genético preditivo como instrumento de controle do trabalhador e de violação de seus direitos, parte-se à proposição de limites à adoção desses testes. O encontro do genoma com a Bioética da Libertação e o trabalho humano é um tema desafiante, estando intimamente relacionado à produção, reprodução e desenvolvimento da vida humana em sua plenitude. / In the field of worker health there is a growing interest in the use of predictive genetic testing. Concomitantly, the results from these genetic tests have been used for discriminatory purposes, practices which many times come about under the guise of and justified by the discourse of risk prevention and safety. Using as a theoretical guide the Bioethics of Liberation as understood by Enrique Dussel, we critically look at the paradoxes produced by genetics, the benefits/harms of its possible impact on labor relations. From this starting point of Dusselian ethics of liberation, we note how the work environment is immersed in the production of a colonial discourse which is constantly mobilized to produce subjectivities that seek to cover up the exploitation of the worker’s body in order to obtain greater productivity and greater profit. These interests, which have always been present in the work environment and which remodel and adapt themselves to every socioeconomic context, are potentialized during the era of genetics with the possibility of the creation of a new category of individuals: the category of the “genetically excluded,” of the “unhireables.” What we see is that total prohibition without exceptions, or total permission for predictive genetic testing, are dichotomous alternatives that do not meet the legitimate concerns and interests of those involved, do not respect the human right of development and scientific research, and also are not befitting of the duty to promote and protect the health of the worker. In the development of this study, we present the main bioethical and legal regulations related to predictive genetic mapping as an instrument of controlling the worker and violating his/her rights, and then propose limits to the use of these tests. The coming together of the genome with bioethics of liberation and human labor is a challenging subject, being intimately related to production, reproduction, and the full development of human life.

Made available in DSpace on 2019-03-29T23:34:38Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2012-08-31 / Advances in biological research, especially in genetics, have a direct influence on medicine. The development of these surveys, especially those under the Human Genome Project, allows man can not only cure or prevent diseases through curative and preventive medicines, but also predict the disease, creating a predictive medicine, which generates information that may be used positively or negatively, with important repercussions in the legal universe. This study, entitled "Discrimination on grounds genetic" examines the consequences of using the so-called predictive medicine, having been developed through a literature review, aiming to identify the rights that may be effected by applying positive knowledge of human genetic data and rights that may be injured due to poor enforcement, seeking legal alternatives within the current legal system. Keywords: Genetic Discrimination, the Human Genome Project; Predictive Medicine; Biological determinism; Privacy genetics; Eugenia. / Os avanços das pesquisas biológicas, em especial da genética, têm influência direta na medicina. O desenvolvimento dessas pesquisas, principalmente as desenvolvidas no âmbito do Projeto Genoma Humano, permite que o homem possa não apenas curar ou prevenir doenças através das medicinas curativa e preventiva, mas também prever as doenças, criando a medicina preditiva, que gera informações que podem ser utilizadas de forma positiva ou negativa, com importantes repercussões no campo jurídico. O presente trabalho, intitulado O Papel dos Direitos de Personalidade no combate à Discriminação por Motivos Genéticos analisa as consequências da utilização da chamada medicina preditiva, tendo sido desenvolvido através de pesquisa bibliográfica, tendo como objetivos identificar os direitos que possam ser efetivados através da aplicação positiva do conhecimento dos dados genéticos humanos e os direitos que possam ser feridos em decorrência de sua má aplicação, buscando alternativas jurídicas dentro do ordenamento jurídico vigente. Palavras - chave: Discriminação genética; Projeto Genoma Humano; Medicina preditiva; Determinismo biológico; Privacidade genética; Eugenia.

A tecnologia de sequenciamento de nova geração (next-generation sequencing – NGS) e suas aplicações tem sido cada vez mais utilizada na prática médica para elucidar a base molecular de doenças Mendelianas. Embora seja uma poderosa ferramenta de pesquisa, ainda existe uma importante transição quanto à análise dos dados entre as tecnologias tradicionais de sequenciamento e o NGS. A primeira parte deste trabalho aborda aspectos analíticos envolvidos nesta mudança, com foco na plataforma Ion Torrent Personal Genome Machine. Esta é uma plataforma amplamente utilizada para sequenciar painéis de genes, já que esta aplicação requer menor rendimento de dados. Este trabalho demonstra indicadores adequados para avaliar a qualidade de corridas de sequenciamento e também uma estratégia baseada em valores de profundidade de cobertura para avaliar a performance de amplicons em diferentes cenários. Por outro lado, o NGS permitiu a realização de estudos populacionais em larga escala que estão mudando nossa compreensão sobre as variações genéticas humanas. Um desses exemplos são as mutações até então chamadas de silenciosas, que estão sendo implicadas como causadoras de doenças humanas. A segunda parte deste trabalho investiga a patogenicidade de polimorfismos de núcleotídeo único sinônimos (synonymous single nucleotide polymorphisms – sSNP) baseado em dados públicos obtidos do Exome Aggregation Consortium (ExAC) (exac.broadinstitute.org/) utilizando o software Silent Variant Analysis (SilVA) (compbio.cs.toronto.edu/silva/) e outros recursos para reunir informações adicionais sobre consequências funcionais visando fornecer um panorama dos efeitos patogênicos de sSNP em mais de 60.000 exomas humanos. Nós demonstramos que de 1,691,045 variantes sinônimas, um total de 26,034 foram classificadas como patogênicas pelo SilVA, com frequência alélica menor que 0,05. Análises funcionais in silico revelaram que as variantes sinônimas patogênicas estão envolvidas em processos biológicos importantes, como regulação celular, metabolismo e transporte. Ao expor um cenário de variações sinônimas patogênicas em exomas humanos, nós concluímos que filtrar sSNP em workflows de priorização é razoável, no entanto em situações específicas os sSNP podem ser considerados. Pesquisas futuras neste campo poderão fornecer uma imagem clara do papel de tais variações em doenças genéticas. / Next-generation sequencing (NGS) technologies and its applications are increasingly used in medicine to elucidate the molecular basis of Mendelian diseases. Although it is a powerful research tool, there is still an important transition regarding data analysis between traditional sequencing techniques and NGS. The first part of this work addresses analytical aspects involved on this switch-over, focusing on the Ion Torrent Personal Genome Machine platform. This is a widely used platform for sequencing gene panels, as this application demands lower throughput of data. We present indicators suitable to evaluate quality of sequencing runs and also a strategy based on depth of coverage values to evaluate amplicon performance on different scenarios. On the other hand, NGS enabled large-scale population studies that are changing our understanding about human genetic variations. One of these examples are the so-called silent mutations, that are being implied as causative of human diseases. The second part of this work investigates the pathogenicity of synonymous single nucleotide polymorphisms (sSNP) based on public data obtained from the Exome Aggregation Consortium (ExAC) (exac.broadinstitute.org/) using the software Silent Variant Analysis (SilVA) (compbio.cs.toronto.edu/silva/) and other sources to gather additional information about affected protein domains, mRNA folding and functional consequences aiming to provide a landscape of harmfulness of sSNP on more than 60,000 human exomes. We show that from 1,691,045 synonymous variants a total of 26,034 were classified as pathogenic and by SilVA, with allele frequency lower than 0.05. In silico functional analysis revealed that pathogenic synonymous variants found are involved in important biological process, such as cellular regulation, metabolism and transport. By exposing a scenario of pathogenic synonymous variants on human exomes we conclude that filtering out sSNP on prioritization workflows is reasonable, although in some specific cases sSNP should be considered. Future research on this field will provide a clear picture of such variations on genetic diseases.

O alfaherpesvírus bubalino 1 (BuHV1) e os alfaherpesvírus bovinos 1 (BoHV1), 5 (BoHV5) e são membros da ordem Herpesvirales, família Herpesviridae, subfamília Alphaherpesvirinae, gênero Varicellovirus. O BoHV1 e o BoHV5 são subdivididos em subtipos (BoHV1.1, 1.2a, 1.2b; BoHV5a, b, c). No Brasil circulam BoHV1 e BoHV5 de todos os subtipos até o presente reconhecidos. Em vista dessa variedade de alfaherpesvírus potencialmente infecciosos para bovinos e bubalinos, o conhecimento sobre estes agentes é essencial para a implementação de medidas de controle ou erradicação. Com o objetivo de permitir algumas comparações entre estes agentes e as respostas por eles induzidas em seus hospedeiros, primeiramente foi realizado o sequenciamento do genoma completo de uma amostra de BuHV1 (b6), isolada a partir de prepúcio de búfalos (Bubalus bubalis) em 1972, na Austrália. O objetivo foi disponibilizar a primeira sequência completa de um alfaherpesvírus bubalino e avaliar o grau de similaridade entre o genoma desse vírus e os alfaherpesvírus de bovinos. O genoma sequenciado compreende 137.452 pares de bases (pb), com um nível de similaridade nucleotídica de 92,2% com BoHV5 (SV507/99) e 76,7% com BoHV1 (NVSL). Estes resultados permitirão estudos futuros buscando reconstruir a história evolutiva destes vírus, a importância de infecções interespécies na geração de variantes destes agentes e possíveis associações entre tais infecções e patogenicidade. Na segunda etapa dos estudos, foram realizados diversos testes sorológicos buscando definir uma metodologia de diagnóstico adequada para a identificação de anticorpos contra BuHV1 e todos os diferentes subtipos de BoHV1 e BoHV5. Inicialmente, 600 amostras de soros de bovinos de campo foram testadas através do teste de soroneutralização (SN), realizada frente aos sete alfaherpesvírus em estudo. Os resultados da SN foram influenciados pela escolha do vírus desafio utilizado no ensaio. Para obter a sensibilidade máxima do teste (259/600), foi necessário combinar resultados positivos frente a pelo menos cinco diferentes amostras virais. Em seguida, foram preparados ensaios do tipo “ELISA” para detecção de anticorpos utilizando antígenos preparados com cada um dos diferentes tipos/subtipos desses vírus (BuHV1; BoHV1.1, 1.2a, 1.2b; BoHV5a, b, c), individualmente (chamado “single ELISA” ou “sAgELISA”). Os resultados obtidos foram comparados com os resultados da soroneutralização (SN). A sensibilidade do sAgELISA variou significativamente conforme a amostra viral utilizada no preparo dos antígenos. Considerando os resultados frente a apenas um antígeno, a maior sensibilidade foi de 96,1% (249/259), obtida com apenas uma amostra de BoHV5c. Foram necessários pelo menos seis antígenos (BuHV1; BoHV1.2a, 1.2b; BoHV5a, b, c) para atingir a sensibilidade máxima do teste (263/259). Assim, foi desenvolvido um ELISA combinando vários antígenos em um mesmo teste (chamado “multiple ELISA” ou “mAgELISA”). O mAgELISA detectou 263 amostras positivas, resultando em uma concordância ótima entre sAgELISA e mAgELISA (κ=0,99). Frente a SN, o mAgELISA apresentou uma sensibilidade de 96,5% e especificidade de 96,1% (κ=0,93; VPP=95,0%; VPN=97,3%). Essas diferenças não foram estatisticamente significativas. Os resultados obtidos com a SN e mAgELISA foram comparados também a um ELISA comercial para a detecção de anticorpos contra BoHV1. O ELISA comercial utilizado nas comparações não apresentou resultados significativamente diferentes dos demais testes realizados, no entanto, revelou o maior número de resultados discrepantes em relação ao SN, considerado padrão-ouro. Estes resultados revelam que o mAgELISA aqui relatado é adequado para a detecção de anticorpos para BuHV1, BoHV1 e BoHV5, com sensibilidade e especificidade significativamente comparáveis às da SN. / Bubaline alphaherpesvirus 1 (BuHV1), Bovine alphaherpesviruses 1 (BoHV1) and 5 (BoHV5) are members of the order Herpesvirales family Herpesviridae, subfamily Alphaherpesvirinae, genus Varicellovirus. The BoHV1 and BoHV5 are divided into subtypes (BoHV1.1, 1.2a, 1.2b; BoHV5a, b, c). In Brazil, circulates BoHV 1 and BoHV 5 from all subtypes known to the present. In view of this variety of potentially infectious alphaherpesviruses for bovines and buffaloes, knowledge about these agents is essential for the implementation of control or eradication measures. In order to gain a deeper understanding about these agents and the responses induced by them in their hosts, initially, the complete genome sequence of BuHV1-b6, one of the first BuHV1 viruses isolated in Australia in 1972, is reported. The objective was to provide the first complete sequence of a buffalo alphaherpesvirus and to evaluate the degree of similarity between BuHV1 and bovine alphaherpesviruses genomes. The BuHV1-b6 genome is a linear double-stranded DNA molecule, 137,452 bp long, with overall sequence of the 92.2% similarity at the nucleotide level to the reference BoHV5 (SV507/99) strain and 76.7% with BoHV1 (NVSL) strain. These results are expected to be valuable for further studies involving evolutionary chain of these viruses, the interspecies infections importance in generation of variants and possible associations between such infections and pathogenicity. In the second stage of the study, several serological tests were performed in order to define a appropriate diagnostic methodology for the identification of antibodies against BuHV1 and all different subtypes of BoHV1 and BoHV5. Initially, 600 bovine field serum samples were screened in serum neutralization tests (SN) performed against all seven virus types/subtypes. The SN results were influenced by the choice of the challenge virus. The maximum number of positive sera (259/600) was detected by adding the positive results obtained with at least five different viruses. Seven enzyme linked immunoassays were prepared with each of the seven antigens (BuHV1; BoHV1.1, 1.2a, 1.2b; BoHV5a, b, c), individually (single antigen ELISAs; sAgELISAs). The results obtained were compared to the SN. The sensitivity of the sAgELISAs was also influenced by the choice of antigen. Considering the results against only one of them, the best sensitivity was 96.1% (249/259), obtained with BoHV5c. Maximum sAgELISA sensitivity (263/259) was achieved when positive results of at least six viruses (BuHV1; BoHV1.2a, 1.2b; BoHV5a, b, c) were combined. A multiple antigen ELISA (mAgELISA) was then prepared by combining of different viral antigens in the same test. The mAgELISA detected 263 positive samples, resulting an optimum concordance between sAgELISA and mAgELISA (κ=0.99). When compared to SN, the mAgELISA revealed 96.5% sensitivity and 96.1% specificity (κ=0.93; PPV=95.0%; NPV=97.3%). These differences were not statistically significant. The results of both SN and mAgELISA were compared to a commercially available (IBRgB) ELISA. The results of the commercial ELISA did not vary significantly in relation to others tests performed, however, revealed the highest number of discrepant results in relation to SN, taken as the gold standard. These results reveal that the mAgELISA reported here is suitable for the detection of antibodies to BuHV1, BoHV1 and BoHV5 with sensitivity and specificity significantly comparable to those of SN.

A citricultura é de extrema importância para a economia do Estado de São Paulo. O cancro cítrico, causado pela bactéria Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac), é um grave problema nesse setor, causando inúmeros prejuízos à produção de frutos e seus derivados. Nosso objetivo principal foi o estudo das interações proteína-proteína que ocorrem em Xac. Com este intuito, utilizamos como principal ferramenta, o sistema duplo-híbrido em leveduras, baseado nos domínios ativador e de ligação da proteína Gal4. Estivemos particularmente interessados em proteínas pertencentes aos Sistemas de dois-componentes, devido à sua importância em mecanismos de sinalização celular. A complexidade desses sistemas tornou a análise genômica comparativa de grande valor para estudos das vias de sinalização que podem levar a bactéria a colonizar o hospedeiro. Xac possui 37 histidina cinases (HKs) e 60 reguladores de resposta (RRs) além de 21 proteínas híbridas contendo ambos os domínios. Nossos resultados mostraram interações específicas entre várias proteínas desse sistema dentre as quais destacamos algumas HKs e seus RRs cognatos: XAC0135 e XAC0136, XAC0620 e XAC0621, XAC0683 e XAC0684, XAC0759 e XAC0760, além de interações entre XAC1669 e XAC1670 e XAC1669 e XAC1282, estas últimas possivelmente envolvidas em quimiotaxia. Outro foco de nosso trabalho foi a identificação de interações entre proteínas com similaridade aos componentes do Sistema de Secreção do Tipo IV (T4SS), envolvido em processos de conjugação e secreção em bactérias. Xac possui dois loci vir que codificam proteínas com similaridade aos componentes do T4SS, um localizado no plasmídeo e outro localizado no cromossomo. Identificamos novas interações entre proteínas hipotéticas adjacentes a esse locus no plasmídeo: XACb0018 e XACb0019 e interações entre VirB8 e VirB9 e VirB9 e XAC2610, estas últimas codificadas por genes presentes no cromossomo. Apesar da importância de alguns T4SSs na secreção de proteínas patogênicas em bactérias, verificamos que o nocaute da proteína VirD4, codificada pelo gene XAC2623 apresentou fenótipo de virulência alterado em apenas um, dos cinco clones infiltrados em folhas de laranja pêra. O nocaute da proteína VirB4 do T4SS plasmidial não apresentou alteração na virulência de Xac, quando infiltrado em folhas de laranja e limão cravo, corroborando a hipótese de o T4SS codificado pelo plasmídeo não estar envolvido em virulência, mas sim em processos conjugativos. Outro sistema secretório importante em bactérias é o Sistema de Secreção do Tipo III (T3SS). Em Xac, o T3SS é o responsável pela secreção de fatores patogênicos, entre eles a proteína HpaA e a proteína de avirulência PthA. Com esse intuito, estudamos possíveis alvos dessas proteínas em Citrus sinensis. Identificamos interações de PthA com a alfa-importina, corroborando dados da literatura que mostram que PthA é importada para o núcleo. Além disso, identificamos três proteínas que interagiram com HpaA, dentre elas, destacamos uma proteína dedo de zinco com domínio “RING C3HC4" característico de E3 ubiquitina-ligases. Isto sugere que HpaA interfere na degradação de proteínas do hospedeiro através do complexo ubiquitina/proteossomo, um processo que pode contribuir para a sobrevivência de Xac nos tecidos de plantas infectadas. / Citriculture is an important sector of the economy of the State of São Paulo. Citrus canker, caused by Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac), is a devastating disease responsible for large losses to Agroindustry every year. In this work, we used the yeast two-hybrid system to study protein-protein interactions that occur in Xac. We were particularly interested in proteins of two-component systems, due to their importance in cell signaling. The complexity of these systems makes genomic analysis an important tool in the study of signalling pathways that allow bacteria to infect the host. Xac has 37 histidine kinases (HK) and 60 response regulators (RR), besides 21 hybrid proteins with both domains. We detected specific interactions between several proteins that belong to this system, notably the following HKs and their cognate RRs: XAC0135 and XAC0136, XAC0620 and XAC0621, XAC0683 and XAC0684, XAC0759 and XAC0760, besides XAC1669 and XAC1670 and XAC1669 and XAC1282, the later possibly involved in bacterial chemotaxis. We were also interested in studying interactions between proteins that make up the Type IV Secretion System (T4SS), involved in bacterial conjugation and protein secretion. Xac has two loci vir, which code for proteins with sequence similarity to T4SS components, one in the plasmid and the other in the chromosome. We identified new interactions between hypothetical proteins adjacent to this locus in the plasmid (XACb0018 and XACb0019) and between VirB8 and VirB9 and VirB9 and XAC2610, coded within the chromosomal locus. Despite the importance of T4SS in the pathogenesis of bacteria, a chromosomal VirD4 knockout strain presented alterated virulence in only one out of five mutants tested in the leaves of Citrus sinensis. Plasmidial VirB4 knockout strains did not present any alteration in Xac virulence when tested in Citrus sinensis or Citrus limonia, consistent with the hypothesis that the T4SS coded by the plasmid is not involved virulence, but in bacterial conjugation. Another secretory system involved in bacterial pathogenesis is the Type III Secretion System (T3SS), responsible for secretion of pathogenic factors like HpaA protein and the avirulence protein PthA. We investigated possible targets for these proteins using a Citrus sinensis cDNA library. We identified interactions between PthA and importin alpha, corroborating previous data that suggest PthA translocation to the host cell nucleus. We also identified three proteins which interacted with HpaA. One of them is a zinc finger protein containing the “RING C3HC4" domain characteristic of E3 ubiquitin-ligases. This suggests that HpaA interferes in the ubiquitin/proteasome-dependent degradation of host target proteins, a process that may contribute towards Xac survival in host tissues.

Até o momento nenhuma espécie daninha de importância agrícola tinha sido sequenciada no Brasil, dessa forma o arroz vermelho oferece uma oportunidade ímpar para isso, podendo levar a um melhor entendimento do seu genoma e facilitar o desenvolvimento de estratégias mais eficientes de controle destas plantas em condições de campo. Sendo assim, o objetivo deste trabalho foi sequenciar o genoma de dois genótipos de arroz vermelho coletados no estado do Rio Grande do Sul, e que possuem degrane elevado (AV60) intermediário (AV53), bem como realizar uma análise estrutural dos genes relacionados a este caráter. Vários programas montadores foram comparados e o Abbys foi o que gerou o maior número de scaffolds, totalizado um tamanho de genoma de 391,7 e 390,2 megabases, respectivamente para os genótipos AV53 e AV60, o que representa cerca de 90% do genoma referência do arroz. A cobertura do sequenciamento foi de 36.6 X e 32.1 X respectivamente para os mesmos genótipos. A análise estrutural de seis principais genes relacionados ao degrane relevou que a composição gênica é similar entre os genótipos analisados, corroborando com resultados de estudos anteriores. Um grande número de variantes genômicos foi descoberto (SNPs e INDELs). O alinhamento dos genótipos com o genoma de referênciaOryza sativa ssp. indica revelou relativamente menor número de variantes, com frequência de um SNP a cada 264 pb. Por outro lado, o alinhamento contra o genoma referência de Oryza sativa ssp. japonica gerou uma frequência média de 1 SNP a cada 154pb, sendo que a mesma tendência foi observada para os INDELs. A menor frequência de SNPs e INDELs no primeiro alinhamento sugere maior similaridade entre as espécies alinhadas, indicando que o arroz vermelho do sul do Brasil é provavelmente originário da espécieOryza sativa spp indica. / So far no weed species of agricultural importance had been sequenced in Brazil, thus weedy red rice provided a unique opportunity for it, leading to a better understanding of genomic and facilitating the development of more effective strategies to control these plants under field conditions. The objective of this study was sequencing the genome of two weedy red rice genotypes found in the Rio Grande do Sul state, which present high (AV60) and intermediate (AV53) degree of shattering,and perform a structural analysis of the genes related to this trait. Several genome assemblers programs were compared, and Abbys was the one that generated the highest number of scaffolds, totalizing a genome size of 391.7 and 390.2 Mb, respectively for AV53 and AV60 genotypes, which represent about 90% of the rice reference genome. The sequencing coverage was 32.1 and 36.6X respectively for the same genotypes. The structural analysis of 6 key genes related to seed shattering revealed that its genetic composition is similar among the genotypes analyzed, confirming results from previous studies. A large number of genomic variants (SNPs and INDELs) were discovered. The alignment of AV53, and AV60 with the Oryza sativa ssp. indica reference genome showed relatively lower number of variants, with a frequency of 1 SNP every 220 bp, whereas the alignment with the Oryza sativa spp. japonica yielded an average frequency of 1 SNP every 154pb; the same trend was observed for INDELS. The lower frequency of SNPs and INDELS in the first alignment suggests greater similarity between the aligned species, indicating that the origin of weedy red rice in southern Brazil is most likely from the Oryza sativa spp indica.