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La diversité morphologique des muscles squelettiques permet la précision et la coordination des mouvements propres à chaque espèce animale. L'établissement du patron musculaire a lieu au cours du développement embryonnaire durant le processus de myogenèse. Il a été décomposé en quatre étapes chez la drosophile : la spécification de groupes de myoblastes équivalents (groupes promusculaires) à des positions précises du mésoderme, la sélection d'une ou plusieurs cellules progéniteurs à partir de chaque groupe, la division asymétrique des progéniteurs en cellules fondatrices des muscles, et enfin, la fusion d'une cellule fondatrice avec un nombre défini de myoblastes compétents pour la fusion qui forme une myofibre syncytiale. Ce processus aboutit à la mise en place d'un patron stéréotypé de muscles morphologiquement distincts par leur taille, orientation, forme, et sites d'attachement au squelette ; ces caractères définissant l'identité du muscle. Chez la drosophile, chacun des 30 muscles par hémisegment de la larve est constitué d'une seule myofibre. Il a été proposé que l'identité morphologique de cette fibre soit contrôlée par une combinatoire de facteurs de transcription identitaires (FTi) exprimés par la cellule fondatrice. Mon projet de thèse a porté sur le contrôle transcriptionnel de l'identité musculaire, avec comme modèle d'étude, un muscle dorso-latéral de la larve de drosophile, le muscle DA3 dont un FTi est Collier/EBF (Col). La transcription de col est activée dans un groupe promusculaire, puis transitoirement dans les quatre progéniteurs issus de ce groupe, avant d'être maintenue spécifiquement dans la myofibre DA3. Dans des embryons mutants pour col, le DA3 est transformé en muscle plus dorsal, DA2. Les travaux précédents de l'équipe ont montré que la transcription de col dans le lignage DA3 est contrôlée par deux modules cis-régulateurs, EarlyCRM et LateCRM, séparés physiquement sur le chromosome et agissant séquentiellement. Leur chevauchement temporel d'activité restreint au progéniteur DA3 et l'autorégulation directe du LateCRM ont mené à l'hypothèse d'un mécanisme de " passage de témoin " entre ces deux CRM, spécifique au progéniteur DA3. L'objectif de ma thèse était de tester cette hypothèse et de comprendre comment une information temporelle et spatiale intégrée par un CRM est transmise à un autre CRM, pour définir une identité cellulaire, une question fondamentale au-delà du cas d'espèce que constitue le muscle DA3.[...] / The morphological diversity of skeletal muscles allows the precision and coordination of movements specific to each animal species. Establishment of a stereotypic pattern of muscles takes places during the process of myogenesis. Studies in Drosophila, an insect model, have identified four steps in this process: the specification of equivalence groups of myoblasts (promuscular clusters) at defined positions within the somatic mesoderm, the selection of progenitor(s) from each group, asymmetric division of each progenitor into post-mitotic muscle founder cells, and finally the fusion of each founder cell with a given number of fusion competent cells to form a syncytial myofiber. This dynamic, integrated process leads to establishing a stereotyped pattern of morphologically distinct muscles which can each be distinguished, based on size, orientation, shape, sites of attachment to the skeleton, all properties defining muscle identity. In the Drosophila larva, each of the about 30 different muscles per hemisegment is made of a single myofiber. It has been proposed that final morphology of a myofiber reflects the combinatorial code of identity Transcription Factors (iTF) expressed by its founder cell, although many questions remain unanswered. My thesis project aimed at better understanding the mechanism of specification of muscle identity, using as model a dorso-lateral muscle of the Drosophila larva, the DA3 muscle whose identity is controlled by the Collier/EBF (Col) iTF. col transcription is activated in one promuscular cluster, transient in the 4 progenitors issued from this cluster and stably maintained in the DA3 myofiber. In col mutant embryos, the DA3 muscle is transformed into a more dorsal, DA2-like muscle. Previous work has shown that col transcription in the DA3 lineage is controlled by two cis-regulatory modules (EarlyCRM and LateCRM), physically distant on the chromosome and acting sequentially. The temporal overlap of EarlyCRM and LateCRM in the DA3 progenitor and direct col autoregulation via the LateCRM led to hypothesize a handover between the two CRM in the DA3 progenitor. One goal of my thesis project was to challenge this hypothesis and understand how positional and temporal information integrated by EarlyCRM could be memorized via LateCRM, in order to specify cell identity, a fundamental question of developmental biology beyond the specific case of the Drosophila DA3 muscle. [...]

L’édition du génome utilisant CRISPR/Cas9 est récemment apparue comme une stratégie thérapeutique potentielle des maladies génétiques. Pour les mutations dominantes de type gain de fonction, la correction allèle-spécifique pourrait être l'approche la plus appropriée. Ici, nous avons testé l'inactivation ou la correction d'une mutation hétérozygote du gène de la dynamine 2 (DNM2) causant la forme autosomique dominante de la myopathie centronucléaire (CNM). Des ARN-guides tronqués ciblant spécifiquement l'allèle muté ont été testés sur des cellules de patients et des myoblastes d'un modèle murin. L'allèle muté a été ciblé avec succès et des clones ont été obtenus avec inactivation ou correction précise du génome. Les myoblastes Dnm2R465W/+ ont montré une altération de l'endocytose et de l'autophagie. L'inactivation ou la correction allèle-spécifique a normalisé ces phénotypes. L'allèle muté a également été ciblé avec succès dans les muscles de la souris Dnm2R465W/+. Ces résultats illustrent le potentiel de CRISPR/Cas9 à cibler et corriger de manière allèle-spécifique les mutations ponctuelles hétérozygotes de type de gain de fonction. / Genome editing with the CRISPR/Cas9 technology has emerged recently as a potential strategy for therapy in genetic diseases. For dominant mutations linked to gain-of-function effects, allele-specific correction may be the most suitable approach. Here we tested allele-specific inactivation or correction of a heterozygous mutation in the Dynamin 2 (DNM2) gene causing the autosomal dominant form of centronuclear myopathies (CNM). Truncated single guide RNAs targeting specifically the mutated allele were tested on cells derived from a mouse model and patients. The mutated allele was successfully targeted in patient fibroblasts and Dnm2R465W/+ mouse myoblasts, and clones were obtained with both precise genome correction or inactivation. Dnm2R465W/+ myoblasts showed an alteration in transferrin uptake and autophagy. Specific inactivation or correction of the mutated allele rescued these phenotypes. The mutated allele was also successfully targeted in Dnm2R465W/+ mouse muscles. These findings illustrate the potential of CRISPR/Cas9 to target and correct heterozygous point mutations leading to a gain-of-function effect in an allele-specific manner.

L’amélioration génétique du blé tendre (Triticum aestivum L.), une des trois céréales les plus cultivées, représente un intérêt stratégique pour la sécurité alimentaire de la population mondiale. Cette amélioration génétique va nécessiter une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires et physiologiques mis en jeu, et va aussi réclamer une efficacité accrue dans notre capacité à intervenir finement sur le génome. Les avancées majeures réalisées dans le domaine des biotechnologies ces dernières années permettent d’envisager de nouveaux champs d’action pour appréhender le fonctionnement des caractères d’intérêt agronomique du blé tendre, ainsi que pour son amélioration génétique, et fournissent également de nouveaux outils pour innover dans le domaine de l’édition des génomes. Nous avons cherché dans le cadre de cette thèse à développer des innovations chez blé tendre à partir de trois nouveaux outils issus des biotechnologies. Nous avons tout d’abord montré que l’extinction du gène pds par une stratégie de micro ARN artificiel à partir d’un micro ARN de riz permettait d’obtenir le phénotype attendu, et que l’expression du micro ARN artificiel était reliée à ce phénotype. Nous avons commencé à explorer la possibilité d’utiliser des microARN de blé pour réaliser la même extinction, sans résultat pour l’instant. Nous avons ensuite montré que des coupures spécifiques d’une séquence donnée peuvent être obtenues in vivo chez le blé tendre à l’aide d’une méganucléase, et que lorsque les sites de coupure encadrent une séquence donnée, une délétion du fragment encadré peut être obtenue. Nous avons enfin réalisé les premiers essais du système CRISPR-Cas9 au laboratoire et généré une lignée exprimant le transgène Cas9 de façon constitutive. Des résultats inattendus obtenus dans le cadre de ces expérimentations nous ont de plus permis d’améliorer le procédé de transformation génétique du blé tendre utilisé au laboratoire. Les applications de nos résultats pourront être utilisées pour des expérimentations de validation de gènes et de compréhension des mécanismes moléculaires associés, mais aussi à l’avenir pour intervenir directement et de plus en plus finement sur le génome du blé. Les choix stratégiques en termes de développement technologique et d’innovation dans le domaine des biotechnologies et dans le cadre des objectifs d’un laboratoire public sont discutés. / The genetic improvement of common wheat (Triticum aestivum L.), one of the three most cultivated cereals, is of strategic interest to the food security of the world's population. This genetic improvement will require a better understanding of the molecular and physiological mechanisms involved, and will also require increased efficiency in our ability to modify finely the genome. In recent years, the major advances in biotechnology have made it possible to envisage new fields of action for a deeply understanding of agronomic traits of wheat as well as for genetic improvement, and also provide new tools for innovate in the field of genome editing. In this PhD manuscript, we sought to develop innovations for wheat improvement using three new biotechnology tools. We first demonstrated that the extinction of the pds gene by a strategy of artificial micro RNA succeeded in the obtaining of the expected phenotype and that the expression of the artificial RNA was related to this phenotype. We have begun to explore the possibility of using wheat microRNAs to achieve the same extinction, with no results at this time. We have then shown that specific cuts of a given sequence can be obtained in vivo in wheat using a meganuclease, and that when the cleavage sites frame a given sequence a deletion of the framed fragment may be obtained. We finally carried out the first tests of the CRISPR-Cas9 system in the laboratory and generated a line expressing the Cas9 transgene constitutively. Unexpected results obtained during these experiments have also made it possible to improve the process of genetic transformation of soft wheat used in the laboratory. The applications of our results can be used for gene validation experiments and a better understanding of the molecular mechanisms involved, but also in the future for wheat genome editing. Strategic choices in terms of technological development and innovation in the field of biotechnology and within the framework of the objectives of a public laboratory are discussed.

Les nucléases programmables et site-spécifiques comme CRISPR-Cas9 sont des signes avant-coureurs d’une nouvelle révolution en génie génétique et portent en germe un espoir de modification radicale de la santé humaine. Le « multiplexing » ou la capacité d’introduire plusieurs modifications simultanées dans le génome sera particulièrement utile en recherche tant fondamentale qu’appliquée. Ce nouvel outil sera susceptible de sonder les fonctions physiopathologiques de circuits génétiques complexes et de développer de meilleures thérapies cellulaires ou traitements antiviraux. En repoussant les limites du génie génétique, il sera possible d’envisager la réécriture et la conception de génomes mammifères. Le développement de notre capacité à modifier profondément le génome pourrait permettre la création de cellules résistantes aux cancers, aux virus ou même au vieillissement ; le développement de cellules ou tissus transplantables compatibles entre donneurs et receveurs ; et pourrait même rendre possible la résurrection d’espèces animales éteintes. Dans ce projet de recherche doctoral, nous présentons l’état de l’art du génie génétique « multiplex », les limites actuelles et les perspectives d’améliorations. Nous tirons profit de ces connaissances ainsi que de l’abondance des éléments transposables de notre ADN afin de construire une plateforme d’optimisation et de développement de nouveaux outils de génie génétique qui autorisent l’édition génomique à grande échelle. Nous démontrons que ces technologies permettent la production de modifications à l’échelle du génome allant jusqu’à 3 ordres de grandeur supplémentaires que précédemment, ouvrant la voie au développement de la réécriture des génomes de mammifères. En outre, l’observation de la toxicité engendrée par la multitude de coupures double-brins dans le génome nous a amenés à développer un bio-interrupteur susceptible d’éviter les effets secondaires des thérapies cellulaires actuelles ou futures. Enfin, en conclusion, nous exposons les potentielles inquiétudes et menaces qu’apporte le domaine génie génétiques et apportons des pistes de réflexions pour diminuer les risques identifiés. / Programmable and site-specific nucleases such as CRISPR-Cas9 have started a genome editing revolution, holding hopes to transform human health. Multiplexing or the ability to simultaneously introduce many distinct modifications in the genome will be required for basic and applied research. It will help to probe the physio-pathological functions of complex genetic circuits and to develop improved cell therapies or anti-viral treatments. By pushing the boundaries of genome engineering, we may reach a point where writing whole mammalian genomes will be possible. Such a feat may lead to the generation of virus-, cancer- or aging- free cell lines, universal donor cell therapies or may even open the way to de-extinction. In this doctoral research project, I outline the current state-of-the-art of multiplexed genome editing, the current limits and where such technologies could be headed in the future. We leveraged this knowledge as well as the abundant transposable elements present in our DNA to build an optimization pipeline and develop a new set of tools that enable large-scale genome editing. We achieved a high level of genome modifications up to three orders of magnitude greater than previously recorded, therefore paving the way to mammalian genome writing. In addition, through the observation of the cytotoxicity generated by multiple double-strand breaks within the genome, we developed a bio-safety switch that could potentially prevent the adverse effects of current and future cell therapies. Finally, I lay out the potential concerns and threats that such an advance in genome editing technology may be bringing and point out possible solutions to mitigate the risks.

La modélisation de maladies métaboliques hépatiques et les approches de thérapie cellulaire nécessitent de disposer d’une source fiable et illimitée d’hépatocytes. Grâce à leurs propriétés spécifiques, les cellules souches pluripotentes peuvent représenter une telle source. Nous avons tout d’abord mis au point une approche originale pour différencier une lignée de cellules souches embryonnaires humaines européenne, générée en conditions GMP-compatibles, en hépatocytes fonctionnels in vitro et in vivo après transplantation dans un modèle murin d'insuffisance hépatique aiguë. Nous avons ensuite utilisé les cellules souches pluripotentes induites (iPSC) spécifiques d’un patient homozygote pour une mutation entrainant une absence de récepteur des lipoprotéines de basse densité (RLDL) afin de modéliser l'hypercholestérolémie familiale (HF) in vitro. Nous avons amélioré notre approche pour différencier ces iPSC en hépatocytes plus matures et polarisés car les hépatocytes sont les seules cellules capables de dégrader le cholestérol via la bile. Nous avons montré que ce modèle reproduit la physiopathologie de l'HF et établit la preuve de concept de la correction génétique ciblée par la technologie CRISPR/Cas au locus AAVS1 par la restauration de l’expression, inductible par les statines, et de la fonctionnalité du récepteur. Nous avons également mis en évidence que le RLDL ne semble pas impliqué dans l'entrée du virus de l'hépatite C (VHC) mais plutôt dans les étapes tardives de la morphogénèse virale. Ce modèle pourra désormais servir à l’étude physiopathologique de différents patients HF, au criblage de nouvelles drogues hypocholestérolémiantes et antivirales ainsi qu'à de nouvelles approches thérapeutiques. / Liver metabolic diseases modeling and cell therapy approaches require a a reliable and well-characterized cell source. Due to their specific properties, pluripotent stem cells represent a credible alternative to primary human hepatocytes. Thus, we have defined a new approach to differentiate a European human embryonic stem cell line, generated in GMP-compatible conditions, into hepatocytes that are functional in vitro and in vivo after transplantation into a murine model of acute liver failure. We have then used induced pluripotent stem cells from a homozygous patient with a mutation leading to an absence of the low-density lipoproteins receptor (LDLR) to model familial hypercholesterolemia type IIA (FH) in vitro. As hepatocytes are the only cells able to metabolize cholesterol into bile acids, we have improved our approach to differentiate these iPSC into hepatocytes displaying cell functional organization and polarization. We have shown that our model reproduced FH physiopathology and have also restored, by the genetic targeted correction at the AAVS1 locus using CRISPR/Cas technology and subsequent hepatocyte differentiation, the LDLR expression – inducible by statins - and functionality. Moreover, we have demonstrated that the LDLR does not seem to be involved in hepatitis C virus entry or replication but rather in viral morphogenesis steps. This model will be useful to develop new cholesterol-lowering and antiviral drugs as well as new cell therapy options. Furthermore, it can be applied to similar studies for other liver metabolic disorders.

京都大学 / 0048 / 新制・課程博士 / 博士(医科学) / 甲第22379号 / 医科博第109号 / 新制||医科||7(附属図書館) / 京都大学大学院医学研究科医科学専攻 / (主査)教授 遊佐 宏介, 教授 武田 俊一, 教授 近藤 玄 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Medical Science / Kyoto University / DFAM

In this thesis, I argue that the treatment/enhancement distinction that is central to the ethical debate concerning germline genome editing and CRISPR is too vague to be ethically and normatively guiding. The problem of vagueness is twofold, being both a semantic and epistemic issue. This vagueness creates borderline cases, cases that cannot be properly defined as either treatment or enhancement, I call this The Borderline Cases Argument. These borderline cases enable a slippery slope towards eugenic practices, radical enhancement and dangerous applications of CRISPR. The distinction therefore fails to be action guiding as it cannot distinguish treatment from enhancement as well as failing to correspond to what is genuinely morally problematic with germline genome editing and not, I call this The Argument of Missing the Point. In using the treatment/enhancement distinction we therefore risk losing control over how CRISPR is used and for what purposes.

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