Glucocorticoids are mammalian steroid hormones secreted from the adrenal gland. The basal levels of glucocorticoids show a pronounced diurnal rhythm with maximum at the beginning of the active period and minimum at its end. Glucocorticoids have an influence over a variety of metabolic functions and their secretion is tightly regulated. This regulation also depends on the circadian system, which utilizes glucocorticoids to entrain the peripheral tissues by inducing rhythmic gene expression. The mechanisms by which glucocorticoids influence mammalian circadian system has not yet been precisely defined, especially concerning the influence of glucocorticoid signalling on gene expression in different tissues and the dynamics of glucocorticoid receptor (GR) occupancy. This thesis studies the influence of ablation of glucocorticoid signalization induced by adrenalectomy on the clock gene expression of in the central clock in the suprachiasmatic nucleus and peripheral clocks in the hippocampus and distal colon. The effect of adrenalectomy on gene expression is compared with the effect of restricting the feeding time, which has also been shown to affect glucocorticoid levels in the body. Other experiments were aimed at elucidating impact of changing the activity of GR on gene expression using synthetic GR...

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Os hormônios glicocorticóides causam uma completa reversão tanto \"in vitro\" quanto \"in vivo\" do fenótipo tumoral para normal, na linhagem celular ST1 de glioma de rato (Armelin & Armelin, 1983) que é um variante da linhagem C6 de glioma de rato. Neste trabalho, foram construídas bibliotecas normalizadas de cDNAs subtraídos e normalizadas, através da metodologia de PCR supressivo, para identificar genes regulados por glicocorticóides, potencialmente envolvidos na reversão fenotípica de células ST1. A construção e análise de duas bibliotecas de cDNAs subtraídos, permitiu o isolamento de 7 genes diferencialmente expressos, alguns dos quais são conhecidos efetores do controle da proliferação celular e/ou diferenciação: trombospondina-1, ciclina G, tirosina fosfatase CL100 e NRP/B. Foi isolado, também, um clone similar a tenascina-X, que apresenta um transcrito de tamanho diferente. O isolamento e caracterização de um cDNA completo correspondente a esse transcrito revelou que é constituído apenas por motivos de fibronectina tipo III e fibrinogênio. A dramática indução deste transcrito por hidrocortisona sugere um papel potencial para esse variante de TN-X no controle da proliferação celular. A análise da expressão destes genes em células P7, um variante de C6 que não sofre reversão fenotípica mediada com glicocorticóides, e em células U87 de glioblastoma humano, revelou que são expressos em níveis muito baixos ou indetectáveis, nestas células indicando que o produto destes genes pode ter um papel importante na reversão fenotípica tumoral-normal. A prevalência de transcritos raros e diferencialmente expressos nestas bibliotecas, mostra que são adequadas para o rastreamento, através de métodos automatizados de microarranjos de DNA, para a validação de clones diferencialmente expressos, podendo revelar, rapidamente, um painel de genes candidatos a estarem envolvidos nas respostas anti-proliferativa e anti-tumoral dos glicocorticóides. / Treatment of the C6 rat glioma cell variant, ST1 cells, with glucocorticoids, leads to a complete reversion of their transformed phenotype and loss of tumorigenic potential. In this work, two subtracted and equalized cDNA libraries were constructed, based on suppressive PCR, in order to identify glucocorticoid-regulated genes related to the ST1 phenotypic reversion. Analysis of both subtracted cDNA libraries revealed 7 differentially expressed genes, some of which are well known negative growth regulators: thrombospondin-1, cyclin G, tyrosine phosphatase CL 100 and NRP/B. In addition, a cDNA clone similar to TN-X, but exibiting a different transcript size was also isolated. Isolation and characterization of a full-length cDNA corresponding to this transcript, revealed that it is composed of fibronectin type III repeats and one single fibrinogen domain. Glucocorticoid induction of this transcript may suggest a different role of TN-X variants in controling cell proliferation. Expression analysis of the C6-derived glucocorticoid-resistant, P7 variant, and of the human glioblastoma U87 cells, revealed very low or undectable levels of these transcripts, further suggesting that their expression is related to the ST1 cells\' phenotypic reversion. Prevalence of rare and differentially expressed transcripts in these libraries suggests that they are likely to be useful in automated systems (DNA microarrays) to rapidly validate differentially expressed clones and to reveal a panel of candidate genes that mediate the anti-proliferative and anti-tumor effects of glucocorticoids.

Os hormônios glicocorticóides (GCs) têm sido amplamente empregados como agentes antiinflamatórios e anti-tumorais. Sua ação ocorre via receptores nucleares (GR) sendo dependente da remodelação da estrutura da cromatina. As proteínas Brm e BRG1, componentes essenciais de um complexo regulador global da transcrição (SWI/SNF), por remodelamento da cromatina, exercem um papel-chave na ação de GR. Para estudar o mecanismo de ação de GCs, foram utilizadas as linhagens celulares ST1 e P7, derivadas da linhagem celular C6, de glioma de rato. P7 é insensível ao tratamento com GC, enquanto ST1 apresenta reversão fenotípica tumoral→normal, gerando um bloqueio específico na fase G1. Um anti-soro policlonal específico para Brm e BRG1, foi gerado através da inoculaçâo de coelha com a proteína hBRG1 recombinante. Este antisoro foi utilizado para análisar os níveis destas proteínas nas duas linhagens celulares, sob ação de GC. Enquanto em ST1, Brm é induzida por GC, em células P7, o nível basal de Brm é relativamente alto, mantendo-se inalterado na presença de GC. A possíbilidade de existirem mutações no gene brm de células P7, foi investigada através de amplificação do DNA, por PCR, e seqüenciamento. A superexpressão de brm e BRG1 em células P7 mostrou que clones isolados apresentavam, de um modo geral, achatamento celular, diminuição da taxa de crescimento e da eficiência de plaqueamento em substrato sólido e semi-sólido. Alguns destes clones passaram a responder ao tratamento com GC, porém não tão drasticamente como as células ST1. Co-imunonoprecipitação mostrou algumas diferenças entre os complexos SWI/SNF de células ST1 e P7. / Glucocorticoid hormones (GCs) have been used as anti-inflammatory and anti-tumor agents, acting via nuclear receptors (GR) and being dependent on remodeling of the chromatin structure. As components of the global chromatin remodeling transcription complex (SWI/SNF), Brm and BRG-1 proteins play a key role in the action of GR. In order to study the mechanisms of action of GCs, we have been using the ST1 and P7 cell lines, derived from the C6, a rat glioma cell line. P7 is insensitive to the GC treatment, while ST1 displays a complete phenotypic reversion from tumoral to normal, including a G1-specific block in the cell cycle. A Brm and BRG1-specific polyclonal antiserum was generated, in rabbit, using recombinant hBRG1 protein as antigen. This antiserum was used to analyze the levels of Brm and BRG1 in these two cell lines, under GC treatment. While Brm is induced by GC, in ST1 cells, the basal level of Brm, in P7 cells, is relatively high, remaining unchanged under GC treatment. The possibility of brm mutations occurring in the P7 cells, was analyzed by DNA sequencing. Overexpression of brm and BRG1 in P7 cells led to morphological alterations (cell flattening) and decreased colony formation in agarose suspension and in solid substrate. Some of these clones became partially responsive to GC, when compared to the ST1 cell line. Co-immunoprecipitation assays revealed some differences in the SWI/SNF complex between ST1 and P7 cells.

Os ritmos biológicos circadianos garantem a relação temporal entre os seres e o ambiente. A regulação metabólica se relaciona à ritmicidade dos ciclos de claro-escuro, com importância das ações da melatonina e dos glicocorticoides no fígado. Investigamos a participação dos glicocorticoides no ajuste metabólico mediado pela secreção rítmica de melatonina e no contexto inflamatório hepático. Ratos Wistar machos pinealectomizados tratados ou não com RU 486 tiveram o padrão circadiano circulante de corticosterona, insulina e glicose aferido ao longo de 8ZTs e no ZT10. Neste ponto, analisou-se a expressão de RNAm e protéica envolvidas em ações metabólicas e inflamatórias. Testes in vivo de tolerância à glicose e ao piruvato e a fosforilação da Akt hepática no ZT10 em resposta à insulina, em conjunto às alterações de peso e composição corpórea, conteúdo de glicogênio e histologia do fígado, apontam maior influência da corticosterona na gliconeogênese e correlação de ambos os hormônios nas alterações energéticas e na instalação de um quadro pró-inflamatório hepático. / Circadian biological rhythms guarantee the temporal relationship between living beings and the environment. Metabolic regulation relates to the rhythm to the light-dark cycle, with importance of the actions of melatonin and glucocorticoids in the liver. We investigated the participation of glucocorticoids in the metabolic adjustment mediated by rhythmic secretion of melatonin on the liver inflammatory context. Male Wistar rats pinealectomized treated or not with RU 486 had the circadian levels of circulating corticosterone, insulin and glucose measured along 8ZTs and on ZT10. At this point, we analyzed mRNA and protein expression related to metabolic and inflammatory actions. In vivo tests to glucose and pyruvate tolerance and rating the phosphorylation of Akt in response to insulin in liver at ZT10, with the changes in weight and body composition, glycogen content and liver histology, indicate influence of corticosterone in gluconeogenesis and correlation of both hormones in energy alterations and on the installation of a hepatic pro-inflammatory process.

Le choc septique est la principale cause de mortalité dans les services de réanimation. Les glucocorticoïdes (GC) et la protéine C activée (APC) sont deux traitements adjuvants recommandés au cours du choc septique. Ce travail a pour objectif d'évaluer l'impact de la combinaison d'APC et des GC sur les paramètres hémodynamiques et la survie. Le sepsis expérimental se caractérise par une hypotension artérielle avec acidose lactique et une hyporéactivité vasculaire. L'administration de Dexa et/ou d'APC permet de diminuer les taux de lactates, d'interleukines et de nitrate/nitrite. Chez les groupes traités, la contraction est améliorée ainsi que la relaxation vasculaire des aortes et des artères mésentériques. L'administration d'APC et de Dexa, seul ou en association, entraine une diminution de l'expression induite d'iNOS et la restauration de la voie Akt. La combinaison APC et Dexa améliore le temps de survie de façon synergique. Nos résultats suggèrent que l'APC et les GC devraient être réévalués en association dans le traitement du choc septique / Sepsis remains the major cause of death in intensive care units. International guidelines for management of severe sepsis and septic shock recommend both stress-dose steroid therapy and recombinant activated protein C (APC). The aims of the present study were to compare the effects of APC and dexamethasone (Dexa) alone as well as in combination in resuscitated septic shock on survival, hemodynamics, and vascular reactivity. Sepsis was associated with a decrease in mean arterial pressure, elevation in plasma lactate and nitrite/nitrate concentration. Administration of APC, Dexa, and their combination improve arterial pressure and decrease lactate and nitrite/nitrate concentration. Both APC and Dexa improved arterial contractility and endothelial dysfunction resulting from septic shock in rats. The expression of iNOS was significantly reduced by the administration of Dexa, APC, and combination therapy. All treatments restore the Akt pathway. Moreover, their combination increased the length of survival. These findings suggest that APC and glucocorticoids should be further re-evaluated in combination in septic shock

A esclerose multipla (EM) é uma doença neurodegenerativa autoimune. As células da glia contribuem para o agravamento da EAE. Este trabalho objetiva mostrar a influência da dexametasona, na progressão da doença e nos défcits cognitivos da EAE. Foram utilizados camundongos C57BL/6, fêmeas, divididos em 4 grupos (CONT, DEX, EAE, EAE+DEX) imunizadas com MOG e Bordetella Pertussis, tratados com dexametasona (50mg/kg). Antes e após o aparecimento dos sintomas, os animais foram submetidos a testes comportamentais de campo aberto, labirinto em cruz elevado, contexto aversivo e reconhecimento de objetos. Os animais tratados com dexametasona (EAE+DEX) apresentaram diminuição do escore clínico em relação ao grupo EAE e apresentaram comportamento do tipo ansioso. Entretanto, o tratamento com DEX promoveu diminuição da memória de trabalho. Houve aumento marcadores inflamatórios e aumento do número de astrócitos no hipocampo do grupo EAE+DEX no 26o dia. Estes dados sugerem que a dexametasona diminui a aquisição da memória e aumenta o número e reatividade astrocitária na EAE. / Multiple sclerosis (MS) is an autoimmune neurodegenerative disease. The glial cells contribute to the aggravation of EAE. This work aims to show an influence of dexamethasone, the progression of the disease and the cognitive deficits of EAE. Female C57BL/6 mice were divided into 4 groups (CONT, DEX, EAE, EAE+DEX) immunized with MOG and Bordetella Pertussis, treated with dexamethasone (50mg/kg). Before and after the onset of symptoms, the animals were submitted to behavioral tests open field, the elevated plus maze, the aversive context and the object recognition test. The animals treated with dexamethasone (EAE+DEX) presented a decrease in the clinical score in relation to the EAE group and presented an anxious type behavior. However, treatment with DEX promoted a decrease in the work memory. There were increased inflammatory markers and increased number of hippocampal astrocytes from the EAE+DEX group on the 26th day. These data suggest that dexamethasone decreases memory acquisition and increases the astrocytic number and reactivity in EAE.

A neuroimunomodulação é um ramo da ciência que estuda as inter-relações existentes entre o SNC e o SI. O termo inter-relações foi empregado porque, sabe-se hoje serem estas relações bidirecionais. Conhecendo-se a existência desta comunicação, não é difícil de se supor que substâncias que atuem no sistema neuro-endócrino tenham a capacidade de influenciar as respostas imunes seja por uma ação neuroimune indireta ou por outra que se faça diretamente nas células imunes. Os canabinóides (endógenos, derivados da planta e sintéticos) apresentam um amplo espectro de ações, dentre as quais cabe destacar aquelas sobre o comportamento (ansiedade e medo), o sistema neuro-endócrino (ativação do eixo HHA) e imune (resposta imune inata e adquirida). Estes efeitos são geralmente atribuídos à ligação dos canabinóides a receptores específicos presentes no SNC (receptores CB1) e na periferia (receptores CB2). Neste sentido, buscamos neste trabalho avaliar os efeitos da Anandamida (AEA), uma agonista canabinóide endógeno, sobre o comportamento, a ativação do eixo HHA e alguns parâmetros de atividade imune adquirida, e o fizemos à luz de mecanismos neuroimunomodulatórios. Nossos resultados mostraram que os efeitos da AEA sobre o comportamento são dependentes da dose e, também, do tempo de latência para as observações. Neste sentido, 10 minutos após a administração de doses crescentes de AEA observou-se, tanto no campo aberto como no LCE, um efeito que seguiu um padrão de curva em U invertido dependente da dose. Nossos resultados mostraram, também, que a AEA na dose de 0,1mg/kg administrada 90 minutos antes das observações, aumentou o tempo gasto pelos animais em movimento na zona periférica e diminui o tempo gasto em movimento na zona central do campo aberto. Mostrou-se, ainda, que a AEA na dose de 0,1mg/kg aumentou acentuadamente os níveis séricos de corticosterona nos animais medidos 45 e 90 minutos após a administração. Finalmente, mostrou-se que uma dose de 0,1mg/kg de AEA previamente a uma imunização com OVA promoveu um aumento da reposta de hipersensibilidade do tipo tardia (DTH) e um aumento na porcentagem de proliferação de células T CD4+. Estes resultados em seu conjunto permitem sugerir que a AEA (0,1mg/kg) administrada 90 minutos antes das observações tenha se comportado como um estressor químico, promovendo efeito semelhante ao de ansiogênicos no campo aberto e aumentando os níveis séricos de corticosterona; esses níveis aumentados de corticosterona teriam sido os responsáveis pelo aumento da resposta imune celular (Th1) observada. / Neuroimmunomodulation is a field of research concerned with the relationships between the CNS and the IS. The term relationship is frequently employed because it is assumed that such communication is bidirectional. In this regard, if we consider that this communication exists, it should be accetable that substances acting on the neuroendocrine system are able of modifying immune responses, either acting via a neuroimmune indirect pathway, or acting directly on immune cells. Cannabinoids (endogenous, plant derived, and synthetic) show a large spectrum of actions over the body. We emphasize here, behavioral (anxiety and fear), endocrine (HPA axis activation), and immune (innate and adaptative immunity) effects. These effects are generally attributed to cannabinoid bind to specific receptors present on CNS (CB1 receptors) and in the periphery (CB2 receptors). In this sense, we evaluated Anandamide (AEA, an endogenous cannabinoid agonist) effects, on behavior, HPA axis activation, and parameters of adaptative immunity, particularly neuroimmune relationships. Briefly, our results show that the AEA effects on behavior are dependent on the dose and time. Thus, 10 minutes after injection of growing increasing doses of AEA, we found in the open field and plus maze an inverted U-shape dose-response for AEA which is characteristic of cannabinoids in this type of behavioral evaluation. Additionally we show, that AEA 0,1mg/kg after 90 minutes of administration increased the time spent in the peripheral zone, and decreased the time spent in the central zone of the open field. Furthermore, we found that AEA 0.1mg/kg strongly increased the serum levels of corticosterone after 45 and 90 minutes of administration. Finally, we show that AEA 0.1mg/kg prior to immunization promoted an increase of delayed-type hypersensitivity (DTH) and an increase in the percentage of CD4+ T cell proliferation. These results allow us to suggest that AEA 0.1mg/kg 90 minutes after administration acted as a chemical stressor, promoting an anxiogenic-like effect in the open field, and increasing the serum levels of corticosterone. Additionally, the increased levels of corticosterone at the moment of antigenic exposition could be responsible for the increased cell-mediated immunity (Th1) observed.

Não é claro como o receptor de glicocorticóide (GR) contrarregula a atividade do STAT5 na transição da gestação para a lactação. Dexras1 é uma pequena proteína G ativada por dexametasona (DEX), que regula morfologia celular, crescimento, etc. Neste estudo detectamos a expressão de Dexras1 em células beta de ilhotas pancreáticas. DEX induz a expressão de Dexras1 em células RINm5F, que está aumentada na gestação e diminuída na lactação. A expressão protéica de 11<font face=\"Symbol\">&#946HSD1, enzima ativadora de glicocorticóides (GCs), segue esse perfil. A ligação tanto do GR como do STAT5, analisada por ChIP assay, ao promotor do gene da Dexras1 aumentada por DEX é revertida por prolactina (PRL), e está diminuída e aumentada na gestação e lactação, respectivamente. DEX induz a associação ao GR, fosforilação e translocação nuclear do STAT5b. O silenciamento gênico de Dexras1 promoveu aumento da secreção de insulina, e aumentou os níveis de pERK1/2, pCREB, pPKC<font face=\"Symbol\">&#948 e PKA. Sendo assim, a regulação de Dexras1 por PRL e GCs contribui para a secreção de insulina característica do periparto. / It is not clear how glucocorticoid receptor (GR) counteracts STAT5 activity during the transition of pregnancy to lactation. Dexras1 is a small G protein activated by dexamethasone (DEX) that controls cell morphology, growth, etc. In the present study we detected Dexras1 expression in pancreatic beta cell. DEX induces Dexras1 expression in RINm5F cells, which is increased in pregnancy and decreased in lactation. The expression of 11<font face=\"Symbol\">&#946HSD1, the glucocorticoids (GCs) activating enzyme, followed Dexras1 profile in pancreatic islet. Both GR and STAT5b bindings to Dexras1 gene promoter, analyzed by ChIP assay, are increased by DEX and PRL counteracts this effect. Both bindings are decreased in pregnancy and increased in lactation. DEX induces STAT5b association to GR, phosphorylation and nuclear translocation. Dexras1 knockdown using small interference RNA (si-RNA) promoted an increase in insulin secretion, as well as increased levels of pERK1/2, pCREB, pPKC<font face=\"Symbol\">&#948 and PKA. Thus, Dexras1 regulation by PRL and GCs contributes to insulin secretion during peripartum.

O processo adaptativo a hipóxia implica em modificações nas funções endócrinas e metabólicas. Embora seja bem estabelecido que o metabolismo de carboidratos é profundamente alterado pela hipóxia, muito pouco se sabe acerca dos efeitos in vivo do estresse hipóxico no metabolismo de proteínas na musculatura esquelética. Portanto, o presente trabalho teve como objetivo avaliar os efeitos agudos da hipóxia intermitente nos processos de síntese e degradação protéica em músculos esqueléticos de ratos e a possível participação dos glicocorticóides na resposta induzida pela hipóxia. Para isso, ratos jovens (~80g) foram expostos à hipóxia intermitente aguda (HIA) por 8 horas (6% O2 durante 40 segundos em intervalos de 9 minutos). Os resultados mostram que a HIA é uma situação catabólica que resulta no aumento da glicose e insulina plasmática, na redução do conteúdo do glicogênio hepático (97%), oxidação de glicose muscular (40%) e massa do tecido adiposo branco retroperitoneal e epididimal (30%), sem alterações na massa muscular. No metabolismo protéico, os animais hipóxicos apresentaram aumento da proteólise total em músculos soleus e EDL acompanhada por uma hiperativação dos sistemas proteolíticos dependente de ubiquitina (Ub)-proteassoma e dependente de cálcio, sem que houvesse alterações na síntese protéica. Essa resposta foi associada ao maior conteúdo de proteínas miofibrilares conjugadas à Ub e à ativação da expressão de genes relacionados à atrofia (atrogina-1 e MuRF1) e autofagia (LC3 e GABARAP ). Adicionalmente, em músculos soleus, observou-se redução da fosforilação da Akt (Ser473), uma proteína chave no controle do metabolismo protéico. Verificou-se ainda que a adrenalectomia em animais hipóxicos preveniu a ativação dos sistemas proteolíticos e a transcrição do RNAm dos \"atrogenes\" sem alterar a autofagia. Esses dados mostram que a HIA, durante 8 horas, age como um gatilho catabólico no processo de degradação de proteínas dependente de Ub-proteassoma e cálcio assim como na hiperexpressão de genes relacionados à atrofia e autofagia. A ativação do programa atrófico induzido pela HIA parece ser mediada pelos glicocorticóides sendo esta resposta provavelmente importante para o fornecimento de aminoácidos do músculo para o fígado e manutenção da hiperglicemia. Portanto, essa resposta catabólica se sustentada pode levar à perda de massa muscular esquelética em situações de exposição prolongada à hipóxia intermitente. / The adaptive process to hypoxia involves changes in endocrine and metabolic functions. Although it is well established that the carbohydrate metabolism is profoundly altered by hypoxia, the in vivo effects of hypoxic stress on protein metabolism in skeletal muscle is still poorly understood. Thus, the main goal of the present work was to investigate the acute effects of intermittent hypoxia on the processes of synthesis and protein degradation in rat skeletal muscles and the possible role of glucocorticoids in the responses induced by hypoxia. For this, young rats (~80g) were exposed to acute intermittent hypoxia (AIH) for 8 hours (6% O2 for 40 seconds at 9 minutes intervals). The data show that AIH is a catabolic situation that increases plasma levels of glucose and insulin, reduces the content of liver glycogen (97%), the muscle glucose oxidation (40%) and the retroperitoneal and epididymal white adipose tissue mass (30%), without changing muscle mass. With respect to the protein metabolism, AIH rats showed an increase in the rates of overall proteolysis in soleus and EDL muscle, which were accompanied by a hyperactivity of the ubiquitin (Ub)-proteasome and calcium-dependent proteolytic systems, without changes in rates of protein synthesis. This response was associated with a high content of myofibrillar proteins Ub-conjugates and mRNA levels of atrophy-related genes (atrogin-1 and MuRF1) and autophagic genes (LC3 and GABARAP). Furthermore, in soleus muscle, we observed reduction of Akt phosphorylation (Ser473), a key protein in the control of protein metabolism. It was also found that adrenalectomy prevented activation of proteolytic systems and gene transcription of \"atrogenes\" in hypoxic rats, while the autophagic genes were not affected. The data suggest that the AIH, during 8 hours, acts as a catabolic trigger activating the Ub-proteassome and calcium-dependent proteolytic processes, as well as the expression of atrophy-related genes and autophagy. The activation of atrophy program induced by hypoxia seems to be mediated by glucocorticoids, and is probably important for the provision of amino acids from muscle to the liver which maintains the hyperglycemia. Therefore, this catabolic response, if sustained, can lead to the loss of skeletal muscle mass in situations of prolonged exposure to intermittent hypoxia.