Anticorpos monoclonais (AcMo) anti-β2GPI foram obtidos de hibridomas produzidos pela fusão de linfócitos de camundongos com células SP2-O, de mieloma murino. A imunização foi realizada com proteína purificada de plasma humano, por cromatografia de afinidade em resina Sepharose-Heparina 6 Fast Flow (GE Healthcare). Os AcMo produzidos pelos hibridomas K257, K2II-3, K233, K22, K237 e K2124 foram estudados quanto à sua capacidade de reconhecer o antígeno adsorvido em suporte sólido (dot-blot, imunoblot, ELISA direto) e em solução (ELISA indireto). Todos os clones foram cultivados e expandidos in vivo (ascite) e in vitro (cultura convencional). Pretende-se a substituição da expansão in vivo pela produção em biorreator. Os AcMo produzidos reconheceram a β2GPI em imunoblot com sensibilidade e especificidade variáveis. O desempenho dos AcMo K22 e K2124 no reconhecimento da proteína adsorvida em placas de ELISA (Maxisorp, NUNC), mostrou-se promissor para o desenvolvimento de um teste ELISA direto (sanduíche), em substituição ao ELISA indireto (competição) atualmente utilizado. O AcMo K22 mostrou reatividade semelhante à do anticorpo comercial 5F7 (ICN) em todos os testes realizados. Tanto o anticorpo produzido pelo clone K22 quanto seus fragmentos Fab, obtidos através de digestão enzimática, foram utilizados para identificação e quantificação da proteína em plasma e tecidos de ratos submetidos a um modelo de sepse e translocação bacteriana. Os resultados obtidos demonstram que a modulação das concentrações plasmáticas de β2GPI e sua distribuição hepática dependem da intensidade e da via de infecção, e sugerem a presença de imunocomplexos da proteína in vivo. / β2-glycoprotein I (β2GPI) detection is important for the accurate diagnostic of autoimmune and chronic inflammatory disease. This project was designed in order to obtain specific monoclonal antibodies (MoAb) that could replace or add to the commercially available 5F7. It is intended to achieve a convenient in vitro production, in the near future. The β2GPI antigen was purified from human plasma through Heparin-Sepharose 6 FF (GE Healthcare) affinity chromatography. Six different hybridomas were generated after the fusion of immunized mouse lymphocytes with SP2-O murine myeloma cells. The anti-β2 GPI MoAb K257, K2II-3, K233, K22, K237, and K2124 were purified after clone expansion from ascites (in vivo) and conventional cellular culture (in vitro). MoAb reactivity was evaluated towards the β2GPI antigen either adsorbed to solid phase support (Dot-Blot, imunoblot, direct ELISA), or in solution (indirect ELISA). All clones were positive in immunoblot. MoAb K237, K257 e K2124 recognized cleaved forms of the protein. The K22, K2124 and K257 MoAb were promising for the development of direct ELISA. Best sensibility was obtained with K22 AcMo in comparison to commercial reference 5F7 (ICN) in all tests. Both AcMo K22 and its digestion product K22Fab, could be applied in assays for β2GPI on plasma and tissues of rats with good performance.

Made available in DSpace on 2014-08-20T13:32:53Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dissertacao_luana_alves_dummer.pdf: 909354 bytes, checksum: d2af8cc0772177718829cf7f15391d43 (MD5) Previous issue date: 2008-06-12 / Outbreaks of fatal meningoencephalitis caused by Bovine Herpesvirus type 5 (BoHV-5) cause important economic losses in national trade of bovine beef. Commercial vaccines developed against Bovine Herpesvirus type 1 can protect cattle of neurological disease caused by BoHV-5. These cross-reactions are due to its genetic and antigenic similarities of both BoHV-1 and 5. However, these vaccines can not prevent latent infection of BoHV-5, even viral spread to healthy animals. This way, new vaccines strategies are based on envelope glycoproteins and are focusing safety, economic viability and on prevention of BoHV-5 latency and spread. This glycoprotein acts in initial steps of viral infection and glycoprotein D has drawn the attention in studies carried out with BoHV-1 and other homologous herpesvirus. The gD acts on viral membrane fusion with permissive cells through glycoproteins and host receptors interactions, so it is essential for viral entry. A vaccine that is capable to stimulate specific humoral and cellular immunity against BoHV-5 must be developed. The aim of this work was the production of a recombinant truncated form of gD of BoHV-5 in yeast Pichia pastoris and its antigenicity and immunogenicity evaluation. Data show that yeast P. pastoris can express the truncated form of BoHV-5 gD to the supernatant due to its secretion of ~190mg/L of recombinant protein, simplifying protein purification. The recombinant protein was successfully recognized by antibodies of animals immunized with BoHV-5, suggesting its antigenicity and immunogenicity and that native protein characteristic are conserved. The data presented herein allow the design of future studies aiming at expression optimization and further immunogenicity evaluation, as well as its capacity to neutralize the virus in biological models and on cattle. / Surtos de meningoencefalites fatais causadas pelo Herpesvírus Bovino tipo 5 (BoHV-5) ocasionam importantes perdas econômicas no comércio nacional de carne bovina. Vacinas comerciais destinadas ao Herpesvírus Bovino tipo 1 são capazes de impedir o aparecimento de sintomatologia clínica do BoHV-5. Estas reações cruzadas se devem a existência de semelhanças genéticas e antigênicas existentes entre ambos os vírus. No entanto, estas vacinas não impedem o estabelecimento da infecção latente e a disseminação do BoHV-5 para animais não imunizados. Desta forma, estratégias que visem à produção de vacinas seguras, economicamente viáveis e que possam ser capazes de impedir a latência do BoHV-5 e sua disseminação estão focadas para glicoproteínas localizadas no envelope viral e que atuam nas etapas iniciais da infecção. Dentre estas, a glicoproteína D tem se destacado em estudos realizados com BoHV-1 e outros herpesvírus homólogos. A gD atua na fusão do envelope viral com a membrana da célula permissiva no hospedeiro através de interações com receptores celulares e com outras glicoproteínas virais, sendo essencial para a entrada do capsídeo na célula. Assim, uma vacina que seja capaz de estimular respostas humorais e celulares contra esta glicoproteína deve ser desenvolvida. Os objetivos deste trabalho foram à produção da forma truncada da gD do BoHV-5 em levedura Pichia pastoris e a avaliação desta quanto a sua antigenicidade e imunogenicidade. Os resultados demonstram que a Pichia pastoris expressou a forma truncada da gD de BoHV-5 secretando para o meio de cultivo ~190mg/L da proteína recombinante, facilitando a purificação da mesma. Testada quanto a sua a sua antigenicidade e imunogenicidade, a proteína recombinante foi reconhecida por anticorpos de animais imunizados com o BoHV-5, sugerindo que características da proteína nativa foram conservadas na proteína recombinante. Os dados apresentados irão permitir o desenvolvimento de estudos 6 futuros com o objetivo de aperfeiçoar a expressão da proteína recombinante e avaliar a sua capacidade de neutralizar o vírus na espécie-alvo.

Made available in DSpace on 2014-08-20T13:32:57Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese_lorena_leonardo_souza.pdf: 798251 bytes, checksum: b0213429356f32517eb7b25ac76b2eeb (MD5) Previous issue date: 2009-12-17 / The rabies virus has two major antigens: the nucleoprotein, a conserved internal protein antigenically and genetically and glycoprotein, a protein responsible for the external adsorption of virus two the host cell and induction of neutralizing antibodies. The development of recombinant DNA technology has opened a new perspective on the control of rabies, since recombinant vaccines have residual pathogenicity and are produced with the antigenic proteins of the virus, without their presence. Furthermore, recombinant proteins can be expressed in order to be used in diagnosis. The objective of this study was to review the literature about rabies, cloning and express the nucleoprotein and glycoprotein of rabies virus using the system Pichia pastoris and evaluate the antigenicity and the immunogenicity of these proteins by Dot blotting, SDS page, Western blotting and ELISA. Glycoprotein synthetic antigen proved to be recognized by anti-rabies from animals experimentally infected with rabies virus strain CVS. And recombinant nucleoprotein expression was confirmed by the techniques of Dot blotting and Western blotting to be recognized by monoclonal anti-histidine. Thus, we conclude that the cloning and expression of synthetic glycoprotein and cloinig and expression nucleoprotein rabies virus by the yeast P. pastoris has been effective, which makes these products an alternative for the production of immunobiological. / O vírus da raiva apresenta dois antígenos principais: a nucleoproteína, uma proteína interna conservada antigênica e geneticamente e a glicoproteína, uma proteína externa responsável pela adsorção do vírus à célula hospedeira e pela indução da produção de anticorpos neutralizantes. O desenvolvimento da tecnologia do DNA recombinante iniciou uma nova perspectiva no controle da Raiva, já que vacinas recombinantes não têm patogenicidade residual e são produzidas com as proteínas antigênicas do vírus, sem sua presença. Além disso, as proteínas recombinantes podem ser expressas com a finalidade de serem usadas em diagnóstico. O objetivo deste trabalho foi clonar e expressar a glicoproteína e a nucleoproteína do vírus da raiva utilizando o sistema Pichia pastoris e avaliar a antigenicidade e imunogenicidade destas proteínas através do Dot blotting, SDS page, Western blotting, inibição da imunofluorescência e ELISA. A glicoproteína demonstrou ser antigênica ao ser reconhecida por anticorpos anti-rábicos provenientes de animais experimentalmente infectados com o vírus rábico cepa CVS. A nucleoproteína recombinante teve sua expressão confirmada pelas técnicas de Dot blotting e Western blotting ao ser reconhecida por anticorpos monoclonais anti-histidina. Podemos concluir que a levedura P. pastoris é um sistema eficiente para clonagem e expressão da nucleoproteína e glicoproteína do vírus rábico.

O presente projeto propõe a avaliação de respostas imunológicas induzidas por uma vacina de DNA bivalente para o controle de infecções por HIV e HSV. A vacina genética codifica a proteína gD do vírus HSV-1 geneticamente fusionada à proteína Gag (p24) do HIV, rica em epítopos reconhecidos por células T CD8+. A vacina de DNA pRE4p24 codifica a proteína p24 inserida em região próxima à porção C-terminal da proteína gD-1, permitindo que a proteína recombinante seja expressa na superfície da célula transfectada. A localização da proteína recombinante foi confirmada na superfície das células HEK-293T transfectadas por ensaios de imunofluorescência. Camundongos imunizados com a vacina foram capazes de gerar respostas de anticorpos específicos após três doses administradas pelas vias intramuscular (i.m.), intradérmica com seringa (i.d.) ou intradérmico por biobalística (gg). Foram analisadas as respostas imunológicas mediadas por linfócitos T CD8+ p24-específicas e, em função dos resultados obtidos, sendo a via i.m. escolhida como a mais promissora para os ensaios subsequentes. Na tentativa de aumentar a imunogenicidade da vacina, particularmente, para respostas celulares, foi avaliado o efeito da co-administração da formulação vacinal com outros plasmídeos que expressam citocinas (pIL-2, pIL-12 ou pGM-CSF), o teste de um vetor vacinal baseado no plasmídeo multicópia pVAX (pgDp24) e o emprego de um gene sintético para promover o aumento da expressão da proteína gD em células de mamíferos (pgDhp24). Por fim, desenvolvemos um modelo murino para a avaliação funcional de respostas citotóxicas antígeno-específicas a partir de uma linhagem tumoral capaz de expressar a proteína p24 do HIV. Camundongos Balb/c imunizados com o pgDp24 apresentaram um retardo no crescimento tumoral em relação aos animais não imunizados além de proteção parcial a desafios letais com HSV-1. / The present thesis aims to evaluate the immunological responses induced by a bivalent DNA vaccine to the control HIV and HSV infectious. This genetic vaccine codes the gD protein from the HSV-1 virus envelope genetically fused with HIV Gag (p24) protein, which has various epitopes recognized by human and murine T CD8+ cells. The DNA vaccine, named pRE4p24, codes for p24 protein, inserted close to the C-terminal region of gD-1 protein, leading to the expression of the recombinant protein on the surface of the transfected cells. The location of the recombinant protein was confirmed with transfected HEK-293 cellsby immunofluorescence assays. Mice immunized with the vaccine generated antigen-specific antibody responses after three doses administered intramuscularly (i.m), intradermally with a syringe (i.d) or intradermally by gene gun (bioballistic) (gg). The immunological responses mediated by specific-T CD8+ p24 lymphocytes were evaluated and, according to the data obtained, the i.m administration was chosen for the next assays. Aiming the improvement of the vaccine immunogenicity, particularly for cellular responses, the effect of co-administration with other plasmids was assessed with: plasmids that express cytokines (pIL-2, pIL-12 or pGM-CSF); a vaccine vector based on pVAX (pgDp24); and a vector encoding a synthetic gene capable to increase the expression of gD protein in mammalian cells (pgDhp24). Finally, we developed a murine model for the functional evaluation of antigen-specific cytotoxic responses using a tumor cell line which expresses the p24 protein. Balb/c mice, immunized with pgDp24 had a reduced tumor growth when compared to non-immunized mice. In addition, vaccinated mice showed partial protection to a lethal challenge with HSV-1.

Não consta resumo na publicação. / The α-amylase inhibitor from Phaseolus vulgaris is a glucoprotein with a Molecular Weight of 53,000 daltons and an isoelectric point of 4.35. It can be dissociated by SDS or guanidin in three subunities having molecular weight of 17,500, 16,000 and 13,500. The molecule has 400 amino acid residues and no disulfide brigde. The C and N terminal amino acid are respectively: leucine and tyrosine and threonine, alanine, and glutamic acid. It is resistent to proteolysis in the native state.

Orientador: Priscylla Tatiana Chalfun Guimarães Okamoto / Resumo: A doença do trato urinário inferior em felinos (DTUIF) apresenta diversos fatores etiológicos, sendo a forma obstrutiva a mais grave. As proteínas de fase aguda (PFAs) são biomarcadores utilizados para avaliar processos inflamatórios sistêmicos. A Alfa-1 Glicoproteína Ácida e o Amilóide A Sérico são PFAs positivas e major, o fibrinogênio é PFA minor e a albumina é negativa em gatos. O objetivo deste estudo é determinar as concentrações séricas das proteínas de fase aguda, Amilóide A sérico, Alfa-1 Glicoproteína Ácida, fibrinogênio e albumina e utilizá-las como biomarcadores de inflamação no monitoramento do processo inflamatório de gatos com doença do trato urinário inferior obstrutiva. Foram avaliados 25 gatos, machos, sem predileção de raça e idade, divididos em dois grupos experimentais, GC - grupo controle com oito gatos hígidos e GO - grupo obstruído com 17 gatos diagnosticados com DTUIF obstrutiva. Foram coletadas amostras para determinação das PFAs, bioquímica sérica, urinálise e UP/C nos M0, M12, M24 e M48 no GO e no GC somente no primeiro momento. As determinações das PFAs foram realizadas com os kits de ELISA para SAA, Kit Cat Serum Amyloid A Elisa (LIFE-SAA-8) e AGP, Kit Cat Alpha-1-Acid Glycoprotein Elisa (LIFE-AGP-8), ambos marca: Life Diagnostics®. No M0 houve correlações positivas de SAA, AGP e fibrinogênio com ureia e creatinina e correlação negativa de albumina com hematúria, SAA e potássio. No M48, houve correlações positivas entre SAA e AGP, AGP e ureia, fi... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The Feline Lower Urinary Tract Disease (FLUTD) presents several etiologic factors, with the obstructive form representing the most severe. The acute phase proteins (APPs) are biomarkers used to evaluate systemic inflammatory processes. In cats, Alpha-1-Acid Glycoprotein and Serum Amyloid A are major positive APPs, fibrinogen is a minor APP and albumin is a negative APP. This study aims at determining the serum concentrations of acute phase proteins Serum Amyloid A, Alpha-1-Acid Glycoprotein, fibrinogen and albumin, in addition of using them as biomarkers of inflammation during the monitoring of the inflammatory processes of cats with obstructive feline lower urinary tract disease. A total of 25 male cats were recruited for the study irrespective of breed and age, and were divided into two experimental groups: the control group (CG), comprised of eight healthy cats; and the obstruction group (OG), comprised of 17 cats diagnosed with obstructive FLUTD. Samples were collected for APP analysis, serum biochemical assay, urinalysis and UP/C determination at M0, M12, M24 and M48 in the OG, and at M0 in the CG. The concentrations of the APPs were determined using commercially-available ELISA kits for SAA (Kit Cat Serum Amyloid A Elisa, LIFE-SAA-8) and AGP (Kit Cat Alpha-1-Acid Glycoprotein Elisa, LIFE-AGP-8) (Life Diagnostics®). At M0, there were positive correlations of SAA, AGP and fibrinogen with urea and creatinine, as well as negative correlations between albumin and hematuria, ... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Células HEK293T e Huh7 foram adaptadas em meios livres de soro fetal bovino (SFM). Parâmetros metabólicos e de crescimento foram avaliados, além da expressão gênica heteróloga, utilizando um sistema de expressão que produz pseudo-partículas (ppHCV), derivadas do vírus da Leucemia Murina (MLV) e da Hepatite C (HCV). A adaptação foi realizada através de diluição sequencial para SFM. A linhagem HEK293T foi adaptada em dois SFM: Hybridoma-SFM e CHO-S-SFMII, a linhagem Huh7 foi adaptada nos quatro SFM escolhidos. O consumo de substratos para cada linhagem foi diferente entre os SFM, apesar de o crescimento celular ter sido semelhante. Para a análise da expressão gênica, três vetores foram co-transfectados em células HEK293T. Foi observado que para a produção de ppHCV, o tempo de coleta foi de 48 horas. O método de co-transfecção por lipofectamina produziu mais cópias de vírus, sendo que quantificações de 5,30x103 cópias RNA/μL foram encontradas para vírus produzidos em células adaptadas no meio Hybridoma-SFM através de qRT-PCR. Estas ppHCV foram usadas para infectar células Huh7, células infectadas produziram cerca de 10 ng de proteína recombinante/106 células. / HEK 293-T and Huh7 cells were adapted in serum free mediu (SFM). Metabolic and growth parameters were assessed, as well as heterologous gene expression, using an expression system that produces pseudo-particles (ppHCV), derived from the murine leukemia virus (MLV), and Hepatitis C (HCV). The adaptation was performed by sequential dilution in SFM. The HEK- 293T line was adapted in two SFM: Hybridoma-SFM and CHO-S-SFMII, the Huh7 line was adapted in four chosen SFM. The consumption of substrates were different for each line in SFM, while cell growth was similar. For the analysis of gene expression, three vectors were co-transfected into HEK-293T cells. It was observed that for the production of ppHCV, the collection time was 48 hours. The method of co-transfection with lipofectamine produced more copies of the virus into the cells, 5,30 x103 RNA copies/μL were found to virus produced in the cells adapted in Hybridoma- SFM, by qRT-PCR. These ppHCV were used to infect Huh 7, infected cells produced around 10 ng recombinant protein /106 cells.

Angiogênese é a formação de novos capilares a partir de vasos pré-existentes, mediada por eventos de sinalização bioquímica que determinam proliferação, migração, diferenciação e morte celular e controlam crescimento e remodelação tecidual. A beta2-glicoproteína I (beta2GPI) é uma proteína plasmática com ação sobre a função vascular e a aterogênese. Monomêros de beta2GPI apresentam efeito anti-inflamatório e anticoagulante; a clivagem enzimática favorece sua dimerização e induz o aparecimento de efeitos opostos. Resultados anteriores mostraram que monômeros e dímeros de beta2GPI têm efeitos diferentes sobre a proliferação e a diferenciação de células endoteliais em culturas bidimensionais utilizadas como modelo de angiogênese. Os monômeros e dímeros de beta2GPI foram obtidos por purificação fracionada e caracterizada por SDS-PAGE e ELISA, como descrito. Neste trabalho, foram utilizadas culturas tridimensionais de células humanas vasculares de cordão umbilical (HUVEC) sobre Matrigel foram utilizadas para identificar efeitos de monômeros e dímeros da beta2GPI sobre a proliferação, migração e formação de estruturas de interação celular in vitro. O monômero de ?2GPI atuou como um fator de diferenciação endotelial dependente da densidade de plaqueamento, induzindo nas culturas tridimensionais de HUVECs a formação de fenótipos alongados, prolongamentos e estruturas de interação célula-célula. A fração dimérica modulou negativamente a proliferação de HUVECs. A membrana corioalantóide (CAM) de embriões de galinha foi empregada para estudar efeitos da beta2GPI sobre a angiogênese. In ovo, o dímero de beta2GPI impediu a angiogênese e induziu a morte embrionária 48h após a exposição, enquanto o monômero permitiu o desenvolvimento do embrião até o 10º dia, apesar de induzir mudanças precoces no desenvolvimento dos vasos da membrana corioalantóide. As estruturas da microvasculatura foram analisadas através de uma abordagem morfológica quantitativa, baseada na classificação de padrões binários locais (LBP). Alvos moleculares de beta2GPI relatados anteriormente foram considerados como fonte dos efeitos observados in vitro e in ovo. Os resultados obtidos suportam dados anteriores sobre a inibição da via de sinalização de anexina-2/Akt pela beta2GPI. Adicionalmente, sugere-se a via de sinalização Notch como um alvo do efeito antiangiogênico de da beta2GPI / Angiogenesis is the formation of new capillaries from pre-existing vessels, mediated by biochemical signaling events that determine proliferation, migration, differentiation and cell death, and control of tissue growth and remodeling. beta2-glycoprotein I (beta2GPI) is a plasma protein active on vascular function and atherogenesis. ?2GPI monomers present anti-inflammatory and anticoagulant effects. Enzymatic cleavage favors beta2GPI dimerization and induces the appearance of opposing effects. Previous results have shown that beta2GPI monomers and dimers induce different effects upon the proliferation and differentiation of endothelial cells in two-dimensional cultures used as an angiogenesis model. beta2GPI monomers and dimers were obtained by fractioned purification and characterized by SDS-PAGE and ELISA, as described. In this work, three-dimensional Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC) cultures on Matrigel were used to investigate the effects of beta2GPI monomers and dimers upon proliferation, migration and in vitro formation of cellular interaction structures. The beta2GPI monomer performed as a density-dependent endothelial differentiation factor, inducing the formation of elongated phenotypes, membrane extensions and cell-cell interaction structures in three-dimensional HUVEC cultures; the dimeric fraction negatively modulated the proliferation and differentiation of HUVECs. The chorioallantoic membrane (CAM) of chicken embryos was employed to study the effects of beta2GPI upon angiogenesis. In ovo, the beta2GPI dimer prevented angiogenesis and induced embryonic death after 48h exposure, while the monomer allowed embryo development up to the 10th day, despite it induced early changes in the development of chorioallantoic membrane vessels. Microvasculature structures were evaluated through a quantitative morphology approach, based on local binary pattern classification. Previously reported molecular beta2GPI targets were then considered as the source of the observed effects in vitro and in ovo. The obtained results support previous data on the inhibition of the annexin-2/Akt signaling pathway by beta2GPI. Additionally, the Notch signaling pathway is suggested as a target of the antiangiogenic effect of beta2GPI

A tuberculose (TB) é uma doença infecciosa causada pelo Mycobacterium tuberculosis, que necessita de uma vacina mais efetiva, pois a única vacina licenciada apresenta eficácia variando entre 0 a 80%. Entre as estratégias em desenvolvimento destaca-se a vacina DNAhsp65, que consiste de um plasmídeo carregando o gene hsp65 de Mycobacterium leprae, que demonstra eficácia na profilaxia da TB. Como as HSPs são proteínas altamente conservadas e podem desencadear respostas auto-imunes, seria interessante o desenvolvimento de uma vacina baseada na utilização apenas dos epítopos da proteína Hsp65 reconhecidos por células T. Estudos com vacinas de DNA baseadas na fusão de peptídeos à glicoproteína D (gD) do Herpes Vírus Tipo-1 têm mostrado maior ativação de linfócitos T e B peptídeos-específicos. Dessa forma, o presente trabalho teve como objetivo a construção e avaliação da imunogenicidade de vacinas de DNA constituídas pelo gene da proteína gD e a seqüência gênica que codifica os cinco epítopos da Hsp65. Para a obtenção da seqüência codificadora dos epitopos, denominada Vac1, foi realizada uma síntese gênica e em seguida, essa seqüência foi fusionada ao gene que codifica a gD em dois sítios presentes em seu interior, no sítio da enzima ApaI e entre os sítios das enzimas PvuII e ApaI, com a retirada de uma porção central da gD. Além dessas construções, também foi realizada a construção da Vac2 pela ligação de fragmentos Vac1 que em seguida foi fusionada ao gene da gD no sítio de ApaI. Essas construções, gDVac1AA, gDVac1PA e gDVac2 foram clonadas no vetor pVAX1 e avaliadas quanto a expressão das proteínas. Após a caracterização, camundongos foram imunizados com quatro doses das vacinas e a imunogenicidade avaliada após trinta dias da última dose. Os ensaios ex vivo foram realizados com o soro para dosagem de anticorpos e com as células do baço, que foram estimuladas com as proteínas Hsp65, Vac1 e Vac2. Como resultado, obtivemos duas construções vacinais, pVAXgDVac1PA e pVAXgDVac2, eficientes em induzir anticorpos do subtipo IgG2a específicos a proteína e aos epitopos da Hsp65 e as três vacinas, pVAXgDVac1AA, pVAXgDVac1PA e pVAXgDVac2, foram capazes de induzir proliferação de linfócitos T e produção de IFN- após estímulo ex vivo. As vacinas foram, portanto, eficazes em desencadear um padrão de resposta Th1 importante no combate ao bacilo M. tuberculosis. / Tuberculosis (TB) is an infectious disease, caused by the infection with Mycobacterium tuberculosis and needs a vaccine more effective, for the only current permitted vaccine shows its effectiveness varying of 0-80%. DNAhsp65 vaccine is among the strategy in development, it consists of a plasmid loading the Mycobacterium leprae hsp65 gene and has been efficient in the prophylaxy of TB. As the HSPs are conserved and they can induce autoimmune disease, a vaccine based only in the epitopes of the Hsp65 protein recognized for T cells could be more interesting. Studies with DNA vaccines based on the fusion of peptides to Herpes Type Virus-1 D glycoprotein (gD) have improved the activation of peptide-specific T and B cells. In this context, the aim of this study was the construction of DNA vaccines encoding gD protein plus Mycobacterium leprae Hsp65 protein epitopes and the evaluation of its immunogenicity. The gene sequence encoding the five Hsp65 epitopes, called Vac1, was obtained by synthetic gene and, after that, this sequence was fusioned in two sites inside gene that enconding the gD, in the ApaI enzyme site and between the PvuII and ApaI enzyme sites with the withdrawal of a gD central portion. In addition, Vac2 was contructed through the linking of Vac1 fragments followed by its insertion in the ApaI site inside gD gene. These constructions, gDVac1AA, gDVac1PA and gDVac2 were cloned in pVAX1 vector and they were evaluated to protein expression. After the characterization, mice were immunized with four doses of vaccine and the immunogenicity was evaluated after thirty days from the last immunization. The ex vivo assays were carried by quantification of antibodies in the serum and the splenocytes were stimulated with the Hsp65, Vac1 and Vac2 proteins. As result, two vaccine constructions, pVAXgDVac1PA and pVAXgDVac2 were efficient in the induction of IgG2a subtype antibodies specific to Hsp65 protein and its respective epitopes. All the three vaccines pVAXgDVac1AA, pVAXgDVac1PA and pVAXgDVac2 were capable to induce T cell proliferation and IFN- production after stimulation. Therefore, the vaccines were efficient to induce a Th1 profile which is important in the combat to Mycobacterium tuberculosis bacillus.

A dengue é uma doença viral infecciosa predominante de regiões tropicais e subtropicais que atinge cerca de 400 milhões de pessoas anualmente. Possui quatro sorotipos diferentes do vírus (DEN.I-IV), de modo que a reinfecção por um novo sorotipo pode causar um quadro mais grave da doença: a dengue hemorrágica e a síndrome do choque da dengue. Durante o processo de infecção o vírus passa por duas etapas importantes: a primeira é a entrada dentro da célula hospedeira; a segunda etapa, é a fusão da bicamada lipídica viral com a membrana do endossomo. Ambas as etapas são mediadas pela Glicoproteína E, e é nessa proteína que se encontra o peptídeo putativo de fusão. O peptídeo possui elevado grau de homologia entre todos os membros de Flaviviridae. Neste trabalho, avaliamos a interação entre o peptídeo de fusão da dengue II, modificado, e membranas modelo através da combinação de técnicas experimentais (Fluorescência, SAXS, DSC e Cryo-TEM) e simulações por Dinâmica Molecular. Avaliamos a capacidade do peptídeo DEN.II 88-123 em induzir a fusão de vesículas de DMPC, DMPC:DMPG (4:1), bem como de alterar as propriedades das bicamadas lipídicas. Buscamos ainda compreender como sua estrutura secundária é afetada pela interação com as bicamadas lipídicas e qual o posicionamento dele em relação à membrana. Conseguimos mostrar que o peptídeo é capaz de alterar a cooperatividade lipídica das membranas conforme a composição lipídica e isso pode ser relacionado a capacidade de induzir fusão entre vesículas. Entretanto, os resultados de dinâmica molecular revelaram que o peptídeo não foi capaz de induzir mudanças em parâmetros estruturais tais como: área por lipídio, espessura e parâmetro de ordem da bicamada. Durante a interação o peptídeo ficou preferencialmente na superfície da bicamada, com inserção do resíduo hidrofóbico triptofano entre as cadeias alifáticas. O peptídeo não apresentou uma conformação estrutural preferencial, embora tenha apresentado pequenas proporções de formação de folha- e -hélice. Em conjunto, esses resultados podem auxiliar na compreensão do modo de ação dos peptídeos de fusão. / Dengue fever is viral infectious disease widespread in tropical and subtropical areas that infects nearly 400 million people annually. There are four different virus serotypes (DEN.I-IV) so that a reinfection by a different serotype may lead to a more severe case of the disease: dengue hemorrhagic fever and the dengue shock syndrome. During the infection cycle, the virus has two important steps: the first one is the entry in the host cell; the second one, is the fusion between the viral lipid bilayer and the endosomal membrane. Both steps are mediated by the E Glycoprotein, that is the host of the putative fusion peptide. The fusion peptide has a high degree of homology among the members of the Flaviviridae. In this work, we evaluated the interaction between modified dengue fusion peptide and model membranes through the combination of experiments (fluorescence, SAXS, DSC and Cryo-TEM), and Molecular Dynamics simulations. We evaluated the capacity of the DEN.II 88-123 peptide to promote fusion between vesicles composed by DMPC, DMPC:DMPG (4:1), as well as the ability to perturb the lipid bilayer properties. Moreover, we seek to understand how the secondary structure is affected by interaction with the model membranes and the peptide position in the membrane. We showed that the peptide is able to change the membrane lipid cooperativity depending on the lipid composition and it may be related to the capacity of fusion induction between vesicles. However, the results revealed that the peptide does not induce changes in the structural parameters such as area per lipid, thickness and bilayer order parameter. The peptide binds to the surface of the lipid bilayer with the insertion of the tryptophan residue into the region of aliphatic chains. The peptide did not have a preferential secondary structure, although it presented a low percentage of -sheet and -helice conformation. Together, these results may help to understand the mode of action of fusion peptides.