Não consta resumo na publicação. / The α-amylase inhibitor from Phaseolus vulgaris is a glucoprotein with a Molecular Weight of 53,000 daltons and an isoelectric point of 4.35. It can be dissociated by SDS or guanidin in three subunities having molecular weight of 17,500, 16,000 and 13,500. The molecule has 400 amino acid residues and no disulfide brigde. The C and N terminal amino acid are respectively: leucine and tyrosine and threonine, alanine, and glutamic acid. It is resistent to proteolysis in the native state.

LEITE, Joana Filomena Magalhães. Propriedades bioativas e caracterização bioquímica de uma lectina purificada a partir de sementes de Clitoria fairchildiana R. A. Howard. 2012. 88 f. Tese (Doutorado em Bioquímica) - Universidade Federal do Ceará, Fortaleza-CE, 2012. / Submitted by Eric Santiago (erichhcl@gmail.com) on 2016-07-20T14:33:05Z No. of bitstreams: 1 2012_tese_jfmleite.pdf: 924415 bytes, checksum: 45e56fd8e929b8124a3f9caf10098395 (MD5) / Approved for entry into archive by José Jairo Viana de Sousa (jairo@ufc.br) on 2016-08-02T20:36:23Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_tese_jfmleite.pdf: 924415 bytes, checksum: 45e56fd8e929b8124a3f9caf10098395 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-08-02T20:36:23Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_tese_jfmleite.pdf: 924415 bytes, checksum: 45e56fd8e929b8124a3f9caf10098395 (MD5) Previous issue date: 2012 / Lectins are proteins that have the ability to bind specifically and reversibly to carbohydrates and glycoconjugates, without changing the structure of binder. They are found in organisms such as virus, bacterias, plants and humans, and has been shown to possess important biological activities. Clitoria fairchildiana R. A. Howard is a species belonging to the Fabaceae family, native to South America. The purpose of this study was to isolate and to characterize a lectin present in seeds of Clitoria fairchildiana, evaluate the herbal and pharmacological potential (antinociceptive, pro-and antiinflammatory, hemolytic, antibacterial and antifungal) of this lectin. The results indicated the presence of a lectin (CFAL) on protein fraction acid glutelin, CFAL binds native rabbit erythrocytes, was not inhibited by monosaccharides and glycoproteins tested and was purified by ion exchange chromatography, DEAE-Sephacel. Analysis of the lectin in SDS-PAGE showed two bands with molecular mass approximately 100 and 116 kDa. In DLS analyzes have a monomodal sample with hydrodynamic radius (RH) of 4.5 nm, showing a conformation high salt concentration dependent. The CFAL is a glycoprotein PAS (+) capable of being inactivated by treatment with sodium metaperiodate, but resistant to the effect of β-mercaptoethanol and urea. This lectin did not show significant cytotoxicity, did not change the osmotic fragility and not showed oxidant/antioxidant significant effects, compared to human erythrocytes. The lectin showed anti-inflammatory activity in models of paw edema induced by carrageenan, decreasing 71% of edema. Dose dependent antinociceptive effects were observed for CFAL on abdominal writhing test induced by acetic acid, reducing the number of writhes in up to 72%. The C. fairchildiana lectin was able to reduce the growth of Bacillus subtilis and did not affect growth of the fungi tested. It was concluded that the lectin purified and characterized from the seeds of Clitoria fairchildiana is a glycoprotein lacks disulfide bonds with antinociceptive and antiinflammatory activity, and is not cytotoxic to human erythrocytes. / Lectinas são proteínas que tem a capacidade de se ligar especificamente e reversivelmente a carboidratos e glicoconjugados, sem alterar a estrutura do ligante. Elas são encontradas em organismos tais como vírus, bactérias, plantas e animais, e tem sido demonstrado que possuem atividades biológicas importantes. Clitoria fairchildiana R. A. Howard é uma espécie pertencente à família Fabaceae, nativa da América do Sul. O objetivo deste estudo foi isolar e caracterizar uma lectina presente em sementes de Clitoria fairchildiana, avaliar o potencial fitoterápico e farmacológico (antinociceptivo, pró e antiinflamatório, hemolítico, antibacteriano e antifúngico) desta lectina. Os resultados indicaram a presença de uma lectina (CFAL) na fração proteica glutelina ácida, que aglutina eritrócitos de coelho nativos, a qual não foi inibida por monossacarídeos e glicoproteínas testadas, foi purificada por cromatografia em coluna de troca-iônica, DEAE-Sephacel. Análise da lectina em SDS-PAGE indicou duas bandas com massa molecular de aproximadamente 100 e 116 kDa. As análises em DLS apresentam uma amostra monomodal com raio hidrodinâmico (RH) de 4,5 nm, indicando uma conformação dependente de alta concentração salina. A CFAL é uma glicoproteína PAS (+) capaz de ser inativada pelo tratamento com metaperiodato de sódio, porém resistente ao efeito de β-mercaptoetanol e uréia. Esta lectina não apresentou citotoxicidade significativa não alterou a fragilidade osmótica, bem como não apresentou efeitos oxidante/antioxidante significativos frente a hemácias humanas. A lectina apresentou atividade antiinflamatória em modelo de edema da pata induzido por carragenina, com diminuição de 71% do edema. Efeitos antinociceptivos dose dependentes foram observados para CFAL no teste de contorções abdominais induzida por ácido acético, com redução do número de contorções em até 72%. A lectina de C. fairchildiana foi capaz de reduzir o crescimento de Bacillus subtilis e não afetou o crescimento dos fungos testados. Concluiu-se que a lectina purificada e caracterizada a partir das sementes de Clitoria fairchildiana é uma glicoproteína desprovida de pontes dissulfeto com atividade antiinflamatória e antinociceptiva e não é citotóxica para eritrócitos humanos.

Foram submetidos à análise molecular, 15 isolados do vírus da bronquite infecciosa (VBI) obtidos durante o período de 1988 a 2000, de surtos à campo da Bronquite Infecciosa (BI), em aves de corte ou de postura das regiões Sul e Sudeste do Brasil. Os resultados obtidos da análise filogenética das sequências parciais dos genes da glicoproteína de espícula (S1) e da nucleoproteína (N) evidenciaram que a maior parte dos isolados estão distribuídos em dois grandes grupos; o primeiro deles mais estreitamente relacionado às estirpes do genótipo Massachusetts e o segundo constituído apenas por isolados brasileiros autóctones com uma grande diversidade em relação às estirpes ou isolados do grupo Massachusetts e de outros países ou continentes. Os sítios polimórficos mais importantes formaram-se em locais específicos e de maneira agrupada nas sequências dos genes S1 ou N e predominam em regiões codificadoras das cadeias polipeptídicas S1 e N que configuram sítios estruturais e antigênicos importantes envolvidos, na expressão de propriedades biológicas relevantes. / Fifteen Brazilian field isolates of infectious bronchitis virus (IBV); were recovered, between 1988 and 2000, from commercial broiler or layer flocks located in South and Southeast Brazilian regions. Molecular and phylogenetic analysis of partial sequences of 5\'-proximal of S1 gene and 3\'-terminus of N gene from these IBV isolates, identified two main groups; the Massachusetts group and a Brazilian indigenous group, which presenting a high diversity regarding the first group or other IBV strains from different countries and continents. The major polymorphic sites are arranged in clusters and predominate in the regions of S1 and N genes which code for relevant structural and antigenic sites responsible for the expression of important biological properties.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:22Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2008-08-14Bitstream added on 2014-06-13T20:35:46Z : No. of bitstreams: 1 oliveira_ap_me_jabo.pdf: 460448 bytes, checksum: eeb8cefed995b5624ebdb1b544ded04b (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / A glicoproteína de superfície (8) do vírus da bronquite infecciosa (VBI) em aves; é um alvo antigênico importante para a indução de imunidade e como antígeno utilizado no imunodiagnóstico da infecção causada por este vírus. Nesse estudo, a forma recombinante da subunidade 81 da glicoproteína 8 da estirpe M41 do VBI foi clonada e expressa como proteína de fusão contendo uma cauda de poli-histidina e o epítopo V-5 em células da levedura Saccharomyces cerevisiae. O gene codificador dessa proteína foi amplificado a partir do RNA genômico da estirpe M41 do VBI, por meio das técnicas da reação de transcrição reversa (RT) e da reação da polimerase em cadeia (PCR). Foi amplificada toda a seqüência codificadora de interesse e fossem geradas extremidades compatíveis com a inserção no vetor pYE82.1N5-His-TOPO. Este vetor foi usado na transformação de leveduras, tendo sido obtidos os clones transformantes específicos portadores do inserto gênico. A expressão da proteína de fusão foi então induzida, em células de S. cerevisiae, sendo produzida a proteína recombinante 81 de fusão com peso molecular 95 kDa. Essa proteína apresentou com uma elevada reatividade cruzada para a proteína 8 do próprio vírus, tal como demonstraram os resultados das análises pelo Western blotting e ELl8A. Essa proteína de fusão foi, devido à presença da cauda de poli¬histidina, prontamente purificada por cromatografia de afinidade em coluna de níquel ¬agarose e, posteriormente utilizada com sucesso no desenvolvimento de um método indireto de ELl8A para a detecção de anticorpos específicos de galinhas infectadas com o VBI. / The surface glycoprotein of infectious bronchitis virus (IBV) is a important antigenic target for the induction of immunity and as antigen in the immunodiagnosis of infection caused by this virus. In this study, the gene of 51 glycoprotein of M41 strain of the IBV was cloned and expressed as a fusion protein containing a poly-histidine and epitope V-5 tags in the yeast cells of Saccharomyces cerevisiae. The 51 gene was amplified from genomic RNA of the M41 strain of VBI, by reverse transcription (RT) and polymerase chain reaction (PCR). The entire coding sequence of 51 gene was amplified and inserted in the vector pYE52.1N5-His-TOPO. This construct was used for transforming yeast cells, and to obtain specific clones carrying the inserted gene. The expression of the fusion protein was induced in transformed cells of S. cerevisiae, and a recombinant 51 protein was produced with a molecular weight of 95 kDa. A high cross¬reactivity with the original 51 protein from the virus was detected by Western blotting and ELl5A. The presence of the poly-histidine tail in the fusion recombinant protein favored their prompt purification by affinity chromatography in a column of nickel¬sepharose. This recombinant 51 protein was successfully used in the development of an indirect method of ELl5A for the detection of specific anti-IBV antibodies in chickens experimentally infected or vaccinated with this virus.

Submitted by Alison Vanceto (alison-vanceto@hotmail.com) on 2017-02-21T12:43:27Z No. of bitstreams: 1 DissMCD.pdf: 3338735 bytes, checksum: a38bd4887b4213867a0c295a634f94c1 (MD5) / Approved for entry into archive by Ronildo Prado (ronisp@ufscar.br) on 2017-04-24T11:24:18Z (GMT) No. of bitstreams: 1 DissMCD.pdf: 3338735 bytes, checksum: a38bd4887b4213867a0c295a634f94c1 (MD5) / Approved for entry into archive by Ronildo Prado (ronisp@ufscar.br) on 2017-04-24T11:24:33Z (GMT) No. of bitstreams: 1 DissMCD.pdf: 3338735 bytes, checksum: a38bd4887b4213867a0c295a634f94c1 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-04-24T11:31:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DissMCD.pdf: 3338735 bytes, checksum: a38bd4887b4213867a0c295a634f94c1 (MD5) Previous issue date: 2016-08-08 / Não recebi financiamento / Although effective, current vaccinations against rabies, one of the most lethal infectious diseases in the world, present security issues of administration and production costs. In this scenario, modern biotechnology has become a source of new alternatives of great interest for vaccine production. The main antigen capable of conferring neutralizing immune response against infection by rabies virus is the glycoprotein of rabies virus (RVGP), which the production by recombinant DNA technology has been developed by researchers at the Viral Immunology Laboratory (LIV) of the Butantan Institute of São Paulo using various expression systems in Drosophila melanogaster S2 cells. One of the latest developments is S2MtRVGP-H-His cell line, obtained by stable transfection with plasmids containing cDNA from other components of RVGP and histidine tag to facilitate purification, both under control of the inducicle metallothionein promoter. This work aims to study the kinetic characteristics of cell growth and production of recombinant glycoprotein rRVGP rabies virus strain of Drosophila melanogaster S2MtRVGP-H-His, in order to evaluate the potential of a bioreactor with agitation induced by waves (Wave) for the scale-up production of rRVGP. The first stage of the study, involving batch cultures in 20 mL Schott bottle with commercial culture medium Sf900-III, allowed us to determine the optimal temperature of cultivation (28ºC), time of induction of expression (72 h), the specific growth rate ranging from 0.022 to 0,034 h-1; maximum cell density 1.82×107 cel.mL-¹ and rRVGP produced from 0.07 to 0.99 μg.mL-1. Based on these results, was started the second part of the study performed in the Single-use Wave bioreactor, involving batch cultures with 650 mL of Sf900-III, with 60% of dissolved oxygen and pH ranging without control from 6.2 to 7.0. The culture in the bioreactor showed maximum specific growth rate of 0,035 h-1, maximum cell density was 1.1×107cel.mL-¹ and RVGP produced 0.85 μg.mL-1. The production of large scale rRVGP with S2MtRVGP-H-His cells using the Wave bioreactor has shown to be viable, reproducible and with high potential to scale-up. / Embora eficazes, as vacinas atuais contra a raiva, uma das doenças infecciosas mais letais do mundo, apresentam problemas relacionados com a segurança de administração e o custo de produção. Nesse contexto, a biotecnologia moderna se torna uma fonte de alternativas inovadoras de grande interesse para produção de vacinas. O principal antígeno capaz de conferir uma resposta imunológica neutralizante contra o vírus rábico é a glicoproteína do vírus da raiva (RVGP), cuja produção por tecnologia de DNA recombinante vem sendo desenvolvida por pesquisadores do Laboratório de Imunologia Viral (LIV) do Instituto Butantan de São Paulo, utilizando vários sistemas de expressão em células de Drosophila melanogaster S2. Um dos mais recentes desenvolvimentos é a linhagem S2MtRVGP-H-His, obtida mediante transfecção estável com plasmídeos contendo entre outros componentes o cDNA da RVGP e a cauda de histidina para facilitar a purificação, ambos sob controle do promotor indutível da metalotioneína. O presente trabalho tem como objetivo o estudo de características cinéticas de crescimento celular e de produção de glicoproteína recombinante do vírus da raiva rRVGP da linhagem de Drosophila melanogaster S2MtRVGP-H-His com vistas a avaliação do potencial de um biorreator com agitação induzida por ondas (waves) para escalonamento da produção de rRVGP. A primeira etapa dos trabalhos, envolvendo cultivos em batelada em frasco Schott com 20 mL de meio de cultura comercial Sf900-III, permitiu a determinação da temperatura ideal (28ºC), o tempo apropriado de indução da expressão (72 h) e das velocidades específicas de crescimento de 0,022-0,034 h-1, densidade celular máxima de 1,82×107 cel.mL-¹ e rRVGP produzida de 0,07-0,99 μg.mL-1. Com base nesses resultados, iniciou-se a segunda parte dos trabalhos com cultivos em biorreator Wave utilizando 650 mL de meio Sf900-III, com concentração média de oxigênio dissolvido de 60% da saturação com ar e pH variando sem controle de 6,2-7,0. O cultivo no biorreator apresentou velocidade específica máxima de crescimento de 0,035 h-1, densidade celular máxima de 1,1×107 cel.mL-¹ e rRVGP produzida de 0,85 μg.mL-1. A produção da rRVGP em larga escala com células S2MtRVGP-H-His utilizando o biorreator Wave mostrou ser uma alternativa viável, reprodutível e com grande potencial de escalonamento.

Infectious bronchitis virus (IBV) is the causative agent of an economically important disease of poultry. In Brazil this disease causes respiratory, renal and reproductive problems in birds of all ages, despite constant vaccination with the Massachusetts strain H120. This lack of immunological protection is known to be due the genetic variation in the spike glycoprotein of IBV, which is involved in host cell attachment, neutralization and the induction of protective immunity. Brazilian IBV variants resulting of this genetic variation are present since the 80s and this study aimed to epidemiologicaly analyze and molecularly characterize the existing variants during 2010-2015 and perform a bioinformatics analysis of the available sequences of IBV variants in a 40 year period. Of the 453 samples tested, 61.4% were positive for IBV and 75.9% of them were considered variants and were detected in birds of all ages, distributed in all five Brazilian regions. A fragment of 559-566 bp was obtained from 12 isolates, where BR-I was the predominant variant while only one isolate belonged to the BR-II genotype. Bioinformatics analysis of the sequences of 40 years of Brazilian IBV variants was performed and the ratio of non-synonymous substitutions per non-synonymous site (dn) to synonymous substitutions per synonymous site (ds) dN/dS was calculated. It revealed a predominance of codons with non-synonymous substitutions in the first third of the S1 gene and a dN/dS ratio of 0.6757, indicating that this portion of the gene was under negative selection. Additionally prediction of N-glycosilation sites showed that most of the BR-I variants (from 2003 to early 2014) present an extra site at animoacid position 20, while the newest ones lack this feature.Together these results suggest that IBV Brazilian variants had probably suffered drastic mutations in some points between the years 1983 to 2003 and after achieving an antigenic structure effective enough for invasion and replication in their hosts, the selection processes became silent. / O vírus da bronquite infecciosa das galinhas (IBV) é o agente causador de uma doença aviária economicamente importante. No Brasil, esta doença ocasiona problemas respiratórios, renais e reprodutivos em aves de todas as idades, apesar da vacinação constante com a cepa Massachusetts H120. Esta falha na proteção conferida pela vacina é ocasionada por mutações nos nucleotídeos do gene da glicoproteína da espícula, a qual está envolvida no processo de interação comas células do hospedeiro, a neutralização e a indução de imunidade protetora. As variantes brasileiras resultantes dessa mutação genética estão presentes desde os anos 80 e este estudo teve como objetivo analisar epidemiologicamente e caracterizar molecularmente os vírus variantes existentes durante 2010-2015 e realizar uma análise bioinformática das sequências disponíveis no GenBank em um período de 40 anos. Das 453 amostras analisadas, 61,4% foram positivas para IBV e 75,9% delas foram consideradas variantes e foram detectados em aves de todas as idades, distribuídos em todas as 5 regiões do Brasil. Um fragmento de 559-566 pb foi obtido a partir de 12 isolados, onde BR-I foi a variante predominante ao contrario que apenas um isolado pertencia ao genótipo BR-II. Análise bioinformática de 40 anos de variantes do IBV brasileiros revelou uma predominância de codões com as substituições não sinónimos no primeiro terço do gene S1 e uma relação dN / dS de 0,6757, indicando que esta porção do gene estava sob selecção negativa. Além disso a previsão de pontos de de N-glicosilação mostrou que a maioria das amostras variantes BR-I (entre o 2003 e início de 2014) apresentam um ponto adicional na posição 20, enquanto as variantes mais novas não apresentam esse ponto de nglicosilação. Estes resultados sugerem que as variantes brasileiras teriam sofrido mutações provavelmente drásticas em alguns pontos do genoma, entre os anos de 1983 a 2003 e depois de atingir uma estrutura antigênica eficaz o suficiente para a invasão e replicação em seus hospedeiros, o processo de seleção mudou para seleção negativa.

As formas tripomastigotas do Trypanosoma cruzi expressam as Tc-85, glicoproteínas de superficie. A Tc85-11, um dos membros da família da Tc-85, foi caracterizado como uma proteína de adesão, com os sítios de ligação a laminina e citoqueratina 18 localizados, respectivamente, nos domínios amino e carboxiterminal. Utilizando-se primers consensos, um produto de cerca de 2000 pb foi amplificado do cDNA de formas tripomastigotas de T cruzi da cepa Y. Uma biblioteca enriquecida em membros da família da Tc-85 foi construída utilizando-se esses primers e o plasmídeo pCR T7/NT Topo Cloning (Invitrogen). O sequenciamento de cerca de 60 clones resultou em 30 ORFs completas. O sequenciamento de DNA foi realizado com o método dideoxi de terminação de cadeia e as seqüências foram analisadas. Por análise comparativa, identidades de 40-90% entres os clones sequenciados e 30-70% com membros da superfamília de proteínas das gp85/trans-sialidases foram encontradas. Os dados foram compilados nas seguintes ferramentas: ORF finder (NCBI), Cap3, Smith-Waterman, ClustalW, BioEdit e BLASTX/BLASTN (NCBI). Para a análise filogenética, foi utilizado o programa Paup empregando máxima parsimônia (MP), \"neighbor joining\" (NJ) e máxima probabilidade (MP). A árvore possuia dois grupos e foi submetida a análise de bootstrapping, com busca heurística completa e com 100 e 500 repetições. Os mesmos dois grupos apareceram quando a comparação de seqüências e análise filogenética foram correlacionadas. Em experimentos utilizando-se elementos de matriz extracelular - laminina e fibronectina- foi testada a ligação de proteínas recombinantes purificadas. A proteína codificada pelo inserto de cDNA Tc85-45 foi capaz de se ligar de maneira saturável a laminina e a fibronectina, mas não a albumina e gelatina. Os dados sugerem fortemente que, apesar da família da Tc-85- e por conseqüência a superfamília das gp85/trans-sialidases- codificarem proteínas com graus variáveis de seqüências similares, as seqüências específicas de peptídeos para a ligação a diferentes moléculas de matriz e receptores celulares variam entre membros da família, constituindo, assim, uma família multiadesiva de glicoproteínas que capacita o parasita a ultrapassar as barreiras impostas pelas membranas celulares, matrizes extracelulares e lâminas basais. / Trypomastigote forms of Trypanosoma cruzi express Tc-85 surface glycoproteins. Tc85-11, one member of the Tc-85 family, was characterized as an adhesion protein, with laminin and cytokeratin-18 binding sites localized, respectively, on the amino and carboxy terminal domains. Using consensus primers, a 2000 bp product was amplified from cDNA of trypomastigote forms of T. cruzi of the Y strain. A library enriched in Tc-85 cDNA was constructed using these primers and pCR T7/NT Topo Cloning (Invitrogen) plasmid. Sequencing of about 60 clones gave 30 complete ORFs. DNA sequencing was performed by the dideoxi-chain termination method and the sequences have been analyzed. By comparative analysis, identity of 40-90% was found among the sequenced clones and 30-70%, with members of the gp85/trans-sialidase superfamily proteins. The data were compiled in the following tools: ORF finder (NCBI), Cap3, Smith-Waterman algorithm, ClustalW, BioEdit and BLASTX/BLASTN (NCBI). For phylogenetic analysis, the Paup program was employed using maximum parsimony (MP), neighbor joining (NJ), and maximum likelihood (ML). The inferred tree had two groups and was submitted to full heuristic bootstrapping with 100 and 500 repetitions. The same two groups appeared when comparative sequence and phylogenetic analyses were correlated. In experiments in which extracellular matrix elements - laminin and fibronectin- were tested for binding to purified recombinant proteins, the protein coded by the cDNA insert Tc85-45 was able to bind in a saturable manner to laminin and fibronectin, but not to albumin and gelatin. The data strongly suggest that although the Tc-85 family, and by extension the gp85/glycoprotein superfamily, encode glycoproteins with variable degrees of similar sequences, the peptide sequences specific for the binding to different matrix molecules and cell receptors varies among the family members, thus, constituting a multi-adhesion family of glycoproteins that enables the parasite to overcome the barriers imposed by cell membranes, extracellular matrices and basal laminae.

Vários laboratórios descreveram moléculas que estão envolvidas na invasão do Trypanosoma cruzi à célula hospedeira. Nosso laboratório foi o primeiro a descrever moléculas de 85 kDa pertencentes a uma família de glicoproteínas (Tc-85) que possuem graus diferentes de homologia de seqüência com os membros da superfamília das gp85/transialidases. Um componente acídico (Tc85-11) da família Tc-85 que se liga à laminina e a receptores da célula hospedeira foi clonado e expresso (Giordano et al., JBC 274, 3461,1999). Nós levantamos a hipótese de que o polimorfismo dos diferentes membros da família Tc-85 poderiam determinar diferentes propriedades da adesão à célula hospedeira. Para provar tal hipótese, uma biblioteca genômica de Tc-85 utilizando o vetor pTEX e os seguintes primers: R-1 (5\') ATGTCCCGGCGTGTGTTTACTTCC e GPI-2(3\') TCACAAAGTCGCAAAGCCCCACAGTCC, foi digerida com enzimas de restrição resultando em fragmentos de tamanho esperado (~2-2,5 kb) em 91% dos clones selecionados. Treze clones foram seqüenciados em suas extremidades 5\' e 3\'. Nenhum era idêntico entre si apesar da variabilidade da homologia de seqüência (40-70%). No entanto, quando comparadas as regiões codantes para o peptídeo sinal foi encontrada uma homologia de 90%. Para assegurar a clonagem de genes funcionais, uma biblioteca de cDNA foi construída com primers degenerados (5\'-ATTTTTGTTCCGCAGAAGACGCAGGTG, 3\'ATTCAGTGGGCGGTTGTACAGAAAGAC) por transcrição reversa de seqüências conservadas da superfamília das gp85/transialidases, excluindo a seqüência codante para o peptídeo sinal e a seqüência codante para âncora de GPI (presença de aminoácidos hidrofóbicos). Os cDNAs foram amplificados e clonados no vetor de expressão pCR®T7/NT-TOPO. Foram selecionados 60 clones que foram submetidos à análise de restrição e 90% deles mostraram fragmentos com tamanho esperado. As proteínas de fusão de 4 destes clones foram reconhecidas em Western blot por um anticorpo policlonal feito contra um fragmento da Tc85-11 (H3.3). As seqüências obtidas da extremidade 5\' revelou que os quatro clones pertencem à superfamília das gp85/transialidase (GenBank). O alinhamento destas seqüências com a Tc85-11 mostrou uma homologia de 60-80% e uma identidade de 40-70% na seqüência de aminoácidos. Estes dados confirmam a heterogeneidade da família da Tc-85 que é expressa pelo parasita. Ademais, a expressão de elevadas quantidades das proteínas correspondentes permitirá a identificação dos ligantes respectivos para estas proteínas de superfície específicas de tripomastigotas. / Several laboratories described molecules that are involved in Trypanosoma cruzi invasion of host-cells. Our laboratory was the first to describe molecules of 85 kDa belonging to a glycoprotein family (Tc-85) having different degrees of sequence homology with the members of the gp85/trans-sialidase supergene family. An acidic component (Tc85-11) of the Tc-85 family that binds to laminin and to host-cell receptors was cloned and expressed (Giordano et al., JBC 274, 3461, 1999). We raised the hypothesis that the polymorphism of different members of the Tc-85 family could specify different adhesion properties to host proteins. In order to prove the hypothesis, a genomic Iibrary of Tc-85 using the pTEX vector and primers R-1 (5\') ATGTCCCGGCGTGTGTTTACTTCC and GPI-2 (3\') TCACAAAGTCGCAAAGCCCCACAGTCC was cut with restriction enzymes resulting in fragments of the expected size (~2-2.5 kb) in 91% of the clones. Thirteen clones were sequenced from their 5\' and 3\' terminal ends. None were identical in spite of a variable sequence homology (40-70%), as opposed to 90% of homology when the signal peptide coding regions were compared. In order to assure the cloning of functional genes, a cDNA Iibrary was constructed with degenerated primers ((5\') ATTTTTGTTCCGCAGAAGACGCAGGTG / (3\') ATTCAGTGGGCGGTTGTACAGAAAGAC) for reverse transcription of conserved sequences from the gp85/trans-sialidase supergene family excluding the hydrophobic sequences from both extremities. The cDNAs were amplified by PCR and cloned into pCR ®T7/NT-TOPO expression vector. 60 clones were selected and were subjected to restriction analysis and 90% of the clones showed fragments with the expected size. The expressed fusion proteins of 4 of these clones were recognized in Western blots by a polyclonal antibody raised against a fragment of Tc85-11 (H3.3). The sequences obtained from the 5\' termini revealed that all four clones belong to the gp85/trans-sialidase supergene family (GenBank TM). The alignment of these sequences with Tc85-11 showed a homology of 60-80% and an identity of 40-70% in aminoacid sequence. These data confirm the heterogeneity of the Tc-85 family that is expressed by the parasite. Additionally, the expression of high amounts of the corresponding proteins will allow the identification of putative Iigands for these trypomastigote specific surface proteins.

Submitted by Marlene Santos (marlene.bc.ufg@gmail.com) on 2016-04-19T18:10:39Z No. of bitstreams: 2 Tese - Greyciele Rodrigues de Almeida - 2015.pdf: 2860659 bytes, checksum: c6b139400f7d4d535cf2e4ccecbabaed (MD5) license_rdf: 19874 bytes, checksum: 38cb62ef53e6f513db2fb7e337df6485 (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2016-04-20T15:16:36Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Tese - Greyciele Rodrigues de Almeida - 2015.pdf: 2860659 bytes, checksum: c6b139400f7d4d535cf2e4ccecbabaed (MD5) license_rdf: 19874 bytes, checksum: 38cb62ef53e6f513db2fb7e337df6485 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-04-20T15:16:36Z (GMT). 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After three cycles of selection (biopanning) and amplification, 44 clones were isolated and their amino acid sequences were determined by sequencing generating 16 different sequences. ELISA, demonstrating the efficiency of selection from the specific antibodies, confirmed the reactivity of pooled clones. Another ELISA evaluated the individual specificity of the most frequent clones, the M13 phage was used as a negative control. We selected three peptides (B, C and E) with affinity for anti-BoHV-1 antibodies, and the E peptide (pepE), showed to have potential as antigen for antibody detection in a serological test for BoHV-1. Immunization of rabbits with the peptides induced specific production of serum antibodies, but they were not able do neutralize BoHV-1 cell lysis. The in silico analysis of the dodecapeptide E (1DRALYGPTVIDH12) enabled the identification of a new discontinuous epitope on the envelope glycoprotein B (gB Env) of bovine herpesvirus type 1 (BoHV-1). There is a short motif (338YKRD341) within a region of the env gB BoHV-1 with high similarity to motifs shared by dodecapeptide the N-terminal region (5YxARD1) of gB and HSV-1 (326YARD329), wherein the 328Arg residue is described as a target for neutralizing monoclonal antibodies (mAb) for HSV-1 gB. Besides the characterization of an antibody-binding site of the BoHV-1 Env gB, we have demonstrated that the phage-fused peptide has potential use as a reagent for virus diagnosis by phage-ELISA assay, discriminating BoHV-1 positive serum samples from negative ones. / Membro da família Herpesviridae, subfamília Alphaherpesvirinae, gênero Varicellovirus, o herpesvírus bovino 1 (BoHV-1) tem sido associado a diferentes condições clínicas em bovinos (doenças respiratórias, genitais e falhas reprodutivas). Não existe um procedimento padrão para medidas de controle e profilaxia das infecções causadas por herpesvírus. Nesse sentido, o phage display foi utilizado com o objetivo de selecionar novos antígenos mimetopos de glicoproteínas do herpesvírus bovino 1 (BoHV-1) e que apresentam potencial para uso em vacinas e diagnóstico. A técnica de phage display foi realizada com a utilização de uma biblioteca de peptídeos randômicos e lineares composta de 12 resíduos de aminoácidos fusionada à pIII de fagos M13 (sem peptídeo), contra anticorpos anti-BoHV-1, purificados em coluna de cromatografia por afinidade. Após três ciclos de seleção (biopanning) e amplificação, 44 clones foram isolados e as sequências de aminoácidos dos peptídeos foram determinadas pelo sequenciamento gerando 16 sequencias diferentes. A reatividade do pool de clones foi confirmada por ELISA, demonstrando a eficiência da seleção a partir dos anticorpos específicos. Para avaliação da especificidade individual, realizou-se o ELISA dos clones mais frequentes, tendo como controle negativo o fago M13. Foram selecionados três peptídeos (B, C e E) com afinidade por anticorpos anti-BoHV-1, e um destes, o peptídeo E (pepE), apresentou potencial antigênico na detecção de anticorpos para o diagnóstico sorológico do BoHV-1. Nos testes de imunização em coelhos, os três peptídeos induziram a produção de anticorpos específicos, porém, estes não foram capazes de neutralizar a lise celular ocasionada pelo BoHV-1 em placa. A análise in silico do dodecapeptídeo E (1DRALYGPTVIDH12) possibilitou a identificação de um novo epitopo descontínuo na glicoproteína B de envelope (Env gB) do BoHV-1. Há um curto motivo (338YKRD341) dentro de uma região do gene Env gB do BoHV-1, com alta similaridade com os motivos compartilhados pelo dodecapeptídio da região N-terminal (5YxARD1) da gB e do Herpesvirus Humano 1 (HSV-1) (326YARD329), em que o resíduo 328Arg é descrito como um alvo para anticorpos monoclonais neutralizantes (mAb) para a gB do HSV-1. Concluindo, além da caracterização de um sítio de ligação ao anticorpo na Env gB do BoHV-1, o pepE expresso pelo fago tem potencial de utilização como reagente para o diagnóstico virológico por ensaio ELISA-fago, que discrimina amostras de soro positivas e negativas para o BoHV-1.

Orientadores: Liana Maria Cardoso Verinaud, Luciana Campos Paulino / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campoinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-20T22:23:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DiGangi_Rosaria_M.pdf: 3869352 bytes, checksum: 6c11f8a4be727a58eb3974501efd287e (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: A paracoccidioidomicose (PCM), uma micose sistêmica, cujo agente etiológico é o fungo Paracoccidioides brasiliensis, acomete primariamente os pulmões e pode causar lesões secundárias na pele e mucosas, que são extremamente dolorosas e de difícil tratamento por métodos convencionais com drogas anti-fúngicas. Estudos anteriores, conduzidos em nosso laboratório, usando modelos experimentais para PCM, mostraram a capacidade do laser HeNe em aumentar a produção de citocinas pró-inflamatórias e a síntese de fibras colágenas, reticulina e de elementos de matriz extracelular, como laminina e fibronectina. Estes eventos levaram a uma cicatrização tecidual mais rápida e eficaz das lesões. Além disso, as células fúngicas recuperados a partir das lesões após tratamento com laser mostrou nenhuma capacidade de crescimento, quando cultivadas in vitro. Neste trabalho foi avaliada a ação direta do laser HeNe sobre o fungo com o objetivo de fornecer suporte para o uso desta terapia durante a infecção PCM. Os resultados mostraram que o tratamento com laser de HeNe reduziu a capacidade de crescimento e a viabilidade de células fúngicas em 90% e 30%, respectivamente. Ademais, as células tratadas apresentaram núcleo mais eletrondenso, sugerindo que a irradiação com laser induz alterações ultra-estruturais que podem afetar a viabilidade e/ou a virulência do fungo. Entretanto, a patogenicidade do fungo não foi afetada, uma vez que nenhuma diferença foi observada no pulmão de animais infectados com o fungo tratado e não tratado. Além dos efeitos sobre a resposta inflamatória, acreditamos que o laser de HeNe modifica, ou mesmo destrói, estruturas que são usadas pelo patógeno como mecanismos de resistência. Certamente, esta atividade fungistática/fungicida do laser também desempenha um papel importante na aceleração da cicatrização de feridas e, deste modo, a terapia com o laser de HeNe pode ser considerada como um tratamento adjuvante na cura de lesões da pele observados durante PCM / Abstract: Paracoccidioidomycosis (PMC), caused by the fungus Paracoccidioides brasiliensis (Pb), mainly affects the lungs and also causes painful lesions in the skin and mucous membranes that can remain active for months even after the beginning of antifungal treatment. In this work, we evaluated the effects of laser treatment on fungal cells, aiming to provide support for the use of this therapy during PCM. Pb yeast cells were exposed to laser for three consecutive days and then analyzed for growth inhibition, viability, 43-kDa glycoprotein (gp43) expression, infectivity, and ultra-structural alterations. HeNe laser treatment reduced the growth capacity and the viability of fungal cells, and increased gp43 expression. Laser-treated cells also showed pronounced structural alterations, since they were collapsed and presented deep folds. Additionally, remarkable changes were observed in the nucleus that presented a very electrondense form. The pathogenicity of P. brasiliensisafter laser treatment was also evaluated,and no differences were observed in pulmonary lesions comparing animals infected with laser-treated and non-treated yeast cells. Possibly HeNe laser is able to modify fungal structures involved in resistance and virulence mechanisms and therefore can be considered as an adjunctive therapy in the treatment of skin lesions observed during PCM / Mestrado / Imunologia / Mestre em Genética e Biologia Molecular