As serinoproteases de peçonha de serpentes (SVSPs) agem sobre pontos específicos do sistema circulatório, sendo consideradas promissoras para o tratamento de uma diversidade de desordens hemostáticas. No presente estudo, é descrita a expressão de uma serinoprotease de Crotalus durissus collilineatus (Collineina-1) em Pichia pastoris, bem como a purificação dessa toxina a partir da peçonha de C. d. collilineatus e a caracterização estrutural e enzimática da Collineina-1 nas formas nativa e recombinante. O cDNA que codifica a serinoprotease foi amplificado a partir da biblioteca de cDNA da glândula de peçonha de C. d. collilineatus e ligado ao vetor pPICZ A. A linhagem KM71H de P. pastoris foi transformada com o plasmídeo recombinante e as colônias foram selecionadas por resistência à zeocina. A expressão heteróloga foi realizada em meio mínimo suplementado com metanol, resultando em um rendimento de 56 mg de proteína por litro de cultura. A proteína recombinante foi purificada por um protocolo baseado em técnicas cromatográficas de troca iônica e fase reversa. A purificação da serinoprotease a partir da peçonha de C. d. collilineatus foi realizada pela combinação de técnicas de cromatografia de exclusão molecular, troca iônica e fase reversa, e resultou no isolamento de duas isoformas, denominadas Collineina-1 e 2. Quando analisada por espectrometria de massas, a Collineina-1 recombinante apresentou massa molar de 28.868 Da, enquanto as enzimas Collineina-1 e 2 apresentaram massas de 29.475 Da e 29.388 Da, respectivamente. A partir do alinhamento das sequências parciais das serinoproteases, foi possível determinar 100% de identidade dos aminoácidos para a Collineina-1 nativa e recombinante. O alinhamento múltiplo da sequência deduzida de aminoácidos da Collineina-1 indica uma semelhança estrutural dessa proteína com outras serinoproteases de peçonha de serpente. As enzimas nativa e recombinante mostraram efeitos similares sobre fibrinogênio bovino por clivarem preferencialmente a cadeia A do fibrinogênio, liberando o fibrinopeptídeo A. Ambas as enzimas induziram a coagulação do plasma bovino de forma dose-dependente, sendo que a Collineina-1 recombinante apresentou maior potencial coagulante, com uma dose mínima coagulante (DMC) de 0,08 mg/uL contra 0,225 mgu/L para a proteína nativa. As serinoproteases foram capazes de hidrolisar os substratos cromogênicos S-2222, S-2238 e S2302, embora ambas as enzimas tenham demonstrado maior atividade sobre o substrato S-2302. A atividade esterásica sobre o TAME foi avaliada em diferentes condições de temperatura e na presença de íons divalentes. As duas enzimas demonstraram alta termoestabilidade e tiveram a atividade inibida na presença dos íons Zn2+ e Cu2+. A cinética enzimática de ambas as serinoproteases seguiram o modelo de Michaelis-Menten. A Collineina-1 nativa apresentou um valor de Km de 1,43 mM, contra 1,682 mM para a proteína recombinante, indicando que a proteína nativa apresenta maior afinidade pelo substrato TAME. No entanto, as enzimas apresentaram valores similares de Kcat/Km (250,69 mM.min-1 para a Collineina-1 e 248,03 mM.min-1 para a rCollineina-1), sugerindo que as serinoproteases não diferem significativamente na eficiência em hidrolisar o substrato. Estes resultados demonstraram a adequação do sistema de escolha na produção heteróloga da Collineina-1, já que a proteína recombinante foi expressa com integridade funcional sobre os parâmetros avaliados. / Snake venom serine proteases (SVSPs) act on specific points of the circulatory system and are promising for the treatment of a variety of hemostatic disorders. In the present study, we describe the expression of a serine protease from Crotalus durissus collilineatus (Collineina- 1) in Pichia pastoris, the purification of the native toxin from C. d. collilineatus venom and the structural and enzymatic characterization of Collineina-1 in native and recombinant forms. The cDNA encoding the serine protease was amplified from cDNA library of C. d. collilineatus venom gland and cloned into pPICZ A vector. KM71H P. pastoris strain was transformed with the recombinant plasmid and colonies were selected by zeocin resistance. Heterologous expression was carried out in minimal medium supplemented with methanol, resulting in a yield of 56 mg of protein per liter of culture. The recombinant protein was purified by ion exchange and reverse phase chromatography. Purification of the native serine protease was accomplished by combining techniques of molecular exclusion, ion exchange and reversed phase, and resulted in the isolation of two isoforms, named Collineina-1 and 2. When analyzed by mass spectrometry, the recombinant Collineina-1 showed a molar mass of 28,868 Da, while Collineina-1 and 2 presented masses of 29,475 and 29,388 Da, respectively. The alignment of partial sequences of the enzymes resulted in 100% of amino acid identity between native and recombinant Collineina-1. The multiple alignment of deduced amino acid sequence of Collineina-1 indicates structural similarity with other snake venom serine proteases. The native and recombinant forms of the enzyme showed similar effects on bovine fibrinogen by cleaving preferentially A chain, releasing fibrinopeptide A. Both enzymes induced coagulation of bovine plasma in a dose-dependent way, though recombinant Collineina-1 presented a higher coagulant potential, with a minimum coagulant dose (MCD) of 0.08 mg/uL against 0.225 mg/uL for the native form. The serine proteases hydrolyzed S- 2222, S-2238 and S2302 chromogenic substrates, although both enzymes demonstrated increased activity upon S-2302. The esterase activity on TAME was evaluated at different temperatures and in the presence of divalent ions. Both enzymes showed high thermostability and their activity were inhibited in the presence of Zn2+ and Cu2+. The enzyme kinetics of both serine proteases followed Michaelis-Menten model. The native Collineina-1 showed a Km value of 1.43 mM, against 1.682 mM for the recombinant form, indicating that the native protein has a higher affinity for TAME substrate. However, enzymes had similar values for Kcat/Km (250.69 mM.min-1 for Collineina-1 and 248.03 mM.min-1 for rCollineina-1), suggesting that the serine proteases did not differ significantly in the efficiency to hydrolyze the substrate. These results demonstrated the adequacy of the system of choice in producing the snake venom serine protease, since the recombinant protein was expressed with functional integrity on the evaluated parameters.

Preeclampsia results from incomplete trophoblast invasion of the spiral arteries during early pregnancy. Vascular endothelial growth factor (VEGF) and plasminogen activator inhibitor-1 (PAI-1) are critical factors involved in angiogenesis, invasion and hemostasis at the maternal-fetal interface. Both factors are transcriptionally regulated by hypoxia inducible factor (HIF), a heterodimeric complex consisting of HIF-1[beta] and either HIF-1[alpha] or -2[alpha] whose specificity or redundancy in gene regulation is cell-type specific. This study uses siRNA technology to dissect the mechanisms of hypoxia-mediated regulation of PAI-1 and VEGF expression in first trimester trophoblasts. Immortalized first trimester human extravillous trophoblasts (HTR8/SVneo cells) were maintained in serum-free and serum-containing media for 4h (n=3-4), 8h (n=6), 24h (n=5) and 48h (n=5) under normoxic (21% O2) and hypoxic (1-2% O2) conditions to determine a time of maximum induction of both VEGF and PAI-1. Subsequently, cells were maintained for 48h in the presence or absence of siRNA for HIF-1[alpha], HIF-2[alpha], HIF-1[alpha] + -2[alpha], a non-targeting (NT) sequence or Cyclophilin B (CB). Media were then removed, cells lysed, and Western blotting used to assess HIF-[alpha] knockdown. VEGF and PAI-1 levels in the media were quantified by ELISA and results expressed as pg or ng/[micro]g protein. Results from 3 to 8 independent experiments were analyzed using unpaired t-tests. Under hypoxic conditions treatment of cells with HIF-1[alpha], HIF-2[alpha] or HIF -1[alpha] + -2[alpha] siRNA resulted in >90% HIF-Ñ protein knockdown as determined by Western blotting. 48h of hypoxic treatment caused a statistically significant increase in PAI-1 levels (p<0.01) and VEGF levels (p<0.001) compared to normoxic controls. Under hypoxic conditions, PAI-1 levels were 4.75 [plus-minus] 0.46 ng/[micro]g protein and VEGF levels were 7.27 [plus-minus] 1.08 pg/[micro]g protein. Treatment with siRNA to HIF-1[alpha], HIF-2[alpha] and HIF-1[alpha] + -2[alpha] significantly reduced PAI-1 levels to 3.3 [plus-minus] 0.35 (p<0.02), 3.1 [plus-minus] 0.38 (p<0.03) and 2.4 [plus-minus] 0.19 (p<0.003), respectively. No significant difference in PAI-1 reduction was noted between the three HIF siRNA conditions. Under hypoxic conditions, levels of VEGF in cells treated with siRNA to HIF-1[alpha] (5.79 [plus-minus] 0.55), HIF-2[alpha] (5.50 [plus-minus] 1.24) and HIF-1[alpha] + -2[alpha] (4.24 [plus-minus] 0.93) were reduced compared to the hypoxic control (7.27 [plus-minus] 1.08), yet these effects did not reach statistical significance. However, when compared with the levels observed in cells treated with NT siRNA (9.90 [plus-minus] .98), all HIF siRNA treatments promoted a significant reduction in VEGF expression (p<0.003, p<0.02 and p<0.003 for HIF-1[alpha], HIF-2[alpha] and HIF-1[alpha]+ -2[alpha], respectively). In conclusion, these results indicate that hypoxia-mediated changes in PAI-1 and VEGF expression in trophoblasts are regulated similarly by both HIF-1[alpha] and HIF-2[alpha]. This provides important insight into the molecular mechanisms regulating hemostasis and trophoblast invasion as well as their potential dysfunction in pregnancies complicated by preeclampsia

Hydroxyethyl starches (HES) are the most routinely used synthetic colloids during fluid resuscitation and have reported effects on coagulation. The overall goal of the investigation in this thesis was to evaluate the effects of tetrastarch administration on hemodynamic, laboratory, and hemostatic variables in healthy dogs and dogs with systemic inflammation. The objectives were to compare hemodynamic and laboratory variables in dogs receiving an isotonic crystalloid (0.9% NaCl) or tetrastarch during health and after induction of systemic inflammation; to compare the hemostatic effects of an isotonic crystalloid (0.9% NaCl) and synthetic colloid (tetrastarch) in healthy dogs and dogs with induced systemic inflammation; to compare two different protocols for TEG® activation and to determine the correlation between TEG® variables and traditional coagulation test results. Sixteen adult purpose-bred Beagles were randomized into one of two groups receiving fluid resuscitation with either 40 mL/kg IV isotonic crystalloid (0.9% NaCl) or synthetic colloid (tetrastarch) after administration of lipopolysaccharide (LPS; 5 μg/kg, IV) or an equal volume of placebo (0.9% NaCl, IV). Blood samples, for analysis, were collected at 0, 1, 2, 4, and 24 hours from the time of fluid resuscitation. After a 14-day washout period, the study was repeated such that dogs received the opposite treatment (LPS or placebo) and the same resuscitation fluid. Resuscitation with equal volumes of 0.9% NaCl and tetrastarch caused similar changes in hemodynamic and laboratory variables in dogs with LPS-induced systemic inflammation; however, larger increases in HR and blood pressure were seen within the first 2 hours following tetrastarch administration compared to 0.9% NaCl. Tetrastarch administration increased COP in all dogs, despite a decrease in TS. Tetrastarch bolus administration to dogs with LPS-induced systemic inflammation also resulted in a transient hypocoagulability characterized by a prolonged PTT, decreased clot formation speed and clot strength, and acquired type 1 von Willebrand disease. Considering the limited additional benefit of tetrastarch administration on hemodynamic variables demonstrated, as well as the transient adverse hemostatic effects of tetrastarch administration, the increased cost associated with the use of tetrastarch likely negates its use as a first line treatment during fluid resuscitation in dogs. / Pet Trust Fund

Diss. (sammanfattning) Stockholm : Karol. inst., 2004. / Härtill 6 uppsatser.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / The objective of this experiment was to document the postoperative evolution of New Zealand rabbits that underwent a hemi laminectomy surgery (T13-L1) and received a graft of autogenous muscle as an hemostatic agent into the spinal canal. These animals were followed for a period of 14 and 28 days with daily neurological assessments and, at the end of their follow-up period, were euthanized in order to remove the graft site to be examined microscopically. The animals were divided into 6 groups such as the control group A and B, C and D treated with 25% decrease of the medullary canal and, E and F treated with 50% decrease of the medullary canal. All groups were evaluated neurologically every day until euthanasia. Groups A, C and E were euthanized at 14 days after the surgery and groups B, D and F at 28 days. The segments T11-L3 vertebral column of all the rabbits were collected and sent for histopathological examination. In order to evaluate the neurological postoperative effect, the animals were classified daily by the Tarlov scale and the results were compared by nonparametric Kruskal-Wallis test for each time (days). There was no statistical difference among the groups. Histopathological examination showed the presence of muscle grafted in the spinal canal and the spinal cord compression caused by the graft. / A hemorragia é uma preocupação importante em pacientes submetidos a intervenção cirúrgica descompressiva da medula espinhal ou de estabilização na coluna vertebral. O objetivo desse experimento foi documentar a evolução pós-operatória de coelhos Nova Zelândia que sofreram hemilaminectomia (T13-L1) e receberam um segmento de músculo autógeno como agente hemostático dentro do canal vertebral. Os animais foram separados em seis grupos sendo os grupos A e B controle, C e D tratados com diminuição de 25% do canal medular e E e F tratados com diminuição de 50% do canal medular. Todos os coelhos tiveram avaliação neurológica diária até a eutanásia. Aqueles dos grupos A, C e E sofreram eutanásia aos 14 dias de pós-operatório e os demais (B, D e E) aos 28 dias. Os segmentos T11-L3 da coluna vertebral contendo a medula espinhal de todos os coelhos foram coletados e enviados para exame histopatológico. Para avaliação neurológica no pós-operatório, os animais foram classificados diariamente pela escala de Tarlov e os resultados foram comparados entre eles pelo teste não paramétrico de Kruskal-Wallis para cada tempo (dia). Não houve diferença estatística da avaliação neurológica entre os grupos estudados. O exame histopatológico demonstrou a presença do músculo transplantado no canal vertebral e a compressão da medula espinhal provocada pelo enxerto.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / This study evaluated the use of bipolar electrosurgery and laparoscopic clip applier with respect to surgical time, blood loss and inflammatory response during video-assisted ovariohysterectomy with two portals. Two groups (n=10) assessed each of the hemostatic techniques during castration and a third group (GIII, n=6) evaluated changes in serum promoted only by the clinical and anesthetic protocols used in order to exclude the changes made by them. The surgical times, such as the volume of blood loss were significantly lower in Bipolar Group. The inflammatory response was significantly higher throughout the evaluation period after surgery, but no clinical manifestations different than those presented by the Clipador Group. There were no significant changes in packed cell volume between the groups, but among the times evaluated it reduced about 10% from initial value until four hours after the procedure, in the surgical groups and Group III. Both techniques have good execution by the video-assisted procedure, however, the use of bipolar forceps allows minor surgical times, minimal blood loss and shorter learning curve for the surgeon. The bleeding does not result in physiological changes and that one s on packed cell volume are presented because of the clinical and anesthetic protocols. / Este estudo avaliou a utilização da eletrocirurgia bipolar e do clipador laparoscópico em relação ao tempo cirúrgico, perda sanguínea e resposta inflamatória durante a ovariohisterectomia videoassistida com dois portais. Dois grupos (n=10) avaliaram cada uma das técnicas hemostáticas durante as castrações e um grupo (GIII, n=6) avaliou as alterações séricas promovidas somente pelo protocolo clínico e anestésico utilizado, a fim de excluir as alterações promovidas por estes. O tempo cirúrgico, assim como o volume de sangue perdido foram significativamente menores no Grupo Bipolar. A resposta inflamatória apresentou valores significativamente maiores durante todo o período de avaliação pósoperatório, sem manifestações clínicas diferentes das apresentadas pelo Grupo Clipador. Em relação ao hematócrito não houve alterações significativas entre os grupos, mas entre os tempos de avaliação reduziu cerca de 10% do valor inicial, até quatro horas do final do procedimento, tanto nos grupos cirúrgicos como no Grupo III. Ambas as técnicas são de boa execução através do procedimento videoassistido, porém, o uso da pinça bipolar permite menores tempos cirúrgicos, sangramento mínimo e menor curva de aprendizado do cirurgião. O sangramento não acarreta em alterações fisiológicas e as mudanças apresentadas no hematócrito são provenientes dos protocolos clínico e anestésico instituídos.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:23:40Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2004-12-17Bitstream added on 2014-06-13T20:50:50Z : No. of bitstreams: 1 almeidajunior_p_me_araca.pdf: 2659878 bytes, checksum: 7b05cfcaf4408ab253ef351ae3eb5826 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / A hemorragia após extração dental constitui-se em uma das complicações mais freqüentes na prática da cirurgia oral. Devido à dificuldade para se exercer manobras como pinçamentos e ligaduras de vasos neste tipo de hemorragias, existe a possibilidade do preenchimento do alvéolo com materiais hemostáticos de ação tópica. O propósito deste estudo foi analisar a influência de três hemostáticos tópicos (Hemostop®, Pro Tape® e ViscoStat®) na cronologia do processo de reparo em feridas de extração dental por meio de uma análise histológica e histométrica. Para tanto foram utilizados 60 ratos (Wistar) machos divididos em quatro grupos de 15 animais cada. Todos os animais foram submetidos à extração do incisivo central superior direito, seguido ou não da colocação de agente hemostático entre o terço médio e apical do alvéolo dental, e posterior sutura com fio reabsorvível. Em grupos de cinco, os animais foram sacrificados aos 7, 14 e 28 dias pós-operatórios por inalação excessiva de éter sulfúrico. Suas maxilas foram separadas, fixadas em formalina, descalcificadas em EDTA e incluídas em parafina. Foram realizados cortes de 6 æm de espessura e corados com Hematoxilina e Eosina, e Tricrômio de Masson. Após a análise histológica, em microscópio óptico; e histometria óssea, com o software ImageLab, os resultados foram submetidos ao teste não-paramétrico de Kruskal-Wallis. Pela metodologia aplicada foi possível concluir que: 1) houve atraso na cronologia do processo de reparo alveolar em todos os grupos tratados; 2) os materiais analisados provocaram intensa reação inflamatória no tecido adjacente; 3) em todos os períodos estudados (7, 14 e 28 dias), a análise histométrica revelou maior neoformação óssea nos animais do grupo 1 (controle). No entanto, a análise estatística constatou diferença significante (p<0,05) somente no 70 dia,... / The hemorrhage after dental extraction is one of the most frequent complications in practice of the oral surgery. Due to the difficulty to exercise maneuvers as arrestty and ligature of blood vessel in this type of hemorrhages, exists the possibility of the filling of the alveolus with hemostatics materials of topical action. The purpose of this study was to analyze the influence of three topical hemostatics (Hemostop®, Pro Tape® and ViscoStat®) in the chronology of the repair process in wounds of dental extraction through a histologic and histometric analysis. For such, 60 male's rats (Wistar) were used divided in four groups of 15 animals each. All the animals were submitted to the extraction of the right superior central incisor, followed or not of the placement of hemostatics agent among the medium and apical third of the dental alveolus, and subsequent suture with reabsorble filament. In groups of five, the animals were sacrificed to the 7, 14 and 28 postoperative days by excessive inhalation of sulfuric ether. Your maxillaries were separate, fixed in formalin solution, decalcified in EDTA and included in paraffin. Cuts of 6 æm of thickness were accomplished and stained with hematoxylin and eosin, and Masson's trichromic. After the histologic analysis, in optical microscope; and histometric bony, with the software ImageLab, the results were submitted to the no-parametric test of Kruskal-Wallis. For the applied methodology it was possible conclude that: 1) there was delay in the chronology of the alveolar repair process in all the treated groups; 2) the analyzed materials instigated a intense inflammatory reaction in the adjacent tissue; 3) in all the studied periods (7, 14 and 28 days), the histometric analysis revealed larger bony neoformation in the animals of the group 1 (control group)...(Complete abstract click electronic access below)

Orientadores: Elinton Adami Chaim, Jose Vassallo, Joyce Maria Annichino Bizzacchi / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-14T21:20:09Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Souto_LuisRicardoMartinhao_D.pdf: 19878737 bytes, checksum: 1bbe9e3450d7a801d05771b6998776a4 (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: Cirurgias plásticas em pacientes que foram previamente submetidos à gastroplastia redutora apresentam altos índices de complicações, destacando-se maior sangramento nos períodos intra e pós-operatórios. A causa desse sangramento é desconhecida; postula-se que haja alterações de hemostasia não detectadas pelos exames pré-operatórios de rotina ou que esses pacientes tenham vasos subcutâneos em número e/ou calibre aumentados. O objetivo desse estudo foi avaliar e comparar a hemostasia e o número e calibre de vasos subcutâneos em dois grupos de pacientes submetidos à abdominoplastia, um deles com história de gastroplastia redutora prévia pela técnica de Fobi-Capella (grupo I) e o outro sem antecedentes de obesidade (grupo II). Cada um dos grupos foi composto por 10 pacientes do sexo feminino. Foram dosadas vitaminas C e K no período pré-operatório. Em diferentes momentos (antes, durante e após as cirurgias) foram realizados exames laboratoriais rotineiros e de dosagem de fatores de coagulação, além de tromboelastografia. Ao final de cada cirurgia, foram colhidas amostras de tecido subcutâneo de seis diferentes topografias abdominais. O sangramento durante as cirurgias foi medido de forma indireta, através de contagem e pesagem de compressas ao final de cada procedimento. Os resultados dos exames laboratoriais e tromboelastografia foram comparados entre os dois grupos de pacientes. Foi também realizado estudo imunoistoquímico das amostras de tecido subcutâneo com anticorpos anti-CD34 (antígeno de superfície presente em vasos e células imaturas hematopoéticas) e avaliadas a densidade de microvasos (MVD) e as áreas endoteliais percentual (AEnd%) e média (AEndM), através de sistema de análise de imagem computadorizado. A análise estatística (Mood Median Test) mostrou sangramento maior (p = 0,007), com tempo de protrombina aumentado (p = 0,007) e dosagem de fator II diminuída no período intraoperatório (p = 0,007) e de fator X diminuída em todos os períodos avaliados nas pacientes do grupo I. A tromboelastografia, que avalia a hemostasia globalmente e no momento da coleta, não mostrou diferenças dos parâmetros avaliados entre os grupos. Demonstraram-se maiores concentrações de vitamina K no grupo I em relação ao grupo II. Não houve diferença estatisticamente significativa entre os valores de MVD obtidos a partir de diferentes sub-regiões abdominais (p = 0,565) nem quanto aos valores de MVD (p = 0,88), AEnd% (p = 0,364) e AEndM (p = 0,257) entre os grupos I e II. O tamanho das peças cirúrgicas e o tempo das cirurgias foram maiores no grupo I (p = 0,007). O maior sangramento durante cirurgias plásticas realizadas em pacientes previamente submetidas à gastroplastia redutora não pode ser explicado por alterações de hemostasia verificada através de exames laboratoriais de coagulação, dosagem de fatores e tromboelastografia, por deficiências de vitaminas C ou K ou por um maior número de vasos sanguíneos, por uma malha vascular mais extensa ou pela presença de vasos mais calibrosos no tecido celular subcutâneo dessas pacientes. Os dados favorecem a hipótese de que as retiradas de maiores quantidades de tecido e o maior tempo das cirurgias nas pacientes do grupo I podem determinar maior ativação da coagulação e consumo dos fatores, com maior sangramento. / Abstract: Plastic surgery procedures performed in patients who previously underwent weight reducing gas troplasty present a high risk for medical complications, one of the most severe being bleeding during the perioperative period. Although the cause of this bleeding is currently unknown, it is postulated that these patients may present alterations in hemostasis not detected by routine coagulation tests or an increase in microvascular density and/or in the diameter of subcutaneous vessels. The purpose of this study was to evaluate and compare the hemostasis and the number and caliber of subcutaneous vessels in two groups of patients undergoing abdominoplasty, one of them with history of previous weight reducing gastroplasty performed in accordance with the Fobi-Capella technique (group I) and the other without obesity backgrounds (group II). Each group was composed by ten female patients. Vitamins C and K were measured at preoperative period. At the beginning, during, and at the end of surgeries, samples were collected to determine the coagulogram (prothrombin and activated partial thromboplastin times), measurements of coagulation factors and thromboelastography. At the end of each surgery, samples of subcutaneous tissue were collected from six different abdominal topographies. Bleeding during intraoperative period was assessed indirectly by counting and weighing the compresses at the end of each surgical procedure. Data obtained from laboratorial tests and thromboelastography were compared between the groups I and II. Subcutaneous vessels were also assessed by immunohistochemistry using the pan-endothelial marker CD34 and quantified through the variables "microvessel density (MVD), percentage (%EndA) and mean (MEndA) endothelial areas" using computer assisted technology. The statistical analysis (Mood Median Test) showed superior bleeding (p = 0.007), increased prothrombin time (p = 0.007) and factor II (FII) decreased during the intraoperative period (p = 0.007) and factor X (FX) decreased during all studied operative periods in the group I. Thromboelastography, which assess the full process of hemostasia in real time, did not show differences between the groups. Greater concentrations of vitamin K were demonstrated in group I compared to group II. There were not statistically significant differences among the MVD values obtained from different abdominal subregions (p = 0.565) nor between groups I and II regarding the values of MVD (p = 0.88), %EndA (p = 0.364) and MEndA (p = 0.257). The size of the surgical pieces and the duration of surgeries were greater in group I (p = 0.007). The more intense bleeding observed during plastic surgeries carried out in patients that previously underwent weight reducing gastroplasty can not be quite explained by alterations in hemostasis when it is assessed through coagulation laboratorial tests, measurements of coagulation factors and thromboelastography, by decreased levels of vitamins K and C, by a larger number of blood vessels, by a more extensive vascular network, or by the presence of vessels with larger calibers in the subcutaneous adipose tissue of these patients when compared to patients without obesity backgrounds. The results indicate that the greater surgical trauma and the longer duration of surgeries in group I may lead to increased coagulation activation and consume of coagulation factors resulting in more intense bleeding. / Doutorado / Cirurgia / Doutor em Cirurgia

As serinoproteases de peçonha de serpentes (SVSPs) agem sobre pontos específicos do sistema circulatório, sendo consideradas promissoras para o tratamento de uma diversidade de desordens hemostáticas. No presente estudo, é descrita a expressão de uma serinoprotease de Crotalus durissus collilineatus (Collineina-1) em Pichia pastoris, bem como a purificação dessa toxina a partir da peçonha de C. d. collilineatus e a caracterização estrutural e enzimática da Collineina-1 nas formas nativa e recombinante. O cDNA que codifica a serinoprotease foi amplificado a partir da biblioteca de cDNA da glândula de peçonha de C. d. collilineatus e ligado ao vetor pPICZ A. A linhagem KM71H de P. pastoris foi transformada com o plasmídeo recombinante e as colônias foram selecionadas por resistência à zeocina. A expressão heteróloga foi realizada em meio mínimo suplementado com metanol, resultando em um rendimento de 56 mg de proteína por litro de cultura. A proteína recombinante foi purificada por um protocolo baseado em técnicas cromatográficas de troca iônica e fase reversa. A purificação da serinoprotease a partir da peçonha de C. d. collilineatus foi realizada pela combinação de técnicas de cromatografia de exclusão molecular, troca iônica e fase reversa, e resultou no isolamento de duas isoformas, denominadas Collineina-1 e 2. Quando analisada por espectrometria de massas, a Collineina-1 recombinante apresentou massa molar de 28.868 Da, enquanto as enzimas Collineina-1 e 2 apresentaram massas de 29.475 Da e 29.388 Da, respectivamente. A partir do alinhamento das sequências parciais das serinoproteases, foi possível determinar 100% de identidade dos aminoácidos para a Collineina-1 nativa e recombinante. O alinhamento múltiplo da sequência deduzida de aminoácidos da Collineina-1 indica uma semelhança estrutural dessa proteína com outras serinoproteases de peçonha de serpente. As enzimas nativa e recombinante mostraram efeitos similares sobre fibrinogênio bovino por clivarem preferencialmente a cadeia A do fibrinogênio, liberando o fibrinopeptídeo A. Ambas as enzimas induziram a coagulação do plasma bovino de forma dose-dependente, sendo que a Collineina-1 recombinante apresentou maior potencial coagulante, com uma dose mínima coagulante (DMC) de 0,08 mg/uL contra 0,225 mgu/L para a proteína nativa. As serinoproteases foram capazes de hidrolisar os substratos cromogênicos S-2222, S-2238 e S2302, embora ambas as enzimas tenham demonstrado maior atividade sobre o substrato S-2302. A atividade esterásica sobre o TAME foi avaliada em diferentes condições de temperatura e na presença de íons divalentes. As duas enzimas demonstraram alta termoestabilidade e tiveram a atividade inibida na presença dos íons Zn2+ e Cu2+. A cinética enzimática de ambas as serinoproteases seguiram o modelo de Michaelis-Menten. A Collineina-1 nativa apresentou um valor de Km de 1,43 mM, contra 1,682 mM para a proteína recombinante, indicando que a proteína nativa apresenta maior afinidade pelo substrato TAME. No entanto, as enzimas apresentaram valores similares de Kcat/Km (250,69 mM.min-1 para a Collineina-1 e 248,03 mM.min-1 para a rCollineina-1), sugerindo que as serinoproteases não diferem significativamente na eficiência em hidrolisar o substrato. Estes resultados demonstraram a adequação do sistema de escolha na produção heteróloga da Collineina-1, já que a proteína recombinante foi expressa com integridade funcional sobre os parâmetros avaliados. / Snake venom serine proteases (SVSPs) act on specific points of the circulatory system and are promising for the treatment of a variety of hemostatic disorders. In the present study, we describe the expression of a serine protease from Crotalus durissus collilineatus (Collineina- 1) in Pichia pastoris, the purification of the native toxin from C. d. collilineatus venom and the structural and enzymatic characterization of Collineina-1 in native and recombinant forms. The cDNA encoding the serine protease was amplified from cDNA library of C. d. collilineatus venom gland and cloned into pPICZ A vector. KM71H P. pastoris strain was transformed with the recombinant plasmid and colonies were selected by zeocin resistance. Heterologous expression was carried out in minimal medium supplemented with methanol, resulting in a yield of 56 mg of protein per liter of culture. The recombinant protein was purified by ion exchange and reverse phase chromatography. Purification of the native serine protease was accomplished by combining techniques of molecular exclusion, ion exchange and reversed phase, and resulted in the isolation of two isoforms, named Collineina-1 and 2. When analyzed by mass spectrometry, the recombinant Collineina-1 showed a molar mass of 28,868 Da, while Collineina-1 and 2 presented masses of 29,475 and 29,388 Da, respectively. The alignment of partial sequences of the enzymes resulted in 100% of amino acid identity between native and recombinant Collineina-1. The multiple alignment of deduced amino acid sequence of Collineina-1 indicates structural similarity with other snake venom serine proteases. The native and recombinant forms of the enzyme showed similar effects on bovine fibrinogen by cleaving preferentially A chain, releasing fibrinopeptide A. Both enzymes induced coagulation of bovine plasma in a dose-dependent way, though recombinant Collineina-1 presented a higher coagulant potential, with a minimum coagulant dose (MCD) of 0.08 mg/uL against 0.225 mg/uL for the native form. The serine proteases hydrolyzed S- 2222, S-2238 and S2302 chromogenic substrates, although both enzymes demonstrated increased activity upon S-2302. The esterase activity on TAME was evaluated at different temperatures and in the presence of divalent ions. Both enzymes showed high thermostability and their activity were inhibited in the presence of Zn2+ and Cu2+. The enzyme kinetics of both serine proteases followed Michaelis-Menten model. The native Collineina-1 showed a Km value of 1.43 mM, against 1.682 mM for the recombinant form, indicating that the native protein has a higher affinity for TAME substrate. However, enzymes had similar values for Kcat/Km (250.69 mM.min-1 for Collineina-1 and 248.03 mM.min-1 for rCollineina-1), suggesting that the serine proteases did not differ significantly in the efficiency to hydrolyze the substrate. These results demonstrated the adequacy of the system of choice in producing the snake venom serine protease, since the recombinant protein was expressed with functional integrity on the evaluated parameters.

Orientador: Erich Vinicius de Paula / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-25T23:01:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Souza_GleiceReginade_M.pdf: 1983428 bytes, checksum: 435b8d4ea1f6b2d6d8254be7fd9c00b2 (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: Há cerca de 50 anos sabe-se que pacientes com anemia falciforme (AF) apresentam maiores concentrações plasmáticas de heme livre. Recentemente, foi demonstrado que o heme é capaz de ativar a resposta imune inata, desencadeando resposta dependente de receptores "Toll-like", envolvendo a expressão de vários genes pró-inflamatórios. Em consonância com estes achados, o papel pró-inflamatório do heme foi confirmado em diferentes modelos experimentais de AF, colocando este metabólito como potencial desencadeante da oclusão microvascular e síndrome torácica aguda. Tromboses micro e macro vasculares são características da AF, e o papel do heme na patogenia destes eventos foi recentemente sugerido pela demonstração de sua capacidade de induzir a expressão de fator tecidual (FT) em células endoteliais e monócitos. No entanto, a relevância funcional da expressão deste achado ainda não foi demonstrada através de marcadores clinicamente relevantes da coagulação. Métodos: A expressão do FT induzida pelo heme foi avaliada em células mononucleares de sangue periférico (PBMC) através de dois ensaios globais da hemostasia: tromboelastometria (TEM) e teste de geração de trombina (TGT). Sangue de voluntários saudáveis foram coletados por uma veia antecubital com mínima estase em tubos de citrato de sódio (1:10) ou heparina. A TEM foi realizada em amostras de sangue total (n=10) incubadas com 30 ?M do heme (Sigma¿Aldrich) durante 4 horas a 37°C, em um equipamento ROTEM (Pentapharm). A coagulação foi ativada pela adição de CaCl2. Como controle, amostras dos mesmos indivíduos foram incubadas concomitantemente com o veículo (n=10). O TGT foi realizado em amostras de plasma duplamente centrifugadas, separadas a partir de sangue total estimulado com heme ou veículo sob as mesmas condições (n=16). A TGT foi realizada utilizando flurímetro Fluoroskan Ascent® (Thermolab). A coagulação foi ativada com FT (5pM) e fosfolipídios ( Reagente PPP, Thrombinoscope). A expressão de FT foi avaliada por qRT-PCR. PBMC e neutrófilos foram separados por centrifugação de gradiente de densidade (Ficoll) e então incubados com 30 uM de heme (n=6) ou salina (n=6) por 24hs. Teste estatístico não-paramétrico foi utilizado em todas as análises. Resultados: a incubação do sangue total com 30 uM de heme resultou numa potente indução de expressão de FT quando comparado com o veículo em PBMC (AU) (0,03±0,06 vs 1,18±0,60; P=0,03). Não foi possível detectar a expressão de FT em neutrófilos. A ativação da coagulação induzida pelo heme pode ser demonstrada através da TEM. O Heme diminuiu significativamente o tempo de coagulação (seg) (562,1±88,2 vs 387±84.3; P=0,002) e a MaxV-t (tempo para a velocidade máxima) (651,4±119,2 vs 451,1±87,4; P=0,002), que são dois indicadores de um estado de hipercoagulabilidade. Uma tendência para a diminuição do tempo de formação do coágulo também pode ser observada (P=0.07). Nenhuma diferença pode ser observada na área sob a curva da TEM. Um perfil de hipercoagulabilidade, também foi observado no TGT. Mudanças estatisticamente significativas, compatíveis com a ativação da coagulação foram observadas em parâmetros como: pico de trombina (aumentado), tempo para atingir a trombina (diminuição), índice de velocidade (aumento), período de latência (diminuição) e StarTail (diminuição) (todos<0,05). Nenhuma mudança estatisticamente significativa pode ser observada no parâmetro de pontencial endógeno de trombina. Discussão e Conclusão: A TEM e o TGT são dois testes globais em hemostasia, amplamente utilizados para avaliação de estados de hipo e hipercoagulabilidade. Ambos os métodos tem sido utilizados em pacientes com AF, que apresentam estado de hipercoagulabilidade similar ao encontrado em nosso trabalho, caracterizada por um início mais rápido da ativação da coagulação. Nossos resultados demonstram pela primeira vez que o heme, em concentrações semelhantes às observadas em pacientes com AF, é capaz de estimular não só a expressão do TF em PBMC, mas também de alterar o equilíbrio da coagulação para um estado de hipercoagulabilidade. Estes resultados fornecem um suporte adicional à hipótese de que o heme é um mediador chave na trombose micro e macro vascular na AF e, possivelmente, em outras doenças hemolíticas. Nosso estudo também avaliou de forma preliminar, o efeito do heme sobre a fosforilação do resíduo S879 da proteína p120-catenina, como um marcador indireto da quebra de barreira endotelial. Os resultados, ainda preliminares, sugerem que pode haver um efeito do heme sobre a integridade de barreira endotelial, fato que será investigado em estudos futuros / Abstract: It has been known for more than 50 years that patients with sickle cell disease (SCD) present higher plasma concentrations of heme. More recently, it was shown that heme is capable to activate innate immune response, and to trigger a toll-like receptor-dependent response that involves the expression of several pro-inflammatory genes. Accordingly, the role of heme as critical inflammatory mediator in SCD has been confirmed in different experimental models, suggesting that heme can be a trigger for microvascular occlusion and acute chest syndrome (ACS). The association between innate immune response and coagulation activation dates back to 450 million years in evolution, so that activation of the former is frequently accompanied by activation of the latter. Micro and macrovascular thrombosis are a hallmark of SCD, and the role of heme in the pathogenesis of these events has been recently suggested by demonstrations of heme-induced expression of tissue factor (TF) by endothelial cells and monocytes. However, the functional relevance of heme-induced TF expression on clinically-relevant coagulation markers has not been demonstrated. Methods: herein we evaluated heme-induced TF expression in peripheral blood mononuclear cells (PBMC), and used two different global assays of hemostasis, namely thromboelastometry (TEM) and Thrombin Generation Test (TGT) to evaluate the effect of heme on coagulation activation. Blood from healthy volunteers was drawn from an antecubital vein with minimal stasis in 0.106 sodium citrate tubes (1:10) or heparin. TEM was performed in whole-blood samples (n=10) incubated with 30 µM heme (Sigma-Aldrich) for four hours at 37oC, in a ROTEM equipment (Pentapharm). Coagulation was activated with the addition of CaCl2. Samples from same individuals incubated with vehicle were assayed concomitantly as controls (n=10). TGT was performed in double centrifuged plasma samples, separated from whole blood stimulated with heme or vehicle under the same conditions (n=16). TGT was performed using a Fluoroskan Ascent Flourimeter (Thermolab). Coagulation was activated with TF (5pM) and phospholipids (PPP reagent, Thrombinoscope). Expression of TF was evaluated by qRT-PCR. Heparin-anticoagulated blood was incubated with 30 µM heme (n=6) or vehicle (n=6) for 24 hours. PBMC and neutrophils were then separated by density gradient centrifugation (Ficoll). Non-parametric statistics were used in all analysis. Results: incubation of whole blood with heme 30 µM resulted in a potent induction of TF expression in PBMC compared to vehicle (AU)(0.03±0.06 vs 1.18±0.60; P=0.03). No TF expression could be detected in neutrophils. Heme-induced coagulation activation could be demonstrated by TEM. Heme significantly decreased the coagulation time (sec) (562.1±88.2 to 387±84.3; P=0.002) and the MaxV-t (time to maximum velocity) (651.4±119.2 to 451.1±87.4 ; P=0.002), which are two indicators of shift towards a hypercoagulable profile. A trend towards a lower clot formation time was also observed (P=0.07). No difference could be observed in the area under the TEM curve. A hypercoagulable profile was also observed in TGT in samples incubated with heme. Statistically significant changes compatible with a shift towards coagulation activation were observed in parameters such as peak thrombin (increased), time to peak thrombin (decreased), velocity index (increased), lagtime (decreased) and StarTail (decreased) (all P<0.05). No statistically significant change could be observed in the endogenous thrombin potential parameter (p=0.10). Discussion and conclusions: TEM and TGT are global hemostasis assays, widely used for evaluation of hypo- and hypercoagulable states. Both methods have been used in patients with SCD, who present hypercoagulable profiles similar to those obtained in our study, and characterized by faster onset and offset of coagulation activation. We demonstrate for the first time that heme, in concentrations similar to those observed in patients with SCD and other hemolytic disorders, is capable to not only stimulate the expression of TF by PBMC, but also to shift the coagulation balance towards a hypercoagulable state, similar to that observed in patients with SCD. These results provide additional support to the hypothesis that heme is a key mediator micro- and macrovascular thrombosis in SCD and possibly, in other hemolytic disorders. Our study also evaluated in a preliminary form the effect of heme on the phosphorylation of the residue S879 from p120-catenin, as a surrogate marker of endothelial barrier breakdown induced by heme. Though preliminary, our results suggest that heme might also affect endothelial barrier integrity. Additional studies are underway to evaluate this hypothesis / Mestrado / Clinica Medica / Mestra em Clínica Médica